CN115341045A - 一种利用微生物及其相关snp位点预测猪饲料转化率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微生物及其相关SNP位点预测猪饲料转化率的方法，本发明涉及猪遗传基因技术领域，所述微生物为甲基杆菌（Methylobacterium persicinum）。还提供了可用于预测猪饲料转化率的微生物SNP位点，所述SNP位点包括rs81429163、rs81325861、rs81450579、rs81450581、rs81451919。还提供了一种利用微生物预测猪饲料转化率的方法，其包括样品采集、微生物DNA提取与16S rDNA测序、数据质控、相关性分析和验证所述微生物对于饲料转化率的影响。本发明提供的微生物及其相关位点可以有效的预测猪的饲料转化率，即可以通过所述微生物鉴定不同猪种之间猪饲料转化率的高低，从而选出高饲料转化率的猪种。本发明提供的方法可以有效筛选出有效预测猪的饲料转化率的微生物及其相关位点。
Description
技术领域
本发明涉及猪遗传基因技术领域，具体而言，涉及一种利用微生物及其相关SNP位点预测猪饲料转化率的方法。
背景技术
生猪养殖业的主要效益取决于与饲料有关的成本以及所生产的瘦肉的数量和质量。为了提高畜牧业的经济效益，降低饲料成本，有必要了解影响生猪生长发育性能的因素。其中猪的饲料转化率（FCR）是畜牧养殖的重要经济性状，直接与猪的生长性状相关，是指饲养的畜禽增重一公斤所消耗的饲料量，它是评价饲料报酬的一个重要指标，也是编制生产计划和财务计划的重要依据，在育种中具有重要的研究意义。目前，许多研究致力于探索基因与性状之间的关系。但随着研究的深入，其边际效益不断下降，需要一个新的研究切入点
随着对肠道微生物研究的不断深入，肠道微生物及其代谢物的作用不容忽视。越来越多的研究表明，猪的肠道微生物与各种性状之间存在相关性，如饲料转化率、平均日增重和背膘厚度。有学者报道猪肠道菌群中的P. Copri通过代谢产物和TLR4、mTOR信号通路激活宿主的慢性炎症反应，显著增加宿主脂肪沉积。但目前对于猪的育种选择普遍考虑的是遗传因素，鲜有研究将微生物因素应用到猪的育种工作中。
16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA），简称16S rRNA，是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分。16S rRNA的长度约为1,542 nt。研究发现物种间16S rRNA序列既有高变区（V区，物种之间有差异）也有保守区（物种之间高度相似），呈交替排列，原核16S rRNA序列包含9个高变区，其中，V4-V5区其特异性好，数据库信息全，是细菌多样性分析注释的最佳选择。保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变序列区域则能体现物种间的差异，因此，16S rDNA也被称为细菌系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟。16S测序技术的应用推动了肠道微生物的研究。
综上所述，经过申请人的海量检索，本领域至少存在如何利用肠道中的微生物来预测猪饲料的转化率的问题，因此，需要开发或者改进一种可用于预测猪饲料转化率的微生物和SNP位点及其方法。
发明内容
基于此，为了解决利用肠道中的微生物来预测猪饲料的转化率的问题，本发明提供了一种可用于预测猪饲料转化率的微生物和SNP位点及其方法，具体技术方案如下：
一种利用微生物及其相关SNP位点预测猪饲料转化率的方法，所述微生物为甲基杆菌（Methylobacterium persicinum）。
进一步地，所述SNP位点包括rs81429163、rs81325861、rs81450579、rs81450581、rs81451919。
进一步地，其包括样品采集、微生物DNA提取与16S rDNA测序、数据质控、相关性分析和验证所述微生物对于饲料转化率的影响。
进一步地，所述样品采集包括以下步骤：
当64~150日龄的时候采用性能自动测定系统测定猪的饲料转化率，具体为每增加1公斤活重所消耗的标准饲料公斤数，当体重达到130±5KG时，结束测定；原始体重数据经过质控后，计算每个个体的饲料转化率；
采用直肠拭子从猪的肛门进行粪便样品的采集，采集后的样品暂存于冰盒内，随后转运至实验室-80℃冰箱保存；
采集耳组织进行DNA提取，采用GeneSeek Porcine 50K 的基因芯片对猪进行基因分型。
进一步地，所述微生物DNA提取与16S rDNA测序包括以下步骤：
采用CTAB对样本微生物基因组DNA进行提取；
以98℃预变性1分钟；30个循环包括98℃，10秒、50℃，30秒、72℃，30秒、72℃，5分钟进行PCR扩增；
根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后用0.02g/ml的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行纯化回收；
使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit 建库试剂盒进行文库的构建，将构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。
进一步地，所述数据质控包括微生物组数据质控和基因组数据质控。
进一步地，所述相关性分析包括微生物与表型相关和全基因组关联性分析。
进一步地，所述验证所述微生物对于饲料转化率的影响包括通过python利用scikit-learn包建立不同的机器学习回归模型，分别进行5折交叉验证。
进一步地，所述机器学习回归模型包括线性回归LR，决策数DT，随机森林RF，支持向量机SVR，梯度提升XGB。
进一步地，所述微生物与表型相关通过python利用scikit-learn包进行Lasso线性模型的建立，最终通过LASSO模型计算得出与饲料转换率线性相关的微生物；
所述全基因组关联性分析利用gemma进行全基因组分析，利用gec软件矫正p值，最终得到相关联的SNP位点。
上述微生物及其相关位点可以有效的预测猪的饲料转化率，即可以通过所述微生物鉴定不同猪种之间猪饲料转化率的高低，从而选出高饲料转化率的猪种，达到精准选育的目的，有利于利于提高养猪业生产水平和经济效益的目的。上述方法可以有效筛选出有效预测猪的饲料转化率的微生物及其相关位点。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“ 及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例中的一种利用微生物及其相关SNP位点预测猪饲料转化率的方法，所述微生物为甲基杆菌（Methylobacterium persicinum）。
在其中一个实施例中，本技术方案提供了可用于预测猪饲料转化率的微生物SNP位点，所述SNP位点包括rs81429163、rs81325861、rs81450579、rs81450581、rs81451919。
在其中一个实施例中，本技术方案提供了一种利用微生物预测猪饲料转化率的方法，其包括样品采集、微生物DNA提取与16S rDNA测序、数据质控、相关性分析和验证所述微生物对于饲料转化率的影响。
在其中一个实施例中，所述样品采集包括以下步骤：
当64~150日龄的时候采用性能自动测定系统测定猪的饲料转化率，具体为每增加1公斤活重所消耗的标准饲料公斤数，当体重达到130±5KG时，结束测定；原始体重数据经过质控后，计算每个个体的饲料转化率；
采用直肠拭子从猪的肛门进行粪便样品的采集，采集后的样品暂存于冰盒内，随后转运至实验室-80℃冰箱保存；
采集耳组织进行DNA提取，采用GeneSeek Porcine 50K 的基因芯片对猪进行基因分型。
在其中一个实施例中，所述微生物DNA提取与16S rDNA测序包括以下步骤：
采用CTAB对样本微生物基因组DNA进行提取；
以98℃预变性1分钟；30个循环包括98℃，10秒、50℃，30秒、72℃，30秒、72℃，5分钟进行PCR扩增；
根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后用0.02g/ml的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行纯化回收；
使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit 建库试剂盒进行文库的构建，将构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。
所述PCR产物纯化试剂盒为Thermo Scientific 公司 GeneJET 胶回收试剂盒。
在其中一个实施例中，所述数据质控包括微生物组数据质控和基因组数据质控。
所述微生物组数据质控包括以下步骤：
首先利用QIIME2（版本 2021.4）软件中的DADA2插件对原始数据进行质控和聚类；对质控后的数据进行过滤并计算相对丰度；所述过滤的条件为：丰度超过0.1%，且在20%的样品中存在；
过滤后的数据通过比对NCBI RefSeq数据库对这些分类单元进行物种注释；置信度超过97%的菌种，可以认为是同一种菌。
所述基因组数据质控包括以下步骤：
利用PLINK（版本1.9）对原始SNP数据进行过滤，符合以下任一条件的SNP或个体将被排除：
1）个体或SNP缺失率大于0.1的个体或SNP；
2）最小等位基因频率（MAF）小于0.05的SNP；
3）不符合Hardy-Weinberg平衡（HWE）中的SNP。
在其中一个实施例中，所述相关性分析包括微生物与表型相关和全基因组关联性分析。
所述微生物与表型相关包括以下步骤：
通过python利用scikit-learn包进行Lasso线性模型的建立，以表型为y值，微生物相对丰度为x值，过滤特征，选择与表型相关的微生物相对丰度。最终通过LASSO模型计算得出与饲料转换率线性相关的微生物。
所述全基因组关联性分析包括：利用gemma进行全基因组分析，利用gec软件矫正p值为5.23E-5，最终得到相关联的SNP位点。
在其中一个实施例中，所述验证所述微生物对于饲料转化率的影响包括通过python利用scikit-learn包建立不同的机器学习回归模型，分别进行5折交叉验证。
在其中一个实施例中，所述机器学习回归模型包括线性回归LR，决策数DT，随机森林RF，支持向量机SVR，梯度提升XGB。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1：
1．实验材料
以杜长大三元杂交猪为研究对象，收集376头的生长数据、基因组数据和微生物组数据用于本发明。生长性能的测定严格按照猪场内部规范进行，收集376头杜长大三元杂交猪的饲料转化率。
2.试验方法
2.1样品采集：
（1）当64~150日龄的时候采用性能自动测定系统测定猪的生长性状，即饲料转化率，具体为每增加1公斤活重所消耗的标准饲料公斤数。当体重达到130±5KG时，结束测定。原始体重数据经过质控后，计算每个个体的饲料转化率。
（2）在屠宰前进行粪便样品的采集，采用直肠拭子从猪的肛门进行采集，采集后的样品暂存与冰盒内，随后转运至实验室-80℃冰箱保存。
（3）采集耳组织进行DNA提取，采用GeneSeek Porcine 50K 的基因芯片对376头猪进行基因分型。
2.2微生物DNA提取、16S rDNA测序与数据分析：
（1）微生物基因组DNA提取：采用CTAB对样本基因组DNA进行提取。
（2）PCR扩增：以98℃预变性1分钟；30个循环包括（98℃，10秒；50℃，30秒；72℃，30秒）；72℃，5分钟进行PCR扩增。
（3）PCR产物的混样和纯化：根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后用0.02g/ml的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行纯化回收。产物纯化试剂盒使用的是ThermoScientific公司 GeneJET胶回收试剂盒。
（4）文库构建和上机测序：使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free LibraryPreparation Kit建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用NovaSeq 6000进行上机测序。
2.3数据质控：
（1）微生物组数据质控：首先利用QIIME2（版本 2021.4）软件中的DADA2插件对原始数据进行质控和聚类。对质控后的数据进行过滤（丰度超过0.1%，且在20%的样品中存在）并计算相对丰度，过滤后的数据通过比对NCBI RefSeq数据库对这些分类单元进行物种注释；置信度超过97%的菌种，可以认为是同一种菌。经过过滤得到68种微生物。
（2）基因组数据质控：利用PLINK（版本1.9）对原始SNP数据进行过滤，符合以下任一条件的SNP或个体将被排除：1）个体或SNP缺失率大于0.1的个体或SNP；2）最小等位基因频率（MAF）小于0.05的SNP；3）不符合Hardy-Weinberg平衡（HWE）中的SNP。经过处理得到31,931个高质量的SNP位点。
2.4 相关性分析
（1）微生物与表型相关：通过python利用scikit-learn包进行Lasso线性模型的建立，以表型为y值，68种微生物相对丰度为x值，过滤特征，选择与表型相关的微生物相对丰度。最终通过LASSO模型计算得出1种微生物与饲料转换率线性相关，即为甲基杆菌（Methylobacterium persicinum）。
（2）全基因组关联性分析：利用gemma进行全基因组分析，利用gec软件矫正p值为5.23E-5，最终得到相关联的SNP位点有：rs81429163、rs81325861、rs81450579、rs81450581、rs81451919。
2.5验证所述微生物对于饲料转化率的影响：
通过python利用scikit-learn包建立不同的机器学习回归模型（线性回归LR，决策数DT，随机森林RF，支持向量机SVR，梯度提升XGB），分别进行5折交叉验证，每一折将数据随机分为30%测试集和70%的验证集，以所述的微生物相对丰度进行饲料转化率的预测，通过均方误差（MSE）反应预测的准确性，MSE越小代表模型预测能力越准确。5次交叉验证的MSE如表1所示：
表1为模型中加入微生物及其相关位点信息，5次交叉验证的MSE。
表1：
由表1可以看出，利用所述的微生物进行表型预测，预测的MSE的均值分别为0.093、0.199、0.113、0.106和0.109，所述微生物及其相关位点可以有效的预测猪的饲料转化率，即可以通过所述微生物鉴定不同猪种之间的猪饲料转化率的高低，从而选出高饲料转化率的猪种，达到精准选育的目的，有利于利于提高养猪业生产水平和经济效益的目的。本发明还提供了筛选出预测猪种的猪饲料转化率高低的微生物的方法，利用该方法可以有效地筛选出相关微生物及其相关SNP位点。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种利用微生物及其相关SNP位点预测猪饲料转化率的方法，其特征在于，所述微生物为甲基杆菌（Methylobacterium persicinum）。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SNP位点包括rs81429163、rs81325861、rs81450579、rs81450581、rs81451919。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其包括样品采集、微生物DNA提取与16SrDNA测序、数据质控、相关性分析和验证所述微生物对于饲料转化率的影响。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述样品采集包括以下步骤：
当64~150日龄的时候采用性能自动测定系统测定猪的饲料转化率，具体为每增加1公斤活重所消耗的标准饲料公斤数，当体重达到130±5KG时，结束测定；原始体重数据经过质控后，计算每个个体的饲料转化率；
采用直肠拭子从猪的肛门进行粪便样品的采集，采集后的样品暂存于冰盒内，随后转运至实验室-80℃冰箱保存；
采集耳组织进行DNA提取，采用GeneSeek Porcine 50K 的基因芯片对猪进行基因分型。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物DNA提取与16SrDNA测序包括以下步骤：
采用CTAB对样本微生物基因组DNA进行提取；
以98℃预变性1分钟；30个循环包括98℃，10秒、50℃，30秒、72℃，30秒、72℃，5分钟进行PCR扩增；
根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后用0.02g/ml的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行纯化回收；
使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit 建库试剂盒进行文库的构建，将构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用NovaSeq 6000进行上机测序。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述数据质控包括微生物组数据质控和基因组数据质控。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述相关性分析包括微生物与表型相关和全基因组关联性分析。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述验证所述微生物对于饲料转化率的影响包括通过python利用scikit-learn包建立不同的机器学习回归模型，分别进行5折交叉验证。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述机器学习回归模型包括线性回归LR，决策数DT，随机森林RF，支持向量机SVR，梯度提升XGB。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微生物与表型相关通过python利用scikit-learn包进行Lasso线性模型的建立，最终通过LASSO模型计算得出与饲料转换率线性相关的微生物；
所述全基因组关联性分析利用gemma进行全基因组分析，利用gec软件矫正p值，最终得到相关联的SNP位点。
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