JP2005523700A - 所定の配列および長さの一本鎖生成物を生産するためのdnaの増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
核酸鋳型中の目的とするヌクレオチド配列を増幅する方法には、相当数のものが開発されている。それらには、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、自立配列複製(self-sustained sequence replication)(3SR)、核酸配列ベース増幅(nucleic acid sequence based amplification)(NASBA)、および鎖置換増幅(strand displacement amplification)(SDA)がある。
目的とする配列の増幅は、たとえば、Rabanni他の欧州特許EP0,971,039に記載されているように、リニアまたはノンリニアな態様で行うことができる。目的配列のリニア増幅は、開始混合物が多数の目的配列のコピーを含む場合に、用いることができる。一般に、リニア増幅では、一つの開始プライマー、プローブ、またはその他の核酸構成物を用いて増幅工程を行う。
多くの増幅法が二本鎖増幅物を生成させる一方、多くの用途は、目的配列を含む一本鎖DNA分子を必要とする。鎖を分離するか、あるいは、二重鎖のうち一方の鎖を除去することにより、二本鎖DNAを一本鎖DNAに変えることができる。鎖間の結合を破壊する熱的または化学的方法によって二重鎖を分離することができる。一方の鎖を除けば、必要な鎖を回収し、その相補鎖を排除することが可能になる。DNA二重鎖のうちの一方の鎖を選択的に除去する戦略の一つは、エキソヌクレアーゼによる消化、好ましくはエキソヌクレアーゼによる5’→3’消化を利用することであり、そこで、一方の鎖はエキソヌクレアーゼによる攻撃から守られている。
所定の配列および長さの短い一本鎖DNA分子は、アレイなどの用途に必要となり、そこにおいて、望ましいサイズの範囲は、約45ヌクレオチド以下である。一本鎖DNA分子を生成させる方法は当該技術において知られているが、それらの方法は、必ずしも45ヌクレオチド以下の小さい分子を生成させるものではない。たとえば、上述した一本鎖DNAを生成させるための方法は、所定の配列および長さの短い一本鎖DNA分子を与えるものでない。ニキホロフ(Nikiforov)他への米国特許第5,518,900号は、二本鎖PCR増幅物から一本鎖DNA分子を生成させる方法を開示するが、得られるPCR生成物は、典型的に45ヌクレオチドより長い。シェピノフ(Shchepinov)他の方法は、典型的に45ヌクレオチドより長い分枝PCR生成物をもたらすものである(Shchepinov他, 1997, Nuc Acids Res 25:4447-4454)。同様に、ヒグチ(Higuchi)他の方法は、この望ましいサイズ範囲にない一本鎖DNA生成物を産するものである(Higuchi他, 1989, Nuc Acids Res 17: 5865)。
ここに開示する本発明の一局面によれば、鋳型の増幅は、よく知られた方法を用いて行われ、少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列と、増幅後の増幅物の処理に利用され、増幅そのものに顕著な影響を与えることのない少なくとも一つの外来配列とを含む増幅物を生成させる。好ましくは、増幅後の処理は、限定されることなく、二本鎖増幅物を一本鎖増幅物に変換すること、および所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させるため、一本鎖増幅物をトリミングすることを含む。適当な鋳型には、DNA分子およびRNA分子が含まれ、たとえば、ゲノムDNA、cDNAおよびmRNAが含まれる。線形的(リニア)または指数関数的(ノンリニア)な増幅の態様を、任意の適当な増幅法とともに用いることができ、態様の選択は、特定の態様の環境に応じて当業者によりなされる。増幅方法は、ポリヌクレオチド鋳型を増幅するため、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)を用いることを含むが、これらに限定されるものではない。
ポリメラーゼ連鎖反応(RCR)は、インビトロでDNAを増幅させるための方法である。PCRは、多数回のプライマー伸長反応を利用するものであり、あるDNA分子の所定領域の相補鎖を耐熱性DNAポリメラーゼによって同時に合成するものである。これらの反応を何回も繰り返す間、新たに合成されるDNA鎖の数は指数関数的に増え、それにより、20〜30回の反応サイクルの後、最初の鋳型DNAは、数千倍または数百万倍に複製されるようになる。異なるタイプおよび態様のPCRを行う方法は、文献、たとえば"PCR Primer: A Laboratory Manual" (PCRプライマー、実験室マニュアル)DieffenbachおよびDveksler編、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995、およびMullis他による特許(たとえば米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号)ならびに科学刊行物(たとえばMullis他, 1987, Methods in Enzymology, 155:335-350)に詳細に記載されおり、ここで各引用文献の内容は、この引用によって本明細書にそっくり記載されるものとする。
本発明の一局面によれば、目的とするヌクレオチド配列を含む鋳型の増幅を可能にし、かつ増幅物にさらなる特徴を導入するため、複数のプライマーが使用される。各プライマーは、鋳型における目的とするヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含み、それにより、各プライマーは、鋳型に結合(アニール)できる。好ましい態様において、少なくとも一つのプライマーは、プライマー結合性の目的とするヌクレオチド配列に相補的なプライマー配列の5’(上流)に外来ヌクレオチド配列を含み、その結果、各増幅物は、プライマーにより導入される外来ヌクレオチド配列を含むこととなる。好ましくは二つのプライマーが用いられ、各プライマーは、増幅自体に顕著な影響を与えることなく、増幅物の増幅後の操作を可能にする外来ヌクレオチド配列を導入する。代わりに、二つより多いプライマーを用いた場合も、各プライマーは、増幅自体に顕著な影響を与えることなく、増幅物の増幅後の操作を可能にする外来ヌクレオチド配列を導入する。当業者は、たとえばDieffenbach および Dveksler ("General Concepts For PCR Primer Design" in PCR Primer: A Laboratory Manual, (PCRプライマー:実験マニュアルにおける「PCRプライマー設計のための一般的コンセプト」の章)、Dieffenbach および Dveksler編(既出)、この引用により本明細書にその内容をそっくり記載したものとする).に開示されるよく知られた原理に従って、特定の態様のためのプライマーを設計することができる。
本発明の他の局面によれば、目的とするヌクレオチド配列を有する領域を含む増幅物を生成させるため、等温増幅法が用いられる。好ましくは、等温増幅法は、「ローリングサークル増幅」(RCA)法である。好ましい態様において、RCAを用いて目的とする配列のリニアな増幅が行われる。他の好ましい態様では、RCAを用いて目的とする配列のノンリニアな増幅が行われる。RCAを行うための方法は、当該技術分野においてよく知られており、特に、リザーディ(Lizardi)他によって開示されており(Lizardi他, 1998, Nature Genet 19: 225-232, および 米国特許第5,854,033号、第6,124,120号、第6,143,495号、第6,183,960号、第6,210,884号、第6,280,949号、および第6,287,824号)、この引用により、それらの内容は、本明細書にそっくり記載されたものとする。有利には、RCAは、目的とする配列に対して高い特異性および高い感受性を有しかつ非特異的なバックグラウンドシグナルのレベルが低い等温法であり、そこにおいて、増幅物の量は、ゲノムDNAまたはcDNA中の目的とする部位の数に比例し、また、必要に応じて、ライゲーション工程を操作して対立遺伝子の区別を行うことができる。
本発明の他の局面によれば、RCA法によって鋳型を増幅するのに使用されるプローブおよびプライマーは、目的とするヌクレオチド配列にはみられない外来ヌクレオチド配列を導入することにより増幅物に特徴を導入するよう、設計される。外来配列によって導入される特徴には、増幅自体に顕著な影響を与えることなく増幅物の増幅後の操作を可能にする、制限部位、プロモーター配列、逆向き反復配列、およびその他の非鋳型5’伸長物があるが、これらに限定されるものではない。一方、ある態様のRCAは、目的とするヌクレオチド配列とプローブまたはプライマーによって導入された外来配列との交互反復(タンデムリピート)(外来ヌクレオチド配列は目的とするヌクレオチド配列の複製物の間に位置するようになっている)を有する増幅物をもたらす。好ましい態様において、外来ヌクレオチド配列は、補助オリゴヌクレオチドとともに制限酵素によって一本鎖増幅物をトリミングするのに必要な部位を導入する。他の好ましい態様において、逆向き反復配列または他の外来配列を含むプライマーおよびプローブは、増幅物の末端に自己相補性を導入するのに使用され、それにより、一本鎖増幅物は、「ヘアピン」またはループのような二次構造を形成するようになる(図5)。
本発明の一局面によれば、二本鎖増幅物を一本鎖増幅物に変換する。二本鎖増幅物は二本鎖DNAからなり、一本鎖増幅物は一本鎖DNAからなり、そこにおいて、DNA鎖は、修飾、たとえば、リン酸化、架橋基、ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体のような修飾塩基、さらには特定の態様に対し当業者によって選択できるその他の修飾、を有してもよい。好ましくは、二本鎖DNAは、一以上の消化方法を用いて一本鎖DNAに変換される。有利には、二本鎖増幅物を消化して、必要ならば同一の反応容器でさらに操作できる一本鎖増幅物を得る。一つの態様において、消化に必要なことは、(i)修飾した鎖の選択的消化を促進する化学的修飾、または(ii)修飾した鎖の消化を阻害する化学的修飾(そこにおいて、そのような阻害は保護していない相補鎖の消化を促進する)を二本鎖増幅物の一方の鎖が有していることである。他の態様において、二本鎖増幅物の消化は、一方の鎖の選択的消化を促進することと、他方の鎖の消化を阻害することとを同時に含んでもよく、それにより、有利に消化工程の選択性を上げることができる。
本発明の一局面によれば、少なくとも一つの一本鎖増幅物をトリミングし、必要なヌクレオチド配列および長さを有する少なくとも一つのDNA分子を生成させ、所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させる。増幅物は、その認識部位から離れた部位で切断させる制限エンドヌクレアーゼを用いてトリミングしてもよいし、同じ部位で認識、結合および切断を行う制限エンドヌクレアーゼを用いてトリミングしてもよい。好ましくは、トリミングによって生成した所定の配列および長さの一本鎖DNA分子は、5〜50ヌクレオチドの長さを有する短い分子であり、より好ましくは、10〜45ヌクレオチドの長さを有する分子であり、さらに好ましくは、15〜40ヌクレオチドの長さを有する分子である。ここに開示する方法によれば、所定の配列および長さの一本鎖DNA分子は、有利に、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドの長さとすることができる。
本発明のさらなる局面の提供するところは、所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させるための方法において、一本鎖のDNAを放出させるためエキソヌクレアーゼを使用することおよび切断部位を完成させるため補助オリゴヌクレオチドを使用することが必要でない方法である。これらの方法は、必要なヌクレオチド配列を有するオリゴマーを生成させ、二本鎖増幅物から所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させる。
本発明の他の局面によれば、ここに開示し特許請求する方法を用いて、RNAの鋳型を増幅し、所定の配列および長さの、短い一本鎖DNA分子を生成させてもよい。RNAを逆転写してcDNAを生成させることができ、それを任意の適当な方法(PCRまたはRCAを含むが、これらに限定されることはない)を用いて増幅することができる。一方、RCAを用いてRNAを直接増幅してもよい。
本発明のさらなる局面によれば、ここに記載されるような、目的とするヌクレオチド配列を含む鋳型から所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させる方法を用いて、生物体または個体を同定または識別することができる。生物体または個体から、あるいは、多様な生物体または個体から、鋳型を含むサンプルを得る。そこにおいて、該鋳型は、少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列を含み、該鋳型はゲノムDNA、cDNAまたはRNAとすることができる。ここに記載する本発明の方法に従い、一以上の特別に設計されたプライマーまたはプローブを用いて鋳型を増幅し、必要であれば、二本鎖増幅物の一本鎖増幅物への変換を行い、そして、ここに記載するように、一本鎖増幅物をトリミングして所定の配列および長さの必要なDNA分子のセットを得る。ある態様において、該一本鎖DNA分子のセットにおける分子のサイズが特定の生物体を同定または識別するのに十分であるように、プライマーを選択し、そこにおいて、サイズは、DNA分子の質量、ヌクレオチド配列または長さとして測定することができる。好ましい態様において、特別に設計したプライマーまたはプローブを用いて鋳型を増幅し、二本鎖増幅物を生成させ、次いで、該二本鎖増幅物を一本鎖増幅物に変え、そして、一本鎖増幅物をここに記載するようにトリミングして所定の配列および長さの必要なDNA分子のセットを生成させる。他の好ましい態様において、特別に設計したプライマーまたはプローブを用いて鋳型を増幅し、一本鎖増幅物を生成させ、次いで、該一本鎖増幅物をここに記載するようにトリミングして所定の配列および長さの必要なDNA分子を生成させる。必要な配列および長さを有する各一本鎖DNA分子の質量またはヌクレオチド配列は、たとえば、すみやかに質量および/またはヌクレオチド配列を測定する質量分析を用いて、決定することができる。そして、その質量またはヌクレオチド配列を用いて、当業者に利用可能な器具またはツールにより、生物体または個体を同定または識別することができる。他の態様において、多様な生物体または個体からの鋳型を用いてこの方法を行うことができ、多様な一本鎖増幅物のそれぞれのヌクレオチド配列を決定し、そして、それぞれの質量またはヌクレオチド配列を用いて、複数の生物体または個体を同定または識別することができる。さらに他の態様において、多様な生物体または個体からのサンプルを用いてこの方法を行うことができ、そこにおいて、鋳型を含む該サンプルは、複数の生物体または個体の混合物から得られるものであるか、あるいは、そこにおいて、複数のサンプル(その各サンプルは一生物体または一個体から得たものである)をプールして一つの貯留サンプルを、ここに開示する方法に従う増幅、変換、トリミング、配列決定、および同定(識別)のために作る。
(材料)
Glen Researchから購入したホルホロアミダイト類を用いてオリゴヌクレオチド類を合成した。TaqDNAポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、カリホルニア州)を除くすべての酵素をNew England Biolabs Inc. (Beverly、マサセッツ州)から購入した。デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート類(dNTP's)もまたStratageneから入手した。γ−32P−ATP(3000Ci/mmol)はPerkin Elmer Life Sciences (Boston、マサセッツ州)から得た。マイクロクイックスピン(Microquich spin)カラム類は、Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis、インディアナ州)から購入した。ABI394DNAシンセサイザーにおいてホスホロアミダイト法によりオリゴヌクレオチド類を合成した。
QuiAamp Blood DNAおよびQiAamp DNAキット(Quiagen、Valencia、カリホルニア州)を用いて製造者の使用説明書に従いゲノムDNAを調製した。同様のキットをRNAの処理に利用できる。
PCRの条件を、必要な収率および特定の鋳型、ゲノムDNAの量、プライマー、および反応の他の成分、さらにサイクル条件および特定温度に対し、最適化した。最適化したPCR条件の具体例を以下に示す。ある特定の条件において、PCR反応の成分を不活性化する必要があった。たとえば、ホスファターゼを用いてdNTP類を不活性化する必要があり、また、プロテアーゼを用いてDNAポリメラーゼを不活性化する必要があった(Werle他, 1994, Nucleic Acids Res 22:4354-5)。
(ラムダエキソヌクレアーゼ消化による一本鎖DNAの生成)
もし、ウシ血清アルブミン(BSA)がPCR反応緩衝液に添加されていなかった場合、実施例1のPCR反応物を最終濃度50μg/mlウシ血清アルブミン(BSA)に加え、次いで、製造者のプロトコルに従い、標的化された(5’リン酸化された)DNA鎖をラムダエキソヌクレアーゼによって除去し、そして、必要な一本鎖DNAを回収した。濃度およびインキュベーション時間は、PCR反応からの収率に応じて変わった(下記の具体例を参照)。次の工程の前、75℃10分間の加熱による酵素の不活性化を行うことが望ましかった。
適合する緩衝液中、補助オリゴヌクレオチドを与えて、二本鎖制限エンドヌクレアーゼ認識部位を生成させた。酵素の量およびインキュベーション条件は、一本鎖生成物の量に応じて変わった(以下の具体例を参照)。最終産物の−20℃での保存安定性を向上させるため、65℃で20分間加熱インキュベーションすることが好ましい。
得られた一本鎖DNAを、ゲル電気泳動による分離の後、可視化のため、その放射性相補鎖にハイブリダイズさせた。その代わりに、固相支持体に固定されたテスト配列にハイブリダイズさせる場合、それを電気化学的SNP検出に用いることができる。
(ポリメラーゼ連鎖反応)
25ngのgDNA(血液または細胞由来)を、PCR反応において、67mMグリシン−KOH(pH9.4)、2.5mMのMgCl2、50μg/mlのBSA、0.625単位のTaqDNAポリメラーゼ、0.2mMのdNTP類、および0.2μMの各プライマーを含有する緩衝液中、増幅させた。以下のプロトコルを用いた。94℃2分間、次いで、94℃で30秒間、64℃で30秒間、および72℃で30秒間を30サイクル。
プライマー26.1’P:
5'P-ATA GGA TGG TTC ATG CCG CCC ATG CA 3'(配列番号1)
プライマー27.2:
5' TGG GGA TGA ACT ACA TGT GTA ACA GTT 3'(配列番号2)
(ラムダエキソヌクレアーゼ消化)
PCR反応物に2.5単位のラムダエキソヌクレアーゼを添加し、次いで、37°で20分間インキュベーションを行った。酵素は75℃で10分間のインキュベーションにより失活させた。
消化反応物は、サンプルに添加された50mM酢酸カリウム中650nMの各補助オリゴヌクレオチド、20mMトリス−アセテート、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオトレイトール、pH7.9を含むものであった。それらの添加の後、4単位のFokIとともに37℃で20分間インキュベーションを行った。この酵素は、65℃20分間のインキュベーションによって失活させた。補助オリゴヌクレオチドは、
(24.1') 5' TGT TAC ACA TGT AGT TCA TCC CCA 3'(配列番号3)
(26.1') 5' ATA GGA TGG TTC ATG CCG CCC ATG CA 3'(配列番号4)
であった。
17−merの一本鎖DNA生成物をテスト配列(17.1') 5' 32P-ATG CAG GAA CTG TTA CA 3'(配列番号5)に室温15分間のインキュベーションによってハイブリダイズさせた。テスト配列17.1'(配列番号5)は、以下のようにして末端標識によりリン酸化した。0.5μMオリゴヌクレオチドを、20μCiのγ−32P−ATP(3000Ci/mmol)、および70mMトリス−HCl、pH7.6中10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ、10mMのMgCl2、5mMのジチオトレイトールとともに37℃で1時間インキュベートした。生成物を定量するため、反応物にリン酸化していないテスト配列17.1’を混ぜ、そして、過剰の32P一本鎖17−merの強度を混合物全体(二重鎖+過剰プローブ)と比較することによって、17−mer二重鎖のフラクションを評価した。
三つ(またはそれより多い)配列を同じサンプルチューブで同時に増幅すること以外は、この実験は上記実施例3と同様である。最適PCR温度が類似するようプライマーの長さを設計する必要がある。C176F、S241FおよびR248Wを構成するSNP類の混合物に対し、次のプライマーおよび補助オリゴヌクレオチドを使用する。
<SNP C176Fに対し>
(PCRプライマー)
プライマー27.6
5' GAT GGA TGA CGG AGG TTG TGA GGC GCT 3'(配列番号6)
プライマー26.5’p
5' P-ATA GGA TGG CAG CGC TCA TGG TGG GG 3'(配列番号7)
(補助オリゴヌクレオチド)
(24.5') 5' GCC TCA CAA CCT CCG TCA TCC ATC 3'(配列番号8)
(26.5') 5' ATA GGA TGG CAG CGC TCA TGG TGG GG 3'(配列番号9)
<SNP S241Fに対し>
上記実施例3と同じプライマー:プライマー26.1’P(配列番号1)およびプライマー27.2(配列番号2)
<SNP R273Hに対し>
(PCRプライマー)
プライマー27.4
5' ATA GGA TGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG 3'(配列番号10)
プライマー26.3’p
5' P-ATA GGA TGC CAG GAC AGG CAC AAA CA 3'(配列番号11)
(補助オリゴヌクレオチド)
(24.3') 5' CTC AAA GCT GTT CCG TCA TCC TAT 3'(配列番号12)
(26.3') 5' ATA GGA TGC CAG GAC AGG CAC AAA CA 3'(配列番号13)
酵素反応およびアッセイは、上記実施例3と同様に行う。SNP間の間隔がそれらのプライマー部位が部分的に重なるほど近い場合、SNP類を同じチューブで増幅できないことが認められた。
次の例では、ラムダエキソヌクレアーゼを用いる場合、5’末端でリン酸化された合成ターゲットを使用し、T7エキソヌクレアーゼを用いる場合、修飾されていないターゲットを使用する。
ターゲットDNA配列30.1P:
5' P-CAG CTT TGA GGT GCG TGT TTG TGC CTG TCC 3'(配列番号14)
をパッドロック(padlock)プローブ配列70.1P:
5' P-GCA CCT CAA AGC TGC GCA TCC CAT CAG ATA GCG AGT CGA CGT GAG GAT GTA CGT GGA CAG GCA CA AAC AC 3'(配列番号15)
にハイブリダイズさせる。
5' P-CAG CTT TGA GGT GCC TGT TTG TGC CTG TCC 3'(配列番号16)
を使用し、それは、ライゲーション部位においてミスマッチを含み、それにより、該ミスマッチはパッドロックプローブ70.1P(配列番号15)の環化を阻害する。その代わりとして、パッドロックプローブ70.1Pをホスファターゼで処理するか、あるいは、70.1配列の非修飾版を用いることによって、ライゲーションを阻害することができる。
24.1ロック(LOCK):
5' ATG GGA TGC GCA GCT TTG AGG TGC 3'(配列番号17)および
24.2ロック(LOCK):
5' TGT GCC TGT CCA CGT ACA TCC TCA 3'(配列番号18)
これは、FokI消化のための二本鎖鋳型を完成させるものである。この反応から得られる生成物は、一本鎖の15−mer:
5' GAG GTG CGT GTT TGT 3'(配列番号19)
である。
ここに記載する方法により二本鎖PCR物を生成させる。この方法は、必要なヌクレオチド配列を有するオリゴマーを生成させ、それにより、本発明の方法に従って所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させる。二本鎖増幅物をニッキング酵素および切断酵素とともにインキュベートし、それにより、所定の配列の一端において二本鎖増幅物にニック(切れ目)をいれ、該所定の配列の他端において二本鎖増幅物を切断する。この例では、一方のプライマーにより導入された外来配列上の認識部位にFokIが結合し、そして、増幅物の一端で切断を行う。必要な配列の他端において、二本鎖増幅物にニック(切れ目)が入れられる。
Claims (66)
- 所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させるための方法であって、
少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列を含む鋳型を増幅する工程(前記増幅は、目的とするヌクレオチド配列に存在しない少なくとも一つの外来ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つのプライマーによって誘導され、そこにおいて前記増幅は、少なくとも一つの目的とする前記ヌクレオチド配列と少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列とを含む複数の二本鎖増幅物を生成させる)と、
前記二本鎖増幅物のそれぞれを一本鎖増幅物に変換する工程と、
前記一本鎖増幅物のそれぞれをトリミングして所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させる工程とを含む、方法。 - 前記増幅する工程にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が用いられる、請求項1の方法。
- 前記増幅する工程にローリングサークル増幅(RCA)が用いられる、請求項1の方法。
- 前記増幅する工程は、リニアな態様で行われる、請求項1の方法。
- 前記増幅する工程は、ノンリニアな態様で行われる、請求項1の方法
- 前記鋳型はゲノムDNAまたはcDNAである、請求項1の方法。
- 前記鋳型はRNAである、請求項1の方法。
- 少なくとも一つの前記プライマーは、アドレス可能なリガンドが付いた少なくとも一つの配列を含む、請求項1の方法。
- 前記アドレス可能なリガンドはビオチンである、請求項8の方法。
- 少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列は、ヘアピン構造を形成する自己相補的配列を含む、請求項1の方法。
- ヘアピン構造を形成する前記自己相補的配列は、前記トリミング工程に用いられる制限酵素のための少なくとも一つの制限酵素認識部位を含む、請求項10の方法。
- 前記トリミング工程に用いられる前記制限酵素は、II型制限酵素またはIIS型制限酵素である、請求項11の方法。
- 前記II型制限酵素はEcoRIである、請求項12の方法。
- 前記IIS型制限酵素はFokIである、請求項12の方法。
- 少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列は、少なくとも一つの補助オリゴヌクレオチドを加えたとき、前記トリミング工程に用いられる制限酵素のための少なくとも一つの制限酵素認識部位を形成する配列を含む、請求項1の方法。
- 前記トリミング工程に用いられる前記制限酵素は、II型制限酵素またはIIS型制限酵素である、請求項15の方法。
- 前記II型制限酵素はEcoRIである、請求項16の方法。
- 前記IIS型制限酵素はFokIである、請求項16の方法。
- 少なくとも一つの前記補助オリゴヌクレオチドは、アドレス可能なリガンドが付いた少なくとも一つの配列を含む、請求項15の方法。
- 前記アドレス可能なリガンドはビオチンである、請求項19の方法。
- 前記変換する工程は、少なくとも一つの目的とする前記ヌクレオチド配列と少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列とを含む前記二本鎖増幅物の一方の鎖を、5’→3’エキソヌクレアーゼを用いて消化することを含む、請求項1の方法。
- 前記5’→3’エキソヌクレアーゼはT7エキソヌクレアーゼまたはラムダエキソヌクレアーゼである、請求項21の方法。
- 少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列は、5’→3’エキソヌクレアーゼを用いる消化に対する抵抗性または5’→3’エキソヌクレアーゼを用いる消化に対する感受性を与える修飾ヌクレオチドを含む、請求項21の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドは、5’→3’エキソヌクレアーゼを用いる消化に対する抵抗性を与える、請求項23の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート誘導体である、請求項24の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドは、5’→3’エキソヌクレアーゼを用いる消化に対する感受性を与える、請求項23の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドは、リン酸化されているものである、請求項26の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子の長さは、10ヌクレオチド〜100ヌクレオチドである、請求項1の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子の長さは、10ヌクレオチド〜50ヌクレオチドである、請求項1の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子の長さは、15ヌクレオチドである、請求項1の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子の長さは、17ヌクレオチドである、請求項1の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子の長さは、21ヌクレオチドである、請求項1の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子の長さは、30ヌクレオチドである、請求項1の方法。
- 所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させるための方法であって、
少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列を含む鋳型を増幅する工程(前記増幅は、目的とするヌクレオチド配列に存在しない少なくとも一つの外来ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つのプライマーによって誘導され、そこにおいて前記増幅は、少なくとも一つの目的とする前記ヌクレオチド配列と少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列とを含む複数の二本鎖増幅物を生成させる)と、
所定の配列の一端で前記二本鎖増幅物にニックをいれ、かつ、前記所定の配列の他端で前記二本鎖増幅物を切断し、所定の配列および長さのDNA分子を生成させる工程と、
所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を、その相補鎖および増幅物のプライマー二重鎖を含む増幅物の残りの部分から分離する工程とを含む、方法。 - 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子をその相補鎖から分離させる一方、前記増幅物の前記プライマー二重鎖を無傷のまま残す条件下において、加熱することにより、所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子を、前記増幅物の前記残りの部分から分離する、請求項34の方法。
- 少なくとも一つの前記プライマーにアドレス可能なリガンドが付いている、請求項35の方法。
- 前記アドレス可能なリガンドはビオチンである、請求項36の方法。
- 相補鎖および増幅物のプライマー二重鎖を含む前記増幅物の残りの部分は、少なくとも一つのプライマーの5’末端に付いた前記ビオチンに結合するストレプトアビジンを保持した磁気ビーズに付着させることにより、除去される、請求項37の方法。
- 所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させるための方法であって、
少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列を含む鋳型を増幅する工程(前記増幅は、前記鋳型に存在しない少なくとも一つの外来ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つのプライマーによって誘導され、そこにおいて前記増幅は、少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列と少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの外来配列とを含む複数の一本鎖増幅物を生成させる)と、
前記一本鎖増幅物のそれぞれをトリミングして所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させる工程とを含む、方法。 - 前記増幅は、リニアな態様のローリングサークル増幅である、請求項39の方法。
- 前記鋳型はゲノムDNAまたはcDNAである、請求項39の方法。
- 前記鋳型はRNAである、請求項39の方法。
- 少なくとも一つの前記プライマーは、アドレス可能なリガンドが付いた少なくとも一つの配列を含む、請求項39の方法。
- 前記アドレス可能なリガンドはビオチンである、請求項43の方法。
- 少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列は、ヘアピン構造を形成する自己相補的配列を含む、請求項39の方法。
- ヘアピン構造を形成する前記自己相補的配列は、前記トリミング工程に用いられる制限酵素のための少なくとも一つの制限酵素認識部位を含む、請求項45の方法。
- 前記トリミング工程に用いられる前記制限酵素は、II型制限酵素またはIIS型制限酵素である、請求項46の方法。
- 前記II型制限酵素はEcoRIである、請求項47の方法。
- 前記IIS型制限酵素はFokIである、請求項47の方法。
- 少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列は、少なくとも一つの補助オリゴヌクレオチドを加えたとき、前記トリミング工程に用いられる制限酵素のための少なくとも一つの制限酵素認識部位を形成する配列を含む、請求項46の方法。
- 前記トリミング工程に用いられる前記制限酵素は、II型制限酵素またはIIS型制限酵素である、請求項50の方法。
- 前記II型制限酵素はEcoRIである、請求項51の方法。
- 前記IIS型制限酵素はFokIである、請求項51の方法。
- 少なくとも一つの前記補助オリゴヌクレオチドは、アドレス可能なリガンドが付いた少なくとも一つの配列を含む、請求項51の方法。
- 前記アドレス可能なリガンドはビオチンである、請求項54の方法。
- 所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させるための方法であって、
少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列を含む鋳型を増幅する工程(前記増幅は、前記鋳型に存在しない少なくとも一つの外来ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つのプライマーによって誘導され、そこにおいて、前記増幅は、少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列と少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの外来配列とを含む複数の増幅物を生成させ、前記増幅物は一本鎖増幅物または二本鎖増幅物を含み、さらに、前記二本鎖増幅物はいずれも一本鎖増幅物に変換され得る)と、
前記一本鎖増幅物をトリミングして所定の配列および長さの少なくとも一つの一本鎖DNA分子を生成させる工程とを含む、方法。 - 少なくとも一種の生物体または個体を同定または識別するための方法であって、
少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列を含む鋳型を前記生物体または個体から得ること(そこにおいて、前記鋳型はゲノムDNA、cDNAまたはRNAからなる)と、
少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列を含む前記鋳型を増幅すること(前記増幅は、前記目的とするヌクレオチド配列に存在しない少なくとも一つの外来ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つのプライマーによって誘導され、そこにおいて前記増幅は、少なくとも一つの目的とする前記ヌクレオチド配列と少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列とを含む複数の二本鎖増幅物を生成させる)と、
前記二本鎖増幅物を一本鎖増幅物に変換することと、
前記一本鎖増幅物をトリミングして所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させることと、
所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子のそれぞれの質量またはヌクレオチド配列を決定することと、
所定の配列および長さの少なくとも一つの一本鎖DNA分子の少なくとも一つの前記質量またはヌクレオチド配列を用いて、少なくとも一つの生物体または個体を同定または識別することとを含む、方法。 - 質量分析を用いて、所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子のそれぞれの前記質量またはヌクレオチド配列を決定する、請求項57の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子のそれぞれの前記質量を決定し、そして、所定の配列および長さの少なくとも一つの一本鎖DNA分子の少なくとも一つの前記質量を用いて、少なくとも一つの生物体または個体を同定または識別することを含む、請求項57の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子のそれぞれの前記ヌクレオチド配列を決定し、そして、所定の配列および長さの少なくとも一つの一本鎖DNA分子の少なくとも一つの前記ヌクレオチド配列を用いて、少なくとも一つの生物体または個体を同定または識別することを含む、請求項57の方法。
- 多様な生物体または個体が同定または識別される、請求項57の方法。
- 少なくとも一種の生物体または個体を同定または識別するための方法であって、
少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列を含む鋳型を少なくとも一種の前記生物体または個体から得ること(そこにおいて、前記鋳型はゲノムDNA、cDNAまたはRNAからなる)と、
少なくとも一つの目的とするヌクレオチド配列を含む前記鋳型を増幅すること(前記増幅は、前記目的とするヌクレオチド配列に存在しない少なくとも一つの外来ヌクレオチド配列を含む少なくとも一つのプライマーによって誘導され、そこにおいて前記増幅は、少なくとも一つの目的とする前記ヌクレオチド配列と少なくとも一つの前記プライマーによって導入される少なくとも一つの前記外来ヌクレオチド配列とを含む複数の一本鎖増幅物を生成させる)と、
前記一本鎖増幅物のそれぞれをトリミングして所定の配列および長さの一本鎖DNA分子を生成させることと、
所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子のそれぞれの質量またはヌクレオチド配列を決定することと、
所定の配列および長さの少なくとも一つの一本鎖DNA分子の少なくとも一つの前記質量またはヌクレオチド配列を用いて、少なくとも一つの生物体または個体を同定または識別することとを含む、方法。 - 質量分析を用いて、所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子のそれぞれの前記質量またはヌクレオチド配列を決定する、請求項62の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子のそれぞれの前記質量を決定し、そして、所定の配列および長さの少なくとも一つの一本鎖DNA分子の少なくとも一つの前記質量を用いて、少なくとも一つの生物体または個体を同定または識別することを含む、請求項62の方法。
- 所定の配列および長さの前記一本鎖DNA分子のそれぞれの前記ヌクレオチド配列を決定し、そして、所定の配列および長さの少なくとも一つの一本鎖DNA分子の少なくとも一つの前記ヌクレオチド配列を用いて、少なくとも一つの生物体または個体を同定または識別することを含む、請求項62の方法。
- 多様な生物体または個体が同定または識別される、請求項62の方法。
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