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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von neuen corticotrop-aktiven Heptacosapeptiden, die eine a-Aminoisobuttersäure als N-endständigen Aminosäurerest statt des Serinrestes im nativen Corticotropin aufweisen, sowie von deren pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalzen. Diese neuen erfindungsgemäss erzeugten Heptacosapeptide haben die Formel
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worin Y Glycin, Glycinamid oder Glycinester bedeutet.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein geschütztes Decapeptid der allgemeinen Formel
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stoff oder Trifluoressigsäure, entfernt werden.
Die neuen erfindungsgemäss erzeugten Heptacosapeptide sowie deren Säureadditionssalze sind, wegen ihrer Adrenalin-Stimulierung sowie der lipotropen Wirksamkeit mit verlängerter Wirkung, als Heilmittel nützlich.
Im Verlaufe der Untersuchungen auf dem Gebiete der corticotrop aktiven Peptide wurde gefunden, dass ein Heptacosapeptid, welches in den ersten 27 Aminosäureresten dem Corticotropin (ACTH) entspricht, mit Ausnahme der endständigen Sevingruppe, welche durch eine a-Aminoisobuttersäure ersetzt wurde, bessere biologische Eigenschaften besitzt und eine verlängerte Wirksamkeit aufweist. Es wurde auch gefunden, dass diese verbesserten Eigenschaften durch eine verringerte Empfindlichkeit des Heptacosapeptids gegenüber der Wirkung von intrazellulären Aminopeptasen zustande kommt. Die Erfindung basiert auf diesen Beobachtungen.
Als Beispiele der in den vorliegendem erfindungsgemässem Verfahren angewendeten aktiven Estermethoden als Kondensationsmethode für die Kupplung eines geschützten Decapeptids der Formel (n) mit einem ge-
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thode genannt werden.
Bei der Herstellung der genannten neuen Heptacosapeptide werden jegliche freie funktionellen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, mit Vorteil mittels solcher Gruppen geschützt, die leicht durch Hy- drogenolyse, Hydrazinolyse, Hydrolyse, durch Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder insbe- sondere durch Azidolyse entfernt werden können.
Die Y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure in 5-Stellung und die ss-Carboxylgruppe der Asparaginsäure in
25-Stellung werden vorteilhafterweise durch Veresterung geschützt, z. B. mit einem Niederalkanol, z. B.
Methanol, Äthanol, Propanol, t-Butanol, oder einem Aralkanol, z. B. Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol. Diese carboxylschützenden Gruppen werden mit Hilfe üblicher Methoden eingeführt.
Die a-Aminogruppe der a-Aminoisobuttersäure am Aminoende und die c-Aminogruppe von Lysinen in den 11-, 15-, 16-und 21-Stellungen werden mit Vorteil durch Einführung einer Gruppe, wie einer t-Butyl- oxycarbonyl-, t- Amyloxycarbonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, 2- (p- Diphenyl) -isopropyloxycarbonyl-, Benzyl-
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Tabelle 1 Adrenalin-stimulierende Wirkungen von [Ibu]-ACTH(1-27)-OH, natürlichem Corticotropin und [Gly1]-ACTH (1-l8) -NH2
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<tb>
<tb> Methode <SEP> Verabreichung <SEP> Peptid
<tb> A <SEP> B <SEP> C <SEP>
<tb> In <SEP> vivo <SEP> Steroidogenese <SEP> in <SEP> :
<SEP>
<tb> peripherem <SEP> Blut <SEP> intravenös <SEP> 325 <SEP> 100 <SEP> 177
<tb> peripherem <SEP> Blut <SEP> intramuskulär <SEP> 320 <SEP> 180 <SEP> 50 <SEP>
<tb>
Bemerkungen : Die Wirkungen sind in USP-Einheiten/mg ange- geben, relativ zum Third USP Cortocotropin
Reference Standard.
Wie aus obiger Tabelle 1 ersichtlich ist, wirkt das erfindungsgemäss erzeugte Heptacosapeptid adrenalin- - stimulierend, wobei die Wirksamkeit etwa die zweifache des [Gly1]-ACTII (1-18) -NE2 und natürlichem Corti- cotropins beträgt. Es soll bemerkt werden, dass die Wirkung des Heptacosapeptids unabhängig ist davon, ob i nun das Peptid intravenös oder intramuskulär verabreicht wird. Beim [Gly1]-ACTH(1-18)-NH2 aber ist das
Wirkungsverhältnis von intramuskulärer gegenüber der intravenösen Verabreichung etwa 1/3. Diese Tatsache zeigt an, dass das erfindungsgemäss erzeugte Heptacosapeptid gegenüber der Wirkung von Aminopeptidase im
Gewebe resistenter ist als das 1-Glycin-analoge.
Das erfindungsgemäss erzeugte Heptacosapeptid [Ibu1]-ACTII (1-27) -OH A zeigt ferner eine deutliche lipotrope Wirkung, welche in folgender Tabelle 2, im Vergleich mit jener von [Gly1]-ACTII (1-18) -NH2 C und dem natürlichen Schaf-Corticotropin (as-ACTH) B zusammengestellt ist.
Tabelle 2
Lipotrope Wirkung von [Ibu1]-ACTH(1-27)OH, natürlichem Gorticotropin und [Gly1]-ACTH(1-18)-NH2
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<tb>
<tb> Versuchstier <SEP> Minimale <SEP> effektive <SEP> Dosis
<tb> (10-6 <SEP> mg/50 <SEP> mg <SEP> Gewebe)
<tb> ABC
<tb> . <SEP> Adipose-Gewebe <SEP> der <SEP> Ratte <SEP> 0,036 <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> 6,3
<tb> Adipose-Gewebe <SEP> des <SEP> Kaninchens <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 0, <SEP> 35 <SEP> 7, <SEP> 1
<tb>
Bemerkungen : Die lipotrope Wirkung wurde nach der Methode von
A. Tanaka und Mitarbeiter (Arch. Blochem. Biophys.
Bd. 99 [1962], S. 294) mit epidimydalem Adipose-
Gewebe der Ratte und perirenalem Adipose-Gewebe des Kaninchens durchgeführt. Als Parameter diente die Erhöhung der Konzentration an nicht veresterten
Fettsäuren, sowohl im Medium als auch im Gewebe.
Die Wirkung wurde als minimale effektive Dosis pro
50 mg Gewebe angegeben.
Die biologische Halbwertszeitdeserfindungsgemäss erzeugten Heptacosapeptids und des natürlichen Corticotropins wurde unter Verwendung der lipotropen Wirkung in vitro als Parameter ermittelt, s. A. Tanaka, B. T. Pickering und C. H. Li, Arch. Blochem. Biophys. Bd.99[1962], S. 294. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
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Tabelle 3 Halbwertszeiten von [Ibu1]-ACTH(1-27)-OH, natürlichem Corticotropin und [Gly1]-ACTII (1-18) -NH2 als in vitro lipotrop-aktive Stoffe
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<tb>
<tb> Peptid <SEP> In <SEP> vivo <SEP> a) <SEP> In <SEP> vitro <SEP> b) <SEP> inkubiert <SEP> mit
<tb> (intravenöse
<tb> Injektion) <SEP> Plasma <SEP> Muskel
<tb> [Ibu-ACTH <SEP> (l-27)-OH <SEP> 6, <SEP> 5min <SEP> 79, <SEP> 3min <SEP> 91, <SEP> 2min <SEP>
<tb> ACTH <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> min <SEP> 59, <SEP> 2 <SEP> min <SEP> 250,9 <SEP> min
<tb> [Gly1]-ACTH(1-18)-NH2 <SEP> 1,9 <SEP> min <SEP> 30,0 <SEP> min <SEP> 42,6 <SEP> min
<tb>
Bemerkung : a) eine Peptidprobe wurde intravenös in die Vena cava inferior von Ratten injiziert, worauf zu bestimmten Zeiten Blutproben aus der Abdominal-Aorta entnommen wurden.
Anschliessend nach Ansäuern wurde die lipotrope Wirkung in vitro bestimmt. b) Eine Probe wurde in frischem Plasma einer anästhesierten
Ratte oder in Krebs-Ringer Bicarbonatpuffer, der Stücke vom
Oberschenkelmuskel der Ratte, Rinderserumalbumin und Glucose enthält, gelöst. Diese Gemische wurden bei 370C inkubiert und es wurden zu bestimmten Zeiten aliquote
Teile entnommen, in denen dann die lipotrope Wirkung in vitro bestimmt wurde.
Die oben angeführten Daten für die Halbwertszeiten von erfindungsgemäss erzeugtem Heptacosapeptid sind
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Dies zeigt, dass die amino-terminale Substitution durch a-Aminoisobuttersäure in einem Corticotropin- Pep- tid seine biologischen Eigenschaften stark verbessert, was sich In der Verlängerung der Wirkungsdauer und in einer Erhöhung der Wirkung zeigt.
Es soll hier bemerkt werden, dass die oben genannten Versuchsergebnisse nur beispielhaften Charakter haben. Auch die übrigen erfindungsgemäss erzeugten Heptacosapeptide sind für therapeutische Zwecke anwendbar, z. B. bei der Behandlung von akuten oder chronischen Gelenksrheumatismus, beiallergischen Leiden oderAdrenarchen beim Menschen und beim Haustier, oder für die Untersuchung von adrenocorticalen Funktionen.
Das oben beschriebene erfindungsgemässe Verfahren wird im nachfolgenden durch zwei Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 :
A) Herstellung der Ausgangsprodukte : a) Benzyloxycarbonyl-L-alanyl-glycin-t-butylester
Benzyloxycarbonyl-L-alanin (6, 70 g) undGlycin-t-butylester (3, 95 g) werden in Äthylacetat (30 ml) gelöst, worauf zum Gemisch eine Lösung von N, NI-Dicyclohexylcarbodiimid (6, 20 g) in Äthylacetat bei 00C gegeben wird. Das Gemisch wird bei 40C über Nacht stehen gelassen, worauf der ausgefal- lene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat wird mit eisgekühlter 1 n Salzsäure und
1 m Natriumbicarbonat gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, was einen Rückstand ergibt, der aus Äther/Petroläther kristallisiert wird.
Man erhält 7, 84 g des ge-
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C17H24N2O5: <SEP> C <SEP> = <SEP> 60,70; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 19 <SEP> ; <SEP> N=8, <SEP> 33 <SEP> ; <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 60, <SEP> 39 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 42 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 8, <SEP> 25. <SEP>
<tb>
b) Benzyloxycarbonyl-ss-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butylester
Das wie oben beschrieben erhaltene Dipeptid (6,73 g) wird während 2 h in einer 10% igen Lösung von Essigsäure in Methanol und unter Verwendung von Palladium als Katalysator hydriert. Nach
Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird der erhaltene Rückstand in Gegenwart von Dichloro- methan in einer Lösung von Kaliumcarbonat geschüttelt.
Die organische Phase wird abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Man erhält L-Alanyl-glycin-t-butylester als Öl.
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Benzyloxyearbonyl-jS-t-butyl-L-asparaginsäure [hergestellt durch Behandeln des korrespondieren- den Dicyclohexylamin-Salzes (10, 1 g) mit Dowex 50W x 8 (H+-Form) (stark saures Kationaustauscherharz auf der Basis von sulfoniertem Polystyrol) in herkömmlicher Weise] und der wie oben erhaltene Dipeptidester werden in Dichloromethan gelöst und mit einer Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (4, 13 g) in Dichloromethan bei 0 C versetzt. Das Gemisch wird bei 4 C über Nacht stehen gelassen. Nach Entfernen des ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffes durch Filtration wird das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, mit eisgekühlter 1 n Salzsäure und 1 m Natriumcarbonat gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt.
Man erhält eine ölige Substanz, die aus Äther/Petroläther kristallisiert wird. Nach Umkristallisieren aus demselben Lösungsmittel erhält man das reine Tripeptid-Deri-
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C25H37N3O8: <SEP> C <SEP> = <SEP> 59,16; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,35; <SEP> N <SEP> = <SEP> 8,28;
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 59, <SEP> 22 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 38 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 8,24.
<tb>
c) Benzyloxycarbonyl-L-prolyl--t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butylester
Der, wie oben beschrieben erhaltene Tripeptidester (6, 10 g) wird in 5%iger Essigsäure in Methanol während 5 h und unter Verwendung von Palladium-Schwarz katalytisch hydriert.
Nach Entfernung des Katalysators wird das Filtrat im Vakuum eingeengt, wobei ein öliger Rückstand entsteht, der
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Lösungen werden zusammengegeben und im Vakuum eingeengt, wobei manBenzyloxycarbonyl-L-prolin (2, 90 g) und der wie oben erhaltene Tripeptidester werden in Dichloromethan (50ml) gelöst und mit einer Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (2,48 g) in Dichloromethan bei 00C versetzt. Das Gemisch wird bei 00C während 30 min gerührt und bei 4 C über Nacht stehen gelassen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, wonach der erhaltene Rückstand mit Äther zur Kristallisation gebracht wird.
Die Kristalle (6, 45 g) werden inAcetonitril gelöst und ein kleiner Teil von unlöslichem Dicyclohexylharn- stoff wird entfernt. Nach Entfernung der Lösungsmittel wird der Rückstand aus Äther kristallisiert.
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C30H44N4O9: <SEP> C <SEP> = <SEP> 59, <SEP> 59; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,33; <SEP> N <SEP> = <SEP> 9,27;
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 59, <SEP> 69 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 46 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 9,12.
<tb>
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Der wie oben beschrieben erhaltene Tetrapeptidester (5,00 g) wird in Methanol, enthaltend 1 ml
Essigsäure, während 4 h und unter Verwendung von Palladium-Schwarz katalytisch hydriert.
Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat im Vakuum eingeengt und der erhaltene Rückstand wird mit 50% Kaliumcarbonat in Gegenwart von Dichloromethan bei 00C geschüttelt. Die organi- schen Phasen werden zusammengegeben, über Natriumsulfat getrocknet, wobei man nach Konzentration den L-Prolyl-ss-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butylester erhält. Dieses Produkt liefert einen isolierten Fleck auf dem Dünnschicht-Chromatogramm (Silicagel) in einem Lösungsmittelsystem von n-Butanol/Essigsäure/Pyridin/Wasser (Volumenverhältnis 30 : 6 : 20 : 24).
Carbodiimid-Methode N, 0-Dibenzyloxycarbonyl-L-tyrosin (0, 45 g, 1 mMol) und der wie oben erhaltene Tetrapeptidester (1 mMol) werden in Dichloromethan (10 ml) gelöst und zu einer Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (0,206 g) in Dichloromethan gegeben. Das Gemisch wird bei 40C über Nacht stehen gelassen, worauf der entstandene Niederschlag abfiltriert wird. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt und der erhaltene Rückstand aus Äther kristallisiert. Durch Umkristallisieren aus Äthylacetat/Äther erhält man das gewünschte Peptid vom Schmelzpunkt 121 bis 1230C. Ausbeute 0, 51 g. Das Produkt liefert einen isolierten Fleck auf dem Dünnschicht-Chromatogramm (Silicagel) im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Essigsäure (Volumenverhältnis 90 : 10 : 3).
Methode der aktiven Ester L-Prolyl-ss-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butylester (5,77 mMol) wird in Dimethylformamid (30 ml) gelöst, worauf zur erhaltenen Lösung N, O-Dibenzyloxycarbonyl-L-tyrosin-p-nitro- phenylester (3, 63 g) zugegeben wird. Das Gemisch wird bei 40C während 3 Tagen stehen gelassen. Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Einengen im Vakuum wird der Rückstand aus Äthylacetat/Äther kristallisiert.
Durch Umkristallisieren aus Äthylacetat erhält man 6,65 g des ge-
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C <SEP> HggNgO <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 62, <SEP> 58 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 59 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 76 <SEP> ; <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 62, <SEP> 44 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 56 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 7,52.
<tb>
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Der wie oben erhaltene Pentapeptidester (6, 60 g) wird in Methanol, enthaltend 10% Essigsäure, während 4 h und unter Verwendung von Palladium, katalytisch hydriert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand in Dichloromethan gelöst.
Die Lösung wird mit 50% Kaliumcarbonat bei 00C geschüttelt, worauf die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt wird, wodurch man den kristallinen Pentapeptiddiester erhält. Dieses Produkt wird in Dimethylformamid (50 ml) gelöst, worauf Benzyloxycarbonyl-L-valin-p-nitro- phenylester (2,72 g) zugegeben wird. Das Gemisch wird bei 40 C während zwei Tagen stehen gelassen und anschliessend im Vakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 40 bis 450C eingeengt, wodurch man ein rohes Produkt erhält. Dieses wird auf einer Silicagel-Säule (Merck, 0, 05 bis
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(20 g/Röhrehen). Anschliessend wird die Säule mit Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis 5 : 95) gewaschen.
Jede Einzelfraktion wird mit Dünnschicht-Chromatographie geprüft, worauf die Fraktionen (Röhrchen Nr. 55 bis 60) zusammengegeben werden. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt
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Methanol).
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<tb>
<tb>
Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C44H62N6O12.H2O: <SEP> C <SEP> = <SEP> 59, <SEP> 71 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 29 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 9, <SEP> 50 <SEP> ; <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 59, <SEP> 65 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 19 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 9, <SEP> 30.
<tb>
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-aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butylester DerHexapeptidester (4,62 g) wird in Methanol, enthaltend 10% Essigsäure, während 4 h und unter Verwendung von Palladium, katalytisch hydriert. Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Einengen im Vakuum wird der erhaltene Rückstand in Äthylacetat gelöst.
Die Lösung wird mit Eis gekühlt und mit 50% Kalium carbonat geschüttelt, worauf die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt wird, wobei man den Hexapeptiddiester erhält. Das Peptid wird inDimethylformamid (40 ml) gelöst und zu der Lösung wird Nα-Benzyloxycarbonyl-N#-t-butyloxy- carbonyl-L-lysin-p-nitrophenylester (2, 56 g) gegeben. Das Gemisch wird bei 4 Cwährend3 T gen stehen gelassen und anschliessend im Vakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 40 bis 45 C eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird auf einer Silicagel-Säule (Merck, 0,05 bis 0,2 mm, 150 g) chromatographiert.
Diese Säule wird mit Methanol/Chloroform (mit linearem Methanol-Konzentrations-Gradient) gewaschen und das Eluat in 50 Röhrchen (20 g/Röhrchen) aufgefangen. Anschliessend wird die Säule mit Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis 5 : 95) gewaschen. Die Fraktionen (Röhrchen Nr. 71 bis 80) werden zusammengegeben und im Vakuum eingeengt, wobei man einen Rückstand erhält, der nach Behandlung mit Äther eine gelatinöse Masse bildet.
Nach Waschen dieses Rückstandes mit Äther und Trocknen erhältman 4, 38 g des gewünschten Produktes.
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C55H82N8O15.H2O: <SEP> C <SEP> = <SEP> 59, <SEP> 34; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,61; <SEP> N <SEP> = <SEP> 10,07;
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 60, <SEP> 05 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 67 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 10,06.
<tb>
g) Benzyloxycarbonyl-L-valyl-N#-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-Ltyrosyl-L-prolyl-ss-t-bu- tyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butylester
Der wie oben erhaltene Heptapeptidester (3, 5 g) wird in Methanol, enthaltend 10% Essigsäure, während 3 h und unter Verwendung von Palladium-Schwarz, katalytisch hydriert.
Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird der entstehende Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 50% Kaliumcarbonat bei 0 C geschüttelt, worauf die organische Phase abgetrennt, über
Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt wird, wobei man einen Rückstand erhält, der in Dimethylformamid (30 ml) gelöst wird. Die Lösung wird mit Benzyloxycarbonyl-L-valin-p-ni- trophenylester (1, 29 g) versetzt. Das Gemisch wird bei 40C während 2 Tagen stehen gelassen, an- schliessend im Vakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 40 bis 450C eingeengt, um einen Rück- stand zu ergeben.
Dieser wird auf einer Silicagel-Säule (Merck, 0,05 bis 0,2 mm, 100 g) chroma- tographiert, worauf die Säule mit Chloroform/Methanol (mit linearem Methanol-Konzentrations-
Gradient von 0 bis 5%) gewaschen wird, wobei das Eluat in 50 Fraktionen (20 g/Röhrchen) aufge-
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fangen wird. Anschliessend wird die Säule mit Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis 5 : 95) gewaschen. Die Fraktionen (Röhrchen Nr. 52 bis 62), die das gewünschte Peptid enthalten, werden zusammengegeben und im Vakuum eingeengt.
Der so erhaltene Rückstand wird mit Äther behandelt,
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(c = 1, 061, Methanol).
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C60H91N9O16: <SEP> C <SEP> = <SEP> 60, <SEP> 34 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 68 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 10, <SEP> 55 <SEP> ; <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 60, <SEP> 30 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 84 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 10, <SEP> 28. <SEP>
<tb>
h) Nα-Benzyloxycarbonyl-NG-nitro-L-arginyl-L-prolin-methylester
Zu einem Gemisch bestehend aus Thionylchlorid (1, 6 ml) und Methanol (2,0 ml), gekühlt im
Eis/Salz-Bad, wird L-Prolin (2, 30 g) zugegeben und das Gemisch wird bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird der erhaltene
Rückstand in Dichloromethan gelöst.
Die Lösung wird mit Wasser (2 ml) versetzt und mit eisge- kühltem 50% Kaliumcarbonat (4 ml) bei OOC geschüttelt. Die wässerige Lösung wird wiederholt mit Dichloromethan extrahiert und die Extrakte werden zusammengegeben, über Natriumsulfat ge- trocknet und im Vakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 20 C eingeengt, wobei man L-Prolin- - methylester in Form eines sirupösen Rückstandes erhält.
Na-Benzyloxycarbonyl-NG-nitro-L-arginin (6, 18 g) wird in Methanol gelöst und die Lösung im
Vakuum eingeengt, wobei man einen sirupösen Rückstand erhält, der in Acetonitril gelöst wird.
Zu dieser Lösung wird der wie oben beschrieben erhaltene L-Prolin-methylester und Dicyclohexyl- carbodiimid (3, 61 g) bei OOC zugegeben. Das Gemisch wird bei 4 C über Nacht stehen gelassen, worauf der kristalline Niederschlag abfiltriert, mit kaltem Acetonitril gewaschen und im Vakuum getrocknet wird. Das erhaltene Produkt (9,98 g) wird in heissem Methanol gelöst, worauf unlösli- cher Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, worauf der erhalteneRückstand ausAcetonitril umkristallisiert wird.
Man erhält 5, 75 g des gewünschten Pro-
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C20H28N6O7: <SEP> C <SEP> = <SEP> 51, <SEP> 72 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 08 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 18, <SEP> 09 <SEP> ; <SEP>
<tb> C <SEP> = <SEP> 51, <SEP> 63 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 14 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 17, <SEP> 92. <SEP>
<tb>
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Essigsäure (10 ml) gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur während 60 min stehen gelas- sen, worauf der amorphe Niederschlag abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Na- triumhydroxyd-Plättchen getrocknet wird, wobei man NG-Nitro-L-arginyl-L-prolin-methylester- - hydrobromid erhält.
Nα-Benzyloxycrbonyl-NG-nitro-L-arginin (2,83 g) wird in wasserfreiem Tetrahydrofuran (2, 5 ml) gelöst, worauf Tri-n-butylamin (1, 63 g) zugegeben wird. Die Lösung wird im Eis/Salz-Bad gekühlt und tropfenweise mit Äthyl-Chloroformiat (0, 96 g) versetzt. Das Gemisch wird 30 min in einem Eis/Salz-Bad gerührt, worauf eine Lösung des wie oben beschrieben erhaltenen Dipeptidester-hydrobromids (2,96 g) und Tri-n-butylamin in Dioxan (40 ml), enthaltend Wasser (1 ml), zugefügt wird.
Das Reaktionsgemisch wird bei 00C während 3 h gerührt und anschliessend'bei 40C über Nacht stehen gelassen. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand in 10% n-Bu- tanol-Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 1 n Salzsäure und 1 m Natriumcarbonat gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wird in Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis 5 : 95,30 ml) gelöst, worauf die erhaltene Lösung auf einer Silicagel-Säule (Merok, 0,05 bis 0,2 mm, 60 g) chromatographiert wird.
Die Säule wird nacheinander mit Chloroform (600 ml), Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis 5 : 95, 200 ml), Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis 7 : 93,1000 ml), Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis 10 : 90,400 ml) und Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis l : l, 400 ml) gewaschen, wodurch das gewünschte Peptid eluiert wird. Die Einzelfraktionen werden mit Dünnschichtchromatographie geprüft, worauf diejenigen, die das gewünschte Peptid enthalten, zusammengegeben werden. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und der erhaltene Rückstand mit Äthylacetat behandelt, wobei man einen gelatinösen Niederschlag erhält.
Dieser wird abfiltriert, mit Äthylace- tat gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 3, 8 g des gewünschten Peptids vom Schmelz-
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<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C26H3N11 <SEP> 010. <SEP> H2O <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 45, <SEP> 68 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 05 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 22, <SEP> 54 <SEP> ; <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 45, <SEP> 52 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 5, <SEP> 92 <SEP> ;
<SEP> N <SEP> = <SEP> 22,85.
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j) Nα-Benzyloxycarbonyl-N#-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-NG-nitro-L-arginyl-NG-nitro-L-arginyl- -L-prolin-methylester
Der wie oben beschrieben erhaltene Tripeptidester (3,7 g) wird in Essigsäure (10 ml), die mit
Bromwasserstoff gesättigt ist, gelöst und die Lösung wird bei Zimmertemperatur während 90 min stehen gelassen. Anschliessend wird durch Zugabe von wasserfreiem Äther das Tripeptidester-hy- drobromid gefällt. DieserNiederschlag wird aus Methanol/Äther umkristallisiert, wobei man 4,6 g einesamorphen Feststoffes erhält.
Dieses Produkt zeigt einenHaupt-Fleck (Rf = 0, 64) und kleinere
Flecke (Rf = 0, 44, 0, 52) auf dem Papier-Chromatogramm bei Verwendung des Lösungsmittelsy-
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: 6 : 20 :Dicyclohexylamin-Salz (3, 05 g) durch Behandlung mit Dowex 50W x 8 (H+-Form) (s. weiter oben und Tri-n-butylamin (1, 11 g) werden in wasserfreiem Tetrahydrofuran (20 ml) gelöst und die Lösung wird in einem Eis/Salz-Bad gekühlt. Anschliessend wird mit Äthyl-Chloroformiat (0, 65 g) versetzt und das Gemisch in einem Eis/Salz-Bad während 30 min gerührt. Zum Gemisch wird dann eine Lösung des wie oben beschrieben erhaltenen Tripeptidesters und von Tri-n-butylamin (2,0 g) inDioxan (30 ml), enthaltend Wasser (3 ml), gegeben, worauf das erhaltene Gemisch bei 00C während 3 h gerührt wird.
Nach Stehenlassen über Nacht bei 40C wird dieses Gemisch im Vakuum eingeengt, wobei ein Rückstand entsteht, der in Äthylacetat, enthaltend 10% n-Butanol, gelöst wird.
Die Lösung wird nacheinander mit eisgekühlter 1 n Salzsäure und 1m Natriumcarbonat gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, worauf der entstehende Rückstand zweimal aus Äthylacetat/Äther umkristallisiert wird. Man erhält 3,82 g des gewünschten Produktes.
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-37,- L-prolin Der wie oben beschrieben erhaltene Tetrapeptidester (3, 8 g) wird in Methanol (10 ml) gelöst und die entstandene Lösung wird zu 1 n Natriumhydroxyd (5, 1 ml) gegeben. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur während 90 min stehen gelassen und anschliessend mit 1 n Salzsäure (5, 1 ml) angesäuert.
Nach Entfernung des Methanols im Vakuum wird der erhaltene ölige Rückstand mit 10% n-Butanol-Äthylacetat extrahiert, der Extrakt wird im Vakuum eingeengt und der erhaltene Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert, wobei man 2,6 g des gewünschten Produktes er-
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<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> CHgO. <SEP> 2H <SEP> O <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 47, <SEP> 21 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 67 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 19, <SEP> 89 <SEP> ; <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> =47, <SEP> 64 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 43 <SEP> ;
<SEP> N <SEP> = <SEP> 19, <SEP> 28.
<tb>
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-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-NG -nitro-L-arginyl-NG-nitro-L-arginyl--aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butylester Das unter g) erhaltene Octapeptid (1, 19 g) wird in Methanol (1, 5 ml) gelöst und die Lösung wird mit Essigsäure (1 ml) versetzt. Anschliessend wird die Lösung während 4 h im Wasserstoff-Strom und unter Verwendung von Palladium-Schwarz katalytisch hydriert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand in Äthylacetat gelost. Die Lösung wird gekühlt, mit kaltem 50% Kaliumcarbonat geschüttelt, worauf die organische Phase abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt wird, wobei man den Octapeptiddiester erhält.
Dieser wird in
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wird bei 40C während 2 Tagen stehen gelassen, worauf der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat wird im Vakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 40 bis 450C eingeengt, wobei man einen Rückstand erhält, der zur Reinigung auf einer Silicagel-Säule (Merck, 0,05 bis 0,2 mm, 40 g) chromatographiert wird. Die zuvor mit Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis 2 : 98) behandelte Säule wird mit demselben Lösungsmittel eluiert, wobei das Eluat in 50 Fraktionen (10 ml/Röhrchen) aufgefangen wird, worauf die Säule mit Methanol/Chloroform (Volumenverhältnis 15 : 85) gewaschen wird. Die Fraktionen (Röhrchen Nr. 34 bis 66) werden zusammengegeben, im Vakuum eingeengt und der entstandene Rückstand in Äthylacetat gelöst.
Durch Zu-
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<tb> Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> CggHNO. <SEP> H <SEP> O <SEP> : <SEP> C-54, <SEP> 48 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 38 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 15, <SEP> 88 <SEP> ; <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 54, <SEP> 14 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 53 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 15, <SEP> 88. <SEP>
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Der wie oben beschrieben erhaltene Dodecapeptidester (577 mg) wird in 90% Essigsäure (15 ml) über Nacht und unter Verwendung von Palladium katalytisch hydriert. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand aus Wasser gefriergetrocknet und im Vakuum über Natriumhydroxyd-Plättchen getrocknet, wobei man 570 mg des gewünschten Produktes erhält.
Das Aminosäure-VeIhältnis im sauren Hydrolysat beträgt : Asparaginsäure 1, 19, Prolin 2,29, Glycin 1, 00, Alanin 0,99, Valin 2, 15, Tyrosin 0,91, Lysin 2,11, Arginin 1, 96.
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Analyse <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> C80H1SsN20 <SEP> 020. <SEP> 2CHsCOOH. <SEP> 4Hp <SEP> : <SEP>
<tb> C <SEP> = <SEP> 53, <SEP> 37 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 8, <SEP> 11 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 14, <SEP> 82 <SEP> ; <SEP> CHs <SEP> CO <SEP> = <SEP> 4, <SEP> 55 <SEP> ; <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 53, <SEP> 07 <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 57 <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 14, <SEP> 82 <SEP> ; <SEP> CHgCO <SEP> = <SEP> 4, <SEP> 57. <SEP>
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wird mit Eis gekühlt, mit eisgekühlter 1 n Salzsäure (1, 375 ml) und 2 m Natriumnitrit (0,303 ml) versetzt und bei 00C während 4 min geschüttelt.
Das resultierende Azid wird mit eisgekühltem
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über Natriumsulfat getrocknet. Das so erhaltene Azid wird zu einer Lösung des wie oben beschrieben erhaltenen Dodecapeptids (0,275 mMol) und Triäthylamin (0, 127 ml) in Dimethylformamid (4 ml) enthaltend Wasser (0,2 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 10 bis 150C bis zum Klarwerden eingeengt. Die Lösung wird bei 40C während 24 h stehen gelassen und anschliessend mit dem Pentapeptid-azid (hergestellt aus 0,138 Mol des korrespondierenden Hydrazids nach der oben beschriebenen Methode) versetzt.
Das Gemisch wird bei derselben Temperatur über Nacht stehen gelassen, worauf das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wird. Man erhält einen Rückstand, der aus Äther gefällt wird. Dieser Niederschlag wird in n-Butanol/Äthylacetat (Volumenverhältnis 1 : 2) gelöst unddie entstandene Lösung mit 1 n Essigsäure gewaschen. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und aus Essigsäure gefriergetrocknet, wobei man den Heptadecapeptidester (1, 12 g) erhält.
Das wie oben beschrieben erhaltene Peptid wird in Methanol in Gegenwart von Essigsäure während 90 min und unter Verwendung von Palladium katalytisch hydriert. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand aus Essigsäure gefriergetrocknet (Ausbeute 1, 007 g).
Ein Teil (0, 37 g) des Lyophilysats wird zur Reinigung auf einer Säule (2, 3 x 143 cm) einer GelFiltration unterworfen sephadex G-25 (chemisch modifiziertes Dextran, erhalten durch Fermentation von Rohrzucker) mit 20% Essigsäure. Das Eluat wird in Fraktionen von 5 ml aufgefangen, in denen die Absorption bei 275 mg aufgezeichnet wird. Die Fraktionen (Röhrchen Nr. 32 bis 45), die das gewünschte Peptid enthalten, werden zusammengegeben, eingeengt und aus Essigsäure ge-
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(c = 0,667, 50% Essigsäure). B) Erfindungsgemässes Verfahren :
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trocknet wird. Das resultierende Decapeptidhydrochlorid wird in Dimethylformamid (3 ml) zusammen mit N-Hydroxysuccinimid (0,083 g) gelöst und zu einer Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (0,15 g) inDimethyl- formamid (2 ml) gegeben.
Das Gemisch wird bei 40C während 24 h stehen gelassen, worauf der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat wird in eisgekühltes Äthylacetat/Äther (Volumenverhältnis l : l, 100 ml) gegossen und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit Äthylacetat und Äther
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gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man den aktiven Decapeptidester erhält.
Das wie oben beschrieben erhaltene Heptadecapeptidester-acetat (0, 300 g) wird in Dimethylformamid (3 ml) gelöst unter Zugabe von Triäthylamin (0, 17 ml). Die Lösung wird mit einer andern Lösung des wie oben beschrieben erhaltenen Decapeptidesters in Dimethylformamid versetzt, worauf das Gemisch (Totalvolumen : 5 ml) bei 40C während 3 Tagen gerührt wird. Dann wird das Reaktionsgemisch in eisgekühltes Äthylacetat (50 ml) gegossen, worauf Äther (50 ml) zugefügt wird. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man das rohe geschützte Heptacosapeptid (0, 60 g) erhält.
Das wie oben beschrieben erhaltene geschützte Heptacosapeptid wird in ein Teflon-Reaktionsgefäss gege- ben, zusammen mit Methionin (0, 1 g) und Anisol (0,6 ml), worauf Fluorwasserstoff durch das in einem
Trockeneis/Aceton-Bad gekühlte Reaktionsgefäss geleitet wird. Das Reaktionsgemisch (zirka 20 ml) wird während 40 min bei Zimmertemperatur gerührt, im Vakuum eingeengt, worauf der entstehende Rückstand in Eis-Wasser gelöst wird. Die Lösung wird mit Chloroform gewaschen und auf eine Säule (1, 4 x 30 cm) gegeben, die mit Amberlite CG-4B (schwach basisches Anionaustauschharz auf der Basis von Polystyrol) (Acetat-Form) gefüllt ist. Die Säule wird mit Wasserportionen gewaschen und die Eluate werden vereinigt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet.
Das resultierende Peptid (0, 41 g) wird zur Reinigung auf einer Carboxymethylcellulose-Säule (2,2 x 30 cm) (0, 56 meq/g) chromatographiert. Die Elution erfolgt mit einem Ammoniumacetat-Puffer (pH 6, 5, 2000 ml) mit linearem Konzentrations-Gradient von 0,02 bis 0,6 M. In den Einzelfraktionen (10 ml/Röhrehen) wird die Absorption bei 280 mu gemessen. Die Fraktionen F-I (Röhrchen Nr. 91 bis 104) und F-II (Röhrchen Nr. 105 bis 130) entsprechend demHaupt-Peak werden gesammelt und getrennt weiter verarbeitet. Der Hauptteil des Lösungsmittels wird durch Evakuieren entfernt und der Rückstand zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet. F-I bzw. F-n machen 100 bzw. 180 mg des deblockierten Heptacosapeptids aus.
F-II wird auf Carboxymethylcellulose in der oben beschriebenen Weise nochmals chromatographiert, wobei man F-II-1 (80 mg) und F-II-2 (85 mg), entsprechend der ersten Hälfte und dem Rest des Haupt-Peaks, erhält. F-I und F-II-1 werden zusammengegeben (180 mg) und nochmals chromatgraphiert, wobei man das gewünschte Peptid in guter Reinheit erhält, was durch Dünnschicht-Chromatographie auf einer Cellulose-Platte und unter Verwendung des Lösungsmittelsystems n-Butanol/Essigsäure/Py- ridin/Wasser (Volumenverhältnis 30 : 6 : 20 : 24) festgestellt wird. Eine 147 mg-Portion des erhaltenen Produktes wird auf einer Carboxymethyl-Cellulose-Säule (2, 0 x 30 cm) und unter Verwendung eines Ammonium-
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phiert.
Die einem isolierten Peak entsprechenden Fraktionen werden zusammengegeben, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei man das reine Heptacosapeptid erhält. Ausbeute 100 mg.
[a] -89, 2 zh 2, 5 (c = 0, 53, 0, 1 n Essigsäure),
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1 cm ^ 0, lN-NaOH 282 mp, (El% 23 0) 288 mg (El% 23, 8). max. 1 cm 1 cm
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man das gewünschte Heptacosapeptid, das mit dem gemäss Beispiel 1 erhaltenem identisch ist.