CH651057A5 - Lineare peptid-verbindungen mit antigener wirkung. - Google Patents
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Description
**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **.
PATENTANSPRÜCH E
1. Antigene Peptidverbindungen, aufgeführt in der Sequenz von den N-terminalen zu den C-terminalen Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp-Lys, b) Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Ans-Leu-Val- Pro-Glu-Asp-Lys Leu, c) Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp-Lys Leu-Ser, d) Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val- Pro-Glu-Asp- Lys Leu-Ser-Arg, e) Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp Lys, f) Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp Lys-Leu, g) Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Prn-Glu-Asp- Lys-Leu-Ser, h) Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp- Lys-Leu-Ser-Arg, i) lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg, j) lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val,
k) Gly-lle-Ser-Gly-Phe- Pro-Val-Gly-Arg, I) Gly-lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val, m) Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-l le-Gly-Thr-Asp-Lys und n) Cys-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-lle-Gly-Thr-Asp-Lys, worin Gly Glycin darstellt und Glu, Gln, Leu, Ile, Asn, Val, Pro, Asp, Lys, Ser, Arg, Cys, Phe, Ala und Thrjeweils die L-Aminosäureformen von Glutaminsäure, Glutamin, Leucin, Isoleucin, Asparagin, Valin, Prolin, Asparaginsäure, Lysin, Serin, Arginin, Cystein, Phenylalanin, Alanin und Threonin darstellen.
2. Peptidverbindungen (a) bis (h) gemäss Anspruch 1, welche die Sequenz aus 12 Aminosäuren von (a) enthalten.
3. Die Peptidverbindung (e) gemäss Anspruch 1.
4. Die Peptidverbindungen (i) bis (I) gemäss Anspruch 1, welche die Sequenz von 8 Aminosäuren gemäss (i) enthalten.
5. Die Peptidverbindung (I) gemäss Anspruch 1.
6. Die Peptidverbindungen (m) und (n) gemäss Anspruch
1.
7. Die Peptidverbindung (n) gemäss Anspruch 1.
Die antigene Wirkung von Säugetierspermatozoen ist seit ielen Jahren bekannt. Kürzlich wurde gezeigt, dass Säugetiersperma ein antigenes Enzym enthält, welches als G-lso- zym der Lactatdehydrogenase (LDH-X, LDH-C4) bekannt ist.
LDH-C4 wurde in reiner kristalliner Form aus Mäusehoden isoliert (Goldberg [1972], J. Biol. Chem. 274; 2044-2048). Das Enzym hat ein Molekulargewicht von 140,000 und besteht aus vier identischen C-Untereinheiten. Die Aminosäuresequenz und dreidimensionale Struktur von LDH-C4 ist von einer Anzahl von Forschern untersucht und teilweise bestimmt worden. Vgl. Musick et al. (1976), J. Mol. Biol. 104; 659-668; und Wheat et al. (1977), Biochem. & Biophys. Res. Comm., 74, Nr. 3; 1066-1077. Wheat et al. bestimmten die Sequenzen des essentiellen Thiolpeptids von Aminosäure 159 bis 171 und fanden es nahezu identisch mit dem essentiellen Thiolpeptid aus anderen Wirbeltier-LDH-lsozymen.
1974 fasste Dr. Erwin Goldberg die Wirkungen der Immunisation mit LDH-C4) auf die Fruchtbarkeit zusammen und äusserte die Möglichkeit, dass durch die Verwendung bestimmter makromolekularer Bestandteile des Spermas es möglich sein müsste, ihre Primärstruktur durch die Aminosäuresequenz zu erläutern, speziell die antigene Determinante(n) aufzuzeichnen, die verantwortlich ist für die Erzeugung von Unfruchtbarkeit, und dann synthetische Peptide zu entwickeln, die diese Determinanten enthalten. Der Besitz der Fähigkeit, ein Molekül mit solchen Eigenschaften zu synthetisieren, macht es möglich, die Fruchtbarkeitskontrolle immunologisch anzugehen (Karolinksa Symposia on Research Methods in Reproductive Endocrinology, 7th Symposia: Immunological Approaches to Fertility Control, Geneva, 1974, 202-222).
Solche synthetischen antigenen Peptide blieben jedoch ein Ziel und wurden nicht vollendet, obwohl ihre theoretische Erwünschtheit erkannt worden ist. 1979 fasste Dr. Erwin Goldberg den Stand der Technik wie folgt zusammen: Als Folgerung und auf einer praktischen Grundlage erfordert die Immuntherapie zur Geburtenkontrolle mehr als Wirksamkeit, Spezifität, Reversibilität und Fehlen von systemischen Nebenreaktionen. Ziemlich grosse Mengen der Antigene müssen in unzweideutig reiner Form zur Verfügung stehen. Diese Bedingung kann voraussichtlich nicht durch ein natürliches Enzymantigen aus Sperma oder Hoden erfüllt werden. Vielmehr benötigt die Technologie der Empfängnisverhütung ein synthetisierbares Peptidfragment, welches die antigenen Eigenschaften enthält und eine Reaktion hervorruft, welche die Fruchtbarkeit verhindert.
Die Vollendung der Strukturanalyse von LDH-C4 sollte es möglich machen, die antigenen Determinanten aufzuzeichnen und die Synthese solcher Peptide zur Verwendung in einer neuen schwangerschaftsverhütenden Technologie zu ermöglichen. (Recent advances in Reproduction and Regulation of Fertility, G.P.
Tal war, Herausgeber; Elsevier/North Holland; Biomedical Press, 1979.)
Es wurde nun gefunden, dass stark antigene Peptide hergestellt werden können, indem man lineare Aminosäuresequenzen synthetisiert, wobei angenommen wird, dass die Sequenzen mit der Aminosäuresequenz übereinstimmen, die im natürlichen LDH-C4-Enzym vorkommt.
Diese Sequenzen enthalten: Glutaminsäure-Glutamin-Leucin-lsoleucin-Gluta- min-Asparagin-Leucin-Valin-Prolin-Glutaminsäure-Asparag- insäure-Lysin, wobei angenommen wird, dass dies den Aminosäuren 5 bis 16 von LDH-C4 entspricht; Isoleucin-Serin Glycin-Phenylalanin-Prolin-Valin-Glycin-Arginin, von dem angenommen wird, dass es dem Aminosäuren 152 bis 159 der LDH-C4 entspricht; und Serin-Leucin-Asparagin-Prolin-Ala nin-lsoleucin-Glycin-Threonin-Asparaginsäure-Lysin, wobei angenommen wird, dass dies den Aminosäuren 211 bis 220 des LDH-C4 entspricht. Die Folge 152 bis 159 entspricht der publizierten unsicheren Aufzeichnung von LDH-C4, die Folgen 5 bis 16 und 211 bis 220 tun dies nicht. Vgl. Musick et al.
(August 25, 1979), J. Biol. Chem., 254, Nr. 16: 7621-7623.
Aus diesem Artikel ist eine Teilaufzeichnung der Aminosäuresequenzen des Enzyms LDH-C4 bekannt. Von den synthetischen Peptidverbindungen, auf die sich die vorliegende
Patentanmeldung bezieht, beschreiben Musick et al. lediglich die Sequenz 152-159. Musick et al. beschreiben andere Sequenzen für die Aminosäuren 5 bis 16 oder 211 bis 220.
Ausserdem erwähnen Musick et al. nirgends, dass Aminosäuresequenzen von LDH-C4 antigene Eigenschaften besitzen, die als unfruchtbar machende Vakzine anwendbar sind.
Der Kurzbericht 41298 g in Chemical Abstract (Vol. 78,
1973) von Johnson hat nichts mit dem Gegenstand der Erfindung zu tun. Es ist natürlich bekannt, dass Polypeptidverbindungen antigene Sequenzen von Aminosäuren enthalten.
Der Kurzbericht bezieht sich auf eine theoretische Studie, die besagt, dass herausgefunden wurde, dass einige Sequenzen eines Polypeptids gewisse Antikörper binden können. Das
Polypeptid war kein LDH-C4 und die beschriebenen antigenen Sequenzen haben nichts zu tun mit den synthetischen
Peptiden nach der Erfindung.
Der Kurzbericht 128346 W in Chemical Abstract (Vol. 95.
1981) von Hensel bezieht sich auf eine Studie der bakteriellen L-Lactat-Dehydrogenase, die ein Typus eines LDH-Enzymes ist. Es wurde festgestellt. dass Differenzen bestehen von Aminosäure-Positionen 165 und 166 von LDH in bezug auf die prokaryotische und eukaryotische Form der Enzyme. Daraus ist kein Hinweis auf die Sequenzen von synthetischen Peptiden nach der vorliegenden Erfindung zu entnehmen.
Verbindungen, die die oben bezeichneten antigenen Sequenzen verkörpern, umfassen die folgende speziellen Verbindungen: a) N-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp Lys-C, b) N-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp- Lys-Leu-C, c) N-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp- Lys- Leu-Ser-C, d) N-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp Lys-Leu-Ser-Arg-C, e) N-Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu- Asp-Lys-C, f) N-Cys-Glu-Gln-Leu-l le-Gln-Asn-Leu-Val- Pro-Glu- Asp-Lys-Leu-C, g) N-Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu- Asp-Lys-Leu-Ser-C, h) N-Cys-Glu-Gln-Leu- lle-Gln-Asn-Leu-Val- Pro-Glu- Asp-Lys- Leu-Ser-Arg-C,
i) N-lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-C, j) N-lle-Ser-Gly-Phe- Pro-Val-Gly-Arg-Val-C, k) N-Gly-lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-C,
1) N-Gly-lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val-C, m) N-Ser-Leu-Asn- Pro-Ala-lle-Gly-Thr-Asp-Lys-C, n) N-Cys-Ser- Leu-Asn-Pro-Ala- lle-Gly-Thr-Asp-Lys-C.
In den vorstehenden Formeln bedeutet der Buchstabe N die N-terminale Aminosäure, während der Buchstabe < (C die C-terminale Aminosäure bedeutet. Gly bedeutet Glycin und Glu, Gln, Leu, lle, Asn, Val, Pro, Asp, Lys, Ser, Arg, Cys, Phe. Ala und Thr geben entsprechend die L-Aminosäureformen von Glutaminsäure, Glutamin. Leucin, Isoleucin, Asparagin, Valin, Prolin, Asparaginsäure, Lysin, Serin, Arginin, Cystein, Phenylalanin, Alanin und Threonin wieder.
Wie man sieht. enthalten die Verbindungen (a) bis (h) die Sequenz aus 12 Aminosäuren, die mit Glutaminsäure beginnt und mit Lysin endet, von der angenommen wird, dass sie den Aminosäuren 5 bis 16 von LDH-C4 entspricht. Es wird angenommen, dass die zusätzlichen Aminosäuren der Verbindungen (b), (c) und (d) den nächsten Aminosäuren von LDH-C4 entsprechen, d.h. den Nummern 16, 17 und 18. Die Verbindung (d) würde demnach die Aminosäuren der Folge 5 bis 18 enthalten. Die Verbindungen (e) bis (h) enthalten die gleichen antigenen Sequenzen wie die Verbindungen (a) bis (d), wobei Cystein am N-terminalen Ende angefügt ist, um die Koppe lung der Verbindungen an Proteine bei der Herstellung antigener Impfstoffe zu erleichtern.
In der gleichen Weise enthält die Verbindung (n) die gleiche antigene Sequenz der Verbin dung (m) mit der Ausnahme, dass Cystein an das N-terminale
Ende aus denselben Gründen angefügt ist.
Die Verbindungen (i) bis (1) enthalten die Sequenz aus 8
Aminosäuren, die mit Isoleucin beginnt und mit Arginin endet. In Verbindung (j) ist Valin am C-terminalen Ende angefügt, um als Spacer-Aminosäure zu wirken und dadurch die Immunogenität zu verstärken. Diese bringt die antigene
Bindungsstelle weiter von der freien Carboxylgruppe weg.
Alternativ oder zusätzlich kann Glycin an das N-terminale
Ende angefügt werden. um als Spacer zur Verbesserung der
Immunogenität zu dienen, wie es in den Verbindungen (k) und (I) vorgesehen ist. Andere Aminosäuren können in ähnli cher Weise als Spacer an den terminalen Enden der antigenen
Sequenzen, die oben beschrieben sind, benutzt werden. Wei terhin ist es für die Fachleute der Immunologie offensichtlich.
dass andere C- und N-terminale Aminosäuren ausgetauscht würden können, wobei die antigene Wirkung beibehalten oder erhöht wird. Die bevorzugten Verbindungen sind jedoch diejenigen, die oben angeführt sind. Es wird angenommen, dass die Verbindungen (a) bis (h) besonders wirkungsvoll sind.
Peptidverbindungen der vorliegenden Erfindung können aus ihren Ausgangsaminosäuren synthetisiert werden. Beispielsweise kann die Synthese nach der Festphasenmethode von Merrifield durchgeführt werden, die in J.A.C.S. 85; 2149-2154(1963), beschrieben ist. Diese Festphasenmethode zur Herstellung von Aminosäuresequenzen wird auch von Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis (W.H.
Freeman und Co., San Francisco, 1969), Seiten 1-4, beschrieben. Nach dieser Methode wird die C-terminale Aminosäure, beispielsweise Lysin bei Verbindungen (a) und (e) oder Leucin bei Verbindungen (b) und (f), an chlormethylierte Polysty rol-Divinylbenzol-Copolymer-Perlen angefügt. Die jeweils folgende Aminosäure, die mit einer geeigneten Schutzgruppe versehen ist, wird dann stufenweise zu der wachsenden Kette hinzugefügt. Die Schutzgruppe kann beispielsweise eine Carbobenzoxygruppe sein, wie es in dem Merrifield-Artikel beschrieben ist. Durch die Massnahmen des Koppelns, Abspaltens der Schutzgruppe und Ankoppeln der nächsten Aminosäure kann die gewünschte Aminosäuresequenz und Kettenlänge hergestellt werden.
Als letzter Schritt wird die Schutzgruppe von der N-terminalen Aminosäure abgespalten und die C-terminale Aminosäure von dem Kunstharz entfernt, wobei ein geeignetes Reagens, beispielsweise Trifluoressigsäure oder Bromwasserstoff, benutzt wird. Die Verbindungen (a) bis (n), die oben beschrieben sind, werden nach dieser Methode hergestellt, um die Fruchtbarkeit bei den Säugetieren zu verringern.
Um die antigenen Peptide der Erfindung als fruchtbarkeitsvermindernde Impfstoffe zu benutzen, werden die Peptide an Trägermoleküle konjugiert, vorzugsweise an ein Protein, welches selbst ein Antigenreaktion hervorruft und welches sicher appliziert werden kann. Beispielsweise kann das Peptid an Tetanustoxoid gekoppelt werden, welches für die intramuskuläre Injektion vorgesehen ist. Beispielsweise wird eine Mischung aus 1 uMol Tetanustoxoid 60 uMol antigenem Peptid und 18 mMol l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-car- bodiimid-Hydrochlorid in Wasser (pH 6)12 Stunden bei Raumtemperatur und 14 Stunden bei 4"C umgesetzt und ein Produkt erhalten, welches 3,5 Mol Peptid/Mol Tetanustoxoid enthält. Ein Überschuss der Reaktanten kann durch-Dialyse oder Gelfiltration entfernt werden.
Siehe Pique et al., Immunochemistry, 15,55-60(1978). Alternativ kann das Peptid unter Verwendung von Bisdiazobenzidin oder Glutaraldehyd angekoppelt werden (Bassiri et al., Endocrinology, 90, 722 [1972]).
Für intramuskuläre Injektion kann das gekoppelte Peptid in steriler isotoner Salzlösung oder einem anderen gebräuchlichen Trägerstoff suspendiert werden und, wenn gewünscht, ein Hilfsstoff zugefügt werden. Die bevorzugte Benutzung dieses Impfstoffes ist die Applikation bei Frauen. Dabei bilden sich Antikörper, die in der Eileiterflüssigkeit auftreten und eine signifikante Verminderung der Fruchtbarkeit bewirken. Die zu diesem Zwecke applizierte Menge liegt zwischen 1 und 10 mg des antigenen Peptids.
Die Peptidverbindungen dieser Erfindung und die Verfahren zu ihrer Herstellung sind in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.
Beispiel I Herstellung des Linearpeptids Cys-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp-Lys
Die Herstellung des obigen Peptids. das in der vorliegen den Beschreibung als Verbindung (e) bezeichnet ist, kann unter Verwendung der gut bekannten Festphasentechnik durchgeführt werden. Nach einem bevorzugten Verfahren wird geschütztes Lysin, welches die COOH-terminale Gruppe des obigen Peptids darstellt, an ein Kunstharz für die konventionelle Festphasenpeptidsynthese gekoppelt, beispielsweise an Chlormethylpolystyrol, welches mit 1 bis 20o Divinylbenzol vernetzt ist. Die Aminoschutzgruppe wird dann selektiv entfernt, wobei ein geeignetes Reagenz, dessen Natur von der betreffenden Schutzgruppe abhängt, verwendet wird.
Bei der bevorzugten Ausführungsform wird die t-Butyloxycarbonyl Gruppe (Boc) zum Schutz der Aminogruppe benutzt und 40"u Trifluoressigsäure in Methylenchlorid als selektives schutzgruppenabspaltendes Mittel verwendet.
Nach Abspaltung der Schutzgruppe wird das Lysin-Harz mit geschützter Asparaginsäure, vorzugsweise N-Boc-O-benzylasparaginsäure und Dicyclohexylcarbodiimid in bekannter Weise umgesetzt, um eine Peptidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Lysinrestes und der Carboxylgruppe der geschützten Asparaginsäure zu bilden.
Der Zyklus der Schutzgruppenabspaltung und Kopplung mit Aminosäurederivaten und Dicylohexylcarbodiimid wird dann wiederholt mit den übrigen Aminosäuren in der Reihenfolge der Sequenz in dem obigen Peptid. Einige der Aminosäuren benötigen zusätzliche Seitenkettenschutzgruppen neben der -Aminosäureschutzgruppe. Solche Aminosäuren und die Schutzgruppen sind folgende:
Cys(MBzl), Glu(oBzl), Asp(oBzl), Lys(CI-z).
oBzl bedeutet dabei Benzyl, Cl-z bedeutet o-Chlorbenzyloxycarbonyl, und MBzl bedeutet Methoxybenzyl.
Die Vervollständigung der Synthese ergibt das folgende Peptid, angekuppelt an Styrol-Divinylbenzol-Copolymerharz (Res):
TFA-Cys(M Bzl )Glu(oBzl)-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val Pro-Glu(o Bzl)-Asp(o Bzl)-Lys(CI-z)-Res.
Das Abspalten des Peptids vom Harz wird durch Behandlung mit flüssigem Fluorwasserstoff bewirkt, wobei gleichzeitig auch alle anderen Schutzgruppen abgespalten werden, wodurch das gewünschte Peptid entsteht.
Festphasensynthese von N-Boc-Lys(C1-z)-Harz
Die Anfügung von N-Boc-Lys(C1-z) an das Chlormethylharz wurde nach der Cäsiumsalzmethode durchgeführt. Eine Probe des Chlormethylharzes (200 g), welches 0,74 mMol Chlorid pro Gramm enthält, wird mit dem Cäsiumsalz von Boc-Lys (Cl-z) behandelt, welches man durch Neutralisation von Boc-Lysin mit Cäsiumcarbonat erhält. Ungefähr 73,8 g Boc-Lysin werden in 80% Methanol und 20% Wasser, welches mit ungefähr 29 g Cäsiumcarbonat auf einen pH 7,0 eingestellt ist, gelöst. Die erhaltene Lösung wird am Rotationsverdampfer eingetrocknet und 3mal unter Zusatz von jeweils 100 ml Xylol nachgetrocknet. Zu dem Cäsiumsalz von Boc Lys(C1-z) werden 200 g des obigen Chlormethylharzes und genügend l-Methyl-2-pyrrolidinon zugefügt, so dass das Gesamtvolumen 1,9 1 beträgt.
Die erhaltene Mischung wird 48 Stunden bei 55 "C gerührt. Das Harz wird danach gründlich mit Methanol, dann mit Wasser und erneut mit Methanol gewaschen. Das Harz wird luftgetrocknet und anschliessend im Vakuum nachgetrocknet. Nach Abspaltung des Lysins vom Harz mit Fluorwasserstoff gibt die Aminosäureanalyse nur eine Spitze, die 0,36 mMol pro Gramm entspricht.
Eine Probe des gerade beschriebenen Harzes (6,0 g) wird in folgendes Syntheseschema eingesetzt:
1. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid,
2. Entfernen der Boc-Gruppe mit 40010 Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid durch einminütiges Waschen und 20minütige Reaktion,
3. Waschen mit drei Portionen von jeweils 100 ml Methylenchlroid,
4. Waschen mit zwei Portionen von je 100 ml Isopropanol,
5. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid,
6. einminütiges Waschen von lüminütiges Neutralisieren mit 100-ml-Portionen von 10 > oigem Triethylamin in Methylenchlorid,
7. Waschen mit drei Portionen von 100 ml Methylenchlorid,
8.
Zufügen von 2,5 Äquivalenten (7,2 mMol) Boc-Aminosäure und 2,5 Äquivalenten (7,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid und zweistündigem Schütteln,
9. Waschen mit drei Portionen von jeweils 100 ml Methylenchlorid,
10. Waschen mit zwei Portionen von je 100 ml Isopropanol, 11. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid.
Der obige Zyklus wird mit den folgenden N-geschützten Aminosäuren wiederholt:
Boc-Arg(Tos)
Boc-Gly
Boc-Val
Boc-Pro
Boc-Phe
Boc-Gly
Boc-Ser(o Bzl) Boc-lle
Boc-Gly
Das ungeschützte Peptidharz wurde der Entfernung der Schutzgruppen unterworfen und ergibt ein TFA-Salz des geschützten Peptidharzes. Das getrocknete Harz wird in Gegenwart von 6 ml Anisol und 60 ml flüssigem Fluorwasserstoff bei 0 C eine Stunde gerührt. Der Fluorwasserstoff wird im Vakuum entfernt und der ölige Rückstand mit zwei Portionen von je 50 ml Ethylether gewaschen. Das Peptid wird aus dem Harz mit drei Portionen von je 50 ml einmolarer Essigsäure extrahiert und die vereinigten Filtrate lyophilisiert, wobei man 8,66 g des rohen Peptids erhält.
Eine Probe (1,5 g) wird gereinigt durch 250 Überführungen in einer Gegenstromverteilungsanlage, wobei man durch Gewinnung der entsprechenden Fraktionen 0,994 g eines hochgereinigten Peptids erhält. Das Lösungsmittelsystem der obigen Fraktionierung war Butanol:Essigsäure:Wasser mit einem Verhältnis von 4:1:5.
Die Aminosäureanalyse des Peptids nach Säurehydrolyse ergibt: Arg,,,,,. SIj)3, Prol {", Gly3.,5, Val2 Ileopx, Phelo.
Das Peptid ergibt einen Einzelfleck in zwei Systemen mit Kieselgel-Dünnschichtchromatographie. Bei diesen Systemen war die stationäre Phase Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:5) und die bewegliche Phase Chloroform:Methanol:Wasser (60:30:5). Die R°Werte des Peptids in den beiden Systemen waren 0,20 und 0,32. Bei Papierelektrophorese ergibt das Peptid einen einheitlichen Fleck, der sich auf die Kathode mit einem R°Wert von 0,54 relativ zu Pikrinsäure bewegt. Die Bedingungen der Elektrophorese waren Whatman- 3MMPapier mit einem Pyridinacetat-Puffer bei pH 5,6.
Die Verbindungen (a) bis (d) und (f) bis (h), die dieselbe Antigensequenz wie Verbindung (e) enthalten, werden in der gleichen Weise hergestellt und in der gleichen Weise charakterisiert.
Beispiel II Herstellung des linearen Peptids Gly-lle-Ser-Gly-Phe-Pro- Val-Gly-Arg-Val
Die Herstellung des obigen Peptids. das in der vorliegenden Beschreibung Verbindung (1) genannt wird, kann unter Verwendung der im Stand der Technik gut bekannten Festphasentechnik durchgeführt werden.
In einem bevorzugten Verfahern wird Valin, welches an der Aminogruppe geschützt ist und welches die COOH-terminale Gruppe des obigen Peptids darstellt, an ein bekannntes Harz für die Festphasenpeptidsynthese. beispielsweise Chlor methylpolystyrol, welches mit 1-2"" Divinylbenzol vernetzt ist. angekuppelt. Die Aminoschutzgruppe wird dann selektiv mit einem Reagens entfernt, dessen Natur von der Schutzgruppe abhängt. In der bevorzugten Ausführungsform wird t-Butyloxycarbonyl (Boc) als Aminoschutzgruppe verwendet und 40innige Trifluoressigsäure in Methylenchlorid als selektives schutzgruppenabspaltendes Mittel verwendet.
Nach Abspaltung der Schutzgruppe wird das Valinharz mit geschütztem Arginin, vorzugsweise N-Boc-N"-tosylarginin. und Dicyclohexylcarbodiimid in bekannter Weise umgesetzt. um die Peptidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Valinrestes und der Carboxylgruppe des geschützten Arginins herzustellen.
Der Zyklus der Abspaltung der Schutzgruppe und das Ankuppeln von Aminosäurederivaten mit Dicyclohexylcarbodiimed wird dann mit den übrigen Aminosäuren in der Reihenfolge der Peptidsequenz wiederholt. Einige der Aminosäuren benötigen eine Seitenkettenschutzgruppe neben der u-Aminoschutzgruppe. Solche Aminosäuren und die entsprechenden Schutzgruppen sind die folgenden:
Ser (oBzl) und Arg (Tos), oBzl bedeutet dabei Benzyl und Tos bedeutet Guanidino-p-toluolsulfonyl.
Die Vervollständigung der Synthese ergibt das folgende Decapeptid. gebunden an Styrol Divinylbenzol-Copolymerharz:
TFA Gly-lle-Ser-(oBzl)-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg(Tos) Val-Res
Das Abkuppeln des Peptids von dem Harz wird durch Behandlung mit flüssigem Fluorwasserstoff durchgeführt, wobei gleichzeitig alle Schutzgruppen mit abgespalten werden und das gewünschte Peptid entsteht.
Festphasensynthese von Gly-lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly- Arg-Val N-Boc-Val-Harz
Das Anknüpfen von N-Boc-Valin an Chlormethylharz wurde nach der Cäsiumsalzmethode durchgeführt. Eine Probe des Chlormethylharzes (200 g), welches 0,74 mMol Chlorid por Gramm enthält, wird mit dem Cäsiumsalz von Boc-Valin. welches durch Neutralisation von Boc-Valin mit Cäsiumcarbonat erhalten wurde, behandelt. Ungefähr 38.6 g Boc-Valin werden in 80 Methanol und 200o Wasser gelöst und mit ungefähr 29 g Cäsiumcarbonat auf pH 7.0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird in einem Rotationsverdampfer eingetrocknet und dreimal unter Zugabe von je 100 ml Xylol nachgetrocknet. Zu dem Cäsiumsalz des Boc-Valins werden 200 g des obigen Chlormethylharzes zugegeben und genug I-Methyl-2-pyrrolidinon, um das Volumen auf 1,90 Liter zu bringen.
Die erhaltene Mischung wird bei 55 C 48 Stunden gerührt. Das Harz wird dann gründlich mit Methanol, Wasser und erneut mit Methanol gewaschen. Das Harz wird luftgetrocknet und unter Vakuum nachgetrocknet. Nach Abspaltung des Valins vom Harz mit Fluorwasserstoff ergibt die Aminosäureanalyse eine Spitze, die 0,48 mMol pro Gramm entspricht.
Eine Probe des vorbeschriebenen Harzes (6.0 g) wird in das folgende Syntheseschema eingesetzt:
1. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid.
2. Entfernen der Boc-Gruppen mit 4Q u Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid durch einminütiges Waschen und 20minütige Reaktion,
3. Waschen mit drei Portionen von jeweils 100 ml Methylenchlorid,
4. Waschen mit zwei Portionen von je 100 ml Isopropanol,
5. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid,
6. einminütiges Waschen und 10minütiges Neutralisieren mit 100-ml-Portionen von 10''oigem Triäthylamin in Methylenchlorid,
7. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid,
8. Zufügen von 2,5 Äquivalenten (7,2 mMol) Boc-Aminosäure und 2,5 Äquivalenten (7,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid und zweistündigem Schütteln,
9. Waschen mit drei Portionen von jeweils 100 ml Methylenchlorid,
10.
Waschen mit zwei Portionen von je 100 ml Isopropanol, II. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid.
Der oben beschriebene Zyklus wurde für die folgenden N-geschützten Aminosäuren wiederholt:
Boc-Asp(oBzl) Boc-Gln
Boc-Glu(oBzl) Boc-lle
Boc-Pro Boc-Leu
Boc-Val Boc-Gln
Boc-Leu Boc-Clu(oBzl)
Boc-Asn Boc-Cys(MBzl)
Aus dem ungeschützten Peptidharz wurden die Schutzgruppen abgespalten und das TFA-Salz des geschützten Peptidharzes erhalten. Das getrocknete Harz (5,88 g) wurde mit 6 ml Anisol und 60 ml flüssigem Fluorwasserstoff bei 0 "C eine Stunde gerührt. Der Fluorwasserstoff wird im Vakuum entfernt und der ölige Rückstand zweimal mit je 50 ml Ethylether gewaschen. Das Peptid wird aus dem Harz mit drei Portionen von je 50 ml einmolarer Essigsäure extrahiert und die vereinigten Filtrate lyophilisiert, wobei 2,27 g des rohen Peptids erhalten werden.
Dies wird durch 250fache Überführung in einem Gegenstromverteilungsapparat gereinigt. Als Lösungsmittelsystem für die vorstehende Fraktionierung wird Butanol:Essigsäure:Wasser im Verhältnis 4:1:5 verwendet.
Vorgereinigte Fraktionen aus der Gegenstromverteilung werden weiter durch Säulenchromatographie an Diethylaminoethylcellulose mit einem linearen Gradienten von 0,01 bis 0,5 molarer Ammoniumbicarbonatlösung gereinigt, wobei 356 mg des reinen Peptids erhalten werden.
Die Aminosäureanalyse des reinen Peptids ergibt nach Säurehydrolyse: Lysl."., Ammoniak2.s7 Asp2'16, Glu352, Pro 6, Cys65, Val,).9" lle(,.79, Leul.s5.
Das Peptid gibt einen einheitlichen Fleck mit einem Rf Wert von 0,89 bei Cellulose-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem Butanol:Ethylacetat:Essig- säure :Wasser im Verhältnis 1:1:1:1.
Verbindungen (i) bis (k), die gleiche antigene Sequenz wie Verbindung (1) enthalten, werden in der gleichen Weise hergestellt und charakterisiert.
Beispiel III Herstellung des linearen Peptids Cys-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala 1 le-Gly-Thr-Asp-Lys
Die Synthese des obigen Peptids, das in der vorliegenden Beschreibung als Verbindung (n) bezeichnet wird, kann nach der Festphasentechnik durchgeführt werden, die im Stand der Technik gut bekannt ist. In einem bevorzugten Verfahren wird an der Aminogruppe geschütztes Lysin, welches die COOH-terminale Gruppe des obigen Peptids darstellt, an ein für die Festphasenpeptidsynthese bekanntes Harz angekuppelt, beispielsweise an Chiormethylpolystyrol, welches mit I bis 20,0 Divinylbenzol vernetzt ist. Die Aminoschutzgruppe wird dann selektiv entfernt, wobei ein geeignetes Reagens benutzt wird, dessen Natur von der verwendeten Schutzgruppe abhängt.
In einer bevorzugten Ausführung wird die t-Butyloxycarbonyl-Gruppe zum Schutz der Aminogruppe verwendet und 40%ige Trifluoressigsäure in Methylenchlorid als selektives Mittel zur Abspaltung benutzt.
Nach der Abspallung der Schutzgruppe wird das Lysin Harz mit geschützter Asparaginsäure, vorzugsweise N-Boc-Obenzylasparaginsäure, und Dicyclohexylcarbodiimid in an sich bekannter Weise behandelt, um die Peptidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Lysinrestes und der Carboxyl-Gruppe der geschützten Asparaginsäure zu bilden.
Der Zyklus der Schutzgruppenentfernung und Kupplung mit den Aminosäurederivaten und Dicyclohexylcarbodiimid wird dann mit den übrigen Aminosäuren wiederholt in der Reihenfolge des obigen Peptids. Einige der Aminosäuren hedürfen seitenkettenblockierender Gruppen neben der a-Amino-Schutzgruppe. Solche Aminosäuren und die blokkierenden Gruppen sind wie folgt:
Cys(M Bzl)
Ser-(oBzl) Thr(oBzl) Asp(oBzl) Lys(C1-z) oBzl ist Benzyl und MBzl ist p-Methoxybenzyl und Cl-z ist o-Chlorbenzyloxycarbonyl.
Die Vervollständigung der Synthese ergibt das folgende Decapeptid, gebunden an das Styrol-Divinylbenzol-Copolymerharz:
TFA-Cys(M Bzl)Ser-(o Bzl)-Leu-Asn-Pro-Ala-Ile-Gly- Thr(oBzl)-Asp(oBzl)-Lys(Cl-z)-Harz
Die Abspaltung des Peptids aus dem Harz wird durch Behandlung mit flüssigem Fluorwasserstoff durchgeführt, wobei gleichzeitig alle Schutzgruppen abgespalten werden und das gewünschte Peptid entsteht.
Festphasensynthese von Cys(M Bzl)-Ser(oBzl)-Leu-Asn Pro-Ala-lle-Gly-Thr(o Bzl)Asp(o Bzl)-Lys(CI-z)-Harz Das Anknüpfen von N-Boc-Lys(C1-z) an Chlormethylharz wird nach der Cäsiumsalz-Methode durchgeführt. Eine Probe des Chlormethylharzes (200 g), welches 0,74 mMol Chlorid pro Gramm enthält, wird mit dem Cäsiumsalz von Boc-Lys (Cl-z) behandelt, welches man durch Neutralisation von N-Boc-Lysin (Cl-z) mit Cäsiumcarbonat enthält. Ungefähr 73,8 g von N-Boc-Lysin (Cl-z) werden in 80% Methanol und 20% Wasser, welches mit ungefähr 29 g Cäsiumcarbonat auf einen pH 7,0 eingestellt ist, gelöst. Die erhaltene Lösung wird am Rotationsverdampfer eingetrocknet und 3mal unter Zusatz von jeweils 100 ml Xylol nachgetrocknet.
Zu dem Cäsiumsalz von Boc-Lys (Cl-z) werden 200 g des obigen Chlormethylharzes und genügend l-Methyl-2-pyrrolidinon zugefügt, so dass das Gesamtvolumen 1,9 1 beträgt. Die erhaltene Mischung wird 48 Stunden bie 55 "C gerührt. Das Harz wird danach gründlich mit Methanol, dann mit Wasser und erneut mit Methanol gewaschen. Das Harz wird luftgetrocknet und anschliessend im Vakuum nachgetrocknet. Nach Abspaltung des Lysins vom Harz mit Fluorwasserstoff gibt die Aminosäureanalyse nur eine Spitze, die 0,36 mMol pro Gramm entspricht.
Eine Probe des gerade beschriebenen Harzes (5,5 g) wird dem folgenden Syntheseschema unterworfen:
1. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid,
2. Entfernen der Boc-Gruppe mit 40% Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid durch einminütiges Waschen und 20minütige Reaktion,
3. Waschen mit drei Portionen von jeweils 100 ml Methy lenchlorid,
4. Waschen mit zwei Portionen von je 100 ml Isopropanol,
5. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid,
6. einminütiges Waschen und 10minütiges Neutralisieren mit 100 ml Portionen von 10 iigem Triethylamin in Methylenchlorid,
7. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid,
8. Zufügen von 2,5 Äquivalenten (7,2 mMol) Boc-Aminosäure und 2,5 Äquivalenten (7,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid und zweistündigem Schütteln,
9.
Waschen mit drei Portionen von jeweils 100 ml Methylenchlorid,
10. Waschen mit zwei Portionen von je 100 ml Isopropanol, II. Waschen mit drei Portionen von je 100 ml Methylenchlorid.
Der oben beschriebene Zyklus wurde für folgende Ngeschützte Aminosäuren wiederholt:
Boc-Asp(oBzl) Boc-Pro
Boc-Thr(oBzl) Boc-Asn
Boc-Gly Boc- Leu Boc-lle Boc-Ser(oBzl)
Boc-Ala Boc-Cys(MBzl)
Aus dem ungeschützten Peptidharz werden die Schutzgruppen abgespalten und das TFA-Salz des geschützten Peptidharzes erhalten. Eine Portion des getrockneten Harzes (6 g) wird in Gegenwart von 6 ml Anisol und 60 ml flüssigem Fluorwasserstoff bei 0 ' C eine Stunde gerührt. Fluorwasserstoff wird im Vakuum entfernt und der ölige Rückstand mit zwei Portionen von je 50 ml Ethylether gewaschen. Das Peptid wird aus dem Harz mti drei Portionen von je 50 ml einmolarer Essigsäure extrahiert und die vereinigten Filtrate lyophilisiert.
Das Peptid wird dimerisiert durch Rühren einer wässrigen Lösung bei pH 9,0 während drei Tagen in Gegenwart von Luft. Es wird danach lyophilisiert und der Gegenstromverteilung in dem System 0,1% Essigsäure:Butanol:Pyridin 11:5:3 unterworfen. Die reinsten Fraktionen werden weitergereinigt durch Säulenchromatographie an Carboxymethylcellulose in einem Ammoniumbicarbontgradienten von 0,01 molar bis 0,2 molar. Die reinsten Fraktionen wurden der Säulenchromatographie an Dietylaminoethylcellulose unterworfen, wobei ein Ammoniumbicarbonatgradient von 0,01 molar bis 0,05 molar verwendet wurde. Das reine Peptid wurde lyophilisiert und ergab 77 mg.
Die Aminosäureanalyse des Peptids nach der Säurehydolyse ergab: Lysint i4, Ammoniak56, Asparaginsäure119, Threoninll,, Serin(,)6, Prolin , Glyzinl "(, Alanin 1.07 Cystein0 5, Isoleucin(rx und Leucin0 2. Dünnschichtchromatographie an Cellulose in Butanol: Ethylacetat:Essigsäure: Wasser im Verhältnis 1:1:1:1 ergab einen RrWert von 0,64 mit einem kleinen oberen Fleck. Bei Verwendung von Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit Butanol:Pyridin: Essigsäure:Wasser im Verhältnis 15:10:3:12 war der R°Wert 0,45, ebenfalls mit einem kleinen oberen Fleck.
Papierelektrophorese auf Whatman-3MM-Papier mit Pyridin-Acetat-Puffer von pH 6,4 zeigt einen einfachen Fleck an der neutralen Position, Rr 0,20, bezogen auf Pikrinsäure.
Verbindung (m), die dieselbe antigene Sequenz enthält wie Verbindung (n), wird in der gleichen Weise hergestellt und in der gleichen Weise charakterisiert.
Claims (7)
- PATENTANSPRÜCH E 1. Antigene Peptidverbindungen, aufgeführt in der Sequenz von den N-terminalen zu den C-terminalen Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp-Lys, b) Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Ans-Leu-Val- Pro-Glu-Asp-Lys Leu, c) Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp-Lys Leu-Ser, d) Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val- Pro-Glu-Asp- Lys Leu-Ser-Arg, e) Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp Lys, f) Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp Lys-Leu, g) Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Prn-Glu-Asp- Lys-Leu-Ser, h) Cys-Glu-Gln-Leu-lle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp- Lys-Leu-Ser-Arg, i) lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg, j) lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val,k) Gly-lle-Ser-Gly-Phe- Pro-Val-Gly-Arg, I) Gly-lle-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val, m) Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-l le-Gly-Thr-Asp-Lys und n) Cys-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-lle-Gly-Thr-Asp-Lys, worin Gly Glycin darstellt und Glu, Gln, Leu, Ile, Asn, Val, Pro, Asp, Lys, Ser, Arg, Cys, Phe, Ala und Thrjeweils die L-Aminosäureformen von Glutaminsäure, Glutamin, Leucin, Isoleucin, Asparagin, Valin, Prolin, Asparaginsäure, Lysin, Serin, Arginin, Cystein, Phenylalanin, Alanin und Threonin darstellen.
- 2. Peptidverbindungen (a) bis (h) gemäss Anspruch 1, welche die Sequenz aus 12 Aminosäuren von (a) enthalten.
- 3. Die Peptidverbindung (e) gemäss Anspruch 1.
- 4. Die Peptidverbindungen (i) bis (I) gemäss Anspruch 1, welche die Sequenz von 8 Aminosäuren gemäss (i) enthalten.
- 5. Die Peptidverbindung (I) gemäss Anspruch 1.
- 6. Die Peptidverbindungen (m) und (n) gemäss Anspruch 1.
- 7. Die Peptidverbindung (n) gemäss Anspruch 1.Die antigene Wirkung von Säugetierspermatozoen ist seit ielen Jahren bekannt. Kürzlich wurde gezeigt, dass Säugetiersperma ein antigenes Enzym enthält, welches als G-lso- zym der Lactatdehydrogenase (LDH-X, LDH-C4) bekannt ist.LDH-C4 wurde in reiner kristalliner Form aus Mäusehoden isoliert (Goldberg [1972], J. Biol. Chem. 274; 2044-2048). Das Enzym hat ein Molekulargewicht von 140,000 und besteht aus vier identischen C-Untereinheiten. Die Aminosäuresequenz und dreidimensionale Struktur von LDH-C4 ist von einer Anzahl von Forschern untersucht und teilweise bestimmt worden. Vgl. Musick et al. (1976), J. Mol. Biol. 104; 659-668; und Wheat et al. (1977), Biochem. & Biophys. Res. Comm., 74, Nr. 3; 1066-1077. Wheat et al. bestimmten die Sequenzen des essentiellen Thiolpeptids von Aminosäure 159 bis 171 und fanden es nahezu identisch mit dem essentiellen Thiolpeptid aus anderen Wirbeltier-LDH-lsozymen.1974 fasste Dr. Erwin Goldberg die Wirkungen der Immunisation mit LDH-C4) auf die Fruchtbarkeit zusammen und äusserte die Möglichkeit, dass durch die Verwendung bestimmter makromolekularer Bestandteile des Spermas es möglich sein müsste, ihre Primärstruktur durch die Aminosäuresequenz zu erläutern, speziell die antigene Determinante(n) aufzuzeichnen, die verantwortlich ist für die Erzeugung von Unfruchtbarkeit, und dann synthetische Peptide zu entwickeln, die diese Determinanten enthalten. Der Besitz der Fähigkeit, ein Molekül mit solchen Eigenschaften zu synthetisieren, macht es möglich, die Fruchtbarkeitskontrolle immunologisch anzugehen (Karolinksa Symposia on Research Methods in Reproductive Endocrinology, 7th Symposia: Immunological Approaches to Fertility Control, Geneva, 1974, 202-222).Solche synthetischen antigenen Peptide blieben jedoch ein Ziel und wurden nicht vollendet, obwohl ihre theoretische Erwünschtheit erkannt worden ist. 1979 fasste Dr. Erwin Goldberg den Stand der Technik wie folgt zusammen: Als Folgerung und auf einer praktischen Grundlage erfordert die Immuntherapie zur Geburtenkontrolle mehr als Wirksamkeit, Spezifität, Reversibilität und Fehlen von systemischen Nebenreaktionen. Ziemlich grosse Mengen der Antigene müssen in unzweideutig reiner Form zur Verfügung stehen. Diese Bedingung kann voraussichtlich nicht durch ein natürliches Enzymantigen aus Sperma oder Hoden erfüllt werden. Vielmehr benötigt die Technologie der Empfängnisverhütung ein synthetisierbares Peptidfragment, welches die antigenen Eigenschaften enthält und eine Reaktion hervorruft, welche die Fruchtbarkeit verhindert.Die Vollendung der Strukturanalyse von LDH-C4 sollte es möglich machen, die antigenen Determinanten aufzuzeichnen und die Synthese solcher Peptide zur Verwendung in einer neuen schwangerschaftsverhütenden Technologie zu ermöglichen. (Recent advances in Reproduction and Regulation of Fertility, G.P.Tal war, Herausgeber; Elsevier/North Holland; Biomedical Press, 1979.) Es wurde nun gefunden, dass stark antigene Peptide hergestellt werden können, indem man lineare Aminosäuresequenzen synthetisiert, wobei angenommen wird, dass die Sequenzen mit der Aminosäuresequenz übereinstimmen, die im natürlichen LDH-C4-Enzym vorkommt.Diese Sequenzen enthalten: Glutaminsäure-Glutamin-Leucin-lsoleucin-Gluta- min-Asparagin-Leucin-Valin-Prolin-Glutaminsäure-Asparag- insäure-Lysin, wobei angenommen wird, dass dies den Aminosäuren 5 bis 16 von LDH-C4 entspricht; Isoleucin-Serin Glycin-Phenylalanin-Prolin-Valin-Glycin-Arginin, von dem angenommen wird, dass es dem Aminosäuren 152 bis 159 der LDH-C4 entspricht; und Serin-Leucin-Asparagin-Prolin-Ala nin-lsoleucin-Glycin-Threonin-Asparaginsäure-Lysin, wobei angenommen wird, dass dies den Aminosäuren 211 bis 220 des LDH-C4 entspricht. Die Folge 152 bis 159 entspricht der publizierten unsicheren Aufzeichnung von LDH-C4, die Folgen 5 bis 16 und 211 bis 220 tun dies nicht. Vgl. Musick et al.(August 25, 1979), J. Biol. Chem., 254, Nr. 16: 7621-7623.Aus diesem Artikel ist eine Teilaufzeichnung der Aminosäuresequenzen des Enzyms LDH-C4 bekannt. Von den synthetischen Peptidverbindungen, auf die sich die vorliegende Patentanmeldung bezieht, beschreiben Musick et al. lediglich die Sequenz 152-159. Musick et al. beschreiben andere Sequenzen für die Aminosäuren 5 bis 16 oder 211 bis 220.Ausserdem erwähnen Musick et al. nirgends, dass Aminosäuresequenzen von LDH-C4 antigene Eigenschaften besitzen, die als unfruchtbar machende Vakzine anwendbar sind.Der Kurzbericht 41298 g in Chemical Abstract (Vol. 78, 1973) von Johnson hat nichts mit dem Gegenstand der Erfindung zu tun. Es ist natürlich bekannt, dass Polypeptidverbindungen antigene Sequenzen von Aminosäuren enthalten.Der Kurzbericht bezieht sich auf eine theoretische Studie, die besagt, dass herausgefunden wurde, dass einige Sequenzen eines Polypeptids gewisse Antikörper binden können. Das Polypeptid war kein LDH-C4 und die beschriebenen antigenen Sequenzen haben nichts zu tun mit den synthetischen Peptiden nach der Erfindung.Der Kurzbericht 128346 W in Chemical Abstract (Vol. 95.1981) von Hensel bezieht sich auf eine Studie der bakteriellen **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.
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