CH661735A5 - Fragment von menschlichem nebenschilddruesenhormon-peptid. - Google Patents

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CH661735A5
CH661735A5 CH8335/81A CH833581A CH661735A5 CH 661735 A5 CH661735 A5 CH 661735A5 CH 8335/81 A CH8335/81 A CH 8335/81A CH 833581 A CH833581 A CH 833581A CH 661735 A5 CH661735 A5 CH 661735A5
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CH8335/81A
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Nobuaki Nakagawa
Shigeo Katsuragi
Kaoru Morita
Kunio Ohyama
Masahiko Taniuchi
Toshiharu Noda
Sadami Kobari
Susumu Watanabe
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Toyo Jozo Kk
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Fragment von menschlichem Nebenschilddrüsenhormon-peptid mit endständigem C der Formel I
R-Lys-Lys-Glu55-Asp-Asn-V al-Leu-V al60-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala70-Asp-Lys-Ala-Asp-Val75-Asp-Val-Leu-Thr-Lys80-Ala-Lys-Ser-Gln84-OH [I]
in welcher R die H-Tyr52-Gruppe oder die R1-Prosl-Arg52-Gruppe, Rj Wasserstoff, die H-Tyr50-Gruppe oder die R2-Ala46-Gly47-Ser48-Gln49-Arg50-Gruppe und R2 Wasserstoff, die Cys45-Gruppe oder die H-Tyr45-Gruppe darstellen, oder ein Salz davon.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen, wie in Patentanspruch 3 definiert, sowie auf die Verwendung besonderer solcher Verweiche mit einem Enzym markiert ist, in welcher Formel R' die R,'-Pro51-Arg52-Gruppe, Rj' die R2'-Ala46-Gly47-Ser48-55 Gln49-Arg50-Gruppe und R2' Wasserstoff oder die H-Cys45-Gruppe ist, unter den Peptiden der Formel I, d.h. h-PTH-[51-84], h-PTH [46-84] und [Cys45] h-PTH [45-84], als eine mit Enzym markierte Verbindung für EIA.
Die Synthese der Peptide der Formel I der vorliegenden 60 Erfindung erfolgt nach dem in Patentanspruch 3 definierten Verfahren.
Hierbei wird eine Aminosäure und/oder ein niederes Peptid durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I umgesetzt, und die Schutzgruppe für 65 die an der Reaktion unbeteiligten reaktionsfähigen Gruppen wird in der Endstufe der Reaktion entfernt. Die Kondensationsreaktion kann durch übliche Peptidsynthese durch erneutes Anbringen und Entfernen der Schutzgruppe und
Kondensation erfolgen. Die Schutzgruppen für die Synthese der Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte sind übliche Schutzgruppen für die Peptidsynthese und sind leicht entfernbar durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse.
Zum Beispiel kann die Aminogruppe auf übliche Weise geschützt werden durch eine Acylgruppe, wie die Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, p-Toluolsulfonyl- oder o-Nitro-phenylsulfonylgruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe, wie die Benzyloxycarbonyl-, o-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, o- oder p-Chlorbenzyloxycarbo-nyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl- oder p-Methoxybenzyloxy-carbonylgruppe, eine aliphatische Oxycarbonylgruppe, wie die Trichloräthyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Buto-xycarbonyl- oder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe, oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe, wie die 2-Phenylisopropo-xycarbonyl-, 2-Tolylisopropoxycarbonyl- oder 2-p-Diphe-nyl-isopropoxycarbonylgruppe. Diese Aminogruppen können geschützt werden durch Bildung des Enamins durch Reaktion mit einem 1,3-Diketon, z.B. Benzoylaceton oder Ace-tylaceton.
Die Carboxylgruppe kann geschützt werden durch Amidbildung, Hydrazidbildung oder Veresterung. Die Amidgruppe wird mit einer 3,4-Dimethoxybenzyl- oder Bis-(p-methoxyphenyl)-methylgruppe substituiert. Die Hydra-zidgruppe wird substituiert mit einer Benzyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, Trifluoracetyl-, t-Butoxycarbo-nyl-, Trityl- oder 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe. Die Estergruppe wird z.B. substituiert mit einem Alkanol, wie Methanol, Äthanol, t-Butanol oder Cyanomethylalko-hol, einem Aralkanol, wie Benzylalkohol, p-Brombenzylal-kohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,6-Dichlorbenzylalkohol, Benzhydryl-alkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brombenzoylmethylalko-hol oder p-Chlorbenzoylmethylalkohol, einem Phenol, wie 2,4,6-Trichlorphenyl, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentachlorphe-nol, p-Nitrophenol oder 2,4-Dinitrophenol, oder einem Thiophenol, wie Thiophenol oder p-Nitrothiophenol. Die Hydroxygruppe in Serin oder Tyrosin kann gegebenenfalls geschützt werden durch Veresterung oder Verätherung. Eine durch Veresterung geschützte Gruppe ist z.B. eine Acetyl-gruppe, eine Benzoylgruppe, die Benzyloxycarbonylgruppe oder Äthyloxycarbonylgruppe. Eine durch Verätherung geschützte Gruppe ist z.B. eine Benzyl-, Tetrahydropyranyl-oder t-Butylgruppe. Der Schutz der Hydroxygruppe kann erzielt werden durch eine 2,2,2-Trifluor- 1-t-butyloxycarbonyl-aminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor- 1-benzyloxycarbonylami-noäthylgruppe. Es ist jedoch nicht immer notwendig, diese Hydroxygruppen zu schützen.
Die Aminogruppe in der Guanidinogruppe in Arginin kann geschützt werden durch die Nitro-, Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Methylen-2-sulfonylgruppe. Es ist jedoch nicht immer notwendig, die Guanidinogruppe zu schützen.
Die Iminogruppe in Histidin kann durch eine Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl, Tosyl-, 2,2,2-Trifluor- 1-t-butyl-oxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor- 1-benzyloxy-carbonylaminoäthylgruppe geschützt werden, doch ist es nicht immer notwendig, die Iminogruppe zu schützen.
Die Mercaptogruppe in Cystein kann durch die Benzyl-, p-Methoxybenzyl-, p-Nitrobenzyl-, Trityl-, Benzylthiome-thyl-, Äthylcarbamoyl- oder Acetamidmethylgruppe geschützt werden.
Das Peptid der Formel I wird synthetisiert durch Kondensation von Aminosäuren oder niederen Peptiden. Beispielsweise wird eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und einer aktivierten endständigen Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid umgesetzt, welche eine freie a-Aminogruppe und eine ge661 735
schützte endständige Carboxylgruppe enthält. Andererseits kann eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter endständiger Carboxylgruppe umgesetzt werden mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier enständiger Carboxylgruppe und einer geschützten a-Aminogruppe.
Die Carboxylgruppe kann z.B. aktiviert werden durch ein Säureazid, ein Säureanhydrid, ein Säureimidazolid oder einen aktiven Ester, z.B. durch Umwandlung in einen Cya-nomethylester, Thiophenylester, p-Nitrophenylester, p-Ni-trothiophenylester, p-Methansulfonylphenylester, 2,4-Dini-trophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6-Trichlorphe-nylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidoester, 8-Hydroxychinolinester oder N-Hydroxypiperidinester, Carbodiimid, N,N'-Carbonyldi-imidazol oder ein Isoxazoliumsalz, z.B. Woodward-Reagens.
Die bevorzugten Kondensationsreaktionen sind die Car-bodiimid-, Azid-, Aktivester- und Säureanhydridmethoden. In der Kondensationsreaktion sollte eine Racemisierung sorgfältig vermieden werden, und die bevorzugten Methoden sind die Azid-, Aktivester-, Wünsch-Methode [Z. Naturforsch., 216,426 (1966)] oder die Geiger-Methode [Chem. Ber., 103, 788 (1970)], insbesondere mit N-Äthyl-N'- 3-dime-thylaminopropyl- carbodiimid (WSCI) als Kondensationsmittel.
Das geschützte h-PTH [51-84] wird vorzugsweise hergestellt durch eine modifizierte Geiger-Methode, unter Verwendung von WSCI unter Kondensation des C-endständi-gen Fragmentes 55-84 und des N-endständigen Fragmentes 51-54. Das C-endständige Fragment 55-84 wird vorzugsweise hergestellt durch Kondensation des Fragmentes 61-84 und des Fragmentes 57-60 durch die modifizierte Geiger-Methode unter Verwendung von WSCI, gefolgt von der Kondensation der 56. und 55. Aminosäure mit der erhaltenen Verbindung nach der Aktivestermethode, und schliesslich der Kondensation des Fragmentes 51-54 nach der modifizierten Geiger-Methode unter Verwendung von WSCI. Das Fragment 61-84 wird vorzugsweise durch sequenzielle Kondensation des Fragmentes 72-84 und der 71., 70. und 69. Aminosäure und des Fragmentes 62-68 und der 61. Aminosäure nach der Aktivestermethode oder der modifizierten Geiger-Methode unter Verwendung von WSCI hergestellt.
Das Fragment 62-68 wird vorzugsweise nach der Azid-methode durch Kondensation des Fragmentes 64-68 und des Fragmentes 62-63 synthetisiert. Das Fragment 72-84 wird vorzugsweise nach der modifizierten Geiger-Methode unter Verwendung von WSCI durch Kondensation des Fragmentes 77-84 und der 76., 75. und 74. Aminosäure und des Fragmentes 72-73 synthetisiert. Das Fragment 77-84 wird vorzugsweise nach der modifizierten Geiger-Methode unter Verwendung von WSCI durch Kondensation des Fragmentes 82-84 und des Fragmentes 77-81 hergestellt.
Geschütztes h-PTH [46-84] wird vorzugsweise durch Kondensation des oben genannten C-endständigen Fragmentes 55-84 und des N-endständigen Fragmentes 46-54 nach der modifizierten Geiger-Methode unter Verwendung von WSCI synthetisiert. Das N-endständige Fragment 46-54 wird vorzugsweise nach der Azidmethode mit dem Fragment 51-54 und dem Fragment 46-50 kondensiert.
Geschütztes [Tyr52] h-PTH [52-84] wird vorzugsweise nach der modifizierten Geiger-Methode unter Verwendung von WSCI mit dem oben genannten geschützten h-PTH [53-84] und dem 52. Tyrosin kondensiert.
Geschütztes [Tyr50] h-PTH[50 84] wird vorzugsweise durch Kondensation des oben genannten geschützten h-PTH [50-84] und dem 50. Tyrosin nach der modifizierten Geiger-Methode unter Verwendung von WSCI hergestellt.
Geschütztes [Tyr45] h-PTH [45-84] und geschütztes
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[Cys45] h-PTH [45-84] werden vorzugsweise durch Kondensation des oben genannten geschützten h-PTH [46-84] und der entsprechenden 45. Aminosäure nach der modifizierten Geiger-Methode unter Verwendung von WSCI hergestellt.
In der oben beschriebenen Peptidsynthese muss die C-endständige Carboxylgruppe nicht immer geschützt werden. Beispielsweise in der Kondensationsreaktion nach der Azid-oder Aktivestermethode, ist dieser Schutz nicht notwendig. Die Carboxylgruppe kann durch Veresterung, z.B. als Me-thyl-, Äthyl- oder Benzylester geschützt werden. Die Estergruppe, z.B. der Methylester, kann durch Behandlung mit verdünnter Natriumhydroxidlösung oder durch Umwandlung in das Hydrazid entfernt werden und die Benzylester-gruppe kann mit wasserfreiem Fluorwasserstoff oder durch katalytische Hydrierung entfernt werden. Die a-Aminogrup-pe des Peptides wird mit einer üblichen Schutzgruppe, z.B. einer Benzyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl- oder t-Amyl-oxycarbonylgruppe geschützt. Die Benzyloxycarbonylgruppe wird durch katalytische Hydrierung und die t-Butoxycar-bonyl- und die t-Amyloxycarbonylgruppe mittels Trifluores-sigsäure entfernt.
Bevorzugte Schutzgruppen sind: für die Hydroxylgruppe von Serin und Threonin eine Benzylgruppe; für die Hydroxylgruppe von Tyrosin eine 2,6-Dichlorbenzylgruppe; für die s-Aminogruppe von Lysin eine o-Chlorbenzyloxycarbonyl-gruppe; für die Aminogruppe in der Guanidinogruppe von Arginin eine Tosylgruppe; und für die Mercaptogruppe von Cystein eine p-Methoxybenzylgruppe. Diese Schutzgruppen können mit wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt werden. Die Acetamidmethylgruppe kann als Schutzgruppe für die Mercaptogruppe von Cystein verwendet werden. Da diese Gruppe gegenüber Fluorwasserstoff stabil ist, kann sie mit Mercuriacetat bei pH 4 dann entfernt werden, wenn die anderen Schutzgruppen abgespalten werden.
Auf diese Weise wird geschütztes h-PTH [46-84], geschütztes [Tyr52] h-PTH [52-84], geschütztes [Tyr50] h-PTH [50-84], geschütztes [Tyr45] h-PTH [45-84] und geschütztes [Cys45] h-PTH [45-84] erhalten. Diese Schutzgruppen wurden vorzugsweise durch saure Zersetzung abgespalten, z.B. in einer einstufigen Reaktion mit Hilfe von wasserfreiem Fluorwasserstoff, um die Verbindung der Formel I zu erhalten.
Wenn die Mercaptogruppe des 45. Cysteins geschützt ist durch eine Acetamidmethylgruppe, kann diese mit Mercuriacetat bei pH 4 entfernt werden nach der Entfernung der anderen Schutzgruppen mit Hilfe von wasserfreiem Fluorwasserstoff.
Die obige Verbindung der Formel I kann nach bekannten Reinigungsmethoden für Peptide gereinigt werden. Beispielsweise kann sie durch Säulenchromatographie unter Verwendung von «Sephadex LH-20» (Markenname), «Se-phadex G-50», «Dowex 1» und Carboxymethylcellulose gereinigt werden.
Das Peptid der Formel I kann in Form der freien Base oder ihres Salzes erhalten werden. Im allgemeinen wird die Base mit einer organischen Säure, z.B. Essigsäure, in ein Salz übergeführt.
Die Peptide der Formel I gemäss der vorliegenden Erfindung, z.B. h-PTH [51-84], h-PTH [46-84] und [Cys45] h-PTH [45-84] sind nützlich zur Antikörpererzeugung und zur Herstellung von mit Enzymen markierten Peptiden. Das h-PTH [46-84] und [Cys45] h-PTH [45-84] weisen einen Vorteil zur Herstellung von Antikörpern auf. H-PTH [51-84] ist besonders nützlich als Reguliermittel für die Antikörperherstellung. Ein Peptid, welches N-endständiges Tyrosin enthält, z.B. [Tyr52] h-PTH [52-84], [Tyr50] h-PTH [50-84] und [Tyr45] h-PTH [45-84] ist besonders nützlich als Markierungsmittel für RIA. Beispielsweise wurden [Tyr52] h-PTH
[52-84] oder [Tyr50] h-PTH [50-84] und Chloramin-T zu einem aliquoten Teil radioaktivem 125I in Phosphatpuffer (pH 7,4) zugesetzt, gerührt, mit Natriumbisulfid versetzt und ferner mit kleinen Mengen von Kaliumjodid und Serumalbu-s min versetzt. Die mit 125I markierten Fraktionen wurden durch Chromatographie gesammelt, um eine 125I-konjugierte Verbindung mit Tyrosinrest, d.h. die markierte Verbindung l25I-[Tyr52] h-PTH [52-84] und die markierte Verbindung I25I-[Tyr50] h-PTH [50—84] zu erhalten, welche nützlich sind io als RIA-Reagenzien.
Die Markierung von 125I und seine Adsorption an die Materialien von Immunreaktionsröhrchen unter Verwendung von [Tyr52] h-PTH [52-84] und [Tyr50] h-PTH [50-84], welche nach den anschliessend beschriebenen Beispielen er-i5 halten wurden, wird im folgenden näher beschrieben.
(1) Markierung mit 125I:
Eine Lösung (10 jj. Liter) [Tyr52] h-PTH [52-84] (2 ng) oder [Tyr50] h-PTH [50-84] (2 ng) und eine Lösung (20 jag) von Chloramin-T (3,5 mg/ml) wurden zu 0,5 M Phosphat-20 puffer (pH 7,5, 50 n Liter) zugesetzt, welcher 125I-NaI (Radioaktivität 2 mCi) enthielt, das Gemisch während 30 Sekunden gerührt und mit Natriumbisulfid (4,5 mg/ml)-Lö-sung (50 |*1) versetzt, um die Reaktion zu unterbrechen. Anschliessend wurden 0,1 N Essigsäurelösung (0,5 ml), welche 25 5% menschliches Serumalbumin enthielt, zugesetzt und das Ganze durch eine Säule (1 x 50 cm) aus «Sephadex G-25» zur Gelfiltration hindurchgeleitet, um nicht-umgesetztes 125I-Nal zu entfernen und die markierte Verbindung l25I-[Tyr52] h-PTH [52-84] und die markierte Verbindung 125I-[Tyr50] 30 h-PTH [50—84] zu erhalten (Entwickler: 0,1 N Essigsäurelösung, welche 0,5% menschliches Serumalbumin enthielt).
Die spezifische Wirksamkeit des derart erhaltenen 125I-[Tyr52] h-PTH [52-84] und 125I-[Tyr50] h-PTH [50-84] betrug 523 |x Ci/|ig bzw. 545 |i Ci/jag, und die Ausbeuten betrugen 35 75,5% bzw. 76,7%. Es wurde eine zweimal höhere spezifische Wirksamkeit und eine drei- bis viermal höhere Ausbeute erhalten im Vergleich mit der Markierung von h-PTH [1-34] oder Rinder-PTH [1—84] (extrahiertes Produkt).
(2) Adsorption von mit l25I markierter Verbindung an 40 Immunreaktionsröhrchen:
Ein aliquoter Teil (10,5 ml) 0,01 M Ammoniumacetatlö-sung (300 000 cpm), welche 125I-[Tyr52] h-PTH [52-84] oder ,25I—[Tyr50] h-PTH [50-84] enthielt, wurde in ein Immunreaktionsröhrchen gegeben, während einer bestimmten Zeit 45 stehen gelassen, das Röhrchen daraufhin entleert, mit einem Überschuss an destilliertem Wasser gewaschen und die verbliebene Radioaktivität im Röhrchen gemessen, um die Adsorption am Reaktionsröhrchen zu bestimmen.
Die Adsorptionsverhältnisse von I25I—[Tyr52] h-PTH 50 [52-84] betrugen 33,1% für «Pyrex»-Glasröhrchen (Markenname), 7,7% für «Eiken»-Röhren No. 1 (Markenname), 5,0% für «Maruemu»-Röhrchen (Markenname) und 0,5% für «Technicon»-Röhrchen (Markenname). Die Adsorptionsverhältnisse von 125I-[Tyr50] h-PTH [50—84] betrugen 55 30,8% für «Pyrex»-Glasröhrchen, 8,1% für «Eiken»-Röhr-chen No. 1, 5,5% für «Maruemu»-Röhrchen und 0,4% für «Technicon»-Röhrchen.
Das Adsorptionsverhältnis der Kontrolle I25I-Rinder-PTH [1-84] betrug 58,4% für «Pyrex»-Glasröhrchen, 15,7% 60 für «Eiken»-Röhrchen No. 1, 12,2% für «Maruemu»-Röhr-chen und 4,5% für «Technicon»-Röhrchen.
Das Adsorptionsverhältnis wird berechnet nach der folgenden Gleichung:
65
verbleibende Radio-
Adsorptionsverhältnis (%) = (cPm)
zugesetzte Radioaktivität (cpm)
x 100
(3) Stabilität:
(a) 125I—[Tyr52] h-PTH [52-84] und I25I-[Tyr50] h-PTH [50-84] wurden bei —20 °C wahrend 2 Tagen, bzw. 18 Tagen, 31 Tagen und 60 Tagen gelagert und anschliessend der Gelfiltration an «Sephadex G-50» (Säule: 1 x 30 cm, Entwickler: 0,1 M Ammoniumacetatpuffer) unterworfen. Die Radioaktivitäten wurden an den Positionen entsprechend [Tyr52] h-PTH [52-84] und [Tyr50] h-PTH beobachtet und wurden als ganz stabil befunden.
(b) Die Adsorptionsaktivitäten von 125I-[Tyr52] h-PTH [52-84] und I25I-[Tyr50] h-PTH [50-84] an Talkpuder betrug 92 bis 98% unmittelbar nach der Adsorption bei —20 °C während 2 Tagen, bzw. 18 Tagen, 31 Tagen und 61 Tagen. Es konnte keine Abnahme der Adsorptionsaktivitäten beobachtet werden.
Menschliches PTH oder sein C-endständiges Fragment kann mit EIA bestimmt werden unter Verwendung eines Peptides der Formel Ia oder eines Peptides der Formel Ib (im folgenden als Peptid Ia bzw. Peptid Ib bezeichnet).
Die zur Bestimmung von PTH mit EIA benötigten Reagenzien, wie Antiserum, Antikörper oder Enzym markierte Verbindung werden wie folgt hergestellt:
Zur Herstellung des spezifischen Antikörpers unter Verwendung des Peptides Ia wird Peptid Ia selbst oder Peptid Ia konjugiert mit Protein, z.B. BSA oder BSA behandelt mit Alkali oder Natriumlaurylsulfat und Mercaptoäthanol zwecks Spaltung der innermulekularen Disulfidgruppe, an Säugetieren, wie Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen und Mäuse zur Sensibilisierung verabreicht. Beispielsweise wird das oben genannte Peptid Ia oder seine proteinkonjugierte Verbindung vermischt mit Freund's vollständigem Adju-vans, subcutan vier- bis siebenmal mit zweiwöchigen Unterbrüchen injiziert, um die Säugetiere zu sensibilisieren. Das Serum wird von den sensibilisierten Tieren gesammelt und auf übliche Weise behandelt, z.B. zentrifugiert, um das Antiserum zu erhalten. Das Antiserum, welches eine hohe Konzentration an spezifischem Antikörper enthält, kann als solches gelagert werden, und kann in aliquoten Verdünnungen verwendet werden. Der spezifische Antikörper kann auch nach üblichen Methoden gereinigt werden, z.B. durch Aussalzen, isoelektrische Ausfällung, Dialyse, Chromatographie oder Gelfiltration.
Das proteinkonjugierte Peptid Ia kann erhalten werden durch Verwendung von polyfunktionellen Reagenzien, z.B. einer Aldehydverbindung, wie Succinaldehyd, Glutaralde-hyd oder Adipoaldehyd, einem Diisocyanat, wie Hexame-thylendiisocyanat oder 2,4-Toluoldiisocyanat, einem 3-(2'-Benzothiazolyl- dithio)- propionatsccinimidesters [japanische Offenlegungsschrift No. 55-17 302], 6-N-[3-(2'-Benzo-thiazolyl- dithio)- propionyl]- capronsäure- succinimidester und N-[2-(2'-Pyridyldithio)- äthyl]- 3-(2'-benzothiazolyl-di-thio)- propionamid [japanische Offenlegungsschrift No. 55-94 367, No. 55-133 382, No. 55-136 261], Maleinimid-benzoat-succinmididester, N,N'-Äthylen-bis-maleinsäure-amid, Bis-diazobenzidin und Diäthylmalonimidat. Diese polyfunktionellen Reagenzien können ausgewählt werden unter Berücksichtigung der funktionellen Gruppen in Peptid Ia oder Protein, wie der Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe. Ein bevorzugtes Beispiel von Peptid Ia -proteinkonjugierter Verbindung wird hergestellt aus [Cys45] h-PTH (45-84] des Peptides Ia und dem polyfunktionellen Reagens 3-(2'-Benzo-thiazolyldithio)- propionat- sccinimid-ester, um die Thiolgruppe in Cys45 zu binden.
Das bevorzugte Verhältnis für die Konjugation beträgt 1 Mol Protein, z.B. BSA, für 1 bis 20 Mil Peptid Ia. In der Reaktion wird das Peptid Ia in ein wässeriges Medium von pH 7 bis 8 zugesetzt, mit dem polyfunktionellen Reagens versetzt, unter Kühlung auf Zimmertemperatur während 1 bis 5
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Stunden reagieren gelassen und anschliessend durch Gelfiltration gereinigt. BSA wird sodann hinzugefügt, die Reaktion bei Zimmertemperatur während 1 bis 5 Stunden fortschreiten gelassen und das erhaltene Produkt durch übliche 5 Gelfiltration und Dialyse gereinigt, um das Peptid Ia konjugiert mit BSA zu erhalten.
Der oben beschriebene spezifische Antikörper kann an einen immobilisierten Träger gebunden werden, z.B. einen immobilisierten Proteinträger, wie Albumin, oder Gelatine, io ein immobilisiertes semisynthetisches Polymer, wie Agarose, Cellulose oder Dextrin, das mit Epichlorhydrin oder Brom-cyanat behandelt wurde, und Polymeren oder Copolymeren von Acrylonitril, Acrylsäure, Acrylsäureester, Methacrylat, Methacrylatester, Vinylalkohol, Vinylacetat, Aminostyrol, i5 Acrylamid oder Äthylen, unter Verwendung eines oben genannten polyfunktionellen Reagens.
Beispiele von Enzymen für die Herstellung von enzymmarkiertem Peptid Ib in EIA sind Oxidoreductase, Hydrola-se, Transferase, Lyase, Isomerase oder Ligase, z.B. Lactatde-20 hydrogenase, Malatdehydrogenase, Apfelsäuredehydrogena-se, Maltosedehydrogenase, Lactatoxidase, Malatoxidase, Glukoseoxidase, Cholinoxidase, Xanthinoxidase, Amino-säureoxidase, Sarcosinoxidase, Catalase, a-Amylase, ß-Ga-lactosidase, Lysozym, Lipase, alkalische Phosphatase, Ami-25 nopeptidase, Tripsin, Papain, a-Chymotrypsin, Amidase, Hexokinase und Glycerokinase. Vorzugsweise kann ein «Spacer» zuvor in diese Enzyme eingeführt werden. Beispiele sind Dialdehyde, wie Glutaraldehyd, reaktionsfähige Derivate, wie co-Äminoessigsäurechlorid, Diamine, wie eine Bin-30 dung von Dialdehyd oder Dicarbonsäure und Hexamethy-lendiamin oder Decamethylenamin, S-Acetylmercaptosuc-cinanhydrid und eine Bindung von Dialdehyd und 2-Amino-äthanthiol. Die Aldehyd-, Amino- oder Thiolgruppe kann unter Verwendung der oben genannten «Spacer»-einführen-35 den Reagenzien eingeführt werden.
Ein Peptid Ib-Enzymkonjugat kann erhalten werden durch Konjugierung des Peptides Ib mit der Amino-, Hydro-xy-, Carboxyl- oder Thiolgruppe des Enzyms oder durch Einführung der Aldehyd-, Amino- oder Thiolgruppe in das 40 Enzym oder durch Einführung der Aldehyd-, Amino-,
Thiol- oder Carboxylgruppe in das Enzym unter Verwendung eines polyfunktionellen Reagens.
Eine Ausführungsform der Herstellung der enzymmarkierten Verbindung von Peptid Ib-Enzymkonjugat ist die 45 folgende: Beispielsweise wird Peptid Ib mit einem polyfunktionellen Reagens bei 0 bis 40 °C in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Äthanol, Aceton, Di-oxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid oder Tetrahy-drofuran in einem Puffer (pH 6 bis 8) oder direkt in diesen 50 organischen Lösungsmitteln umgesetzt. Das Verhältnis des Peptides Ib zum polyfunktionellen Reagens ist vorzugsweise ein äquimolares Verhältnis. Nach der Reaktion wird das Reaktionsprodukt gereinigt, falls erforderlich, und das Enzym wird damit umgesetzt, vorzugsweise in einem Puffer mit sta-55 bilem pH für das Enzym. Die Menge an Enzym ist vorzugsweise äquimolar oder etwas über der molaren Menge. Das derart hergestellte Peptid Ib-Enzymkonjugat kann durch Adsorptionschromatographie oder Gelfiltration gereinigt werden.
60 Verschiedene konventionelle EIA-Techniken können in der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von h-PTH angewendet werden. Beispiele sind die Konkurrenzmethode oder die Sandwich-Methode.
Einzelheiten der Konkurrenzmethode werden im folgen-65 den beschrieben.
Die Probe, welche das zu bestimmende h-PTH enthält, das Enzym markierte Peptid Ib und das Antiserum oder der Antikörper des Peptides Ia werden in einem Immunoreak-
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tionsmedium, z.B. einem Phosphatpuffer oder Veronalpuffer bei 4 bis 5 °C während 1 bis 3 Tagen inkubiert. Dann wird der immunologisch gebundene Teil (gebunden: B) und der nicht-gebundene freie Teil (frei: F) getrennt (B-F-Trennung). Die B-F-Trennung wird vorzugsweise durch Zusatz von normalem Serum desselben Säugetieres, das zurAntiserum-herstellung verwendet wird, und ein Antiserum dafür zugesetzt, über Nacht inkubiert, dann mit 3000 Touren pro Minute während 20 bis 30 Minuten zur B-F-Trennung zentrifu-giert. Anschliessend wird die enzymatische Aktivität der ausgefällten enzymmarkierten Verbindung (b) oder diejenige der überstehenden Flüssigkeit (F) bestimmt. In einer Festphasenmethode wird immobilisierter Antikörper verwendet für die Konkurrenzreaktion anstelle des Antiserams oder Antikörpers des Peptides Ia in der oben beschriebenen Konkurrenzmethode, worauf die B-F-Trennung durchgeführt wird und die Enzymaktivität wie oben bestimmt wird.
Auch die übliche Sandwich-Methode kann mit entsprechenden Reagenzien angewendet werden.
Das h-PTH oder sein C-endständiges Fragment kann bestimmt werden unter Verwendung des Antikörpers des Peptides Ia und des enzymmarkierten Peptides Ib mit guter Genauigkeit und auf einfache Weise. Am meisten bevorzugt wird ß-galactosidase-markiertes [Cys45] h-PTH [45-84] zur Bestimmung verwendet.
Die in der vorliegenden Beschreibung verwendeten Abkürzungen weisen die folgende Bedeutung auf: BOC: t-Butoxycarbonyl PAC: Phenacylester Bzl: Benzyl
Acm: Acetamidmethyl
Val: L:Valin
OEt: Äthylester
OBzl: Benzylester
OSU: N-hydroxysuccinimidester
Ser: L-Serin
Asn: L-Aspartinsäure
Leu: L-Leucin
MeOH: Methanol
Arg: L-Arginin
Ala: L-Alanin
Lys: L-Lysin
BuOH: Butanol
Tyr: L-Tyrosin
ToSOH: p-Toluolsulfonsäure
TFA: Trifluoressigsäure
THF: Tetrahydrofuran
NMM: N'-_Methylmorpholin
WSCI: N-Äthyl-N'-dimethylaminopropyl-carbodiimid
AOC: t-Amyloxycarbonyl
Z-Cl: o-Chlorbenzyloxycarbonyl
Tos: Tosyl
OMe: Methylester
ONP: p-Nitrophenylester
Cys: L-Cystein
Thr: L-Threonin
Glu: L-Glutaminsäure
Pro: L-Prolin
Asp: L-Aspartinsäure
Gly: Glycin
Gin: L-Glutamin
His: L-Histidin
EtOH: Äthanol
NMP: N-Methyl-2-pyrrolidon
Et3N: Triäthylamin
Äther: Diäthyläther
DMF: Dimethylformamid
TBA: Tribenzylamin
HOBT: 1-Hydroxybenzotriazol
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung. In diesen Beispielen werden die folgenden Träger und Entwicklungslösungsmittel für die Dünnschichtchromato-5 graphie [TLC] verwendet:
Träger: Silicagel-G Entwickler:
1) Chloroform-Methanol-Essigsäure (95:5:3)
2) Chloroform-Methanol-Essigsäure (85:15:5) io 3) Chloroform-Methanol-Essigsäure (85:10:5)
4) Chloroform-Methanol-Essigsäure (80:25:2)
5) Benzol-Äthylacetat (1:1)
6) Benzol-Äthylacetat (2:1)
7) Chloroform-Äthanol-Äthylacetat (5:2:5) 15 8) Chloroform-Äthanol-Äthylacetat (10:1:5)
Träger: Merck-00 Cellulose Entwickler:
9) Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (2:2:2:3) 10) Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (1:1:1:2). 20 Die Aminosäureanalyse wird wie folgt durchgeführt: Die Probe wird in 6 N -HCl (Anisol wird für geschützte Peptide zugesetzt, falls notwendig) bei 110 °C während 24 bis 45 Stunden in einem versiegelten Röhrchen hydrolysiert und das Hydrolysat sodann im Vakuum zur Trockene ver-25 dampft.
Beispiel 1
h-PTH (53-84); H-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-30 Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH
(1) P(83-84): BOC-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [1].
BOC-Gln-OBzI (181,4 g, 0,242 M) wurde in TFA
35 (270 ml) gelöst und bei Zimmertemperatur während 45 Minuten gerührt. Das TFA wurde sodann im Vakuum abdestilliert, der Rückstand mit Äther versetzt und der Niederschlag gesammelt. Der Niederschlag wurde in DMF (270 ml) gelöst und HOBT (32,67 g, 0,242 M), BOC-Ser(Bzl)-OH (67,35 g, 40 0,242 M) und WSCI (44,29 ml, 0,242 M) zu der Lösung zugesetzt und über Nacht gerührt. Das DMF wurde sodann abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat (440 ml) gelöst und anschliessend mit 1 N HCl, dann mit 5%igem Na-triumbicarbonat und schliesslich mit Wasser gewaschen. Die 45 Lösung wurde durch Zusatz von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, dann filtriert und im Vakuum getrocknet. Die Umkristallisation erfolgte aus Äthylacetat-Hexan, um die Substanz [1] (101,43 g, Ausbeute: 81,6%) zu erhalten. Schmelzpunkt: 121 bis 123 °C.
50 TLC: Rf7 = 0,75.
[a] ^ = -14,12 (c = 1,0, DMF).
Elementaranalyse: [C27H35O7N9]:
gefunden: C 62,98%, H 7,03%, N 8,01%
55 berechnet: C 63,14%, H 6,87%, N 8,18%
(2) P(82-84): BOC-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [2]: TFA (440 ml) wurden zur Substanz [1] (98,87 g,
192,5 mM) zugesetzt und bei Zimmertemperatur während 30 Minuten gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestilliert. 60 Der Rückstand wurde in DMF (330 ml) gelöst. HOBT (28,6 g), eine DMF-Lösung von BOC-Lys(Z-Cl)-OH [BOC-Lys(Z-Cl)-OH-TBA] (103,33 g, 1,1 molarer Überschuss) wurden mit Äthylacetat-1 N-HCL behandelt. Die Äthylace-tatschicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet 65 und im Vakuum zur Trockene verdampft und WSCI [38,72 ml (1,1 molarer Überschuss)] wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 2 Tagen gerührt. Das DMF wurde sodann im Vakuum abdestilliert
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und der Rückstand mit Eiswasser versetzt, worauf der gebildete Niederschlag gesammelt wurde. Die Umkristallisation erfolgte dreimal aus Äthanol-Hexan, um die Substanz [2] (111,06 g, Ausbeute: 71,2%) zu erhalten.
TLC: Rf, = 0,32, Rf7 = 0,76 Schmelzpunkt: 145 bis 147 °C
[a] p = —13,1" (C = 1,0, DMF)
Elementaranalyse: ^i^O^NsCl]:
gefunden: C 61,02%, H 6,65%, N 8,74%
berechnet: C 60,77%, H 6,47%, N 8,65%
(3) P(80—81): BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-OMe [3]: BOC-Lys(Z-Cl)-OH TBA (234,24 g) suspendiert in
Äthylacetat wurde mit 1 N-HC1 und Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Suspension wurde sodann im Vakuum zur Trockene verdampft und der Rückstand in DMF (400 ml) gelöst. H-Ala-OMe-HCl (67,0 g), HOBT (64,8 g) und WSCI (87,84 ml) wurde zur Lösung zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde sodann im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat (2 Liter) gelöst und anschliessend mit 5%igem Natriumbicarbonat, mit 1 N-HC1 und mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wurde die Lösung im Vakuum zur Trok-kene verdampft. Die Umkristallisation erfolgte aus Äthyl-acetat-Hexan, um die Substanz [3] (231,8 g, Ausbeute: 96,6%) zu erhalten.
Schmelzpunkt: 58 bis 60 °C TLC: Rf, = 0,77
[a] p = -17,16 (c = 1,0, DMF)
Elementaranalyse: [C23H34O7N3CI]:
gefunden: C 54,96%, H 6,78%, N 8,56%
berechnet: C 55,25%, H 6,85%, N 8,40%
(4) P(79-81): BOC-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-OMe [4]: Die Substanz [3] (174,99 g, 0,35 M) wurde zu TFÄ
(500 ml) zugesetzt und bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und mit 5%igem Natriumbicarbonat und anschliessend mit Wasser gewaschen. Die Lösung wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde in DMF (400 ml) gelöst. HOBT (49,95 g, 1,05 molarer Überschuss), BOC-Thr(Bzl)-OH (114,33 g, 1,05 molarer Überschuss) und WSCI (67,7 ml, 1,05 molarer Überschuss) wurden zu der Lösung zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Eiswasser versetzt. Der Niederschlag wurde gesammelt und aus heissem Äthanol umkristallisiert, um die Substanz [4] (99,31 g) zu ergeben.
Die Mutterlauge wurde im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst und viermal mit 5%igem Natriumbicarbonat, zweimal mit 1 N-HC1 und zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde die Lösung .im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde durch Silica-gelsäulenchromatographie [Entwickler: Chloroform-Äthanol-Essigsäure (5:1:5)] gereinigt, um die Substanz [4] (35,09 g) zu ergeben. Fraktionen, welche Verunreinigungen enthalten, werden in der nächsten Säulenchromatographie-Reinigungsstufe verwendet.
Die Substanz [3] (22,5 g, 45 mM) wurde zu TFA (70 ml) zugesetzt und bei Zimmertemperatur während 45 Minuten gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in DMF (50 ml) gelöst, worauf das pH durch Zusatz von NMM auf 7 eingestellt wurde. HOBT (6,68 g, 1,1 molarer Überschuss), BOC-Thr(Bzl)-OH (15,31 g, 1,1
molarer Überschuss) und WSCI (9,06 ml, 1,1 molarer Überschuss) wurden zur Lösung zugesetzt und das Gemisch über Nacht gerührt. Nach dem Abdestillieren des DMF im Vakuum wurde der Rückstand in Chloroform (200 ml) gelöst und mit 5%igem Natriumbicarbonat, mit 1 N HCl und mit Wasser gewaschen. Die Lösung wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschliessend im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde mit den obigen Fraktionen, welche Verunreinigungen enthielten, vermischt und anschliessend durch Silicagelsäulenchromatographie gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockene verdampft, zweimal aus Chloroform-Hexan umkristallisiert und ergaben die Substanz [4] (48,80 g). Gesamtausbeute: 183,2 g.
Schmelzpunkt: 132 bis 134 C TLC: Rf7 = 0,85
Elementaranalyse: [C34H4709N4C1]:
gefunden: C 59,06%, H 7,05%, N 7,41%
berechnet: C 59,08%, H 6,85%, N 8,11%
(5) P(77-78): BOC-Val-Leu-OEt [5]:
BOC-Val-OH (101,99 g, 0,47 M), H-Leu-OEt HCl
(91,98 g, 0,47 M), HOBT (63,45 g) und WSCI (86,01 ml, 0,47 M) gelöst in THF (400 ml) wurde über Nacht gerührt. Das THF wurde sodann im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in Äthylacetat (400 ml) gelöst und mit 5%igem Natriumbicarbonat, mit 1 N-HC1 und mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde die Lösung im Vakuum zur Trockene verdampft. Die Umkristallisation des Rückstandes erfolgte aus Äthylacetat-He-xan, um die Substanz [5] (153,7 g, Ausbeute: 91,2%) zu ergeben.
Schmelzpunkt: 108 bis 110 CC TLC = Rf, = 0,63
[et] q = -25,78 (c = 1,0, DMF)
Elementaranalyse: [C18H34O5N2]:
gefunden: C 60,35%, H 9,42%, N 8,39%
berechnet: C 60,31%, H 9,56%, N 7,82%.
(6) P(77-78): BOC-Val-Leu-OH [6]:
Zur Substanz [5] (134,43 g, 0,375 M), gelöst in Äthanol (400 ml) wurde 1 N-NaOH (412,5 ml, 1,1 molarer Überschuss) unter Eiskühlung zugesetzt und während 1,5 Stunden gerührt. 1 N-NaOH (37,5 g, 0,1 molarer Überschuss) wurde sodann zugesetzt und während 1 Stunde weitergerührt. 1 N-HC1 (75 ml) wurde sodann zu dem Gemisch gegeben, um das pH auf 5 einzustellen. Die Lösung wurde mit Äther gewaschen. 1 N-HC1 (400 ml) wurde zu der wässerigen Schicht zugesetzt und diese mit Äthylacetat extrahiert. Nach dem Trocknen der Äthylacetatschicht wurde diese im Vakuum zur Trockene verdampft und der Rückstand aus Äthylace-tat-Hexan umkristallisiert, um die Substanz [6] (119,66 g, Ausbeute: 96,6%) zu ergeben.
TLC: Rf, = 0,35, Rf7 = 0,58 Elementaranalyse: [Ci6H30O5N-)]:
gefunden: C 57,83%, H 9,40%, N 8,78%
berechnet: C 58,16%, H 9,15%, N 8,48%.
(7) P(77-81): BOC-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-OMe [7]:
Die Substanz [4] (182 g, 0,263 M) wurde zu TFA (500 ml) zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. Das TFA wurde abdestilliert und der Rückstand mit Hexan versetzt. Die ausgeschiedene ölige Substanz wurde durch Dekantieren abgetrennt und in DMF (350 ml) gelöst, worauf die Lösung durch Zusatz von NMM auf pH 6,5 eingestellt wurde. HOBT (42,61 g, 1,2 molarer Überschuss), die Substanz [6] (104,28 g, 1,2 molarer Überschuss) und WSCI (57,8 g, 1,2 molarer Überschuss) wurden zur Lösung zugesetzt und das Gemisch bei Zimmer-
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temperato während 1,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch verfestigte sich und konnte nicht gerührt werden; daher erfolgte ein weiterer Zusatz von DMF (200 ml), worauf das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur und während 4 Stunden bei 30 °C stehen gelassen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde sodann mit Eiswasser versetzt und der gebildete Niederschlag gesammelt, in Chloroform (2,5 Liter) gelöst und mit 5%igem Natriumbicarbonat, mit N-HC1 und Wasser gewaschen. Das Chloroform wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand aus Chloroform-Äther-Hexan umkristallisiert, um die Substanz [7] (224,68 g, Ausbeute: 94,9%) zu ergeben.
Schmelzpunkt: 219 bis 221 °C TLC: Rf! = 0,15, Rf8 = 0,68
[a] p = -11,72 (c = 1,0, DMF)
Elementaranalyse: ^sH^Oj jN6C1]:
gefunden: C 59,80%, H 7,56%, N 9,83%
berechnet: C 59,82%, H 7,48%, N 9,30%.
(8) P(77-81): BOC-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-OH[8]:
Eine 90%ige Äthanollösung (800 ml) von 1 N-KOH wurde unter Eiskühlung zu der Substanz [7] (72,3 g, 80 mM), gelöst in Chloroform (700 ml) zugesetzt und das Gemisch während 40 Minuten bei 0 bis 5 °C gerührt. 1 N-HC1 (800 ml) wurde sodann unter Eiskühlung zugesetzt und das Gemisch mit Chloroform (500 ml), welches wieder zugegeben wurde, extrahiert. Die Chloroformschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zusatz von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschliessend im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde durch Silikagelsäulen-chromatographie gereinigt [Entwickler: Chloroform-Ätha-nol-Äthylacetat (5:1:5)]. Die entsprechende Fraktion wurde im Vakuum zur Trockene verdampft und dreimal aus Chloroform-Methanol-Äther-Hexan umkristallisiert, um die Substanz [8] zu ergeben.
Die obigen Operationen wurden dreimal wiederholt, um die Substanz [7] (216,9 g) zu hydrolysieren und die Substanz [8] (156,07 g, Ausbeute 73,1%) zu erhalten.
Schmelzpunkt: 180 bis 183 °C TLC: Rf3 = 0,69
[a] p = -7,54 (c = 1,0, DMF)
Elementaranalyse: [C44H65O nN^Cl-1 /2H20] :
gefunden: C 58,94%, H 7,67%, N 9,64%
berechnet: C 58,82%, H 7,40%, N 9,35%. Aminosäureanalyse [Probe 3,1 mg/1 ml 6 N-HC1 + 0,1 ml
Anisol, hydrolysiert bei 110 °C während 45 Stunden]: Thr 0,96 (1), Ala 1, Val 0,93 (1), Leu 0,94 (1), Lys 1,01
(1).
(9) P(77-84): BOC-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [9]:
Die Substanz [2] (104,5 g, 129 mM), zugesetzt zu TFA (400 ml) wurde bei Zimmertemperatur während 40 Minuten gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der Niederschlag wurde gesammelt und in DMF (500 ml) gelöst. HOBT (20,9 g, 1,2 molarer Überschuss), die Substanz [8] (137,7 g, 1,2 molarer Überschuss), und WSCI (28,3 ml, 1,2 molarer Überschuss) wurden hinzugefügt, der pH durch Zusatz von NMM auf 7 eingestellt und das Gemisch über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch erstarrte zu einem Gel, worauf weiteres DMF (150 ml) und WSCI (12,8 ml) zugesetzt wurden, und das Gemisch über Nacht gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit Eiswasser versetzt, der Niederschlag gesammelt und fünfmal mit heissem Methanol gewaschen, um die Substanz [9] (185,36 g, Ausbeute: 90,68%) zu erhalten.
TLC: Rf2 = 0,85
[a] p = -12,84 (c= 1,0, DMF)
Elementaranalyse: [C8oH107018N nClJ:
5 gefunden: C 60,61 %, H 7,04%, N 10,38%
berechnet: C 60,75%, H 6,82%, N 9,74%. Aminosäureanalyse [Probe 3,1 mg/1 ml 6 N-HC1 + 0,1 ml Anisol, hydrolysiert bei 110 °C während 45 Stunden]: Thr 0,93 (1), Ser 0,91 (1), Glu 1,01 (1), Ala 1, Val 0,74 io(l), Leu 0,75 (1), Lys 2,01 (2).
(10) P(76-84):BOC-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys-(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [10]:
Die Substanz [9] (183,5 g, 116 mM), wurde zu TFA (500 ml) gegeben und bei Zimmertemperatur während 65 15 Minuten gerührt und das TFA sodann abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt, der ausgeschiedene Niederschlag gesammelt und im DMF (900 ml) aufgelöst. HOBT (18,8 g, 1,2 molarer Überschuss), BOC-Asp(OBzl)-OH (45,0 g, 1,2 molarer Überschuss) und WSCI (25,5 ml, 20 1,2 molarer Überschuss) wurden zugesetzt, das pH durch Zusatz von NMM auf 7 eingestellt, und das Gemisch sodann bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Eiswasser versetzt. Der ausgeschiedene Niederschlag wurde gesam-25 melt und zweimal mit heissem Methanol gewaschen. Unlösliche Stoffe wurden in heissem DMF gelöst und Äthanol zu der Lösung zugesetzt. Der Niederschlag wurde gesammelt, suspendiert und filtriert, um die Substanz [10] (205,5 g, Ausbeute: 99,14%) zu erhalten.
30 Schmelzpunkt: 259 bis 262 °C TLC: Rf2 = 0,81
[a] U = -13,7 (c = 1,0, DMF)
Elementaranalyse: [C91H ^ ! 80? ! N, iCl->] :
35 gefunden: C 61,01%, H 6,84%, N 9,54%
berechnet: C 61,16%, H 6,66%, N 9,41%.
(11) P(75-84): BOC-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [11]:
Die Substanz [10] (196,55 g, 0,11 M) wurde in TFA 40 (500 ml) gegeben, bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt und das TFA im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt, und der ausgeschiedene Niederschlag gesammelt und in DMF (1,3 Liter) gelöst. HOBT (19,3 g, 1,3 molarer Überschuss), BOC-Val-OH 45 (31,1 g, 1,3 molarer Überschuss) und WSCI (26,2 ml, 1,3 molarer Überschuss) wurden unter Rühren zugesetzt, das pH durch Zusatz von NMM auf 7 eingestellt und das Gemisch bei Zimmertemperatur gerührt. Nach 1 Stunde begann das Reaktionsgemisch zu gelieren und wurde über 50 Nacht stehen gelassen. NMP (400 ml), 2,4-Dinitrophenol (20,2 g) und WSCI (26,2 ml, 1,3 molarer Überschuss) wurden sodann zugesetzt. Die Gelierung trat nach etwa 10 Minuten ein, worauf das Gemisch über Nacht stehen gelassen wurde. Dem Reaktionsgemisch wurden dann Eis und 5%ige 55 Natriumbicarbonatlösung zugesetzt. Der Niederschlag wurde gesammelt, dreimal mit Wasser und viermal mit heissem Methanol gewaschen, um die Substanz [11] (203,75 g, Ausbeute: 98,2%) zu ergeben.
Schmelzpunkt: 267 bis 270 °C 60 TLC: Rf3 = 0,56
Elementaranalyse: [C96H,270-nN, 3C12.H20] :
gefunden: C 60,25%, H 6,78%, N 9,82%
berechnet: C 60,55%, H 6,83%, N 9,56%. Aminosäureanalyse: [Probe 3,1 mg/1 ml 6 N-HC1 + 65 0,1 ml Anisol, Hydrolyse während 48 Stunden bei 110 "C]: Asp 1,04 (1), Thr 0,83 (1), Ser 0,78 (1), Glu 1,03 (1), Ala 1,08 (1), Leu 1, Val 1,87 (2), Lys 2,19 (2).
(12) P(74-84):BOC-Asp(OBzl)-Val-As-(OBzl)-Val-Leu-
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Thr(Bzl)-Lys(Z-C 1 )-AIa-Lys(Z-C I )-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [12]: Die Substanz [11] (151,2 g, 0,08 M), gelöst in Methylenchlorid (100 ml), und TFA (450 ml) wurden bei Zimmertemperatur während 40 Minuten gerührt, worauf das TFA im Vakuum abdestilliert wurde. Dem Rückstand wurde Äther zugesetzt. DMF (500 ml) und NMF (1 Liter) wurden zum Niederschlag zugesetzt, um ihn aufzulösen. Dann wurde Eis und 5%iges Natriumbicarbonat zugesetzt. Der entstandene Niederschlag wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und zur Trockene verdampft. Ein Gemisch von DMF (500 ml) und NMP (1 Liter) wurden zum Rückstand zugesetzt, um das Material zu lösen, worauf BOC-Asp(OBzl)-OSU (44,0 g, 1,3 molarer Überschuss), HOBT (1,4 g, 0,13 molarer Überschuss) und NMM (11,4 ml, 1,3 molarer Überschuss) zur Lösung zugesetzt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen, der entstandene Niederschlag gesammelt und Methanol für die Wärmebehandlung zugesetzt. Diese Operation wurde zweimal wiederholt, um die Substanz [12] (157,6 g, Ausbeute: 94,2%) zu erhalten.
TLC: Rf3 = 0,56
Elementaranalyse: [Ci07H135O25N14Cl2]:
gefunden: C 61,35%, H 6,66%, N 9,90%
berechnet: C 61,45%, H 6,65%, N 9,38%. Aminosäureanalyse: [6 N-HCL/Anisol, 110 °C, 48 Stun-" den]:
Asp 1,86 (2), Thr 0,87 (1), Ser 0,71 (1), Glu 1,01 (1), Ala* 1,00 (1), Val 1,91 (2), Leu 1, Lsy 2,01 (2).
(13) P(72-73): BOC-Lys(Z-CL)-Ala-OH [13]:
1 N-NaOH (115,2 ml, 1,2 molarer Überschuss) wurde bei 0 °C zur Substanz [3] (48,0 g, 96 mM), gelöst in Äthanol (100 ml), zugesetzt und während 50 Minuten gerührt. 1 N-HC1 (19 ml) wurden sodann zugesetzt, um das pH auf 6 einzustellen und der Äthanol sodann abdestilliert bei 35 °C. Dem Rückstand wurde Äthylacetat, Eiswasser und 1 N-NC1 (96 ml) zugesetzt, um den Rückstand zu extrahieren. Die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zusatz von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat-Hexan umkristallisiert und ergab die Substanz [13] (45,90 g, Ausbeute: 98,4%).
Schmelzpunkt: 116 bis 119 °C TLC: Rf7 = 0,44
Elementaranalyse: [C22H32O7N3CI]:
gefunden: C 54,57%, H 6,91%, N 8,95%
berechnet: C 54,37%, H 6,64%, N 8,65%.
(14) P(72-84): BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp-(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [14]:
Methylenchlorid (60 ml) und TFA (360 ml) wurden zur Substanz [12] (125,46 g, 60 mM) zugesetzt, das Gemisch bei Zimmertemperatur während 55 Minuten gerührt und das TFA sodann abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt und der gebildete Niederschlag gesammelt. DMF (600 ml) und NMP (600 ml) wurden zugesetzt, um ihn aufzulösen. Eis und 5%iges Natriumbicarbonat wurden zugegeben. Das derart ausgefällte Material wurde gesammelt, dreimal mit Wasser, dann mit Methanol und mit Äther gewaschen und schliesslich zur Trockene verdampft. NMP (1200 ml) und DMF (600 ml) wurden zum Rückstand gegeben, um ihn aufzulösen. HOBT (10,56 g, 1,3 molarer Überschuss), die Substanz [13] (37,92 g, 1,3 molarer Überschuss) und WSCI (14,28 g, 1,3 molarer Überschuss) wurden der Lösung zugesetzt und das Gemisch während 3 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen und der gebildete Niederschlag gesammelt, dreimal mit Wasser und zweimal mit heissem Methanol gewaschen. Das Material wurde weiter mit Äther gewaschen und dann getrocknet, um die Substanz [14] (142,74 g, Ausbeute: 96,7%) zu ergeben.
Elementaranalyse: [C, 24H, 61 029N27CI3] :
gefunden: C 60,30%, H 6,79%, N 9,70%
berechnet: C 60,54%, H 6,60%, N 9,58%. Aminosäureanalyse [6 N-HC1/Anisol, 110 C, 48 Stunden]:
Asp 1,86 (2), Thr 0,85 (1), Ser 0,67 (1), Glu 1,02 (1), Ala 1,90 (2), Val 1,93 (2), Leu 1, Lys 2,93 (3).
(15) P(71-84): BOC-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp-(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [15]:
Die Substanz [14] wurde zu TFA (420 ml) zugesetzt und das Gemisch während 55 Minuten gerührt, worauf das TFA im Vakuum abdestilliert wurde. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt, der Niederschlag gesammelt und dieser in NMP (720 ml) und DMF (720 ml) gelöst. Das Gemisch wurde in Eis und 5%ige Natriumbicarbonatlösung gegossen und der derart gebildete Niederschlag gesammelt, dreimal mit Wasser, einmal mit Methanol und mit Äther gewaschen. NMP (840 ml) und DMF (840 ml) wurden sodann zugesetzt, um das Material aufzulösen. HOBT (0,732 g, 0,14 molarer Überschuss), 2,4-Dinitrophenol (11,93 g, 1,2 molarer Überschuss), BOC-Asp(OBzl)-OSU (3,18 g, 1,2 molarer Überschuss) und NMM (5,94 ml, 1,4 molarer Überschuss) wurden zur Lösung zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 2 Tagen gerührt. NMP (120 ml) und DMF (60 ml) wurden sodann erneut dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um das Material aufzulösen. BOC-Asp(OBzl)-OSU (4,56 g, 0,2 molarer Überschuss) und NMM (1,19 ml, 0,2 molarer Überschuss) wurden zur Lösung zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur weitere 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann in Eiswasser gegossen und der Niederschlag gesammelt, mit Wasser gewaschen und in heissem Methanol suspendiert. Nach dem Kühlen wurde der Niederschlag abfiltriert. Diese Operation wurde dreimal wiederholt und ergab die Substanz [15] (136,72 g, Ausbeute: 95;0%).
Elementaranalyse: [C )35H,72032N!8C13]:
gefunden: C 60,33%, H 6,55%, N 9,76%
berechnet: C 60,83%, H 6,51%, N 9,46%. Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110 °C, 48 Stunden]:
Asp 2,60 (3), Thr 0,83 (1), Ser 0,65 (1), Glu 1,00 (1), Ala 1,81 (2), Val 1,92 (2), Leu 1, Lys 2,85 (3).
(16) P(70-84): BOC-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp-(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [16]:
Die Substanz [51] wurde zu TFA (325 ml) zugesetzt, bei Zimmertemperatur während 70 Minuten gerührt und das TFA sodann im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und mit NMP (600 ml) und DMF (600 ml) versetzt, um das Material aufzulösen. Dann wurde 5%iges Natriumbicarbonat zugesetzt. Der Niederschlag wurde in NMP (720 ml) und DMF (720 ml) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (9,0 g), HOBT (0,55 g, 0,1 molarer Überschuss), BOC-Ala-OSU (17,52 g, 1,5 molarer Überschuss) und NMM (6,72 ml, 1,5 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Dann wurde weiteres BOC-Ala-OSU (2,34 g) und NMM (0,9 ml) zugesetzt und bei Zimmertemperatur während weiteren 5 Tagen gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen und der gebildete Niederschlag gesammelt und dreimal mit Wasser und zweimal mit Methanol gewaschen, um die Substanz [16] (109,78 g, Ausbeute: 98%) zu ergeben. Schmelzpunkt: über 280 C (Zersetzung)
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Aminosäureanalyse [6 N-HC1/Anisol, 110 °C, 48 Stunden]:
Asp 2,57 (3), Thr 0,84 (1), Ser 0,67 (1), Glu 1,00 (1), Ala 2,53 (3), Val 1,98 (2), Leu 1, Lys 2,79 (3).
(17) P(69-84): BOC-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [17]:
Die Substanz [16] (85,38 g, 31,2 mM) wurde zu TFA (280 ml) zugesetzt, das Gemisch bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt und das TFA sodann abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt, der gebildete Niederschlag gesammelt, durch Zusatz von DMF (540 ml) und NMP (540 ml) gelöst und die Lösung zu einem Gemisch von 5%igem Bicarbonat und Eis zugegeben. Der Niederschlag wurde dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol gewaschen. Dann wurde er in DMF (600 ml) und NMP (780 ml) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (6,89 g, 1,2 molarer Überschuss), HOBT (0,59 g, 0,14 molarer Überschuss, BOC-Glu(OBzl)-OSU (18,97 g, 1,4 molarer Überschuss) und NMM (4,8 ml, 1,4 molarer Überschuss) wurden zur Lösung zugesetzt und das Gemisch während 3 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt. BOC-Glu(OBzl)-OSU (2,71 g, 0,2 molarer Überschuss) gelöst in DMF (60 ml) und NMP (50 ml) und NMM (0,64 ml, 1,4 molarer Überschuss) wurden sodann zugesetzt und das Rühren bei Zimmertemperatur während 3 Tagen fortgesetzt. Dann wurde nochmals dieselbe Menge an BOC-Glu(OBzl)-OSU und NMM wie oben zugesetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur weiter gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen und der gebildete Niederschlag gesammelt und dreimal mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag wurde in heissem Methanol suspendiert, gekühlt und filtriert. Diese Operation wurde dreimal wiederholt, um die Substanz [17] (88,97 g, Ausbeute: 96,5%) zu ergeben.
Aminosäureanalyse [6 N-HC1/Anisol, 110 °C, 24 Stunden]:
Asp 2,66 (3), Thr 0,91 (1), Ser 0,78 (1), Glu 1,76 (2), Ala 2,65 (3), Val 1,97 (2), Leu 1, Lys 2,88 (3).
(18) P(66-68): BOC-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OBzl [18]:
WSCI (33,69 ml) wurde tropfenweise zu BOC-Leu-
0H H20 (45,64 g), H-Gly-OBzl-TosOH (61,87 g) und HOBT (24,87), gelöst in TMF (200 ml), unter Kühlen zugesetzt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert und ergab ein öliges Material, das in Äthylacetat (600 ml) gelöst und je dreimal mit 5%igem Natriumcarbo-nat, 1 N-HC1 und Wasser gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde sodann durch Zusatz von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockene verdampft, um eine ölige Substanz (69,0 g, Ausbeute: 99%) zu ergeben. Diese wurde in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, mit TFA (250 ml) bei 5 °C versetzt und während 20 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit DMF (200 ml) versetzt und durch Zugabe von NMM bei 0 °C neutralisiert. Dann wurden HOBT (20,7 g, 0,19 M), BOC-Ser(Bzl)-OH (0,56 g, 0,19 M) und WSCI (34,8 ml, 0,19 M) zugesetzt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das DMF wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat versetzt, dann mit 5%igem Natriumbicarbonat, 1 N-HC1 und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde das Gemisch im Vakuum konzentriert. Hexan wurde sodann zum Rückstand zugesetzt und der Niederschlag durch Filtrieren gesammelt. Die Umkristallisation erfolgte aus Äthylacetat-Hexan und Äthylace-tat-Äther-Hexan, wobei die Substanz [18] (72,47 g, Ausbeute: 72,0%) erhalten wurde.
Schmelzpunkt: 112 bis 113 °C TLC: Rf5 = 0,55 Elementaranalyse: [C3oH4107N3]:
gefunden: C 65,06%, H 7,75%, N 7,36%
5 berechnet: C 64,84%, H 7,44%, N 7,56%.
(19) P(65-68): BOC-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OBzl
[19]:
TFA (250 ml) wurde bei 5 C zur Substanz [18] (72,47 g, 0,13 M), gelöst in Methylenchlorid (20 ml), zugesetzt und bei io Zimmertemperatur während 20 Minuten gerührt. Das TFA wurde sodann im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und mit DMF versetzt. Dann wurde die Lösung bei 5 °C mit NMM neutralisiert.
15 Äthylacetat (200 ml) wurde zu BOC-Lys(Z-Cl)-OHTBA (70 g, 0,143 M) zugesetzt und zweimal mit 1 N-HC1 und Wasser gewaschen. Die Äthylacetatschicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das erhaltene ölige Material wurde mit DMF 20 (100 ml) versetzt, um eine DMF-Lösung von BOC-Lys-(Z-Cl)-OH zu ergeben. Zu dieser neutralisierten DMF-Lösung wurden HOBT (19,3 g), DMF-Lösung von BOC-Lys-(Z-Cl)-OH und WSCI (26,2 ml, 0,143 M) zugegeben und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das 25 DMF wurde im Vakuum abdestilliert, der Rückstand mit Äthylacetat (400 ml) versetzt und dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat, zweimal mit 1 N-HC1 und zweimal mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum kon-30 zentriert. Der Rückstand wurde mit Äther und Hexan versetzt, das derart ausgefällte Material gesammelt und aus Äthylacetat-Methanol-Hexan umkristallisiert, wobei die Substanz [19] (104 g, Ausbeute: 94,6%) erhalten wurde. Schmelzpunkt: 128 bis 130 °C 3= TLC: Rf, = 0,51, Rf2 = 0,88
Elementaranalyse: [C^HssO^NsCl]:
gefunden: C 61,96%, H 7,02%, N 7,91%
berechnet: C 62,00%, H 6,86%, N 8,22%. Aminosäureanalyse [1 ^M/6 N-HC10,3 ml, 105 °C, 20 40 Stunden]: Ser 0,92 (1), Gly 0,98 (1), Leu 1, Lys 0,99 (I).
(20) P(65-68): BOC-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OH
[20]:
Methanol (600 ml) wurde zur Substanz [19] (85,3 g) zugesetzt, unter Rühren bei 5 °C 1 N-NaOH (120 ml) hinzuge-45 fügt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 3 Stunden gerührt. Nach Zusatz von 1 N-HC1 (20 ml) bei 5 °C wurde das Methanol im Vakuum abdestilliert. 1 N-HC1 (100 ml) wurde zur wässerigen Lösung des Rückstandes bei 5 °C zugesetzt und die Lösung mit Chloroform (500 ml) ex-50 trahiert. Die Chloroformschicht wurde mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit Hexan versetzt, der Niederschlag gesammelt und aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei die Substanz [20] (66,21 g, Ausbeute: 55 87%) erhalten wurde.
Schmelzpunkt: 156 bis 158 °C TLC: Rf2 = 0,63
Elementaranalyse: [C37H52O10N5N5Cl]:
gefunden: C 58,49%, H 6,95%, N 9,09%
berechnet: C 58,30%, H 6,88%, N 9,19%. Aminosäureanalyse [1 [iM/0,3 ml, 6 N-HC1, 105 °C, 20 Stunden]: Ser 0,92 (1), Gly 0,97 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1).
(21) P(64-68):BOC-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OH [21]:
Methylenchlorid (300 ml) wurde zur Substanz [20] (66,2 g, 87 mM) zugesetzt, bei 5 °C sodann TFA (250 ml) zugegeben und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 45 Stunden gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestil60
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liert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und in DMF (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde durch Zusatz von NMM bei 5 C neutralisiert. DMF (500 ml) wurden sodann erneut zugesetzt infolge der Niederschlagsbildung. BOC-Glu(OBzl)-OSU (50 g, 113 mM) und HOBT (1,53 g, 11,3 mM) wurden zugesetzt, mit NMM neutralisiert und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in Wasser gegossen. Der derart erhaltene Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Umkristallisation erfolgte zweimal aus Aceton-Metha-nol und ergab die Substanz [21] (63,85 g, Ausbeute: 73,5%). Schmelzpunkt: 165 bis 167 °C (Zersetzung)
TLC: Rf4 = 0,72
Elementaranalyse: [C49H650|4N6C1]:
gefunden: C 59,61%, H 6,76%, N 8,31%
berechnet: C 59,00%, H 6,57%, N 8,42%. Aminosäureanalyse [0,927 mg/0,3 ml, 6 N-HC1, 105 °C, 24 Stunden]: Ser 0,92 (1), Glu 0,99 (1), Gly 0,97 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1).
(22) P(62-63): BOC-Ser(Bzl)-His-NHNH2 [22]:
THF (150 ml), H-His-OMe-2HCl (31,5 g, 0,13 M) und HOBT (17,6 g, 0,13 M) wurden zu BOC-Ser(Bzl)-OH (37 g, 0,125 M) zugesetzt. WSCI (23,8 ml, 0,13 M) wurde zu diesem Gemisch gegeben, DMF (150 ml) hinzugefügt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. HOBT (4,4 g) und WSCI (6 ml) wurden nochmals zugesetzt und dann wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum abdestilliert. Das verbliebene ölige Material wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde die Lösung konzentriert. Der Rückstand wurde mit Hexanversetzt, der Niederschlag gesammelt und aus Äthylacetat-Äther-Hexan umkristallisiert, um rohes BOC-Ser(Bzl)-His-OMe (TLC: RF3 = 0,56) (46,1 g) zu ergeben.
Das obige Produkt (44,6 g) wurde in DMF (300 ml) gelöst. Hydrazinhydrat (100%) (100 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde sodann im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde achtmal mit Äthylacetat extrahiert und der Extrakt mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und anschliessend mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde im Vakuum mit Hexan versetzt und der gebildete Niederschlag gesammelt und mittels Silicagel-Chromatographie gereinigt [Entwickler: Chloroform-Metha-nol-Äthylacetat (5:0 bis 1:5)]. Entsprechende Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum zur Trockene verdampft und aus einer kleinen Menge Benzol-Hexan umkristallisiert. Nach dem Stehenlassen im Eisschrank wurden die ausgeschiedenen Kristalle zweimal aus Äthylacetat-Methanol-He-xan umkristallisiert und ergaben die Substanz [22], Schmelzpunkt: 125 bis 129 °C TLC: Rf4 = 0,70, Rf7 = 0,14 Elementaranalyse: [C2iH30O5N6]:
gefunden: C 56,30%, H 6,98%, N 18,54%
berechnet: C 56,49%, H 6,77%, N 18,82%.
(23) P(62—68): BOC-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OH [23]:
Eine Dioxanlösung (52 ml) von 4,32 N-HC1 und Iso-amylnitril (20 ml) wurden zur Substanz [22] (33,5 g), gelöst in DMF (200 ml), bei — 50 °C zugesetzt und bei —20 °C während 10 Minuten gerührt. Et3N (31,6 ml) wurde sodann bei —50 °C zugesetzt.
Methylenchlorid (20 ml) wurde zur Substanz [21] (63,85 g, 64 mM) zugesetzt, TFA (200 ml) wurde bei 5 °C zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während
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50 Minuten gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestilliert, der ölige Rückstand mit Äther versetzt und der derart gebildete Niederschlag gesammelt, in DMF (200 ml) gelöst und mit NMM bei 5 C neutralisiert.
Die neutralisierte DMF-Lösung wurde zu der obigen, mit Triäthylamin behandelten Lösung zugesetzt und das Gemisch im Eiskasten über Nacht und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in Methanol gelöst. Die Lösung wurde in Wasser gegossen und der gebildete Niederschlag mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Umkristallisation aus DMF-Äther und das zweimalige Waschen mit Methanol ergab die Substanz [23] (59,16 g, Ausbeute:
60,1%.
Schmelzpunkt: 209 bis 214 °C (Zersetzung)
TLC: Rf4 = 0,66
Elementaranalyse: [C65H830j7N,0C1]:
gefunden: C 59,43%, H 6,58%, N 10,67%
berechnet: C 59,51%, H 6,38%, N 10,68%.
Aminosäureanalyse [1,549 mg/0,5 ml, 6 N-HC1, 105 C, 21 Stunden]: Ser 1,82 (2), Glu 1,01 (1), Gly 0,98 (1), Leu I, Lys 1,01 (1), His 0,94(1).
(24) P(62-84): BOC-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [24]:
TFA (250 ml) wurde zur Substanz [17] (75,35 g, 25,5 mM) zugesetzt und bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und in NMF (500 ml) und DMF (500 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde in Eis -5%iges Natriumbicarbonat gegossen, der Niederschlag gesammelt und mit Wasser und Methanol gewaschen. Der Niederschlag wurde sodann in NMP (1 Liter) und DMF (1 Liter) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (5,61 g, 1,2 molarer Überschuss), HOBT (4,08 g, 1,2 molarer Überschuss), die Substanz [23] (40,16 g, 1,2 molarer Überschuss) und WSCI (5,6 ml, 1,2 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 4 Tagen gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 5%iges Natriumbicarbo-nat-Eis gegossen und der Niederschlag gesammelt, mit Wasser, heissem Methanol und zweimal mit Methanol gewaschen, um die Substanz [24] (93,53 g, Ausbeute: 88,4%) zu ergeben.
Aminosäureanalyse: Asp 2,67 (3), Thr 0,81 (1), Ser 1,37 (3), Glu 2,59 (3), Gly 0,76 (1), Ala 2,68 (3), Val 2, Leu 1,74 (2) Lys 3,66 (4), His 0,66 (1).
(25) P(61-84): BOC-Glu(OBzl)-Ser(BZL)-His-Glu-(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzI)-Ala-Asp-(OBzl)Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [25]:
TFA (150 ml) wurde zur Substanz [24] (41,5 g, 10 mM) zugesetzt, das Gemisch bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt und das TFA sodann abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt, der Niederschlag gesammelt und in DMF (300 ml) und NMP (500 ml) gelöst. Die Lösung wurde in 5%iges Natriumbicarbonat-Eis gegossen und der gebildete Niederschlag mit Wasser und Methanol gewaschen. DMF (700 ml) und NMP (600 ml) wurden zugesetzt, um den Niederschlag aufzulösen. 2,4-Dinitrophenol (2,2 g, 1,2 molarer Überschuss), BOC-Glu(OBzl)-OSU (6,08 g, 1,4 molarer Überschuss), HOBT (0,23 g, 0,14 molarer Überschuss) und NMM (1,52 ml, 1,4 molarer Überschuss) wurden zugesetzt.und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. BOC-GLU(OBzl)'OSU (0,87 g, 9,2 molarer Überschuss) und NMM (0,22 ml, 0,2 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch weiter über
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Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eis - 5%iges Natriumbicarbonat gegossen und der Niederschlag gesammelt und mit Wasser und Methanol gewaschen. DMF (700 ml) und NMP (600 ml) wurden zugesetzt, um den Niederschlag aufzulösen. 2,4-Dinitrophenol (2,2 g, 1,2 molarer Überschuss), BOC-Glu(OBzl)-OSU (6,08 g, 1,4 molarer Überschuss) HOBT (0,23 g, 0,14 molarer Überschuss) und NMM (1,52 ml, 1,4 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. BOC-Glu(OBzl)-OSU (0,87 g, 0,2 molarer Überschuss) und NMM (0,22 ml, 0,2 molarer Überschuss) wurden weiter zum Reaktionsgemisch zugesetzt und das Gemisch über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eis - 5%iges Natriumbicarbonat gegossen und der ausgeschiedene Niederschlag gesammelt, vollständig mit Wasser gewaschen, dann dreimal mit heissem Methanol gewaschen, wobei die Substanz [25] (40,7 g, Ausbeute: 93,2%) erhalten wurde.
Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110 °C, 48 Stunden]: Asp 2,66 (3), Thr 0,85 (1), Ser 1,56 (3), Glu 3,14 (4), Gly 0,71 (1), Ala 2,65 (3), Val 2, Leu 1,73 (2), Lys 3,67 (4), His 0,63 (1).
(26) P(59-60): BOC-Leu-Val-OBzl [26]:
Äthylacetat (100 ml) wurde zu H-Val-OBzl-TosOH
(17,8 g, 47 mM) zugesetzt, mit 5%igem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Äthylacetat abdestilliert. Der Rückstand wurde in DMF (100 ml) gelöst. B0C-Leu-0HH20 (11,7 g, 56,4 mM), HOBT (9,3 g, 1,2 molarer Überschuss) und WSCI (10,3 ml, 1,3 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat (300 ml) gelöst und mit 5%igem Natriumbicarbonat, mit 1 N-HC1 und mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde die Lösung im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat-Hexan umkristallisiert und ergab die Substanz [26] (17,55 g, Ausbeute: 88,8%).
TLC* Rf6 = 0 85
(27) P(58-60): BOC-Val-Leu-Val-OBzl [27]:
TFA (50 ml) wurde zur Substanz [26] (17,2 g, 41 mM) zugesetzt, das Gemisch bei Zimmertemperatur gerührt und das TFA abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt, der entstandene Niederschlag gesammelt und in DMF (60 ml) gelöst. HOBT (7,7 g, 1,2 molarer Überschuss), BOC-Val-OH (1,07 g, 1,2 molarer Überschuss) und WSCI (9,0 ml, 1,2 molarer Überschuss) wurden zugesetzt, das pH durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt und das Gemisch sodann bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat (300 ml) und mit 5%igem Natriumbicarbonat mit 1 N-HC1 und mit Wasser gewaschen. Die Lösung wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trok-kene verdampft. Der Rückstand wurde zweimal aus Äthylacetat-Hexan umkristallisiert und ergab die Substanz [27] (17,38 g, Ausbeute: 81,6%).
Schmelzpunkt: 149 bis 152 °C TLC: Rf5 = 0,82
[a] p = -32,36 (c = 1,0, DMF)
Elementaranalyse: [C28H4506N3]:
gefunden: C 64,80%, H 8,81%, N 8,20%
berechnet: C 64,71%, H 8,73%, N 8,09%.
(28) P(57-60): BOC-Asn-Val-Leu-Val-OBzl [28]: TFA (50 ml) wurde zur Substanz [27] (17,15 g, 33 mM)
zugesetzt, das Gemisch bei Zimmertemperatur während 25 Minuten gerührt und das TFA sodann abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Äther versetzt und der Niederschlag gesammelt und in DMF (100 ml) gelöst. HOBT (0,62 g, 0,14 molarer Überschuss) und BOC-Asn-ONP (16,32 g, 1,4 molarer Überschuss) wurden zur Lösung zugesetzt, der pH durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt und das Gemisch 5 sodann bei Zimmertemperatur während 2 Tagen gerührt. Das DMF wurde sodann im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in 5%iges Natriumbicarbonat-Eis gegossen. Der Niederschlag wurde in Chloroform gelöst und mit 5%igem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Lösung io wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde zweimal aus Äthanol-Äther umkristallisiert, wobei die Substanz [28] (13,82 g, Ausbeute: 79,5%) erhalten wurde. TLC: Rf2 = 0,70 i5 Elementaranalyse: [C3->H5108N5]:
gefunden: C 60,83%, H 8,19%, N 11,09%
berechnet: C 60,64%, H 8,11%, N 11,05%.
(29) P(57-60): BOC-Asn-Val-Leu-Val-OH [29]:
Die Substanz [28] (13,2 g, 25 mM) wurde in Äthanol 20 (50 ml) und DMF (60 ml) gelöst. Dieser Lösung wurde 5%iges Pd/C (1 g) zugesetzt und die Lösung während 3 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde zweimal aus Äthanol-Äther umkristallisiert und ergab die 25 Substanz [29] (9,70 g, Ausbeute: 71,4%
TLC: Rf, = 0,56
Aminosäureanalyse: Asp 1,02 (1), Val 1,95 (2), Leu 1 (1). Elementaranalyse: [C^H^OgNs]:
gefunden: C 55,02%, H 8,13%, N 13,06% 30 berechnet: C 55,23%, H 8,34%, N 12,88%.
(30) P(57-84): BOC-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu-(OBzl)-Ala-Asp-(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp-(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-
35 Gln-OBzl [30]:
TFA (150 ml) wurde zu der Substanz [25] (39,75 g, 9,1 mM) zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 60 Minuten grührt. Das TFA wurde abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der entstandene Nie-40 derschlag wurde gesammelt und in DMF (600 ml) und NMP (600 ml) gelöst. Die Lösung wurde in Eis - 5%iges Natriumbicarbonat gegossen und der Niederschlag abfiltriert und dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol gewaschen. NMP (1,2 ml) und DMF (1,2 Liter) wurden zugesetzt, um 45 den Niederschlag aufzulösen. HOBT (1,60 g, 1,3 molarer Überschuss), 2,4-Dinitrophenol (2,18 g, 1,3 molarer Überschuss), die Substanz [29] (6,43 g,..l,3 molarer Überschuss) und WSCI (4,32 ml, 2,6 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 2 Ta-50 gen gerührt. Zusätzliche Substanz [29] (0,99 g, 0,2 molarer Überschuss), gelöst in DMF (100 ml), wurde zum Gemisch gegeben und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt.Das Reaktionsgemisch wurde sodann in 5%iges Natriumbicarbonat-Eis gegossen und der entstandene Niederschlag gesam-55 melt, in DMF (100 ml) suspendiert und erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden die unlöslichen Stoffe abfiltriert. Die unlöslichen Stoffe wurden weiter, wie oben, unter Erhitzen mit Methanol und Äthanol behandelt und ergaben die Substanz [30] (42,25 g, Ausbeute: 97,2%).
60 Aminosäureanalyse: Asp 3,34 (4), Thr 0,93 (1), Ser 1,60 (3), Glu 3,24 (4), Gly 0,85 (1), Ala 3, Val 3,39 (4), Leu 2,58 (3), Lys 4,24 (4), His 0,79 (1).
(31) P(56-84): BOC-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu-(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-
65 Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [31]:
TFA (150 ml) wurde zur Substanz [30] (28,7 g, 6 mM)
zugegeben und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. Das TFA wurde abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der Niederschlag wurde gesammelt und über NaOH über Nacht getrocknet. Der Niederschlag wurde sodann in DMF (300 ml) und HMP (500 ml) gelöst. HOBT (0,16 g, 0,2 molarer Überschuss) und BOC-Asp(OBzl)-OSU (5,04 g, 2 molarer Überschuss) wurden zugesetzt, das pH durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Weiteres BOC-Asp(OBzl)-OSU (2,50 g, äquimolar) wurde zugesetzt und über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen, der entstandene Niederschlag gesammelt, mit Wasser gewaschen und anschliessend in Methanol erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden unlösliche Stoffe abfiltriert. Das Erhitzen in Methanol wurde dreimal wiederholt, worauf die Substanz [31] (42,25 g, Ausbeute 97,2%) erhalten wurde.
Aminosäureanalyse: Asp 4,00 (5), Thr 0,92 (1), Ser 1,69
(2), Glu 3,57 (4), Gly 0,81 (1), Ala 3, Val 3,22 (4), Leu 2,62
(3), Lys 4,12 (4), His 0,62 (1).
(32) P(55-84): BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp-(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Aln-OBzl[32]:
TFA (150 ml) wurde zu der Substanz [31] (27,50 g, 5,5 mM) zugesetzt und bei Zimmertemperatur während 55 Minuten gerührt. Das TFA wurde abdestilliert, der Rückstand mit Äther versetzt, der gebildete Niederschlag gesammelt und über NaOH während 2 Tagen getrocknet. Der Niederschlag wurde in DMF (300 ml) und NMP (500 ml) aufgelöst. 2,4-Dinitrophenol (1,01 g, äquimolare Menge), HOBT (0,11 g, 0,15 molarer Überschuss) und BOC-Glu(OBzl)-OSU (3,10 g, 1,3 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht geröhrt. Weiteres BOC-Glu(OBzl)-OSU (3,10 g, 1,3 molarer Überschuss) wurde zugesetzt und während 2 Tagen gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eis - 5%iges Natriumbicarbonat gegossen. Der Niederschlag wurde zweimal mit 5%igem Natriumbicarbonat und dreimal mit Wasser gewaschen. Methanol wurde zum Niederschlag zugesetzt, das Gemisch erhitzt und unlösliche Stoffe nach dem Abkühlen abfiltriert. Diese Wärmebehandlung wurde dreimal wiederholt und ergab die Substanz [32] (26,77 g, Ausbeute: 93,3%).
Aminosäureanalyse: Asp 4,11 (5), Thr 0,92 (1), Ser 1,59 (3), Glu 3,99 (5), Gly 0,83 (1) Ala 3, Val 3,28 (4), Leu 2,49 (3), Lys 4,08 (4), His 0,71 (1).
(33) P(53—54): BOC-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Pac [33]:
BOC-Lys(Z-Cl)-OH.TBA (36,6 g, 75 mM) wurde in
Äthylacetat (300 ml) suspendiert und das Gemisch mit Eis -1 N-HC1 und Wasser gewaschen. Die Äthylacetatschicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum zur Trockene verdampft und der Rückstand in DMF (50 ml) gelöst. Phenylbromid (19,40 g) und Et3N (13,60 ml, 1,3 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 4 Stunden gerührt. Natri-umacetat (3,68 g, 0,5 molarer Überschuss), gelöst in Äthylacetat (500 ml), wurde zum Reaktionsgemisch zugesetzt, das anschliessend dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat, mit 1 N-HC1 und mit Wasser gewaschen wurde. Nach dem Trocknen der Äthylacetatschicht mit wasserfreiem Natriumsulfat, wurde sie im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Silicagel gereinigt [Entwickler: Benzol-Äthylacetat (2:1)] und die Fraktionen gesammelt, welche Rf, = 0,77 im Dünnschichtchroma-togramm aufwiesen und diese im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde aus Äther-Hexan umkristallisiert und ergab BOC-Lys(Z-Cl)-PAC (23,46 g, Ausbeute:
13 661 735
60,5%). Schmelzpunkt: 52 bis 53 C TLC: Rfi = 0,96.
TFA (60 ml) wurde zu dem obigen Produkt (20,68 g, 40 mM) zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur 5 während 20 Minuten gerührt. Das TFA wurde abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der Niederschlag wurde gesammelt und in DMF (50 ml) gelöst (im folgenden als DMF-Lösung A bezeichnet).
BOC-Lys(Z-Cl)-OH.TBA (23,42 g, 1,2 molarer Über-lo schuss), suspendiert in Äthylacetat (200 ml), wurde mit Eis -1 N-HC1 (200 ml) und Wasser (100 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen der Äthylacetatschicht mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde sie im Vakuum zur Trockene verdampft. Das derart erhaltene ölige Material wurde in DMF (50 ml) 15 gelöst (im folgenden als DMF-Lösung B bezeichnet).
Die DMF-Lösung B, HOBT (6,48 g, 1,2 molarer Überschuss) und WSCI (8,78 ml, 1,2 molarer Überschuss) wurden zu der DMF-Lösung A zugesetzt, durch Zugabe von NMM der pH auf 7 eingestellt und das Gemisch bei Zimmertempe-20 ratur über Nacht gerührt. Das DMF wurde im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in Äther (500 ml) gelöst und diese Lösung dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat gewaschen. Äthylacetat (300 ml) wurde zur Ätherschicht zugesetzt und diese dann zweimal mit 1 N H-Cl und dreimal mit Wasser 25 gewaschen. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde dreimal aus Äther umkristallisiert und ergab die Substanz [33] (18,74 g, Ausbeute: 57,5%). Schmelzpunkt: 72 bis 75 °C.
30 Elementaranalyse: [C^HjoO^^Cy:
gefunden: C 59,22%, H 5,98%, N 6,81%
berechnet: C 59,35%, H 6,07%, N 6,75%.
(34) P(53-54): BOC-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-OH [34]: Die Substanz [33] (4,07 g, 5 mM) wurde in Essigsäure
35 (30 ml) gelöst. Zinkpulver (20 g) Essigsäure (30 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 1,5 Stunden gerührt. Das Zinkpulver wurde abfiltriert und das Filtrat konzentriert, um die Essigsäure zu entfernen. Der Rückstand wurde in Äther (100 ml) gelöst und die Lösung 40 dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat (70 ml) extrahiert. Die wässrige Schicht wurde durch Zusatz von 1 N-HC1 unter Eiskühlung auf pH 2 eingestellt und anschliessend mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrock-45 net und im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde aus Äther-Hexan umkristallisiert und ergab die Substanz [34] (3,08 g, Ausbeute: 85,8%).
Schmelzpunkt: 59 bis 62 °C TLC: Rf2 = 0,45 50 Elementaranalyse: [C33H44O9N4CI2]:
gefunden: C 55,58%, H 6,40%, N 7,58%
berechnet: C 55,69%, H 6,23%, N 7,87%.
(35) P(53-84): BOC-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Asn-V al-Leu-V al-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu-
55 (Obzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp-(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [35]: TFA (50 ml) wurde zur Substanz [32] (7,83 g, 1,5 mM) zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 60 55 Minuten gerührt. Das TFA wurde abdestilliert, der Rückstand mit Äther versetzt und der gebildete Niederschlag gesammelt und in DMF (150 ml) und NMP (150 ml) gelöst. HOBT (0,4 g, 2,0 molarer Überschüsse, die Substanz [34] 65 (2,13 g, 2,0 molarer Überschuss) und WSCI (0,55 ml, 2,0 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch wurde bei 5 bis 10 °C während 3 Tagen gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen, der Niederschlag gesammelt, mit Wasser gewaschen und mit Methanol erhitzt.
661735
14
Nach dem Abkühlen wurden die unlöslichen Stoffe durch Filtrieren entfernt. Die Wärmebehandlung wurde dreimal wiederholt und ergab die Substanz [35] (8,31 g, Ausbeute: 95,3%).
Aminosäureanalyse: Thr 0,92 (1), Ser 1,60 (3), Glu 4,06 (5), Gly 0,85 (1), Ala 3,00 (3), Val 3,33 (4), Leu 2,48 (3), Lys 5,41 (6), His 0,70 (1).
(36) h-PTH [53-84]:
a) Die Substanz [35] (3,49 g, 0,6 mM) und Anisol (3 ml) wurden zu wasserfreiem HF (25 ml) bei 0 °C zugesetzt und das Gemisch während 75 Minuten gerührt. Nach der Reaktion wurde der HF im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Äther versetzt. Der derart gebildete Niederschlag wurde gesammelt, in 0,1 N Essigsäure (50 ml) gelöst und die Lösung durch eine Säule aus «Dowex XI» (2,7 x 35 cm) geleitet. Das Eluat wurde lyophilisiert, um das rohe Produkt (2,18 g) zu ergeben. Dieses wurde in 8 M Harnstofflösung (50 ml) gelöst, das pH durch Zusatz von wässerigem Ammoniak auf 9,5 eingestellt und die Lösung 50 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wurde über eine Säule (4,4 x 12 cm) aus CM-Cellulose, gepackt mit 8 M Harnstofflösung geleitet, mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, etwa 100 ml) eluiert und durch linear ansteigende Eluierung mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) bis 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) eluiert und dann mit 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 13,5 ml gesammelt. Jede Fraktion wurde nach der Folin-Lowry-Methode (500 nm) untersucht. Auf diese 5 Weise wurden die Fraktionen No. 30 bis 50 (Fraktion CO, die Fraktionen No. 56 bis 119 (Fraktion C2) und die Fraktionen No. 120 bis 150 (Fraktion C3) erhalten.
Jede dieser Fraktionen wurde entsalzt durch Hindurch-io leiten durch eine «Sephadex LH-20»-Säule. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 8,5 ml aufgeteilt und deren Aktivität wie oben geprüft. Fraktion Q wurde durch eine Säule (3,4 x 113 cm) geleitet, um die Fraktionen No. 31 bis 40 (Fraktion L(), die Fraktionen No. 41 bis 44 (Fraktion L2) 15 und die Fraktionen No. 45 bis 54 (Fraktion L3) zu erhalten.
Die Fraktion C2 wurde durch eine Säule (3,4 x 120 cm) geleitet und ergab die Fraktionen No. 35 bis 45 (Fraktion L]), die Fraktionen No. 46 bis 52 (Fraktion L2) und die Fraktionen No. 53 bis 60 (Fraktion L3).
20 Die Fraktion C3 wurde durch eine Säule (3,4 x 120 cm) geleitet und ergab die Fraktionen No. 31 bis 44 (Fraktion L0 und die Fraktionen No. 45 bis 52 (Fraktion L2). Jede dieser Fraktionen wurde lyophilisiert, um die in der folgenden Tabelle angegebenen Bestandteile zu ergeben.
25
Bestandteile
Aminosäureanalyse
Frak
Aus
Asp
Thr
Ser
Glu
Gly
Ala
Val
Leu
Lys
His tionen beute (mg)
(5)
(1)
(3)
(5)
(1)
(3)
(1)
(3)
(6)
(1)
C,L,
182
3.81
1.12
2.06
3.21
0.63
3
3.04
2.15
4.21
0.46
QU
353
3.79
1.01
2.07
3.71
0.79
3
3.09
2.35
4.45
0.66
c,L3
304
3.31
1.01
1.70
2.94
0.55
3
2.74
1.96
4.11
0.43
c2l,
166
4.26
1.00
2.28
4.44
0.98
3
3.57
2.80
5.67
0.87
C2L2
568
4.76
0.97
2.33
4.80
0.98
3
3.88
2.93
5.89
0.87
c2L3
120
4.19
1.04
2.03
4.02
0.82
3
3.44
2.56
4.97
0.66
c3l,
170
4.55
1.02
2.29
4.65
1.03
3
3.82
2.95
6.00
0.83
c3l2
157
4.58
0.96
2.36
4.69
1.09
3
3.81
3.00
6.49
0.95
40
b) Reinigung von C2L2:
C2L2 (565 mg), gelöst in 0,1 N Essigsäure (5 ml) wurde über eine Säule (4,4 x 70 cm) aus CM-Cellulose geleitet und durch linear ansteigende Eluierung mit 0,01 M Ammoni-umacetatlösung (8pH 4,5, 500 ml) - 0,1 M Ammoniumace-tatlösung (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Portionen von je 6,0 ml fraktioniert und jede Fraktion nach der Folin-Lowry-Methode geprüft. Es wurden die Fraktionen No. 113 bis 136 (Fraktion QL^Q), die Fraktionen No. 137 bis 151 (Fraktion C2L2-C2) und die Fraktionen No. 152 bis 190 (Fraktion Q,C12-:CI3) erhalten.
Jede dieser Fraktionen wurde mit einer «Sephadex LH-20»-Säule entsalzt. Die Eluate wurden in Fraktionen von je 5,2 ml gesammelt und jede Fraktion nach derselben Methode wie oben geprüft. Die Fraktion C2L2-Cj wurde durch eine Säule (3,4 x 120 cm) geleitet, um die Fraktionen No. 55 bis 72 (Fraktion C2L2-C1L1) und die Fraktionen No. 73 bis 80 (Fraktion C2L2-C; L2) zu ergeben. Die Fraktion C2L2-C2 wurde durch eine Säule (3,4 x 110 cm) geleitet, um die Fraktionen No. 50 bis 59 (Fraktion C2L2-C2Lj) und die Fraktionen No. 60 bis 67 (Fraktion C2L2-C2L2) zu ergeben. Die Fraktionen C2L2-C3 wurden durch eine Säule (3,4 x 110 cm) geleitet und ergaben die Fraktionen No. 45 bis 60 (Fraktion C2L2-C3Lj) und die Fraktionen No. 61 bis 72 (Fraktion C2L2-C3L2). Jede Fraktion wurde lyophilisiert, um die untenstehenden Bestandteile zu ergeben:
C2L2—C]Lj 108,7 mg C2L2-C,L2 95,9 mg
45
50
55
60
65
C2L2-C2L, 53,6 mg C2Lj-C2L2 44,1 mg Cfc-Cfo 97,0 mg C2L2-C3L2 95,1 mg c) Reinigung von C2L2-CiLf.
Die obige Fraktion QLr-QL! gelöst in 0,1 N Essigsäure wurde durch eine Säule (2,0 x 15 cm) aus CM-Cellulose geleitet und durch linear ansteigende Eluierung mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) - 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) eluiert. Die Eluate wurden in Fraktionen von je 7,4 ml gesammelt und jede Fraktion nach der Folin-Lowry-Methode (500 nm) geprüft, wobei die Fraktionen No. 46 bis 56 (Fraktion C2L2-CiL]-C) erhalten wurde. Diese Fraktionen wurden im Vakuum konzentriert und über eine Säule (3,0 x 90 cm) aus «Sephadex LH-20» geleitet und mit 0,1 N Essigsäure eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 6,0 ml gesammelt. Jede Fraktion wurde nach derselben Methode wie oben geprüft und man erhielt die Fraktionen No. 25 bis 35 (Fraktion C2L2-CiLj-CL), welche lyophilisiert wurde, um h-PTH [53-84] (90,0 mg) zu ergeben.
TLC: Rf9 = 0,76 (ein Fleck)
Aminosäureanalyse: Asp 4,45 (5), Thr 0,92 (1), Ser 2,16 (3), Glu 4,94 (5), Gly 0,96 (1), Ala 3, Val 3,96 (4), Leu 2,92 (3), Lys 6,22 (6), His 1,01 (1).
Beispiel 2
h-PTH (51-84): H-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-
15
661 735
Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH
(1) P(51—84): BOC-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-GIu(OBzI)-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-GIu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [39]:
TFA (50 ml) wurde zur Substanz [32] (7,82 g, 1,5 mM), erhalten in Beispiel 1, zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt. Das TFA wurde abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde gesammelt und in DMF (120 ml) und NMP (120 ml) gelöst. HOBT (0,30 g, 1,5 molarer Überschuss), die Substanz [38] )2,52 g, 1,5 molarer Überschuss) der Formel BOC-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-OH und WSCI (0,41 ml, 1,5 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 2 Tagen gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen. Der derart gebildete Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und anschliessend mit Methanol versetzt und erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden die unlöslichen Stoffe gesammelt. Diese Wärmebehandlung wurde zweimal wiederholt und die unlöslichen Stoffe sodann mit Äther gewaschen, um die Substanz [39] (8,20 g, Ausbeute: 87,9%) zu ergeben.
Aminosäureanalyse: Asp 4,09 (5), Thr 1,05 (1), Ser 2,30
(3), Glu 4,08 (5), Pro 0,52 (1), Gly 0,83 (1), Ala 3, Val 3,42
(4), Leu 2,53 (3), Lys 5,11 (6), His 0,69 (1), Arg 0,51 (1).
(2) h-PTH [51-84]:
Die Substanz [39] (3,73 g, 0,6 mM) und Anisol (4 ml) wurden zu HF (40 ml) bei 0 °C zugesetzt und das Gemisch während 60 Minuten gerührt. Der HF wurde sodann im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der Niederschlag wurde gesammelt, in Essigsäure (50 ml) gelöst und durch eine Säule aus «Dowex XI» (Acetatform, s 2,7 x 33 cm) hindurchgeleitet. Das Eluat wurde lyophilisiert, um das rohe Produkt (2,41 g) zu ergeben.
Dieses Produkt wurde in 8 M wässerigem Harnstoff (50 ml) gelöst, durch Zugabe von wässerigem Ammoniak auf pH 10,0 eingestellt und während 30 Minuten stehen ge-io lassen. Die Lösung wurde sodann über eine Säule (4,2 x 11,5 cm) aus CM-Cellulose, gepackt mit 8 M wässerigem Harnstoff, geleitet, der Harnstoff durch Zusatz von 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5) entfernt und die Säule durch linear ansteigende Eluierung mit 0,01 M Ammoniumacetat 15 (pH 4,5, 700 ml) - 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) eluiert und mit 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 250 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 8,5 ml gesammelt und jede Fraktion nach der Folin-Lowry-Methode (500 nm) geprüft. Man erhielt die Fraktionen No. 30 bis 63 20 (Fraktion CO, die Fraktionen No. 105 bis 150 (Fraktion C2) und die Fraktionen No. 151 bis 195 (Fraktion C3). Die Fraktionen C2 und C3 wurden zum Entsalzen durch eine «Sephadex LH-20»-Säule geleitet. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 5,2 ml gesammelt. Die Fraktion C2 wurde so-25 dann durch eine Säule (3,4 x 110 cm) geleitet, um die Fraktionen No. 51 bis 63 (Fraktion C2L0, und die Fraktionen No. 64 bis 80 (Fraktion C2L2) zu erhalten. Die Fraktion C3 wurde durch eine Säule (3,4 x 120 cm) geleitet, um die Fraktionen No. 50 bis 69 (Fraktion C3L0 und die Fraktio-30 nen No. 70 bis 78 (Fraktion C3L2) zu ergeben. Jede Fraktion wurde lyophilisiert und ergab die in der folgenden Tabelle angegebenen Bestandteile.
Bestandteil
Aminosäureanalyse
Frak- Aus-
Asp
Thr
Ser
Glu
Gly
Ala
Val
Leu
Lys
His
Arg
Pro tionen beute
mg
(5)
(1)
(3)
(5)
(1)
(3)
(4)
(3)
(6)
(1)
(1)
(1)
C2L, 100
4.38
1.07
2.18
4.28
0.84
3
3.65
2.65
5.23
0.69
0.56
0.59
C,L2 378
4.78
0.95
2.30
5.02
0.99
3
3.95
2.96
5.97
0.89
0.96
0.99
C3L, 196
4.45
1.06
2.24
4.52
0.94
3
3.75
3.01
5.63
0.77
0.71
0.76
C3L2 458
4.70
0.93
2.31
4.92
1.03
3
3.89
2.94
6.05
0.93
0.99
1.00
Die obige Fraktion C2L2 (375 mg), gelöst in 0,1 N Essigsäure (4 ml), wurde über eine Säule (2,0 x 31 cm) aus CM-Cellulose geleitet und durch linear ansteigende Eluierung mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) - 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eulat wurde in Fraktionen von je 7,5 ml gesammelt und die Fraktionen No. 85 bis 103 (Fraktion C2L2-C) wurden erhalten. Diese wurde durch eine Säule aus «Sephadex LH-20» (3,0 x 123 cm) zur Entsalzung geleitet. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 6 ml gesammelt, wobei die Fraktionen No. 34 bis 42 (Fraktion C2L2-CL0 und die Fraktionen No. 43 bis 50 (Fraktion C2L2-CL2) erhalten wurden. Jede dieser Fraktionen wurde lyophilisiert und ergab folgende Bestandteile:
C2L2: 80,0 mg
Aminosäureanalyse: Asp 4,95 (5), Thr 0,98 (1), Ser 2,47 (3), Glu 5,14 (5), Gly 1,01 (1), Ala 3 (3), Val 4,05 (4), Leu 3,02 (3), Lys 6,16 (6), His 0,96 (1), Arg 0,97 (1), Pro 1,06 (1).
C2L2-CL2: 197,6 mg
Aminosäureanalyse: Asp 5,00 (5), Thr 0,93 (1), Ser 2,30 (3), Glu 5,17 (5), Gly 1,01 (1), Ala 3 (3), Val 4,03 (4), Leu 3,00 (3), Lys 6,15 (6), His 0,95 (1), Pro 1,04 (1).
Die obige Fraktion C2L2-CL2 (195 mg), gelöst in 0,1 N Essigsäure (2 ml), wurde über eine Säule (2,0 x 15 cm) aus
CM-Cellulose geleitet und durch linear ansteigende Eluierung mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) - 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 6,4 ml gesammelt, wobei die Fraktio-50 nen No. 55 bis 64 (Fraktion C2L2-Q) und die Fraktionen No. 66 bis 72 (Fraktion C2L2-CL2-C2) erhalten wurden. Jede Fraktion wurde im Durchgang durch eine «Sephadex LH-20» entsalzt. Die Fraktion C2L2- CL2-C, wurde durch eine Säule (3,0 x 123 cm) geleitet und das Eluat in Fraktio-5S nen von je 7,4 ml gesammelt, um die Fraktionen No. 31 bis 38 (Fraktion C2L2-CL2-C]L0 und die Fraktionen No. 39 bis 43 (Fraktion C2L2-CL2-C]L2) zu ergeben. Die Fraktion C2L2-CL2-CiL| wurde lyophilisiert, wobei h-PTH [53-84] (77,2 mg) erhalten wurde.
60 TLC: Rl0 = 0,89 (ein Fleck).
Beispiel 3
h-PTH [46-84]: H-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-V al-Leu-V al-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-65 Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH.
(1) P(46-84): BOC-Ala-Gly-Ser (Bzl)-Gln-Arg(Tos)-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Glu(OBzl)-Asp (OBzl)-Asn-
661 735
16
Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser (Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys-(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)V al-Asp(OBzl)-V al-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [46]:
TFA (80 ml) wurde zur Substanz [32] (10,44 g, 2 mM) aus Beispiel 1 zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde in DMF (160 ml) und NMP (160 ml) gelöst. Die Substanz [45] (4,28 g, 1,15 molarer Überschuss) der Formel BOC-Ala-Gly-Ser(Bzl)-Gln-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-OH, HOBT (0,32 g,l,2 molarer Überschuss) und WSCI (0,44 ml, 1,2 molarer Überschuss) wurden zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 2 Tagen gerührt. Das DMF wurde im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Eiswasser versetzt und der Niederschlag abfiltriert und dieser anschliessend nach Zusatz von Methanol (200 ml) erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden die unlöslichen Stoffe gesammelt. Diese Operation wurde zweimal wiederholt und ergab die Substanz [46] (12,17 g, Ausbeute: 87,4%).
(2) h-PTH [46-84]:
Die Substanz [46] (4,18 g, 0,6 mM) und Anisol (10 ml) wurden zu HF (60 ml) bei 0 °C zugesetzt und während 60 Minuten gerührt. Nach der Reaktion wurde der HF im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der Niederschlag wurde gesammelt, in 10%iger Essigsäure (50 ml) gelöst und durch eine Säule aus «Dowex XI» (Ace-tatform, 2,5 x 24 cm) geleitet. Das Eluat wurde lyophilisiert und ergab das rohe Produkt (2,82 g), welches in 8 M wässerigem Harnstoff (pH 9,0, 50 ml) gelöst und bei Zimmertemperatur während 60 Minuten stehen gelassen wurde. Die Lösung wurde über eine Säule (2,0 x 33 cm) aus CM-Cellulose, gepackt mit 8 M Harnstofflösung, geleitet und durch linear ansteigende Eluierung mit 0,01 M Ammoniumacetat ( pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 7,5 ml aufgefangen und nach der Folin-Lowry-Methode (500 nm) geprüft, wobei die Fraktionen No. 1 bis 22 (Fraktion CO, die Fraktionen No. 23 bis 45 (Fraktion C2), die Fraktionen No. 46 bis 80 Fraktion C3) und die Fraktionen No. 81 bis 120 (Fraktion C4) erhalten wurden. Jede Fraktion wurde über eine «Sephadex LH-20»-Säule geleitet zur Entsalzung. Die Fraktion Q wurde über eine Säule (3,0 x 120 cm) geleitet, das Eluat in Fraktionen von je 7,5 ml gesammelt und die Fraktionen No. 28 bis 42 (Fraktion QL) erhalten. Die Fraktion C2 wurde durch eine Säule (3,4 x 120 cm) geleitet und das Eluat in Fraktionen von je 7,6 ml gesammelt. Die Fraktionen No. 33 bis 40 (Fraktion C2Li) und No. 41 bis 62 (Fraktion C2L2) wurden erhalten. Die Fraktion C3 wurde durch eine Säule (3,0 x 120 cm) geleitet, in 6,0 ml-Fraktionen fraktioniert und die Fraktionen No. 31 bis 40 (Fraktion C3L]) und No. 41 bis 51 (Fraktion C3L2) erhalten. Die Fraktion C4 wurde durch eine Säule (3,4 x 120 cm) geleitet, in 7,5 ml-Fraktionen gesammelt, wobei die Fraktionen No. 35 bis 48 (Fraktion C4L]) erhalten wurden. Jeder Teil wurde lyophilisiert, um die Fraktion QL (312 mg), QLj (142,3 mg), C2L2 (1380 mg), C3L, (103 mg), C3L2 (510 mg) und C4L (130 mg) zu ergeben.
Die obige Fraktion C2L2 (1380 mg), gelöst in 0,1 N Essigsäure (13 ml), wurde durch eine Säule (4,3 x 6,0 cm) aus CM-Cellulose geleitet und durch linear ansteigende Eluierung mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) - 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wurde in 7,6 ml-Fraktionen gesammelt, wobei die Fraktionen No. 40 bis 50 (Fraktion C2L2-C,) und No. 53 bis 77 (Fraktion C2L2-C2) erhalten wurden. Jede Fraktion wurde durch eine «Sephadex LH-20»-Säule zum Entsalzen geleitet. Die Fraktion C2L2-C, wurde durch eine Säule (2,9 x 120 cm) geleitet und das Eluat in Fraktionen von je 8,0 ml gesammelt, wobei die Fraktionen No. 26 bis 30 (Fraktion C2L2-CiLi) und No. 31 bis 39 (Fraktion C2L2-C]L2) erhalten wurden. Die Fraktion C2L2-C2 wurde durch eine Säule (3,4 x 120 cm) geleitet und das Eluat in Fraktionen von je 8 ml gesammelt, wobei die Fraktionen No. 34 bis 44 (Fraktion C2L2-C2Li) und No. 45 bis 53 (Fraktion C2L2-C2L2) erhalten wurden. Jede Fraktion wurde lyophilisiert, wobei die Fraktionen C2L2-CiL! (79,0 mg), C2L2-C,L2 (455 mg), C2L2-C2Li (157,3 mg) und C2L2-C2L2 (551,7 mg) erhalten wurden.
Aminosäureanalyse der Fraktion C2L2-C2L2: Asp 4,65 (5), Thr 0,97 (1), Ser 3,47 (4), Glu 5,99 (6), Pro 0,93 (1), Gly 1,96 (2), Ala 4 (4), Val 3,97 (4), Leu 3,01 (3), Lys 6,13 (6), His, 0,93 (1), Arg 1,96 (2).
Die Fraktion C2L2-C2L2, gelöst in 0,1 N Essigsäure (5 ml), wurde über eine Säule (4,2 x 7,0 cm) aus CM-Cellulose geleitet und durch linear ansteigende Eluierung mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 3,5, 300 ml) - 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 8,0 ml aufgefangen und ergab die Fraktionen No. 39 bis 45 (Fraktion C2L2-C2L2-C), welche ihrerseits über eine Säule (2,9 x 120 cm) aus «Sephadex LH-20» zur Entsalzung geleitet wurde. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 8 ml aufgefangen, wobei die Fraktionen No. 24 bis 30 (Fraktion C2L2-C2L2-CLi), die Fraktionen No.31 bis 35 (Fraktion C2L2-C2L2-CL2) und die Fraktionen No. 36 bis 39 (Fraktion C2L2-C2L2-CL3) erhalten wurden. Jede Fraktion wurde lyophilisiert und ergab die Fraktion C2L2-C2L2-CL2 (200 mg) und die Fraktion C2L2-C2L2-CL, (h-PTH [46-84], 94,9 mg).
TLC: Rf9 = 0,76
Aminosäureanalyse: Asp 4,86 (5), Thr 0,99 (1), Ser 3,58 (4), Glu 6,17 (6), Pro 0,96 (1), Gly 1,97 (2), Ala 4 (4), Val 4,02 (4), Leu 2,93 (3), Lys 6,05 (6), His 0,90 (1), Arg 1,87 (2).
Beispiel 4
[Tyr45] h-PTH (45-84): H-Tyr-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro Arg-Lys-Lys-Glu-Äsp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH:
(1) P(45-84): BO-C-Tyr(Bzl-Cl2)-Ala-Gly-Ser(Bzl)-Gln-Arg(Tos)-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu (OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu (OBzl)-Ala-Asp-(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr (Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [47]:
TFA (60 ml) wurde zur Substanz [46] (6,27 g, 0,9 mM) aus Beispiel 3 zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt. Das TFA wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Äther versetzt. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, wobei die De-BOC-Verbindung (6,30 g) erhalten wurde.
Die erhaltene De-BOC-Verbindung (2,10 g, 0,3 mM) wurde in DMF (35 ml) und NMP (35 ml) gelöst. BOC-Tyr(Bzl-Cl2)-OH (0,16 g, 1,2 molarer Überschuss), HOBT (0,05 g, 1,2 molarer Überschuss) und WSCI (0,07 ml, 1,2 molarer Überschuss) wurden bei 0 °C zugefügt und das Gemisch über Nacht gerührt. Das DMF wurde abdestilliert und der Rückstand mit Eiswasser versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und ergab die Substanz [47] (2,00 g).
(2) [Tyr45]-h-PTH [45-84]:
Die Substanz [47] (2,00 g, 0,27 mM) und Anisol (1,0 ml) wurden zu HF (20 ml) bei 0 °C zugesetzt und das Gemisch während 60 Minuten gerührt. Der HF wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der derart gebildete Niederschlag wurde gesammelt, in 0,1 N Essigsäure (20 ml) gelöst und durch eine Säule aus «Dowex XI»
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
17
661 735
(Acetatform, 2,5 x 15 cm) geleitet. Das Eluat wurde lyophilisiert und ergab das rohe Produkt (1,37 g)
Das rohe Produkt wurde in 8 M Harnstofflösung (pH 9,5, 50 ml) gelöst und bei Zimmertemperatur während 60 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wurde sodann über eine Säule (4,3 x 8,0 cm) aus CM-Cellulose, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt worden war, geleitet und durch Eluierung mit linearem Gradienten mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 400 ml) - 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5,400 ml) eluiert. Das Eluat wurde in 6,5 ml-Fraktionen gesammelt. Jede Fraktion wurde nach der Folin-Lowry-Methode (500 nm) geprüft, wobei die Fraktionen No. 30 bis 45 (Fraktion CO, die Fraktionen No. 51 bis 68 (Fraktion C2), die Fraktion No. 69 bis 83 (Fraktion C3) und die Fraktionen No. 84 bis 100 (Fraktion C4) erhalten wurden. Jede Fraktion wurde durch eine Säule aus «Sephadex LH-20» zum Entsalzen geleitet. Die Fraktion Q wurde über eine Säule (3,4 x 120 cm) geleitet und 7,5 ml-Fraktionen aufgefangen, wobei die Fraktionen No. 25 bis 41 (Fraktion QL) erhalten wurden. Die Fraktion C2 wurde über eine Säule (3,0 x 120 cm) geleitet und in 7,5 ml-Fraktionen gesammelt, wobei die Fraktionen No. 25 bis 36 (Fraktion C2L) erhalten wurden. Die Fraktion C3 wurde über eine Säule (2,9 x 120 cm) geleitet und in 8,0 ml-Fraktionen gesammelt, wobei die Fraktionen No. 24 bis 27 (Fraktion C3L]) und die Fraktionen No. 28 bis 38 (Fraktion C3L2) erhalten wurden. Die Fraktion C4 wurde über eine Säule (2,9 x 95 cm) geleitet und in 7,6 ml-Fraktionen gesammelt, wobei die Fraktionen No. 20 bis 25 (Fraktion C4L() und No. 26 bis 30 (Fraktion C4L2) erhalten wurden. Jede Fraktion wurde lyophilisiert und ergab die Fraktion QL (521,6 mg), C2L (230,2 mg), C3L) (41,8 mg), C3L2 (222,4 mg), C4L] (74,3 mg) und C4L2 (48,9 mg).
Die obige Fraktion C2L, gelöst in 0,1 N Essigsäure (3 ml) wurde über eine Säule (2,1 x 25 cm) aus CM-Cellulose geleitet und durch Eluierung mit linearem Gradienten mit 0,01 M Ammoniumacetatlösung (pH 4,5, 300 ml) - 0,3 M Am-moniumacetatlösung (pH 4,5, 300 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 8,0 ml aufgefangen, wobei die Fraktionen No, 30 bis 36 (Fraktion C2L-C) erhalten wurden, die zur Entsalzung über eine Säule (2,9 x 90 cm) aus «Sephadex LH-20» geführt wurde. Das Eluat wurde in 8,0 ml-Fraktionen gesammelt und die Fraktionen No. 20 bis 29 lyophilisiert, wobei [Tyr45]-h-PTH [46-84] (163,3 mg) erhalten wurde.
TLC: Rf9 = 0,75
Aminosäureanalyse: Asp 4,86 (5), Thr 1,02 (1), Ser 3,51 (4), Glu 6,05 (6), Pro 0,93 (1), Gly 1,90 (4), Val 4,00 (4), Leu 2,93 (3), Tyr 0,88 (1), Lys 6,02 (6), His 0,96 (1), Arg 1,81 (2).
Beispiel 5
[Cys(Acm)45]-H-PTH(45-84):H-Cys(Acm)-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH:
(1) P(45-84): BOC-Cys(Acm)-Ala-Gly-Ser(Bzl)-Gln-Arg-(Tos)-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Glu(OBzl)-Asp (OBzl)-Asn-V ai-Leu-V al-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu-(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala- Asp-(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp (OBzl)-Va-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [48]:
Die verbliebene De-BOC-Verbindung (420 mg, 0,6 mM) aus Beispiel 4 wurde in einem Gemisch von DMF (70 ml) und NMP (70 ml) gelöst. HOBT (0,10 g, 1,2 molarer Überschuss), BOC-Cys(Acm)-OH (0,20 g, 1,2 molarer Überschuss) und WSCI (0,13 ml, 1,2 molarer Überschuss) wurden bei 0 °C zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das DMF wurde im Vakuum abdestilliert, der Rückstand mit Eiswasser versetzt und der Niederschlag gesammelt. Der Niederschlag wurde in Äthanol suspendiert, erhitzt, dann abgekühlt und die unlöslichen Stoffe abfiltriert. Diese Operation wurde zweimal wiederholt und ergab die Substanz [48] (4,07 g, Ausbeute: 95,0%.
(2) [Cys(Acm)45] h-PTH [45-84]:
Die Substanz [48] (4,00 g, 0,57 mM) und Anisol (10 ml) wurden bei 0 °C zu wasserfreiem HF (60 ml) zugesetzt und das Gemisch während 60 Minuten gerührt. Der Niederschlag wurde in 20%iger Essigsäure (40 ml) gelöst und durch eine Säule aus «Dowex XI» (Acetatform, 2,8 x 35 cm) geleitet. Das lyophilisierte Eluat wurde in 8 M Harnstofflösung gelöst, der pH durch Zugabe von wässerigem Ammoniak auf 9,0 eingestellt und die Lösung während 30 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wurde über eine Säule (3,4 x 35 cm) aus CM-Cellulose, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt worden war, geleitet und durch Eluierung mit linearem Gradienten mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) - 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 8 ml gesammelt und nach der Folin-Lowry-Methode (500 nm) geprüft. Hierbei wurden die Fraktionen No. 25 bis 35 (Fraktion Q), die Fraktionen No. 36 bis 45 (Fraktion C2), und die Fraktionen No. 46 bis 84 (Fraktion C3) zu erhalten. Jede Fraktion wurde durch eine «Sephadex LH-20»-Säule zur Entsalzung geleitet. Die Fraktion C2 wurde durch eine Säule (3,0 x 120 cm) geführt und in 0,8 ml-Fraktionen gesammelt, um die Fraktionen No. 27 bis 33 (Fraktion C2L,) und No. 34 bis 40 (Fraktion C2L2) zu erhalten. Die Fraktion C3 wurde durch eine Säule (3,4 x 120 cm) geleitet und in 8,0 ml-Fraktionen gesammelt, um die Fraktionen No. 35 bis 47 (Fraktion C3Lj) und No. 48 bis 53 (Fraktion C3L2) zu erhalten. Jede Fraktion wurde lyophilisiert, wobei die Fraktion C2L] (148 mg), C2L2 (620 mg), C3L, (212 mg) und C3L2 (605 mg) erhalten wurden.
Die obige Fraktion C2L2, gelöst in 0,1 N Essigsäure (6 ml), wurde über eine Säule (5,0 x 12 cm) aus CM-Cellu-lose geleitet und durch Eluierung mit linearem Gradienten mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 400 ml) - 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 400 ml) eluiert. Das Eluat wurde in 6,0 ml-Fraktionen gesammelt, wobei die Fraktionen No. 110 bis 126 (Fraktion C2L2-C) erhalten wurden, die über eine Säule (4,0 x 120 cm) aus «Sephadex LH-20» zum Entsalzen geführt wurden. Das Eluat wurde in 8,0 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen No. 38 bis 54 (Fraktion C2L2-CL) wurden lyophilisiert, wobei [Cys(Acm)45] h-PTH [45—84] (246,8 g) erhalten wurde.
TLC: Rf9 = 9,74
Aminosäureanalyse: Asp 4,91 (5), Thr 0,98 (1), Ser 3,50 (4), Glu 6,11 (6), Pro 0,98 (1), Gly 1,98 (2), Ala 4 (4), Val 4,04 (4), Cys 0,42 (0,5), Leu 2,90 (3), Lys 5,99 (6), His 0,87 (1), Arg 1,87 (2).
Beispiel 6
[Cys45]-h-PTH(45-84): H-Cys-AIa-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-V ai-Leu-V al-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH:
[Cys(Acm)45] h-PTH[45-84] (88 mg, 0,02 mM), erhalten in Beispiel 5, wurde in 50%iger Essigsäure (2 ml) gelöst. Mercuriacetat (52,24 mg, 0,19 mM) wurde zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 70 Minuten gerührt. Nun wurde ß-Mercaptoäthanol (3,4 ml) zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und die überstehende Lösung über eine Säule (3,2 x 42 cm) aus «Sephadex LH-20» geleitet und mit 0,1 M Essigsäure eluiert. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen gesammelt und die auf
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Ninhydrin positiv reagierenden Fraktionen No. 9 bis 14 vereint und lyophilisiert, um [Cys45] h-PTH [45-84] (76,1 mg) zu ergeben.
TLC: Rf9 = 0,73.
Beispiel 7
[Tyr52] h-PTH(52-84): H-Tyr-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH:
(1) P(52-84): BOC-Tyr(Bzl-Cl2)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [49]:
TFA (50 ml) wurde zur Substanz [35] (5,82 g, 1,0 mM) aus Beispiel 1 zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. Das TFA wurde sodann im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde in DMF (150 ml) und NMP (150 ml) gelöst. HOBT (0,27 g, 2 molarer Überschuss) wurde zum Lösen zugesetzt, dann WSCI (0,37 g, 2 molarer Überschuss) zugegeben und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 2 Tagen gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen, der Niederschlag gesammelt, mit Wasser gewaschen, in Methanol suspendiert, erhitzt und abgekühlt. Die unlöslichen Stoffe wurden durch Filtrieren gewonnen. Der Niederschlag wurde in Methanol suspendiert und erhitzt. Diese Suspension wurde gekühlt und die unlöslichen Stoffe gesammelt, um die Substanz [49] (5,59 g, Ausbeute: 91,0%) zu erhalten.
Aminosäueanalyse: Asp 4,09 (5), Thr 0,90 (1), Ser 1,65 (3), Glu 4,10 (5), Gly 0,88 (1), Ala 3 (3), Val 3,41 (4), Leu 2,50 (3), Tyr 0,82 (1), Lys 5,40 (6), His 0,71 (1).
(2) [Tyr52] h-PTH [52-84]:
Die Substanz [49] (3,68 g, 06 mM) und Anisol (5 ml) wurden zu wasserfreiem HF (50 ml) bei 0 °C zugesetzt und das Gemisch während 60 Minuten gerührt. Der HF wurde sodann abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und in 0,1 N Essigsäure (50 ml) gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule aus «Dowex XI» (Acetatform, 2 x 45 cm) geführt und mit 0,1 N Essigsäure eluiert. Das Eluat wurde lyophilisiert, wobei das rohe Material (2,30 g) erhalten wurde, welches in 8 M Harnstofflösung (50 ml) gelöst, mit wässerigem Ammoniak auf pH 9,5 eingesellt und bei 0 °C während 60 Minuten stehengelassen wurde. Diese Lösung wurde auf eine Säule (4,4 x 12 cm) aus CM-Cellulose, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt worden war, verbracht und zuerst mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, etwa 100 ml) eluiert, dann durch Eluierung mit linearem Gradienten mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) - 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) eluiert und schliesslich mit 0,2 M Ammoniumacetat (300 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 13,5 ml gesammelt, welche mit Hilfe der UV-Absorption bei 280 nm geprüft wurden, wonach die Fraktionen No. 54 bis 110 vereint und lyophilisiert wurden. Das Lyophilisat wurde in 0,1 N Essigsäure (5 ml) gelöst und durch eine Säule (3,4 x 120 cm) aus «Sephadex LH-20» geleitet. Das Eluat wurde in Fraktionen von 8,5 ml gesammelt und die Fraktionen No. 47 bis 53 vereint und lyophilisiert, um das Material (510 mg) zu erhalten. Dieses Material wurde in 0,1 N Essigsäure (20 ml) gelöst und auf eine Säule (4,5 x 70 cm) aus CM-Cellulose verbracht, welche durch Eluierung mit linearem Gradienten mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) - 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml eluiert wurde. Das Eluat wurde in 6,0 ml-Fraktionen gesammelt.
Jede Fraktion wurde durch UV-Absorption bei 280 nm geprüft; die Fraktionen No. 109 bis 120 wurden vereint und lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in 0,1 N Essigsäure (5 ml) gelöst und die Lösung durch eine Säule (3,4 x s 120 cm) aus «Sephadex LH-20» geleitet. Das Eluat wurde in 3,4 ml-Fraktionen gesammelt, die Fraktionen No. 56 bis 73 vereint und lyophilisiert, um {Tyr52] h-PTH [52-84] (102 mg) zu erhalten.
TLC: Rf8 = 0,75, ein Fleck.
io Aminosäureanalyse: Asp 4,55 (5), Thr 0,93 (1), Ser 2,20 (3), Glu 4,98 (5), Gly 0,96 (1), Ala 3, Val 3,98 (4), Leu 2,93
(3), Tyr 0,90 (1), Lys 6,10 (6), His 1,00 (1).
Beispiel 8
15 [Tyr50] h-PTH (50-84): H-Tyr-Pro-Arg-Lys-Gly-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His- Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH:
(1) P(50-84): BOC-Tyr(Bzl-Cl2)-Pro-Arg(Tos)-Lys-
20 (Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [50]:
25 TFA (50 ml) wurde zur Substanz [39] aus Beispiel 2 zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 55 Minuten gerührt. Das TFA wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde in DMF (160 ml) und NMP (160 ml) gelöst. 30 HOBT (0,27 g, 2 molarer Überschuss) und BOC-Tyr(Bzl-Cl2)-OH (0,88 g, 2 molarer Überschuss) wurden zugesetzt um zu lösen, auf —20 °C gekühlt, WSCI (0,37 g, 2 molarer Überschuss) zugesetzt und das Gemisch während 3 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wur-35 de in Eiswasser gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen, in Methanol suspendiert und erhitzt. Anschliessend wurde die Methanolsuspension gekühlt und die unlöslichen Materialien abfiltriert. Der Niederschlag wurde wiederum unter Erhitzen in Methanol sus-40 pendiert und gekühlt, um den Niederschlag zu sammeln. Diese Operation wurde nochmals wiederholt und der Niederschlag mit Äther gewaschen, um die Substanz [50] (5,97 g, Ausbeute: 90%) zu erhalten.
Aminosäureanalyse: Asp 4,21 (5), Thr 0,95 (1), Ser 2,32 45 (3), Glu 4,50 (5), Pro 0,75 (1), Gly 0,88 (1), Ala 3, Val 3,45
(4), Leu 2,60 (3), Tyr 0,70 (1), Lys 5,21 (6), His 0,72 (1), Arg 0,71 (1).
(2) [Tyr50] h-PTH [50-84]:
Die Substanz [50] (3,98 g, 0,6 mM) und Anisol (6 ml) 50 wurden zu wasserfreiem HF (60 ml) bei 0 °C zugesetzt und das Gemisch bei 0 °C während 60 Minuten gerührt. HF wurde sodann im Vakuum abdestilliert, der Rückstand mit Äther versetzt und der gebildete Niederschlag gesammelt. Der Niederschlag, gelöst in 0,1 N Essigsäure (50 ml), wurde 55 über eine Säule aus «Dowex XI» (Acetatform, 3 x 45 cm) geleitet. Das Eluat wurde lyophilisiert und ergab das rohe Produkt 2,30 g). Dieses wurde in 8 M Harnstofflösung gelöst, die Lösung mit wässerigem Ammoniak auf pH 10,0 eingestellt und bei 0 °C während 30 Minuten stehengelassen. 60 Die Lösung wurde sodann auf eine Säule (4,2 x 11,5 cm) aus CM-Cellulose, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt worden war, aufgebracht und mit 0,01 M Ammoniumacetat-lösung (pH 4,5) eluiert, um den Harnstoff zu entfernen. Dann folgte die Eluierung mit linearem Gradienten mit 0,01 65 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) - 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml), worauf mit 0,2 M Ammoniumace-tatlösung (pH 4,5, 250 ml) eluiert wurde. Das Eluat wurde in Fraktionen von 8,5 ml gesammelt und die Fraktionen durch
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Absorption bei 280 nm geprüft. Die Fraktionen No. 110 bis 155 wurden vereint und lyophilisiert. Das Lyophilisat, gelöst in 0,1 M Essigsäure (6 ml), wurde durch eine Säule aus «Sephadex LH-20» (3,4 x 110 cm) geleitet. Die Fraktionen No. 66 bis 82 der 5,2 ml-Fraktionen wurden vereint und lyophilisiert. Das Lyophilisat (360 mg) wurde in 0,1 M Essigsäure (10 ml) gelöst, auf eine Säule (2,0 x 31 cm) aus CM-Cellulose verbracht und durch Eluierung mit linearem Gradienten mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) - 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 7,5 ml gesammelt. Die Fraktionen No. 90 bis 110 wurden vereint, lyophilisiert und wiederum in 0,1 N Essigsäure (3 ml) gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule (3,0 x 123 cm) aus «Sephadex LH-20» gelassen. Das Eluat wurde in 6 ml-Fraktionen gesammelt, und die Fraktionen No. 35 bis 43 wurden vereint und lyophilisiert, um [Tyr50] h-PTH [50-84] (115 mg) zu ergeben.
TLC: Rf10 = 0,88 (ein Fleck)
Aminosäureanalyse: Asp 4,95 (5), Thr 0,91 (1), Ser 2,32
(3), GIu 5,10 (5), Pro 1,01 (1), Gly 0,99 (1), Ala 3, Val 4,01
(4), Leu 2,99 (3), Tyr 0,85 (1), Lys 6,03 (6), His 0,92 (1), Arg 1,02(1).
Beispiel 9
(1) Antigene:
Das h-PTH [53-84], h-PTH [51-84], h-PTH [46-84] und BSA-[Cys45] h-PTH [45-84], hergestellt nach der folgenden Methode, wurden als Antigene verwendet.
BSA-[Cys45] h-PTH [45-84] wurde wie folgt hergestellt:
Tetranatrium-EDTA (4 mg) wurde zu BSA (50 mg), gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0,1 ml), zugesetzt. Dimethylformamidlösung (150 uLiter) von 3-(2'-Benzothia-zolyl-dithio)-propionat-succinimidester (500 (ig) wurde zugesetzt und das Gemisch unter Eiskühlung während 60 Minuten gerührt. Nach der Reaktion wurde [Cys45] h-PTH [45-84] (50 mg) zugesetzt, unter Eiskühlung während 30 Minuten reagieren gelassen, auf pH 7,0 eingestellt und durch eine Säule (1 x 50 cm) aus «Sephadex G-75» die mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), enthaltend 0,15 M NaCl gepackt worden war, zur Gelfiltration geführt. Eluate von 15 bis 20 ml wurden gesammelt, um die Fraktionen zu erhalten, die BSA-[Cys45] h-PTH [45—84] enthielten. [Im Durchschnitt waren 11 Mol [Cys45] h-PTH [45-84] pro Mol BSA konjugiert].
(2) Antikörper
Eine Lösung (500 fig/ml) des obigen Antigens in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,15 M NaCl, wurde zubereitet. Je 2,5 ml dieser Lösung wurden mit Freund's vollständigem Adjuvans (2,5 ml) vermischt und damit männliche Meerschweinchen, 5 Stück pro Gruppe, durch subkutane Injektion (5 subkutane Injektionen mit zweiwöchigem Intervall) immunisiert. Zwei Wochen nach beendeter Immunisierung wurde Blut aus dem Herzen entnommen, um auf übliche Weise das Antiserum zu erhalten.
Im folgenden wird das Antiserum von h-PTH [53-84] als [A], das Antiserum von h-PTH [51-84] als [B], das Antiserum von h-PTH [46-84] als[C] und das Antiserum von BSA-[Cys45] h-PTH [45—84] als [D] abgekürzt.
(3) Enzym-Markierung
1) [Cys45] h-PTH [45-84] (4 mg) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0, 1 ml) gelöst.
N-[2-(2'-Pyridyldithio)-äthyl]-3-(2'-benzothiazolyldithio)-propionamid (0,6 mg) in Dimethylformamid (0,9 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch während 60 Minuten bei 0 °C gerührt. Der pH wurde durch Zusatz von HCl auf 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde durch eine «Sephadex G-25»-Säule (1 x 50 cm) geleitet und mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) eluiert, um Fraktionen von 15 bis 19 ml zu erhalten. (660 y/ ml [Cys45] h-PTH [45-84]). Die obige Fraktion (20 fd) wurde zu 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0, 1,5 ml), der ß-Galactosi-dase (1,2 mg) enthielt, zugesetzt und das Gemisch bei 0 C während 60 Minuten gerührt. Das Incubationsgemisch wurde durch eine «Sephadex G-100»-Säule (1 x 50 cm) mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) enthaltend 0,15 M NaCl, zur Gelfiltration geführt, um Fratkionen von 13 bis 17 ml zu erhalten. In dieser Fraktion betrug das Verhältnis des mit ß-Galactosidase markierten Konjugates [Cys45] h-PTH [45-84]: ß-Galactosidase = etwa 1:1 (im folgenden als Lot A bezeichnet).
2) h-PTH [53-84] (2 mg) wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0, 1 ml) gelöst. Eine Dimethylformamidlösung (0,2 ml) von 3-(2'-Benzothiazolyl-dithio)-propionat-succini-midester (0,2 mg) wurde zugesetzt und das Gemisch bei 0 C während 60 Minuten gerührt. Nach der Reaktion wurden 20 (x Liter davon zu 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0, 1 ml) enthaltend ß-Galactosidase (1 mg) zugesetzt und bei 0 C während 60 Minuten reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine «Sephadex G-100»-Säule (1 x 50 cm) zur Gelfiltration geführt, um die Fraktionen 14-17 ml zu erhalten. Das Verhältnis des ß-Galactosidase-konjugates ist h-PTH [53-84]: ß-Galactosidase = 1:1 (im folgenden als Lot B bezeichnet).
(4) Bestimmungsmethode:
Die Probenlösung (100 n Liter), das mit Enzym markierte Konjugat (100 n Liter), aliquot verdünntes Antiserum (100 (o. Liter) und normales Serum von Meerschweinchen (hundertfache Verdünnung) (100 p Liter) wurden bei 5 C während 24 Stunden inkubiert. Anti-Meerschweinchen-y-Globulin-Kaninchen-Serum (zehnfache Verdünnung, 100 ji Liter) wurde zugesetzt und bei 5 °C während 24 Stunden inkubiert. 0,5 M NaCl (3 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch mit 3000 Touren pro Minute während 15 Minuten zentrifugiert, um das Sediment zu sammeln. Das Sediment wurde zu 0,1 M Phosphatpuffer (enthaltend 1 % Natrium-azid, 0,1% BSA, 20 mM Mercapotäthanol und 10% Äthanol, pH 6,7), welches o-Nitropenyl-ß-galactosid (5 mg/ml) enthielt (200 (j. Liter) zugesetzt und während 90 Minuten bei 37 °C reagieren gelassen. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 0,2 M Glycin-Puffer (pH 10,4; 2,5 ml) unterbrochen und optisch bei 420 nm gemessen.
0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) enthaltend 0,1% Natri-umazid, 0,25% BSA, 0,15 M NaCl und 5 mN EDTA wurde als Verdünnungsmedium verwendet.
1) Lot A wurde als enzymmarkiertes Konjugat verwendet. Der Antikörpertiter (Bo/T) von jedem der oben genannten Antiseren wurde bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle I zusammengestellt. Jedes Antiserum wurde in 1000-facher Verdünnung verwendet.
Tabelle I
Antiserum Meerschwein- Antikörper-Titer chen No. Bo , 0/
(—-) %
T
A-l 1 9
A A-2 2 3
A-3 1 7
B-l 1 5
B B-2 16
B-3 1 6
C-l 3 8
C C-2 3 9
C-3 3 4
D-l 3 0
D D-2 4 6
D-3 4 2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
661735
20
2) Das enzymmarkierte Lot B wurde verwendet und der Antikörper-Titer (Bo/T) an den obigen Antiseren C und D bestimmt.
Die Resultate sind aus Tabelle II ersichtlich.
Tabelle II
Antiserum
Meerschwein
Antikörper-Titer
chen No.
(I2-) %
C-l
2 9
C
C-2
3 2
C—3
2 9
D-l
2 4
D
D-2
3 4
D-3
3 4
Jedes Antiserum wurde in 2000-facher Verdünnung verwendet.
3) Standard-Kurven wurden unter Verwendung der obigen Antiseren aufgestellt.
Verwendete Antiseren:
A-2: 600-fache Verdünnung B-2: 500-fache Verdünnung C-2: 1500-fache Verdünnung D-2: 2000-fache Verdünnung.
Enzymmarkiertes Konjugat: Lot B.
Die Standard-Kurve für h-PTH [53-84] wurde unter Verwendung der obigen aufgestellt.
Die Resultate sind in Fig. 1 für A-2, Fig. 2 für B-2, Fig. 3 für C-2 und Fig. 4 für D-2 gezeigt.
Wie aus dem obenstehenden ersichtlich, ergeben die unter Verwendung des Peptides der Formel Ia der vorliegenden Erfindung erhaltenen Antiseren bevorzugte Standardkurven und somit kann h-PTH oder dessen C-endständige Fragmente durch EIA mit guter Genauigkeit bestimmt werden.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
c
1 Blatt Zeichnungen

Claims (9)

  1. 661735
    2
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Fragment von menschlichem Nebenschilddrüsenhor-mon-peptid mit endständigem C der Formel I:
    R-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH [I]
    in welcher R die H-Tyr-Gruppe oder die Ri-Pro-Arg-Grup-pe, R[ Wasserstoff, die H-Tyr- oder R2-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Gruppe und R2 Wasserstoff, die H-Cys-Gruppe oder die H-Tyr-Gruppe darstellen, oder Salze davon.
  2. 2. Fragment der Formel Ia:
    R2'-Ala46-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro5I-Arg-Lys53-Lys-Glu55-Asp-Asn-Val-Leu-Val60-Glu-Ser-His-Glu-Lys65-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala70-Asp-Lys-Ala-Asp-Val75-Asp-Val-Leu-Thr-Lys80-Ala-Lys-Ser-Gln84-OH [Ia]
    in welcher R2' Wasserstoff oder die H-Cys45-Gruppe ist, als Peptid nach Patentanspruch 1.
  3. 3. Verfahren zur Herstellung eines Peptid-Fragmentes der Formel I oder Salzen davon nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Aminosäuren und/oder niedere Peptide unter intermediärem Schutz nicht an der Reaktion beteiligter reaktionsfähiger Gruppen in der Reihenfolge der gewünschten Aminosäuresequenz kondensiert und gegebenenfalls in ein Salz überführt.
  4. 4. Verwendung des 34-Fragmentes (51-84) gemäss Patentanspruch 1 oder eines Fragmentes nach Patentanspruch 2 oder die proteinkonjugierten Peptide der letzteren Fragmente zur Herstellung von dessen Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass man Säugetiere mit dem Fragment sensibilisiert und den gebildeten Antikörper aus dem Serum der Tiere gewinnt.
  5. 5. Antikörper hergestellt nach Patentanspruch 4.
  6. 6. Verwendung eines Peptid-Fragmentes nach Patentanspruch 1, welches N-endständig den Cys-Rest aufweist, zur Herstellung des entsprechenden enzymmarkierten Peptid-Fragmentes, dadurch gekennzeichnet, dass man das Peptid-Fragment mit einem SH-bindenden Enzym umsetzt.
  7. 7. Enzymmarkiertes Peptid-Fragment, hergestellt nach Patentanspruch 6.
  8. 8. Verwendung eines Peptid-Fragmentes nach Patentanspruch 1, welches N-endständig den Tyr-Rest aufweist, zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptides, dadurch gekennzeichnet, dass man das Peptid-Fragment der Formel I mit 125I umsetzt.
  9. 9. Radioaktiv markiertes Peptid, hergestellt nach Patentanspruch 8.
    bindungen, wie in den Patentansprüchen 4, 6 und 8 definiert und die derart erhaltenen Produkte.
    Ein menschliches parathyroides Hormon (h-PTH) ist ein Peptidhormon, welches aus 84 Aminosäuren besteht, und 5 seine biologische Aktivität wird offenbar auch einen 34-Ami-nosäurerest von seinem N-endständigen Rest [G.W. Tregear et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 355, 415 (1974)] bestimmt.
    Die Erfinder haben den C-endständigen 34-Rest [51-84] io und den 39-Rest [46-84] synthetisiert und diese Peptide injiziert, um Kaninchen zu sensibilisieren, wobei es gelang, den spezifischen Antikörper für C-endständige Peptide zu erhalten.
    Eine Markierung mit 125I auf h-PTH war als ziemlich 15 schwierig in Radioimmuno-Bestimmungen (RIA) bekannt. Die h-PTH [51-84] und h-PTH [46-84] enthalten kein Tyro-sin, welches leicht mit I25I markiert werden kann, jedoch können [Tyr52] h-PTH [45-84] mit Radioisotopen-Markie-rungssubstanzen leicht markiert werden und sind dann 20 schwer an Immunreaktionsgläschen zu adsorbieren. Es wurde gefunden, dass diese h-PTH-Fragmente für markierte Verbindungen für den h-PTH-Nachweis infolge ihrer geringeren unspezifischen Adsorption und genauen quantitativen Bestimmungen in RIA nützlich sind.
    25 Die h-PTH [51-84] und h-PTH [46-84] enthalten die Aminosäure Cystein nicht, welche mit einem SH-bindenden Enzym markiert werden kann, doch wurde gefunden, dass diese Peptide quantitativ nachgewiesen werden können, basierend auf EIA, unter Verwendung des Antikörpers gegen 30 das h-PTH-C-endständige Fragment, bei Verwendung eines Peptides der Formel Ia
    R2'-Ala46-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro51-Arg-Lys53-Lys-Glu55-Asp-Asn-Val-Leu-Val60-Glu-Ser-His-Glu-Lys65-Ser-35 Leu-Gly-Glu-Ala70-Asp-Lys-Ala-Asp-Val75-Asp-Val-Leu-Thr-Lys80-Ala-Lys-Ser-Gln84-OH [Ia]
    in welcher R2' Wasserstoff oder die H-Cys45-Gruppe ist, die unter die allgemeine Formel I fällt, d.h. h-PTH [46-84] und [Cys45] h-PTH [45-84], Vorzugsweise kann h-PTH oder das C-endständige Fragment von h-PTH mit Vorteil nachgewiesen werden unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers, der durch Immunreaktion von [Cys45] h-PTH [45-85] oder seinem Komplex mit einem Protein, z.B. einem Immun-45 komplex von Rinderserumalbumin (BSA) als Antigen und unter Verwendung einer Verbindung der Formel Ib
    R'-Lys53-Lys-Glu55-Asp-Asn-Val-Leu-Val60-Glu-Ser-His-Glu-Lys65-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala70-Asp-Lys-Ala-50 Asp-Val75-Asp-Val-Leu-Thr-Lys80-Ala-Lys-Ser-Gln84-OH [Ib;
    40
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