CN108192956A - 一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用，该方法包括三个步骤：（1）对靶DNA进行PCR扩增；（2）用CAT方法处理PCR扩增；（3）以CAT处理的DNA为模板进行PCR扩增。运用该方法可成功检测人宫颈癌细胞中HPV16和HPV18的L1和E6/E7基因。本发明利用了CRISPR技术对DNA的特异性识别切割特性，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和特异性PCR引物设计等关键瓶颈问题。

Description

一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用。

背景技术

对于基础研究、各种检测及诊断应用，DNA检测和基因分型一直很重要。因此，DNA检测和基因分型技术一直受到广泛关注，从而促进了该类技术发展。归纳起来，主要有三类DNA 检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术。PCR是最常用的DNA检测和基因分型技术。基于PCR的DNA检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重PCR扩增。PCR检测可以通过传统PCR(tPCR)、定量PCR(qPCR)和最近开发的数字PCR来实现。因为具有明显的优点，如实时检测和高灵敏度，qPCR在几乎所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字PCR，作为临床检测工具，具有很大的潜力和优势。然而，PCR技术在用于区分高度相关的基因型时，要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除PCR技术外，DNA微阵列等多种DNA杂交技术也被广泛用于检测和分型DNA。然而，由于其昂贵的设备、复杂的检测流程和不可避免的非特异性杂交，DNA微阵列技术不能像PCR一样成为常规DNA检测和基因分型工具。DNA测序是另一种有效的DNA检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(NGS)技术的出现，诸如Illumina NovaSeq等NGS平台的DNA测序工具越来越多。然而，由于需要昂贵的设备和化学试剂，它们仍然不能像PCR一样用于常规研究，检测和诊断。因此，相比之下，如果克服了引物设计的限制，PCR仍然是最方便、经济高效的DNA检测和基因分型的平台。

Ishino等人于1987年首先在大肠杆菌(E.coli)的基因组中发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)，并由Jansen等人在2002年定义为CRISPR。现在，已知的CRISPR系统包括三种不同类型(类型I，类型II和类型III)。I型和III型系统由多种Cas蛋白组成，而II 型系统只需要一种Cas蛋白Cas9。Cas9与CRISPR相关的RNA(crRNA)和反式激活的crRNA (tracrRNA)相关联。TracrRNA能够激活Cas9核酸酶，crRNA与目标DNA的20个核苷酸序列互补。因此后者决定了CRISPR-Cas9系统的特异性。crRNA引导的Cas9核酸酶可以与原始毗邻基序(PAM)相邻的靶DNA结合，并在PAM序列(NGG)上游三个碱基处切割靶DNA。将tracrRNA和crRNA整合成一个单导向RNA(sgRNA)后，极大地简化了II型CRISPR系统的应用。由sgRNA引导着Cas9去切割靶DNA。目前，CRISPR-Cas9系统由于其简便性和高效性，被许多研究者广泛应用于基因组编辑领域。另外，dCas9(dead Cas9)是由Cas9改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)，dCas9(dead Cas9) 作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。

尽管Cas9/sgRNA已广泛应用于基因编辑和调控，但很少应用于核酸检测。凭借高特异性的DNA切割能力(能够区分单碱基)，Cas9/sgRNA在DNA检测和分型上有具有很大的潜力。最近，CRISPR-Cas9系统已被用于检测Zika病毒并且能够对美国和非洲Zika病毒进行分型。鉴于CRISPR的工具的高度特异性，CRISPR-Cas9在区分病毒株时可以达到单碱基的分辨率，可以在单碱基水平上对直系同源的细菌和病毒进行分型检测。最近CRISPR系统(III型的cas13a /C2c2)已经应用于Zika病毒的检测并且具有超高灵敏度(病毒颗粒的量低至2aM)。这些研究表明，CRISPR系统用于开发核酸检测技术时具有很大的潜力和优势。然而，在目前报道的基于Cas9的核酸检测方法中，他们是先用待检测RNA反转录出单链DNA，再生成双链DNA，然后用Cas9/sgRNA系统切割双链DNA来达到分型RNA的目的。因此，Cas9/sgRNA系统尚未直接用于检测和分型基因组DNA，这是常规核酸检测的主要目的。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是解决目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和特异性 PCR引物设计等关键瓶颈问题，提供一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用，利用了CRISPR技术对DNA的特异性识别切割特性，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和特异性PCR引物设计等关键瓶颈问题。

技术方案：

一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法，包括以下步骤：

步骤1，对靶DNA进行PCR扩增；

步骤2，对步骤1的扩增序列进行处理，依次包括Cas9/sgRNA切割、DNA末端加腺嘌呤和 T接头连接；

步骤3，对步骤2处理后的序列进行PCR扩增。

进一步地，所述Cas9/sgRNA切割是利用Cas9/sgRNA对靶DNA的双链进行切割。

进一步地，所述DNA末端加腺嘌呤是在Cas9/sgRNA切割后的双链DNA的3′端末端产生一个突出的A碱基。

进一步地，所述T接头连接是将T接头连接到加腺嘌呤处理后末端带有3′端突出A碱基的双链DNA末端。

进一步地，所述T接头为一段带有粘性末端的双链寡核苷酸。

进一步地，所述粘性末端为3′端突出一个T碱基。

进一步地，步骤3进行PCR扩增的引物5′端序列可与T接头序列退火，3′端序列可与靶DNA 上序列退火。

上述基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法在DNA检测和基因分型中的应用。

基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法设计的试剂盒，该试剂盒用于检测高危型人乳头状瘤病毒。

有益效果：本发明提供了一种基于Cas9核酸酶检测靶DNA的新方法，命名为ctPCR，代表Cas9/sgRNA分型PCR(Cas9/sgRNA-typing PCR)。通过成功检测了13种HPV亚型中的两种高危型HPV(HPV16和HPV18)L1基因，验证了该方法。通过成功检测了三个宫颈癌细胞(HeLa，SiHa和C-33a)中的两种高危型HPV(HPV16和HPV18)L1和E6/E7基因，再次验证了该方法。

本发明表明，ctPCR具有较高的特异性和灵敏度。本发明还表明，ctPCR检测可以通过简单的两轮qPCR实现，使ctPCR适用于临床诊断。通过被广泛使用的qPCR仪，3到4小时可以完成整个ctPCR检测过程。因此，ctPCR可以应用于未来的DNA检测和基因分型。

附图说明

图1为本发明的ctPCR检测及分型靶DNA分子原理及流程示意图。

图2为实施例1用Cas9/sgRNA体外切割HPV L1基因，首先用HPV L1质粒转化大肠杆菌DH5α，用Cas9/sgRNA质粒转化挑选的Amp耐药细菌，将转化的细胞在具有氨苄青霉素加氯霉素的琼脂上培养过夜并成像。

图3为实施例2用Cas9/sgRNA切割HPV16和HPV18L1基因，图3(A)sgRNA靶基因和通用PCR引物在HPV16和HPV18的L1和E6-E7基因中的位置和HPV L1质粒，图3(B)Cas9/sgRNA切割HPV16L1基因，sgRNA：16-1274和16-950，图3(C)Cas9/sgRNA切割HPV18L1基因， sgRNA：18-1490和18-1274。Cas9蛋白特异于HPV16或18L1基因的sgRNA与Cas9蛋白结合后 切割线性化的HPV16或HPV18L1质粒(A)，DNA用琼脂糖凝胶运行电泳检测。

图4为实施例3中通过ctPCR用不同的引物检测HPV L1基因，图4(A)通过ctPCR用不同的引物检测检测和分型HPV DNA和ctPCR的实验流程示意图，图4(B)通过ctPCR用不同的引物检测HPV16L1基因，图4(C)通过ctPCR用不同的引物检测HPV18L1基因。最后的PCR 产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测。引物：与ctPCR检测中使用的常规T接头(oJW接头)互补的通用引物；引物对：与常规T接头和Cas9切割产物末端的3个核苷酸互补的一对引物(命名为通用-特异引物；gs-primers)。

图5为实施例3中HPV16或18L1基因的ctPCR检测灵敏度，图5(A)用基于tPCR的ctPCR 检测HPV16L1基因，图5(B)用基于tPCR的ctPCR检测HPV18L1基因，图5(C)用基于qPCR的ctPCR检测HPV18L1基因。

图6为实施例3中用ctPCR检测13例HPV亚型中的HPV16或18L1基因，图6(A)检测十三种HPV亚型中的HPV16L1基因，图6(B)检测十三种HPV亚型中的HPV18L1基因。最终的ctPCR产物用琼脂糖凝胶进检测行。

图7为实施例4用基于tPCR的ctPCR检测宫颈癌细胞中HPV16和HPV18基因，图7(A)基于tPCR的ctPCR检测和分型HPV DNA的流程示意图，图7(B)用ctPCR检测SiHa gDNA(200ng)中的HPV16L1和E6-E7基因，图7(C)用ctPCR检测HeLa gDNA(200ng)中的HPV18L1 和E6-E7基因。用C-33a gDNA(200ng)作为阴性对照，并使用无DNA的模拟检测作为空白对照。最终的ctPCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

图8为实施例4使用基于qPCR的ctPCR检测宫颈癌细胞中HPV16和HPV18基因，图8(A) 使用基于qPCR的ctPCR检测和分型HPV DNA的示意图，显示了每个步骤中的反应体积和下一步使用的溶液(右)；图8(B)检测三种人宫颈癌细胞系HeLa、SiHa和C-33a中的HPV16L1和E6-E7基因。用每个细胞系200ng gDNA作为模板进行qPCR1。

图9为实施例4使用基于qPCR的ctPCR检测HeLa细胞中HPV18L1基因，图9(A)用通用引物MY09/MY11，qPCR1检测HeLa gDNA中的HPV18L1基因，图9(B)用ctPCR分型HPV18 L1基因。最终的ctPCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明提供了一种基于Cas9核酸酶检测靶DNA的新方法，该方法被命名为ctPCR，代表Cas9/sgRNA或CRISPR型PCR。

在ctPCR检测中，(1)首先用一对通用引物以第一轮PCR(PCR1)扩增靶DNA；(2) 然后用CAT法对PCR1产物做一些连续处理：由依次进行的三个反应组成，包括Cas9/sgRNA 切割、DNA末端加腺嘌呤(A)，以及T接头连接；(3)最后，使用一对通用的特异性引物 (gs引物)，以第二轮PCR(PCR2)扩增处理过的PCR1产物。PCR1用于鉴定DNA样本是否含有目标DNA(如病毒感染)，而PCR2则用于区分DNA样本中DNA基因型(如病毒亚型)。

步骤(1)所述通用引物为可将含有目标DNA序列的DNA片段从待检测DNA样品中PCR扩增出来的一对引物；该对引物既可以是单一序列，也可以是简并序列。

步骤(3)所述特定引物包括一个通用引物或一对“通用-特异引物”；其中一个通用引物是指可与T接头序列退火的引物；一对“通用-特异引物”是指引物主要序列(5′端序列)可与T接头序列退火，而3′端序列可与目标DNA上的序列退火；其中3′端序列一般使用少数几个碱基。

步骤(1)和步骤(3)所述PCR包括普通PCR、定量PCR、数字PCR，以及其他类型的PCR。

步骤(2)中Cas9/sgRNA切割是利用Cas9核酸酶与靶向目的DNA的一对sgRNA混合，形成两个Cas9/sgRNA复合物；该复合物在sgRNA的引导靶向目的DNA，使Cas9/sgRNA复合物与目的DNA结合并在Cas9的作用下发生目的DNA的双链切割。DNA末端加腺嘌呤(A) 是利用普通Taq DNA聚合酶对Cas9/sgRNA切割产生的平末端进行处理，则在双链DNA的 3′端末端产生一个突出的A碱基，该A碱基有利于T接头的连接。T接头连接是利用T4DNA 连接酶及其他具有类似功能的酶将T接头连接到加A处理后末端带有3′端突出A碱基的双链DNA末端。所述T接头为一段带有粘性末端的双链寡核苷酸；该T接头的粘性末端为3′端突出一个T碱基；所述T碱基可与步骤(3)中加A处理后产生的双链DNA的3′端突出的 A碱基退火。

上述技术方案中，所述Cas9包括与Cas9类似其他CRISPR相关核酸酶，如Cpf1等；所述sgRNA包括对应于其他CRISPR相关核酸酶的引导RNA。使用其他CRISPR相关核酸酶 Cas9时，针对其他CRISPR相关核酸酶的切割特征对本方法加A及接头连接所进行的修改。

当检测高拷贝靶DNA或仅用于含量丰富的靶DNA分型检测时，步骤(1)PCR扩增靶DNA可省略，直接使用Cas9与一对sgRNA形成的复合体切割靶DNA，切割产物经加A并连接T接头后，利用一个可与T接头退火的通用或通用-特异引物与另一可与靶DNA退火的引物进行步骤(3)PCR扩增，即可。

本发明表明，ctPCR可以在13种不同高危型人乳头状瘤病毒(HPV)亚型中检测HPV16 和HPV18的L1基因。本发明还表明，ctPCR可以针对L1和E6/E7基因检测人宫颈癌细胞(HeLa和SiHa)中的两种高危型HPV(HPV16和HPV18)。通过这些原理验证试验，本发明开发了一种新的基于CRISPR的PCR方法，用于检测和分型DNA。该方法即充分利用了 PCR的优势，又通过CRISPR与PCR的结合，消除了引物设计的弊端。该方法实现了快速 DNA检测和分型，不依赖于杂交和测序。

HPV是一种双链DNA病毒，是宫颈、肛门与生殖器和其他癌症的病原体。有大约100个不同变异的HPV亚型。根据致癌能力，将HPV分为高危型和低危型HPV。世界上最常见的高危型HPV是HPV16和HPV18，能够引起大约70％的宫颈癌。其他高危型HPV也包括 HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。低危型的HPV包括HPV6、11、 40、42、43、44、61和81。由于其致癌性，HPV检测广泛应用于宫颈癌诊断和常规妇女健康检查，目前主要采用各种基于PCR的技术来进行检测。例如，Roche cobas HPV检测(cobas 4800或cobas 6800/8800系统)在HPV初步筛选中得到临床验证。在单个患者样本的单一检测中，cobas HPV检测在提供HPV16和HPV18的特异性基因分型信息的同时，也会将其他 12种高危型HPV的报告结果汇集起来。由于包含多种高度可变的基因型，HPV是证实核酸检测和基因分型方法的理想材料。

L1基因已广泛用于检测和分型HPV。在本发明中，首先设计了用于检测HPV L1基因的 sgRNA，因为有一组用各种HPV亚型的L1基因克隆的质粒。用Cas9/sgRNA进行了HPV L1基因的体内和体外切割。还通过检测HPV16和HPV18L1基因来验证ctPCR方法，这有助于我们通过引入“通用-特异引物”(gs-primer)来改进ctPCR方法。还通过检测ctPCR的L1 基因，最终在两个宫颈癌细胞HeLa和SiHa中检测出了两种高危型HPV HPV16和HPV18的基因。然而，据报道，当整合到宿主细胞基因组中时，HPV会丢失L1基因，因此可能导致假阴性检测。另外，几乎所有HPV18阳性宫颈癌基因组中只整合了HPV18的基因，HPV16 阳性宫颈癌基因组中HPV16基因在所有整合基因中的比例≤60％。因此，HPV检测越来越依赖于致癌基因E6/E7，这可以避免错过检测，因为E6/E7在整合后总是存在的。因此，E6/E7 基因可作为HPV检测的可靠目标。在三种人宫颈癌细胞系HeLa，SiHa和C-33a中检测HPV16 和HPV18时，本发明也检测到E6/E7基因。结果表明，可以分别从SiHa和HeLa细胞检测出两种最高危型的HPVHPV16和HPV18；然而，在C-33a中没有检测到两种HPV。这与HeLa 是HPV18阳性细胞，SiHa是HPV16阳性细胞，C-33a是HPV阴性细胞的事实一致。

本发明也观察到整合型HPV DNA缺失部分L1。在本发明中，最初设计了一对HPV16和HPV18L1基因的sgRNA(16-1274/16-950；18-1490/18-1274；图3)。使用这些sgRNA成功地进行了L1质粒的体内和体外切割(图3-6)。然而，当使用sgRNA 18-1490/18-1274检测 HeLa细胞中的HPV18时，发现ctPCR不能扩增DNA。因为据报道，通过使用通用引物 MY09/MY11可以在HeLa细胞中检测到L1基因，因此设计了一对新的HPV16和HPV18L1 的sgRNA(L1-1和L1-2为HPV16；HPV18的L1-5和L1-11；表2；图3)，其位于引物 MY09/MY11扩增出的L1区中。在三个宫颈癌细胞系中重新扩增了L1基因。结果，在HeLa 和SiHa中发现了HPV L1基因。然后用ctPCR分型两个细胞的HPV L1基因，分别证实HPV16 和18L1基因存在于SiHa和HeLa细胞中。这些数据表明，在整合的HPV DNA中遗漏了最初设计的sgRNA靶向的L1区域。使用两对sgRNA对HPV进行体内切割和体外ctPCR检测表明多种亚型的特异性sgRNA可以很轻易地设计出来，这取决于PAM在基因组中广泛存在和Cas9/sgRNA系统的高度特异性。意味着特异性依赖于sgRNA的ctPCR比依赖于特异性引物的传统PCR有更高的基因分型能力

本发明中，在宫颈癌细胞系中检测HPV16和HPV18DNA时，用了两轮PCR。第一轮 PCR用通用引物MY09/MY11扩增L1基因或用通用引物E67-6F/E67-7R扩增E6-E7基因。 PCR产物用Cas9/sgRNA切割，加腺嘌呤(A)，并与不变的T接头连接。然后用普通引物或一对“通用-特异引物”(gs-primer)进行第二轮PCR。因此，使用第一轮PCR扩增HPV DNA，以判断样品是否被HPV感染。第二轮PCR与Cas9/sgRNA切割，加A和T接头连接共同命名为CRISPR型PCR(ctPCR)，用于鉴别感染样品的HPV亚型。由于PCR扩增的高灵敏度，第一轮PCR(PCR1)保证了检测下限。此外，PCR1还为后续ctPCR提供了足够的靶DNA。

DNA分型对于DNA特异性检测至关重要，尤其对于区分检测病毒亚型和寡核苷酸多态性。在本发明中，为了保证ctPCR检测的特异性，采取了两种策略。一个是设计两个高度特异于靶DNA的sgRNA。另一种是在ctPCR中使用一对gs引物。尽管Cas9/sgRNA系统的脱靶限制了在人基因治疗中的应用，但是ctPCR用双重sgRNA切割的是DNA小片段，并不影响ctPCR检测。此外，超出PCR扩增极限的远距离靶标也不影响ctPCR。即使脱靶在PCR 扩增范围内发生了，也可以通过通用-特异引物来防止这些脱靶被ctPCR扩增。通用-特异引物进一步保证了ctPCR在一对特异性sgRNA基础上的特异性检测。因此，本发明表明ctPCR 可以特异地检测两种人类宫颈癌细胞系HeLa和SiHa复杂基因组DNA中的两种最高危险 HPV(HPV16和HPV18)的L1和E6-E7基因。

实时PCR已经成为广泛普及的DNA检测工具。以临床应用为目的，本发明验证了用qPCR 实现ctPCR检测的可行性。发现Cas9/sgRNA可以直接切割qPCR1反应液，表明qPCR1反应体系不会干扰下一步Cas9/sgRNA切割。Cas9/sgRNA反应液不影响随后的加A和T接头连接，也不影响最终的qPCR2。因此，整个ctPCR检测过程都不用纯化DNA，只需简单的三步溶液转移即可实现(图8A)。各种生化反应之间的这种不同功能的兼容性使得ctPCR容易且快速地实现临床检测。此外，基于qPCR的ctPCR也增加了检测下限。

显然，ctPCR的检测周期主要取决于两轮PCR。在这项发明中，实际上优化了CAT步骤。因此，提供了一个最短时间的CAT优化处理流程(图7和图8)。发现Cas9/sgRNA在ctPCR检测中切割靶标只需要5分钟，表明Cas9/sgRNA的体外切割效率很高。还发现，加A和T 接头连接也分别只需要五分钟。因此，整个CAT处理过程可以在15分钟内完成。事实上，通过PCR1富集靶DNA有助于Cas9/sgRNA的高效率切割。在本发明中，曾经不经PCR扩增而直接检测过HeLa gDNA中的HPV18，然而，即使在长时间(2小时)内切割大量的gDNA (1μg)之后，检测也失败了。这与最近发现Cas9/sgRNA复合物长达6小时才能获得大肠杆菌基因组(约400万个碱基对)中靶标的发现一致。因此，在高度复杂的DNA环境(如人类gDNA)中，Cas9/sgRNA复合物需要很长时间才能找到低拷贝靶点。由于Cas9在DNA切割后不会脱离DNA，使这种情况更加严重。该问题只有通过使用更多的Cas9/sgRNA复合物和更长时间的切割来解决。对于临床应用来说，耗时且昂贵的检测是致命的。然而，当我们检测到L1质粒时，无PCR1的ctPCR对高拷贝靶标有效。

然而，必须注意的是，本发明只是用HPV作为一种实验材料来验证ctPCR方法的可行性。该方法也可用于检测其他DNA。本发明采用HPV DNA作为ctPCR检测的DNA靶标。结果表明ctPCR可以检测和分型HPV DNA。发现ctPCR可以在少至0.005ng宫颈癌细胞系gDNA中检测到HPV16和HPV18DNA。

实施例1用Cas9/sgRNA切割HPV 16and 18L1基因

实验方法：

构建sgRNA表达质粒：首先合成一对引物，以pCas9(Addgene)为模板，PCR扩增原核Cas9基因序列，其中正向引物含有J23100启动子加RBS序列(总共88bp)。PCR产物克隆到去除了Cas9，trancRNA和间隔区RNA序列的pCas9质粒中。从pgRNA-细菌(Addgene)中通过 PCR扩增出J23119-sgRNA序列，并克隆到新制备的pCas9载体中。将新质粒命名为 pCas9-sgRNA，在J23100和J23119启动子的控制下，pCas9-sgRNA可以分别表达Cas9蛋白和 sgRNA。该质粒还含有cat启动子控制下的氯霉素基因。将BsaI酶切割过的各种sgRNA序列(退火的双链寡核苷酸在末端带有BsaI位点)克隆到pCas9-sgRNA中，在细菌中同时表达Cas9蛋白和sgrRNA。sgRNA的靶序列用于体内Cas9/sgRNA切割(加PAM)示于表1。

用Cas9/sgRNA体内切割HPV16和18L1基因：用Cas9/sgRNA对HPV L1基因进行体内切割，首先用包含AmpR启动子控制的HPV L1基因和氨苄青霉素抗性基因(AmpR) 的质粒转化大肠杆菌DH5α。在氨苄青霉素固体培养基上选择转化成功的大肠杆菌，通过PCR 确认其中的阳性大肠杆菌。然后用pCas9-sgRNA转化阳性大肠杆菌并表达各种sgRNA。将转化的大肠杆菌在具有氨苄青霉素加氯霉素的固体培养基上培养过夜并成像。

用Cas9/sgRNA体内切割HPV16和18L1基因：用Cas9/sgRNA对HPV L1基因进行体内切割，首先用包含AmpR启动子控制的HPV L1基因和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒转化大肠杆菌DH5α。在氨苄青霉素固体培养基上选择转化成功的大肠杆菌，通过PCR 确认其中的阳性大肠杆菌。然后用pCas9-sgRNA转化阳性大肠杆菌并表达各种sgRNA。将转化的大肠杆菌在具有氨苄青霉素加氯霉素的固体培养基上培养过夜并成像。

实验结果：

为了初步探讨Cas9/sgRNA系统是否可以特异地区分HPV亚型，首先进行了体内切割检测。在该实验中，首先用包含氨苄青霉素抗性的HPV L1质粒转化大肠杆菌DH5α。然后用能够表达氯霉素的Cas9/sgRNA质粒转化阳性细胞。培养过夜后，对琼脂平板进行成像。Cas9核酸酶在特异于HPV L1基因的sgRNA的引导下可以杀死具有HPV L1质粒的大肠杆菌(图2)。这些结果表明，所设计的sgRNA可以特异地识别靶目标，Cas9/sgRNA可用于HPV分型。

实施例2用Cas9/sgRNA切割克隆到质粒中的HPV L1基因

实验方法：

制备sgRNA：根据说明书，用T7聚合酶(New England Biolabs)通过体外转录合成sgRNA。使用表1中列出的寡核苷酸经过三次PCR扩增出sgRNA的DNA模板。用F1和R(7个循环)进行第一次PCR。用第一次PCR的产物作为模板，F2和sgR作为引物进行第二次PCR(30个循环)，用第二PCR的产物作为模板，F3和sgR作为引物进行第三次PCR(30个循环)。第三次PCR的产物纯化后作为体外转录的模板。然后将纯化后的sgRNA模板用T7RNA聚合酶(NewEngland Biolabs)在37℃孵育过夜进行体外转录。将体外转录的RNA与Trizol溶液混合，然后用氯仿和异丙醇依次萃取，用乙醇沉淀。将纯化的RNA溶解在无RNase的ddH₂O中，并通过光谱法进行定量。

用Cas9/sgRNA切割克隆在质粒中的HPV L1基因：重组Cas9蛋白购自New EnglandBiolabs (NEB)。Cas9消化反应(30μL)由1×Cas9核酸酶反应缓冲液，1μM Cas9核酸酶(NEB)，300nM sgRNAa(16-1274或18-1490；表2)和300nM sgRNAb(16-950或18-1274；表2)首先在25℃下温育10分钟(该过程在下文中称为预组装)。将与上述溶液混合的200ng底物DNA(由AatII线性化的L1质粒DNA)在37℃下孵育5分钟。将反应产物与含有10×SDS的上样缓冲液(Takara)混合，并用1.0％琼脂糖凝胶运行。

实验结果：

在Cas9/sgRNA高效地对HPV L1基因进行体内切割后，设想如何通过sgRNA引导的Cas9 特异性地切割DNA以用于体外检测和分型DNA。因此，进行了体外切割实验。首先用限制性内切核酸酶AatII将包含HPV16或HPV18L1基因的质粒线性化，产生有四个碱基突出的3'端线性DNA片段。我们用与HPV16和HPV18L1基因特异的sgRNA结合Cas9核酸酶来切割线性化的HPV16和HPV18L1质粒DNA(表2)。结果表明，HPV16和HPV18L1基因可以被其对应的sgRNA特异地识别，并被Cas9核酸酶切割(图3)。这意味着Cas9/sgRNA体外的特异性DNA 切割可用于检测和分型DNA。

实施例3用ctPCR检测HPV 16和18L1基因

实验方法：

制备sgRNA：同实例1。

用ctPCR检测克隆在质粒中的HPV 16和18L1基因：为了制备T接头，将oligooJW102和 oJW103(表3)溶解在Tris-HCl/EDTA/NaCl(TEN)缓冲液中并在相同摩尔中混合。将混合物在95℃加热5分钟，并缓慢冷却至室温。一对特异于HPV16和HPV18L1基因的sgRNA与Cas9 蛋白质结合后切割各种HPV亚型(200ng)L1基因克隆的质粒。将质粒(200ng)与含有1×Cas9 核酸酶反应缓冲液，1μMCas9核酸酶，300nM sgRNA a(16-1274或18-1490；表2)，300nM sgRNA b(16-950或18-1274；表2)的预组装的Cas9/sgRNA复合物混合，并在37℃下孵育5分钟。将消化反应液(5μL)与5μL预混Taq(Takara)混合，并在72℃下孵育5分钟加A。将加A 反应液(10μL)与1×T4连接酶缓冲液，830nM T接头和5U T4DNA连接酶混合，并在22℃下孵育5分钟。Cas9切割，加A和T接头连接的过程简称为CAT。最后，通过对T接头退火的通用引物(oJW102)或一对特异于HPV16和HPV18L1基因的通用引物(gs引物)，用tPCR扩增CAT 处理的DNA。tPCR反应体系：10μL SYBR Green(Bioer)，500nM通用引物(oJW102；表3) 或500nM特异于HPV16和18L1和E6-E7基因的gs引物(表3)。PCR程序如下：95℃2分钟；95℃ 15秒，60℃30秒和72℃60秒，30个循环；72℃5分钟。用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

实验结果：

为了用Cas9/sgRNA检测和分型DNA，设计了一种CRISPR型PCR(ctPCR)方法。在该方法中，首先用一对与靶DNA特异的sgRNA切割靶DNA。然后将切割产物加上腺嘌呤(A)尾巴，并与T接头连接。我们将Cas9切割的过程，加A和T接头连接简称为CAT。最后，通用引物和T接头退火后，用PCR扩增CAT处理的DNA(图4A)。用这种方法检测HPV16和HPV18。结果表明，通过该方法(图4B)特异地检测到了HPV16靶DNA，而用该方法检测HPV18时，有非特异性DNA片段产生(图4C)。为了提高检测特异性，在能够和T接头退火的通用引物的 3'末端添加了三个特异的核苷酸。将这种引物命名为通用引物(gs-primer)。根据HPV16和 HPV18sgRNA的切割位点制备了一对HPV16和HPV18的gs引物。然后用一对gs引物扩增CAT 处理的DNA。因此，发现通过改进的ctPCR方法(图4，B和C)特异地检测了HPV16和HPV18 目标DNA。

接下来探讨了ctPCR检测L1基因的灵敏度。用针对HPV16和HPV18L1基因设计的一对 sgRNA结合Cas9核酸酶分别切割不同量的HPV16和HPV18L1基因。将切割的DNA加A并与T接头连接。然后用对应的gs引物通过PCR2对CAT处理过的DNA进行扩增，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果表明，ctPCR具有很高的扩增效率和灵敏度。发现基于tPCR的ctPCR能检测到少至5ng的CAT-处理的HPV18L1质粒DNA(图5)。此外，当通过qPCR扩增CAT处理的HPV18L1质粒DNA时，可以检测到10000倍稀释的CAT处理的HPV18L1质粒DNA。这些数据表明CAT处理效率较高。

为了进一步验证ctPCR的特异性，用HPV16或HPV18的sgRNA结合Cas9蛋白切割12个HPV 亚型的L1基因。然后将切割的DNA加A并与T接头连接。使用gs引物，用tPCR扩增CAT处理的DNA。最后，用琼脂糖凝胶电泳检测tPCR产物。结果表明，ctPCR可以在12种HPV亚型中特异地检测HPV16和HPV18的L1基因(图6)。两种最高危型的HPV亚型HPV16和HPV18可以从其他10种高危HPV亚型区分开。

实施例4用ctPCR检测宫颈癌细胞中HPV基因

实验方法：

制备sgRNA：同实例1。

用ctPCR检测人宫颈癌细胞中的HPV DNAs，使用了两种PCR扩增方法，一是用传统PCR (tPCR)检测，二是用定量PCR(qPCR)检测。

tPCR检测：对于tPCR检测，L1或E6-E7基因的PCR1扩增反应：10μL预混基质STARSTAR Taq(Takara)，500nM MY09或E67-6F(表2)，500nM MY11或E67-7R(表2)，三种人宫颈癌细胞(SiHa、HeLa和C-33a)的各种gDNA。PCR程序如下：95℃2分钟；35个循环：95℃15秒，60℃30秒、72℃60秒；72℃5分钟。PCR产物用琼脂糖凝胶进行检测。将PCR1产物 (5μL)与预组装的Cas9/sgRNA复合物混合，其含有1×Cas9核酸酶反应缓冲液，1μM Cas9 核酸酶，300nM sgRNAa(L1-1或L1-5用于L1基因；E6-E6-E7基因的7或E6-10；表2)和300 nM sgRNAb(L1基因的L1-2或L1-11；E6-E7基因的E7-6或E7-1；表2)在37℃下孵育5分钟进行切割。将切割产物(5μL)与5μL预混Taq(Takara)混合，并在72℃下孵育5分钟，在末尾加上A碱基。加A反应产物(10μL)与1×T4连接酶缓冲液，830nM T接头和5U T4DNA连接酶混合，并在22℃下孵育5分钟。最后，将CAT处理的PCR1产物(1μL)在含有10μL SYBR Green (Bioer)，500nM每个特异于HPV16和18L1和E6-E7基因的gs引物(表3)的20μL tPCR反应体系中进行扩增。PCR程序如下：95℃2分钟；30个循环：95℃15秒、60℃30秒、72℃60 秒；72℃5分钟。PCR程序在9700PCR仪(ABI)上运行。PCR2产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

qPCR检测：对于qPCR检测，qPCR1用对L1或E6-E7基因进行扩增，qPCR1反应(20μL)：10μL 2×Sybr Green Master Mix(Yeasen)，500nM MY09或E67-6F(表2)，500nM MY11或E67-7R(表2)，三种各种量的人宫颈癌细胞(SiHa、HeLa和C-33a)的gDNA。qPCR程序如下：95℃10分钟，95℃15秒，60℃30秒和72℃1分钟40个循环。将qPCR1产物(2μL)与预组装的Cas9/sgRNA复合物混合，其中含有1×Cas9核酸酶反应缓冲液、1μM Cas9核酸酶、 300nM sgRNA a(L1-1或L1-5用于L1基因；E6-E6-E7基因的7或E6-10；表2)和300nM sgRNA b (L1基因的L1-2或L1-11；E6-E7基因的E7-6或E7-1；表2)。将反应物在37℃下孵育5分钟。将切割反应产物(5μL)与5μL预混Taq(Takara)混合，并在72℃下孵育5分钟进行加A。将加 A反应产物(10μL)与1×T4连接酶缓冲液，830nM T接头和5U T4DNA连接酶混合，并在22℃下孵育5分钟。最后，将CAT处理的qPCR1产物(1μL)在含有10μL 2×Sybr Green Master Mix (Yeasen)，500nM每个特异于HPV16和18L1和E6-E7基因的gs引物(表3)的20μLqPCR反应中进行扩增。PCR程序如下：95℃10分钟；40个循环：95℃15秒、60℃30秒、72℃1分钟。 PCR程序在定量PCR仪StepOnePlus(ABI)上进行。用1.5％琼脂糖凝胶对qPCR1和qPCR2产物进行电泳检测，进一步确证PCR产物特异性。

实验结果：

尽管可以通过ctPCR检测到L1基因，但是ctPCR检测的L1基因与其宿主质粒是相对简单的 DNA样本。HPV临床检测使用的是复杂的细胞基因组DNA(gDNA)。为了验证是否可以使用 ctPCR技术检测gDNA中的HPV，接下来尝试用双向PCR策略检测人类宫颈癌细胞gDNA中的HPV L1和E6-E7基因(图7A)。为此，首先从三种不同的人宫颈癌细胞系HeLa，SiHa和C-33a中提取了gDNA。然后，使用一对通用引物MY09和MY11扩增了L1基因，该引物以前被设计用于扩增各种HPV亚型的L1基因。结果，L1基因从HeLa和SiHa gDNA中成功扩增，从C-33a gDNA中没扩增出来(图7，B和C)。因为没有用于扩增E6和E7基因的通用引物，新设计了一对这样的通用引物E67-6F和E67-7R，用于扩增各种HPV亚型的E6-E7基因。

然后使用相同的引物扩增E6-E7基因。结果表明，E6-E7基因可以从HeLa和SiHagDNA中扩增，但不能从C-33a gDNA中扩增(图7，B和C)。称第一轮PCR为PCR1(图7A)。接下来我们用HPV16和HPV18的L1和E6-E7基因特异的sgRNA结合Cas9核酸酶切割L1和E6-E7 qPCR1产物。在将Cas9切割产物加A并与T接头连接后，用特异于HPV16和HPV18的L1和E6-E7 基因的gs引物对进行CAT处理的DNA进行PCR扩增。我们称第二轮PCR为PCR2(图7A)。虽然通过PCR1从C-33a gDNA检测不到L1和E6-E7基因，但仍用CAT2处理C-33a gDNA的PCR1 产物，并用PCR2扩增。仍然没有检测到HPV16和18的L1和E6-E7基因(图7，B和C)。这些结果与以前的报道一致，HeLa和SiHa分别是HPV18和HPV16阳性细胞，C-33a是HPV阴性细胞。

尽管ctPCR可以从人宫颈癌细胞的gDNA中检测到L1和E6-E7基因，但是由于繁琐的凝胶电泳检测，这种基于tPCR的ctPCR检测不利于临床应用。因此，验证了ctPCR检测是否可以用类似的两轮qPCR程序来实现(图8A)。如预期的那样，L1和E6-E7基因通过qPCR1从HeLa和 SiHa细胞的gDNA扩增出来(图8，B和C)。接下来用CAT处理qPCR1产物，并用gs引物通过qPCR2进行扩增。在SiHa和HeLa细胞的gDNA中分别成功检测到HPV16和HPV18L1和E6-E7 基因(图8，B和C)。这意味着qPCR1不影响随后的CAT处理，CAT处理也不影响随后的qPCR2。由于无需DNA纯化步骤，因此大大简化了基于qPCR的ctPCR检测。

为了验证ctPCR检测的特异性，使用多达200ng的gDNA作为PCR1的模板，基于tPCR和 qPCR的ctPCR检测HPV L1和E6-E7基因。接下来检测了qPCR和qPCR2的灵敏度。为此，用qPCR1扩增了不同量HeLa gDNA的HPV18L1基因。结果表明，通过qPCR1从不同量的HeLa gDNA中扩增出了HPV18L1基因(图9A)。特别是，通过qPCR1从少至0.005ng gDNA中扩增出了HPV18L1基因(图9A)。此外，以0.005ng gDNA为模板，用PCR1扩增，CAT处理后稀释1000倍(10-3)，qPCR2使用1μL稀释液来扩增HPV18L1基因(图9B)。这些结果表明，PCR1 和PCR2都可以用高灵敏的qPCR来实现，这表明基于qPCR的ctPCR有利于临床应用。表1.用于制备sgRNA的体外转录模板的寡核苷酸

表2.用于制备sgRNA的体外转录模板的寡核苷酸

表3.用于制备T接头寡核苷酸及用于PCR扩增的引物寡核苷酸

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用

<160> 53

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agttctagac ttcttgcagt ggg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agttctagac tccttgctgt ggg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taaccctgga caggataaca ggg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taatcctggt caggataata ggg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cataacaatg gtatttgttg ggg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cataacaatg gtatttgctg ggg 23

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actgtgttta ttaactctaa tgg 23

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actgtgtttt taagttctaa ggg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaccaaact tattggggtc ggg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccaaatt tatttgggtc agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagtagacag tggcctcact agg 23

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agatatacgg tattgtcact agg 23

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttg 53

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaaaaaaagc accgactcgg tgccactttt tcaagttgat aacggactag cc 52

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaaaaaaagc accgactcgg tgccactttt tc 32

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

actgtgttta ttaactctaa gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttctaatacg actcactata gactgtgttt attaactcta ag 42

<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aaaccaaact tattggggtc gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttctaatacg actcactata gaaaccaaac ttattggggt c 41

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaaccaaatt tatttgggtc gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttctaatacg actcactata gaaaccaaat ttatttgggt c 41

<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agatatacgg tattgtcact gttttagagc tagaaatagc aag 43

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttctaatacg actcactata gagatatacg gtattgtcac tg 42

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gattccataa tataaggggt gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttctaatacg actcactata ggattccata atataagggg t 41

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaggaggagg atgaaataga gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ttctaatacg actcactata ggaggaggag gatgaaatag a 41

<210> 28

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggagtaccta cgacatgggg gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttctaatacg actcactata gggagtacct acgacatggg g 41

<210> 30

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggatcttctt taggtgctgg gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 31

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ttctaatacg actcactata gggatcttct ttaggtgctg g 41

<210> 32

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gtgctgcaac cgagcacgac gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 33

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttctaatacg actcactata ggtgctgcaa ccgagcacga c 41

<210> 34

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgagcaatta agcgactcag gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 35

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttctaatacg actcactata gcgagcaatt aagcgactca g 41

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<212> DNA

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gcatcatatt gcccaggtac gttttagagc tagaaatagc aag 43

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttctaatacg actcactata ggcatcatat tgcccaggta c 41

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgttgctatt acctgtcaaa gttttagagc tagaaatagc aag 43

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<212> DNA

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ttctaatacg actcactata gtgttgctat tacctgtcaa a 41

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<212> DNA

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gcggtgaccc gggagatctg aattct 26

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<211> 11

<212> DNA

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gaattcagat c 11

<210> 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgtccmarrg gawactgatc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcmcagggwc ataayaatgg 20

<210> 44

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

aagggmgtaa ccgaaawcgg t 21

<210> 45

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<212> DNA

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gtacctkcwg gatcagccat 20

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<212> DNA

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gcggtgaccc gggagatctg aattctggg 29

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcggtgaccc gggagatctg aattcttgg 29

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcggtgaccc gggagatctg aattctcct 29

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcggtgaccc gggagatctg aattctgac 29

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gcggtgaccc gggagatctg aattctggt 29

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<212> DNA

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gcggtgaccc gggagatctg aattctatt 29

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gcggtgaccc gggagatctg aattctgac 29

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gcggtgaccc gggagatctg aattctagt 29

Claims (9)

1.一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，对靶DNA进行PCR扩增；

步骤2，对步骤1的扩增序列进行处理，依次包括Cas9/sgRNA切割、DNA末端加腺嘌呤和T接头连接；

步骤3，对步骤2处理后的序列进行PCR扩增。

2.根据权利要求1所述的基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法，其特征在于：所述Cas9/sgRNA切割是利用Cas9/sgRNA对靶DNA的双链进行切割。

3.根据权利要求1所述的基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法，其特征在于：所述DNA末端加腺嘌呤是在Cas9/sgRNA切割后的双链DNA的3′端末端产生一个突出的A碱基。

4.根据权利要求1所述的基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法，其特征在于：所述T接头连接是将T接头连接到加腺嘌呤处理后末端带有3′端突出A碱基的双链DNA末端。

5.根据权利要求1所述的基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法，其特征在于：所述T接头为一段带有粘性末端的双链寡核苷酸。

6.根据权利要求5所述的基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法，其特征在于：所述粘性末端为3′端突出一个T碱基。

7.根据权利要求1所述的基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法，其特征在于：步骤3进行PCR扩增的引物5′端序列可与T接头序列退火，3′端序列可与靶DNA上序列退火。

8.权利要求1所述的基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法在DNA检测和基因分型中的应用。

9.基于权利要求1所述的方法设计的试剂盒，该试剂盒用于检测高危型人乳头状瘤病毒。