JP2009000123A - リガーゼ検出反応による核酸相違の適合性の高い検出 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少数鋳型を正常鋳型の過剰の存在下に熱安定性リガーゼで識別するのに、リガーゼ検出反応を用いる方法。この方法は、変異リガーゼ、熱安定性リガーゼまたは修飾オリゴヌクレオチドプローブで実施でき、特に癌関連変異の検出に有用である。また少数鋳型の量および比率の測定を可能とする利点を有する。
【選択図】図1
Description
本発明は、米国保健研究所認可番号GM41337−06による政府資金でもってなされた。米国政府が一定の権利を有し得る。
発明の分野
本発明は、リガーゼ検出反応(”LDR”)を用いる核酸配列相違の適合性の高い検出に関する。本発明の1つの実施態様は、熱安定性リガーゼで過剰の正常鋳型の存在下における少数鋳型を識別するためのリガーゼ検出反応の使用である。本発明の他の実施態様は、リガーゼ検出反応を実施するための変異リガーゼの使用である。本発明の第3の実施態様は、リガーゼ検出反応を実施するための修飾オリゴヌクレオチドプローブの使用である。
多重検出
高度に多形的な座の大規模多重解析が、父親検定および法医学(Reynolds et al., Anal. Chem., 63:2-15(1991))、臓器移植のドナーとレシピエントの組み合わせ(Buyse et al., Tissue Antigens, 41:1-14(1993) and Gyllensten et al., PCR Meth. Appl, 1:91-98(1991))、遺伝疾患の診断、予後および出産前の相談(Chamberlain et al., Nucleic Acids Res., 16:11141-11156(1988) and L. C. Tsui, Human Mutat., 1:197-203(1992))および発ガン変異(Hollstein et al., Science, 253:49-53(1991))などについて個体の実際的な同定に必要である。さらに、核酸解析による感染疾患診断の費用効率はパネル試験における多重規模で直接的に変動する。これらの適用の多くは、時に密接なスペース座の多重性において単一塩基の相違の識別力に依存している。
DNAリガーゼは、二本鎖DNAにおける一本鎖の切断(ニック)にホスホジエステル結合を形成するのに触媒作用を及ぼし、DNA復製、修復および組換えに要する。連結反応の一般的メカニズムは、NAD+依存性リガーゼについて下記に示された3つの可逆性工程を含む。この実施例において、ニックDNA基質は、2つの短いオリゴヌクレオチド(オリゴAおよびB)を長い相補的オリゴヌクレオチドにアニールすることにより形成される。最初に、共有結合的にアデニル化された酵素中間体を、酵素中においてNAD+のアデニレート基をリシンのe−NH2基へ転移することにより形成する。第2に、アデニレート部分を酵素からオリゴB上の5’末端リン酸塩に転移する。最後に、ホスホジエステル結合を、オリゴBの活性化5’ホスホリル基上のオリゴAの3’ヒドロキシル末端の求核的作用により形成する(Gumport, R.I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68:2559-63(1971); Modrich, P., et al., J. Biol. Chem., 248:7495-7501(1973); Modrich, P., et al., J. Biol. Chem., 248:7502-11(1973); Weiss, B., et al., J. Biol. Chem., 242:4270-72(1967); Weiss, B., et al., J. Biol. Chem., 243:4556-63(1968); Becker, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 58:1996-2003(1967); Yudelevich, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61:1129-36(1968); Zimmerman, S.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 57:1841-48(1967); Zimmerman, S.B., et al., J. Biol. Chem., 244:4689-95(1969);およびLehman, I.R., Science, 186:790-97(1974))。
(i) E-(lys)-NH2 + AMP〜PRN+ ⇔ E-(lys)-NH2 +〜AMP + NMN
(ii) E-(lys)-NH2 +〜AMP + 5’P-オリゴB ⇔ AMP〜P-オリゴB + E-(lys)-NH2
(iii) オリゴA-3’OH + AMP〜P-オリゴB ⇔ オリゴA- P-オリゴB+ AMP
米国における死亡原因の第2位として、年間約600,000人が癌で死亡し、癌をすべての医療診断において最も不安なもののひとつとしている。男性および女性における進行性癌の発生に対する生命の危険性は各々、50%および33%である。1995年には、120万以上の新しい癌患者が米国において診断される見込みである。1994年の癌に対する健康管理費は約1040億ドルであった。しかしながら、癌が家族および社会に与えたすべての影響は、診断や治療に費やされた金額のみでは測れない。多くの人々が彼らの最も生産的な年齢で癌にかかっている。1985年における早死の18%は癌が原因であり、1991年に9,200人以上の米国女性が乳癌により55歳前に死亡している。推定では、1995年には結腸直腸癌および乳癌について、それぞれ140,000および183,000近くの新しい診断がなされると予測されている。
PCRを用いて癌を検出するために多くの方法が開示されている。Sidransky, et al., ”Identification of ras Oncogene Mutations in the Stool of Patients with Curable Colorectal Tumors,” Science 256:102-05(1992)は、K−ras変異の同定により結腸癌を検出する。これは、全DNAのPCR増幅、バクテリオファージベクターへのクローニング、バクテリオファージの平板培養、いくつかの異なるK−ras変異に特異的な個々のオリゴヌクレオチドによる反復プローブおよび一定のプレート上の陽性プラークの割合の計算を含む。これは、便のサンプル中の野生型DNAに対する変異の割合を測定する技術的に難しい方法で、完了するのに3日かかる。Brennan, et al., ”Molecular Assessment of Histopathological Staging in Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck,” N. Engl. J. Med. 332(7):429-35(1995)は、配列決定によりp53変異を発見した。この特異的変異は、全DNAのPCR増幅、バクテリオファージベクターへのクローニング、バクテリオファージの平板培養、配列決定によって発見された変異に特異的な個々のオリゴヌクレオチドによるプローブおよび一定のプレート上の陽性プラーク割合の計算を用いて、周縁組織についてプローブされる。Berthelemy, et al., ”Brief Communications -- Identification of K-ras Mutations in Pancreatic Juice in the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer,” Ann. Int. Med. 123(3):188-91(1995)は、膵臓分泌物におけるK−ras変異を検出するためにPCR/制限酵素方法を使用する。しかし、この技法は不完全であって、変異を定量しない。同様に、Tada, et al., ”Detection of ras Gene Mutations in Pancreatic Juice and Peripheral Blood of Patients with Pancreatic Adenocarcinoma,” Cancer Res. 53:2472-74(1993)およびTada, et al., ”Clinical Application of ras Gene Mutation for Diagnosis of Pancreatic Adenocarcinoma,” Gastroent. 100:233-38(1991)は、膵臓癌の検出のためにこのようなサンプルを対立遺伝子特異的PCRにかける。これには、正常鋳型からのポリメラーゼ伸張により偽のポジティブを提供し、プライマーニ量体と識別するために産物の電気泳動分解を要し、重複プライマーの阻害により近接クラスター部位の多重化を不可能とし、小さな反復配列における単一塩基または小さな挿入および欠失の検出を不可能とし、および正常DNAの高いバックグラウンドにおける変異DNAの定量について理想的には適切でないというデメリットがある。Hayashi, et al., ”Genetic Detection Identifies Occult Lymph Node Metastases Undetectable by the Histopathological Method,” Cancer Res. 54:3853-56(1994)は、結腸癌における隠れたリンパ節転移を同定するためにK−rasまたはp53変異を発見する対立遺伝子特異的PCR技法を使用する。千の正常細胞において一つの腫瘍細胞という感受性が要求される;しかしながら、量の値を得るには、困難なクローニング、平板培養およびプローブ工程を要する。Mitsudomi, et al., ”Mutations of ras Genes Distinguish a Subset of Non-small-cell Lung Cencer Cell Lines from Small-cell Lung Cancer Cell Lines,” Oncogene 6:1353-62(1991)において、遺伝子DNAのPCR増幅中のミスマッチプライマーからつくられた制限フラグメント長・多型性を用いて、ヒト肺癌細胞系はK−、H−およびN−rasの点変異について検査される。このようなプライマー媒介RFLPのデメリットには、正常DNAから変異を識別するために電気泳動分解を必要とし、制限部位に転換される部位への適用が限られ、変異の特性を決定するために追加分析を要し、および正常DNAの高いバックグラウンドにおける変異DNA定量が難しいということがある。さらに、これらの方法は労力を要し、不正確になりがちである。
本発明の1つの実施態様は、1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により1以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している1以上の少数標的ヌクレオチド配列をサンプル中で検出する方法に関し、少数標的ヌクレオチド配列はサンプル中に多数配列よりも少量で存在する。
図1は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のためのPCR/LCRプロセスを表わす流れ図である。ここでは、野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブがLDR相から排除され、少数変異標的からのシグナルが圧倒されることを回避し(to avoid overwhelming signal from minority mutant target)、LDR相にマーカーは加えられていない。
図2は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のためのPCR/LCRプロセスを表わす流れ図である。ここでは、野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブがLDR相から排除され、少数変異標的からのシグナルが圧倒されることを回避し(to avoid overwhelming signal from minority mutant target)、LDR相にマーカーは加えられている。
図3は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のためのPCR/LCRプロセスを表わす流れ図である。ここでは、野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが低レベルで、LDR相において使用され、および/または修飾されて、多数標的に対応する少ない連結反応産物を製出する。これは少数変異標的からのシグナルが圧倒されるのを防ぐ。
図4は、連結反応産物を分離するために電気泳動を用いる図1のPCR/LDRプロセスを表わす模式図である。
図5は、連結反応産物を分離するために電気泳動を用いる図2のPCR/LDRプロセスを表わす模式図である。
図7は、連結反応産物を分離するためにアドレス可能アレイを用いる図1のPCR/LDRプロセスを表わす模式図である。
図8は、連結反応産物を分離するためにアドレス可能アレイを用いる図2のPCR/LDRプロセスを表わす模式図である。
図9は、連結反応産物を分離するためにアドレス可能アレイを用いる図3のPCR/LDRプロセスを表わす模式図である。
図10は、部位特異的変異生成を用いて、アミノ酸残基294でのThemus thermophilus DNAリガーゼ変異体の構築に関する。
図12A−Bは、図11の変異リガーゼをつくるためのプライマーを表わす。
これらのプライマーは以下の配列番号を有する:プライマーaは、配列番号:1(JL501)、および配列番号:78 (JL505)として特定される;プライマーbは、配列番号:2 (JL503R)、配列番号:79 (JL507R)、配列番号:80 (JL537R)、配列番号:81 (JL535R)、配列番号:82 (JL525R)、配列番号:83 (JL527R)、配列番号:84 (JL529R)、配列番号:85 (JL531R)、および配列番号:86 (JL533R) として特定される;プライマーcは、配列番号:3 (JL502)、配列番号:87 (JL509)、配列番号:88 (JL506)、配列番号:89 (JL536)、配列番号:90 (JL534)、配列番号:91 (JL524)、配列番号:92 (JL526)、配列番号:93 (JL528)、配列番号:94 (JL530)、および配列番号:95 (JL532)として特定される;プライマーdは、配列番号:4 (JL504R)、配列番号:96 (JL508R)、および配列番号:97 (JL518R)として特定される;プライマーb1は、配列番号:5として特定される;プライマーc1は、配列番号:6として特定される;プライマーb2は、配列番号:8として特定される;およびプライマーc2は、配列番号:7として特定される。
図14は、図13のオリゴヌクレオチドをつくるために用いられたプローブの配列を表わす。
SLP3'C: 5' TACGTCTGCGGTGTTGCGTC 3' (配列番号:23).
SLP3'T: 5' CGTCTGCGGTGTTGCGTT 3' (配列番号:24).
SLP3'ATC: 5' ATGCGTCTGCGGTGTTGCATC 3' (配列番号:25).
SLP3'ATT: 5' GCGTCTGCGGTGTTGCATT 3' (配列番号:26).
SLP3'QTC: 5' AAATGCGTCTGCGGTGTTGCQTC 3' (配列番号:27)
SLP3'QTT: 5' ATGCGTCTGCGGTGTTGCQTT 3' (配列番号:28)
識別オリゴヌクレオチドにおける塩基“N”はCまたはTのいずれかである。“Q”はQ塩基類似体を示す。Q塩基類似体を含有する鋳型鎖を除き、試験した全基質についての鋳型鎖はGLgであり、その配列を図14に示す。Q塩基類似体を含有する基質における鋳型鎖はGLg.m3Aであり、太字体で示された単一部位でGLgと相違する。連結反応の初速度(fmol/min)は、分での時間を表わすX軸とfmolでの産物量を表わすY軸との直線グラフの勾配として計算した。TthDNAリガーゼの連結反応忠実性は、完全マッチ連結反応の初速度のミスマッチ連結反応の初速度に対する割合と定義する。
図17は、また、プライマーSLP3’TTCC(配列番号:29)、SLP3’TTT (配列番号:30)、Com 610-3’F (配列番号:31)、GLg.m3A (配列番号:32)、GLg.m3A.Rev (配列番号:33)、ALg.m3A (配列番号:34)、ALg.m3A.Rev (配列番号:35)、GLg. (配列番号:36)、GLg.Rev (配列番号:37)、SLP3’GTC (配列番号:38)、SLP3’GTT (配列番号:39)、GLg.m3T (配列番号:40)、およびGLg.m3T.Rev (配列番号:41)のための配列を示す。
図31A−Bは、野性型または変異K294 TthDNAリガーゼによる正常DNAの過剰下の典型的LDR反応におけるコドン12、13および61での種々の変異を検出するために使用したK−rasLDRオリゴヌクレオチドプローブの名前および配列を示している。図31A−Bは、以下のプライマーのための配列を示す:Fam-K-ras c12.2D (配列番号:49)、Tet-K-ras c12.2A (配列番号:50)、Fam-K-ras c12.2V (配列番号:51)、K-ras c12 Com-2 (配列番号:52)、Tet-K-ras c12.1S (配列番号:53)、Fam-K-ras c12.1R (配列番号:54)、Tet-K-ras c12.1C (配列番号:55)、K-ras c12 Com-1 (配列番号:56)、Fam-K-ras c13.4D (配列番号:57)、Tet-K-ras c13.4A (配列番号:58)、Fam-K-ras c13.4V (配列番号:59)、K-ras c13 Com-4 (配列番号:60)、Tet-K-ras c13.3S (配列番号:61)、Fam-K-ras c13.3R (配列番号:62)、Tet-K-ras c13.3C (配列番号:63)、K-ras c13 Com-3 (配列番号:64)、Tet-K-ras c61.7HT (配列番号:65)、Fam-K-ras c61.7HC (配列番号:66)、K-ras Com-7 (配列番号:67)、Tet-K-ras c61.6R (配列番号:68)、Fam-K-ras c61.6P (配列番号:69)、Tet-K-ras c61.6P (配列番号:70)、K-ras Com-6 (配列番号:71)、Fam-K-ras c61.5K (配列番号:72)、Tet-K-ras c61.5E (配列番号:73)、およびK-ras Com-5 (配列番号:74)。
データを解析し、その結果を図42に示し(コールド変異)、ジデオキシ配列決定の結果(期待変異)と比較した。
X軸は正常鋳型の種々の量を表し、Y軸は生じたLDR産物の量を表す。(■、△、□)は、夫々0.5nM(10fmol)、2.5nM(50fmol)および5nM(100fmol)の、野性型酵素と共に用いた野性型プローブを表し、(●、◆、○)は、夫々0.5nM(10fmol)、2.5nM(50fmol)および5nM(100fmol)の、K294R変異酵素と共に用いた野性型プローブを表す。
本発明の1つの実施態様は、1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により1以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している1以上の少数標的ヌクレオチド配列をサンプル中で検出する方法に関し、少数標的ヌクレオチド配列はサンプル中に多数配列よりも少量で存在する。
オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物であり得る。
一つの変法において、オリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチド各々、ハイブリダイゼーションすなわち溶融温度(すなわち、Tm)66−70℃を有する。これらのオリゴヌクレオチドは長さが20−28ヌクレオチドである。
上記したように、オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは検出に適したレポーター標識を有する。有用な標識には、発色団、蛍光分子、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセント分子および電気化学的検出分子がある。
連結検出反応でのハイブリダイゼーション段階は、好ましくは熱ハイブリダイゼーション処理であり、連結反応の接合部において識別されるヌクレオチドを基にしたヌクレオチド配列の間を識別する。標的ヌクレオチド配列間の相違は、例えば、単一核酸塩基の相違、核酸欠失、核酸挿入または再配置である。1以上の塩基を含むこのような配列相違もまた検出できる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブセットは、実質的に同じハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、実質的に同じ長さである。結果として、本発明のプロセスは、感染性疾患、遺伝的疾患および癌の検出を可能とする。環境監視、法医学および食物科学においても有用である。
本発明により検出できるウイルス感染作用因子は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトTリンパ球好性ウイルス、肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルス)、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニャウイルス、アレナウイルス、ルベラウイルスおよびレオウイルスを含む。
本発明はまた感染作用因子による医薬耐性の検出にも有用である。例えば、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・ファエシウム、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニューモニアエ、多剤耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシスおよびAZT耐性ヒト免疫不全ウイルスを本発明によりまた同定できる。
この目的のための毛管およびゲル電気泳動の使用はよく知られている。参照、例えばGrossman, el al., ”High-density Multiplex Detection of Nucleic Acid Sequences: Oligonucleotide Ligation Assay and Sequence-coded Separation”, Nucl. Acids Res. 22(21):4527-34(1994)(出典明示により本明細書の一部とする)。
識別性プライマーの第3位にQ2およびQ18類似体を導入すると、シグナル対ノイズ比率は約2−3培に増進し、これによって、癌シグナルをバックグラウンドから識別するLDRシステムの能力が増大する。このアッセイは、最も困難なケース、即ちT:A完全マッチからT:Gミスマッチを識別するリガーゼの能力を比較するものである。プローブの3’末端から3ヌクレオチドの位置にあるQ2またはQ18類似体は、3’位のミスマッチに関して存在する場合、局所融解を高め、同時に、3’末端の塩基対マッチに関して存在する場合は、ミスマッチ以上にらせん構造の保全を保護する。プローブの3’末端近くにQ2またはQ18類似体を用いると、完全マッチおよびミスマッチの酵素DNA複合体の安定性に様々な度合いで影響を及ぼすことがあり、そのため、これらの連結反応では別個のKM作用を働かせる。完全にマッチしたおよびミスマッチした基質の連結反応などの競合反応では、特異性定数の比率は、各基質に対するKMや起こり得るkcat変化の結果として変わることもある。下記等式(Q類似体について示す)を満たす全ての修飾プローブは、過剰の正常DNA存在下の癌関連変異の識別力を増すものである。
修飾および非修飾オリゴヌクレオチドプローブを持つ熱安定性リガーゼを用いる場合、少数変異検出用の各プローブに付随するシグナル対ノイズ比率があり、本発明の第3の態様では、修飾オリゴヌクレオチドプローブを用いて得られるシグナル対ノイズ比率は、非修飾オリゴヌクレオチドプローブを用いて得られるシグナル対ノイズ比率より大きいと表現することができる。
実施例1−部位特異的突然変異誘発法を用いたアミノ酸残基294位でのThermus thermophilusDNAリガーゼ変異の構築
Thermus thermophilus (”Tth”)DNAリガーゼ変異は、2段階PCR法(Horton et al.,”Engineering Hybrid Genes Without the Use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension”, Gene, 77: 61-68 (1989)、出典明示により本明細書の一部とする)を用いて作製した。プラスミドpDZ15(HindIIIによって鎖状にした)を鋳型として第1ラウンドのPCR反応に用いた。図10の上部図に、クローン化Tth DNAリガーゼ遺伝子を含有するプラスミドpDZ15(Barany, F., et al., ”Cloning, Overexpression, and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA Ligase Gene”, Gene, 109: 1-11 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)を、PstI部位で開裂させた場合のおおよそに拡大して描いた遺伝子の略図として示す。pDZ15では、Tth リガーゼ遺伝子とその方向を太い斜め平行線を引いた矢印で表し、ベクターApR(bla)遺伝子は、点描(灰色)矢印で、非機能性TaqIエンドヌクレアーゼ遺伝子の切形(truncated)末端は細い斜め平行線を引いた矢印で、pBR複製起点は白塗りバーで表した。phoAおよびT7プロモーターは右角矢印で、その転写方向は矢先で示す。制限部位は、Av、AvrII;Bm、BamHI;Bg、BglII;(Bg/Bm再結合部位は、BamHIまたはBglIIのいずれかでは切断不能である;)Hd、HindIII;RI、EcoRI;Ps、PstI、Pv、PvuIIである。pTZ18R由来のポリリンカー領域は、列挙した外部制限部位のみで3本足付き三角で示す。下記の構築に使用するEscherichia coli宿主株は、次から得られた:N3098(ligts7;(Wilson, G.G., et al.,”Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene From the Bacteriophage T4.I. Characterization of the Recombinants”, J. Mol. Biol., 132: 471-491 (1979)、出典明示により本明細書の一部とする)、N. Murrayから);JH132(mrr−,Tn10;(Heitman, J., et al., ”Site-Specific Methylases Induce the SOS DNA Repair Response in Escherichia coli”, J. Bacteriol., 169: 3243-3250 (1987)、出典明示により本明細書の一部とする)、J. Heitmanから);MN294(endA−、hsdR−、hsdM+、thi−1、supE44;(Miller, J. H., ”Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-205 (1972)、出典明示により本明細書の一部とする)、我々のコレクションから)。AK53株(mrrB−、MM294)およびAK76(mrrB−、N3098)は、上記JH132からmrrB−表現型を形質導入することにより構築した(Miller, J. H., ”Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-205 (1972)、出典明示により本明細書の一部とする)。mrrB−表現型の存在は、プラスミドpFBT71上に存在するTaq MTアーゼ−コード遺伝子に対するこれらの株の耐性により確認した(Barany, F.,”A Genetic System for Isolation and Characterization of TaqI Restriction Endonuclease Mutants”, Gene, 56: 13-27 (1987)およびBarany, F., et al.,”Cloning and Sequencing of the TthHB8I DNA Restriction and Modification Enzymes, and Comparison With the Isoschizomeric TaqI Enzymes”, Gene, 112: 3-12 (1992)、出典明示により本明細書の一部とする)。
図11の変異リガーゼは、下記のように図12A−Bのオリゴヌクレオチドを用いて調製した。K294部位で複数の部位特異的変異を作るためにPCR反応用の4つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。それらの配列は次のとおりである:プライマーa (JL505) (配列番号:78): 5'CAG AAC CTC CTC ACC ATC 3'; プライマーb (JL507R) (配列番号:79): 5'CTC GTC CAG (G,C) (T, G, C, A) G CAC CAC CAC CCC GTC 3';プライマーc (JL506) (配列番号:88): 5' TGG TGG TGC (A, C, G, T) (C, G) C TGG ACG AGC TTG CCC T 3';およびプライマーd (JL508R) (配列番号:96): 5' CTC TAT GTA GCT CTC GTT GTG 3'。プライマーbとcは、変異部位で縮重コドンを含有する重複プライマーである。これらのプライマーは、各種試薬とPerkin-Elmer Corporation, Foster City, CAのApplied Biosystems Divisionからの394自動DNA合成機を用いて合成した。合成後、プライマーを30%水酸化アンモニウム中、55℃で12時間脱保護し、高速真空乾燥し、ddH2O(即ち、二重蒸留水)100μlに再懸濁し、エタノール沈殿により精製した。ペレットをddH2O200μlに再懸濁し、その濃度を分光測光法によりOD260で測定した。次いで、プライマーを等分し、使用まで−20℃で冷凍庫に貯蔵した。
phoAプロモーターの制御下で変異Tth DNAリガーゼを含有するプラスミドを形質転換によりE.コリ株AK53に導入した。変異Tth DNAリガーゼタンパク質を30℃で15時間、0.2mM K2HPO4と75μg/mlアンピシリンを含有するMOPS培地(Neidhardt, et al., J. Bacteriol., 119: 736-47 (1974)、出典明示により本明細書の一部とする)中で過剰発現させた(F. Barany, et al., Gene 109: 1-11 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)。細胞を遠心して集め、VWR社のソニファイヤー350細胞破壊機(Sonifier 350 cell disruptor)にてマイクロプローブと共に3×10秒間超音波処理したTE(10mMトリス、pH8.5、1mMEDTA)400μlに懸濁し、4℃で10分間遠心した。上清を20mMトリス−HCl、pH8.5、50mMKCl、10mMMgCl2および0.5mMEDTA、1mMDTTおよび2mM2−メルカプトエタノールに順応させた。64℃で25分間インキュベーション後、濁った懸濁液を4℃で15分間遠心して透明化した。クマシー・ブリリアント・ブルーと共に0.1%SDSを含有する7.5%ポリアクリルアミドゲルの染色により測定したところ、得られた透明懸濁液中総タンパク質の70%以上がTth DNAリガーゼであった。およそ200μgのTth DNAリガーゼを培養物6mlから単離した。いずれの変異Tth DNAリガーゼも、AK53中で過剰発現し、65℃で熱処理後も可溶性のままであった。
変異したTth DNAリガーゼ遺伝子を含有するプラスミドを温度感受性リガーゼ欠損E.コリ株AK76(lig ts7 株)(F. Barany, et al., Gene 109: 1-11 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)に形質転換により導入した。個々の形質転換体を、高ホスフェートプレート(0.6%NaCl、2.5%バクト−トリプトン、0.75%酵母エキス、0.1%デキストロースおよび10mMK2HPO4、pH7.6および50μg/mlアンピシリン)および低ホスフェートプレート(0.2mMK2HPO4)(Neidhardt, et al., J. Bacteriol., 119: 736-47 (1974)、出典明示により本明細書の一部とする)上でレプリカプレーティングし、許容(32℃)および非許容(42℃)温度でそれぞれ一晩インキュベーションした。Tth DNAリガーゼ遺伝子は、低ホスフェート濃度でのみ誘導される。プラスミドによりコードされた活性酵素は、低ホスフェートプレート上42℃で温度感受性宿主を増殖させることができる。
アデニレーションは、野生型と上記で調製した変異のTth DNAリガーゼおよそ8μg(100fmoles)を、20mMトリス−HCl、pH7.6、50mMKCl、10mMMgCl2、0.5mMEDTA、1mMNAD+、1mMDTT、2mM2−メルカプトエタノールを含有する反応緩衝液100μl中65℃で25分間インキュベーションすることによりアッセイした。これらの条件下、野生型リガーゼは全て、事実上、アデニル化(adenylated)形態で見られた。120mMトリス−HCl、pH7.6、2%SDS、20%グリセロール、0.02%ブロモフェノールブルー、および300mM2−メルカプトエタノールを含有する等容量の2×サンプル緩衝液の添加により反応を止めた。サンプルを5分間沸騰させ、7.5%ポリアクリルアミド−0.1%SDSゲル上に50μlを充填することにより分析した。アデニル化酵素は、脱アデニル化形態(78Kd)よりも見かけの分子量が高い(81Kd)ので識別できる。
幾つかの変異ではアデニレーション後も移動度が変わらないという可能性を除外するために、放射性[32P]NAD+を用いる実験も実施した。この場合、反応は、3.3μCi[32P]NAD+(800Ci/mmol、NEN-DuPont Company, Chadds Ford, PA)を使用する以外は上記と同じ条件下、反応混合物25μl中で実施した。65℃で15分インキュベーション後、非放射性NAD+1.5pmolesを反応混合物に加え、5分以上インキュベーションさせてアデニレーション反応をほぼ完了するまで進める。2×サンプル緩衝液25μlを添加して反応を止める。得られた混合物を100℃で5分間沸騰させ、その後7.5%ポリアクリルアミド−0.1%SDSゲルにて分析した。このゲルを室温で3時間、コダックXAR−5フィルム対してオートラジオグラフィーにかけた。各レーンのタンパク質サンプルを確かめるために、次いで、ゲルをクマシー・ブリリアント・ブルーで染色した。
脱アデニレーション活性(酵素からDNA基質へのアデニル基の転移)についてアッセイするために、鮭精子DNA(Sigma, St. Louis)を膵臓DNase I(Barany et al., Gene 109: 1-11 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)とインキュベーションすることにより調製したニック形成鮭精子DNA5μgを1mMNAD+の代わりに使用した以外はアデニレーション実験と同じ条件を使用した。脱アデニル化酵素は、7.5%ポリアクリルアミド−0.1%SDSゲルでの電気泳動により分離した場合、高速移動バンド(78Kd)として認識された。
オリゴヌクレオチドプローブJL514を、50mMトリス−HCl、pH7.6、10mMMgCl2、1mMEDTA、10mMDTT、[γ−32P]ATP(6000Ci/mmol、NEN-DuPont Company)45pmole、ゲル精製オリゴヌクレオチド15pmoleおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を含有する反応物10μl中、37℃で45分間インキュベーション後、5’標識した。10mMATP 1μlを反応混合物に加え、インキュベーションを2分以上続けた。60mMEDTAを加えて反応を止めた。キナーゼを64℃で20分間インキュベーションすることにより熱不活性化した。リン酸化オリゴヌクレオチドをTE緩衝液中で平衡化したセファデックスG−25カラムにて分離した。リン酸化オリゴヌクレオチドを含有するフラクションを集め合わせ、使用まで等分ずつ−20℃で貯蔵した。リン酸化オリゴヌクレオチドJL514の比放射能は、9×106cpm/pmolであった。
2つの短いオリゴヌクレオチドプローブ(JL538およびJL514)をより長い相補性オリゴヌクレオチド標的(JL539)にアニーリングすることによりニック形成DNA二本鎖基質を形成させた。これらのヌクレオチド配列は:JL538 (配列番号:75): 5' AAC CAC AGG CTG CTG CGG ATG CCG GTC GGA G 3'; JL514 (配列番号:76): 5' AGA GCC GCC ACC CTC AGA ACC GCC ACC CTC 3'; JL539配列番号:77): 5' GAG GGT GGC GGT TCT- GAG GGT GGC GGC TCT CTC CGA CCG GCA TCC GCA GCA GCC TGT GGT T 3'である。
反応は、20mMトリス−HCl、pH7.6、10mMMgCl2、100mMKCl、10mMDTT、1mMNAD+とニック形成DNA二本鎖基質60fmolを含有する緩衝液40μl中で実施した。DNAプローブと標的は、反応混合物を94℃で2分間インキュベーションして変性させ、65℃で2分間再度アニーリングした。連結反応は、Tth DNAリガーゼの添加により開始し、65℃で30分間実施した。停止溶液(83%ホルムアミド、8.3mMEDTAおよび0.17%ブルーデキストラン)40μlを添加して反応を止めた。サンプルを93℃で2分間変性させ、迅速に氷で冷却し、その後、8M尿素−10%ポリアクリルアミドゲル上に20μlを充填した。電気泳動後、ゲルをホスホリメジャースクリーン(phosphorimager screen)に20分間さらした。放射性標識連結反応産物をMolecular Dynamics Phosphorimager (Sunnyvale, CA)にて分析し、Image-Quant ソフトトウェアを用いて定量した。
部分精製した変異Tth DNAリガーゼを、NAD+の存在下でアデニレーションについて、また、ニック形成鮭精子DNAの存在下で脱アデニレーションについてアッセイした。試験した野生型酵素も全K294変異もNAD+の存在下でアデニル化され、ニック形成鮭精子DNAと共にインキュベーションすると脱アデニル化される。
オリゴヌクレオチドプローブは、Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation (Foster City, CA)の試薬およびモデル394自動DNA合成装置を使用して合成した。フルオレッセント標識を6−FAM(6−カルボキシフルオレッセイン)アミデイトを使用してオリゴヌクレオチドの5’末端に結合したか、またはApplied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation Applied Biosystems DivisionのNHS−FAM(FAMのN−ヒドロキシスクシンイミドエステル)を使用して、3’−アミノ基(Glen ResearchのC3−CPGカラム(Sterling, VA))に結合した。一般的ヌクレオチド同族体であり、本明細書でQと呼ぶ1−(2’−デオキシ−b−D−リボフラノシル)−3−ニトロピロールを、記載(出典明示により本明細書の一部とするBergstrom, D. E., et al., JACS, 117:1201-1209 (1995))のように合成し、ホスホロアミデイトに形質転換し、オリゴヌクレオチド合成した。本実験で使用した総てのオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動で、DNAのゲルスライスからの回収をWaters Division of Millipore (Bedford, MA)のC18−Sep-Pak Cartridgesを使用して行った。
ゲル精製オリゴヌクレオチド1nmoleを、50mMトリス−HCl、pH7.6、10mM MgCl2、1mM EDTA、10mM DTT、1mM ATPおよび10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を含む25μl反応物中で、37℃で45分、リン酸化した。反応を0.5M ETDA 0.5μlの添加により停止させ、キナーゼを64℃で20分インキュベートすることにより熱不活性化した。リン酸化オリゴヌクレオチドを使用まで5μl量で−20℃で貯蔵した。
野生型TthDNAリガーゼを、phoAプロモーターコントロール下にTthリガーゼ遺伝子を含むイー・コリ株から、いくつか修飾しながら記載(出典明示により本明細書の一部とするBarany, F., et al., Gene, 109:1-11 (1991))のように精製した。簡単に、細胞を一晩30℃で低リン酸(誘導)培地で生育させ、回収し、融解緩衝液(20mMトリス−HCl pH8.5、1mM EDTA、10mM 2−メルカプトエタノール、0.15M PMSF)に再懸濁し、超音波処理(出典明示により本明細書の一部とするBarany, F., et al, Gene, 109:1-11 (1991))した。細胞残骸の除去後、上清を20mMトリス−HCl pH8.5、50mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM EDTA、1mM DTTおよび2mM 2−メルカプトエタノールに調節し、65℃で30分インキュベートし、4℃で遠心することにより浄化した。上清を等量の10mMトリス−HCl、pH7.6、0.5mM EDTAで希釈し、濾過し、20mMトリス−HCl、pH8.5、50mM KCl、1mM EDTA、20%グリセロールで平衡化した10ml Red-Sepharoseカラム(Pharmacia)に充填した。タンパク質を、PharmaciaのFPLC装置を使用して、50mMから1M KClの30ml直線塩勾配で溶出した(出典明示により本明細書の一部とするTakahaski, M., et al., Agric. Bio. Chem., 50:1333-1334 (1986))。TthDNAリガーゼは0.4−0.8M KClの間で溶出し、純粋Tthリガーゼ(クーマシー染色7.5%ポリアクリルアミド−0.1%SDSポリアクリルアミドゲルでアデニル化および脱アデニル化形のダブレットとして見られる)を含むDNAフラクションをプールした。酵素を等量の飽和硫酸アンモニウムで沈殿し、ペレットを1.5ml dH2Oに溶解し、10mMトリス−HCl、pH8.5、1mM EDTA、1mM DTT、0.2mg/ml BSAおよび50%グリセロール含有貯蔵緩衝液500mlに対して4℃で透析した。タンパク質濃度をブラッドフォード法(出典明示により本明細書の一部とするBradford, M.M., Anal. Biochem., 72:248-254 (1976))により測定した。約4mgのTthDNAリガーゼを450mlの培養から得た。変異体TthDNAリガーゼを先に記載のように部分的に精製した。
各反応を、ニックDNA二本鎖基質で、20mMトリス−HCl、pH7.6;10mM MgCl2;100mM KCl;10mM DTT;1mM NAD+;および12.5nM(100fmoles)を含む緩衝液40μl中で行った。DNAプローブを変性(94℃で2時間)し、再アニール(65℃で2分)し、0.12nM(5fmoles)TthDNAリガーゼの添加により連結反応を開始し、65℃で行った。5μl量を0時間、2時間、4時間、6時間、8時間および23時間に取り、停止溶液(83%ホルムアミド、83mM EDTAおよび0.17%ブルー・デキストラン)18μlと混合した。この混合物5μlに、レーン内標準で蛍光標識したROX−1000 0.5μlを添加した。サンプルを93℃で2分変性し、氷で急速に凍結させ、8M尿素−10%ポリアクリルアミドゲルに充填し、モデル373A自動DNAシークエンサー(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation)で1400V(一定ボルト数)で電気泳動した。電気泳動条件は、製造者の指示通りであった。ゲルを1.2×TBE(54mMトリス−ホウ酸および1.2mM EDTA、pH8.0)中で重合化し、0.6×TBE(27mMトリス−ホウ酸および0.6mM EDTA、pH8.0)の流動緩衝液で、30分、サンプルの正常流と逆の電極極性で予め流し、サンプルを充填した。予め流し、サンプルを充填した後、ゲルを正常の頂上から下の方向で2.5時間流した。蛍光標識した連結反応産物を分析し、Genescan 372 ヴァージョン1.2ソフトウエア(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation)を使用して定量し、結果をDeltaGraph Pro3ソフトウエア(DeltaPoint, Inc. Monterey, CA)を使用してプロットした。
これらの実験の条件は、図面の簡単な説明に示すように異なる量のTthDNAリガーゼおよび異なるプローブを使用する以外、適合性アッセイと同じであった。反応を12.5nM(2pmoles)のニックDNA二本鎖基質含有反応緩衝液160μl中、65℃で行った。DNAプローブおよび標的を反応混合物を94℃で2分インキュベートすることにより変性し、65℃で2分再アニールした。連結反応をTthDNAリガーゼの添加により開始した。一定量(10μl)をミスマッチ基質含有反応については0、2、4、6、8および10時間に:およびマッチ基質含有反応については0、10、20、30、40、50、60および70秒に回収した。マッチ基質を使用したアッセイのために、2.5μlサンプルを2.5μl充填緩衝液、0.5μl ROX−1000と混合し、ゲル電気泳動をした。373ADNAシークエンサーでのフルオレッセントサンプルの直線検出範囲が0.1fmolから10fmolの範囲であるため、1%より少ない収率のミスマッチ連結反応の産物を正確な定量のためにエタノール沈殿により濃縮した。10μl量から、9.5μlをTE緩衝液(10mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA)で200μlとし、担体としての酵母tRNA 4μgとエタノール沈殿させた。ペレットを5μl充填緩衝液および0.5μl ROX−1000に再懸濁し、ゲル電気泳動した。未反応フルオレッセントプローブの量を、10μl量の0.5μlを4.5μl充填緩衝液と0.5μl ROX−1000で希釈することにより測定した。サンプルを変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、得られたものを上記のように分析した。初速度をx軸が時間、y軸が産物の収率であるグラフの直線の傾斜から計算した。
塩基同族体またはニックの3’側の3位にミスマッチを挿入することにより、TthDNAリガーゼを使用したLDR反応の適合性を改善する可能性を試験するために、オリゴヌクレオチドプローブを設計した。これらの10個の識別したプローブを5つの対に分けた。各対の二つのプローブは3’末端の一つの塩基が異なる(”C”または”T”)。3’末端に”C”を有するプローブは、”T”プローブより5’末端に二つ多い塩基を有し、配列決定ゲルにおける連結反応産物の区別を可能にする。3’末端から3位の塩基同族体”Q”および他の塩基は下線を引く。ニックDNA二本鎖基質を左側プローブの一端 (例えば、SLP3’TTT)、および共通蛍光標識プローブCom610-3’Fを鋳型プローブ(例えば、GLg.m3A)にアニールすることにより形成する。この基質はニックの3’側にT−Gミスマッチを含む。ミスマッチおよび完全マッチ連結反応産物の正確な定量は、Genescanプログラムを使用した蛍光標識産物の走査により達成できる。完全マッチ連結反応の、ミスマッチ連結反応を超える初速度は、LDR反応のマッチ性を示す。余分のミスマッチまたは塩基同族体を、適合性を改善するためにニックの3’側の3位に挿入した。図17Aにおいて、プローブSLP3’Q2TC、SLP3’Q2TT、SLP3’TTCおよびSLP3’TTTを標的GLg.m3Aで使用し、3’側から3位のT:Aマッチと比較して増加したマッチ性におけるQ2:Aの寄与を試験した。SLP3’TTCおよびSLP3’TTTプローブを標的Glg.m3AおよびAlg.m3Aの組み合わせで使用し、共通標的(正常DNA)の過剰における、少ない標的(癌変異)の検出の試験をした。図13Bにおいて、プローブSLP3’ATCおよびSLP3’ATTを標的GLgに使用し、3’側の3位におけるG:Cマッチと比較して改善されたマッチ性におけるA:Cの寄与を試験した。図17Cにおいて、プローブSLP3’Q2TC、SLP3’Q2TT、SLP3’Q18TC、SLP3’Q18TT、SLP3’GTCおよびSLP3’GTTを標的GLg.m3Tに使用し、3’側から3位のT:Aマッチと比較して増加した適合性におけるQ2:T、Q18:TまたはG:Tの寄与を試験した。
図13A−Cに示されるように、4つの長さGLg、ALg、TLgまたはClgの一つ(図13Cに示す)を、下線塩基で変化する鋳型標準として使用した。図13A−Bは、鋳型鎖の一つ、例としてALgを使用したニックDNA二本鎖の形成を示す。図13Aに示すように4つの異なるニックDNA基質は、共通蛍光標識オリゴ、com5Fおよび識別したオリゴ(RP5’A,RP5’C、RP5’G、RP5’T)を鋳型鎖ALgにアニールすることにより形成する。図13Bにおいて。4つの異なるDNA基質を、蛍光標識オリゴcom3Fおよび識別したオリゴ(LP3’A、LP3’C、LP3’G、LP3’T)を鋳型鎖ALgにアニールすることにより形成する。ニックDNA二本鎖のマトリックスは、ALgが以下の鋳型鎖、GLg、TLgおよびCLgで置き換わった場合、ニックの3’および5’側マッチおよび三つマッチ塩基対の可能な総ての組み合わせで形成する。共通蛍光標識への連結反応により形成された産物は、異なる長さの”A”テイルの取りこみにより、変性ポリアクリルアミドでのサイズにより識別できる。
これらのプローブ(図14に示す)は、ヒト真核成分タンパク質合成開始因子eIF−4E(出典明示により本明細書の一部とするRychlik, W., et al., ”Amino Acid Sequence of the mRNA Cap-Binding Protein From Human Tissue”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:945-949 (1987))から由来する。真核生物源由来のランダムDNA配列をTthDNAリガーゼ調製物における可能性のある細菌DNA汚染に起因する誤シグナルを避けるために選択する。プローブの融解温度は、最も近い近接熱力学法を使用して予測した(出典明示により本明細書の一部とするBreslauer, K. J., et al., ”Predicting DNA Duplex Stability From the Base Sequence”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3746-3750 (1986))。National Biosciences Inc., Plymouth, MN由来のOLIGO4.0プログラムを、可能性の有るヘアピン構造、反復配列および誤プライミングを除外するために使用した。このアッセイのための鋳型および検出オリゴヌクレオチドは、融解温度がアッセイ(65℃)で使用する温度よりも十分高いように設計し、連結反応作用におけるプローブの融解温度の作用を最小とする。
ニック基質を使用したフルオレッセントアッセイは、TthDNAリガーゼ適合性を試験するために開発された。ニック二本鎖基質を二つの隣接オリゴヌクレオチドプローブ(その一つはフルオレッセント色素FAMを含む)を長い相補的鋳型(底)鎖(配列は図13参照)にアニールすることにより製造した。明瞭にするために、蛍光標識ラベルプローブを共通オリゴヌクレオチドと定義し、一方その末端に試験塩基を含むプローブを識別オリゴヌクレオチドと呼ぶ。14オリゴヌクレオチド(図14)のセットを、ニックの3’および5`位に異なる1塩基対マッチおよびミスマッチの可能性の有る総ての組み合わせを製造するために使用した。両方の共通および識別オリゴヌクレオチドは、その融点が、アッセイ温度(65℃)よりも少なくとも10℃高いように設計した。これは、恐らく連結反応能率におけるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの相違の効果を最小とする。連結反応時間は23時間まで延び、ミスマッチ連結反応産物の正確な定量を可能とする。二つの隣接オリゴヌクレオチドの連結反応は、長いフルオレッセント産物を形成し、これを変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、分析した。
野生型TthDNAリガーゼによるニック閉鎖の適合性
識別塩基がニックの3’側に存在する場合、TthDNAリガーゼによるニック閉鎖の時間経過を表3に記載し、図15に示す。
T4 DNAリガーゼの適合性は特異性比として表されてきたが、これは1単位の酵素で30℃において100nMの鋳型の存在下、マッチ対ミスマッチの鋳型で生成する連結産物の比として定義される(Wu, D.Y., et al., Gene, 76:245-254 (1989)、引用により本明細書の一部とされる)。高い塩濃度(200mM)では、T−Tミスマッチに対する特異性比は6から60に、A−Aミスマッチに対しては1.5から40に、増加した。このより厳しい条件は、またKmを4倍に増加させ、Vmaxを凡そ30倍に減少させる(Wu,D.Y., et al., Gene, 76:245-254 (1989)、引用によって本明細書の一部とする)。S.セレヴィシエのDNAリガーゼIの適合性は3ないし900ngの酵素の存在下、20℃で30分間、完全マッチ対ミスマッチを含む基質での連結反応効率として定義される(Tomkinson, A.E., et al., Biochemistry, 31:11762-11771 (1992)、引用によって本明細書の一部とする)。このDNAリガーゼの効率は、ニックの3’側にT−Gミスマッチが存在するときは50倍減少することが見出された。その連結反応効率は、ニックの3’側にC−Tミスマッチが、そして同じ基質の5’側にT−Cミスマッチが存在するときは100倍以上減少した。異なったDNAリガーゼ適合性を上記二つの条件で比較することは、異なったインキュベイション時間および基質の使用によって変化するので、困難である。
Tth DNAリガーゼの優れた特異性は、変異対立遺伝子(A−Tマッチ)を野生型配列(G−Tミスマッチ)の200倍モル過剰の存在下に検出するためのリガーゼ連鎖反応(すなわちLCR)で利用された(Balles, J., et al., Mol. Gen. Genet., 245:734-40 (1994)、引用によって本明細書の一部とする)。いくつかの医学的DNA検出にはさらに大きな特異性が要求されるであろう。酵素−基質相互反応を不安定化することによってTth DNAリガーゼの適合性比を改善する二つの方法が、下に述べるように考案された。
対立遺伝子特異的PCRのための優れた方法は、識別3’塩基に隣接する意図的ミスマッチを持つプライマーの使用に基づいている(Cha, R.S., et al., PCR Methods and Applications, 2:14-20 (1992)およびRust, S., et al., Nucleic Acids Res., 21(16):3623-3629 (1993)、引用によって本明細書の一部とする)。この不安定化ミスマッチは正しい標的対立遺伝子のTaqポリメラーゼ伸延を劇的には阻害しなかったが、他の対立遺伝子の二重ミスマッチのため不正対立遺伝子の伸延効率を100ないし1000倍の因数で減少させた(Cha, R.S., et al., PCR Methods and Applications, 2:14-20 (1992)、引用によって本明細書の一部とする)。
モデル研究(QUANTA/CHARMM)に基づけば、Qはヘリックス構造への最小限の影響でTおよびAの両方に対して適合する(Bergstrom, D.E., et al., JACS, 117:1201-1209 (1995)、引用によって本明細書の一部とする)。ある場合には、Qはアンチ配座(Q−T)を採り、他の場合にはシン配座(Q−A)を採る。それでも、進行中の研究は、3−ニトロピロール−天然塩基相互作用には水素結合は限られた役割しか演じていないことを示唆している。
DNAポリメラーゼの適合性は、プライマー−鋳型結合に係わるモチーフ(HIVポリメラーゼ)(Bead, W.A., et al., J. Biol. Chem., 269:28091-28097 (1994) 、引用によって、本明細書の一部とする)、またはPhi29 DNAポリメラーゼ(Soengas, M.D., et al., The EMBO J., 11(11):4227-4237 (1992)、引用によって本明細書の一部とする)、T4 DNAポリメラーゼ(Reha-Krantz, L.J., et al., J. Virol., 67(1):60-66 (1993) およびReah-Krantz, L.J., et al., J. Biol. Chem., 269:5635-5643 (1994)、共に引用により本明細書の一部とする)またはヒトDNAポリメラーゼ・アルファ(Dong, Q., et al., J. Biol. Chem., 268:24163-24174 (1993)、引用により本明細書の一部とする)のexoIIIモチーフの領域指向的変異誘発によって減少する。時に、この同じexoIIIモチーフまたはモチーフ”A”は”アンチミューテイター”ストレインとしても知られる適合性増大変異物を与えるが、これは全体の適合性を調整しているこれらの酵素のポリメリゼイションと3’-5’エキソヌクレアーゼ活性との間の複雑な相互作用を反映する(Reha-Krantz, L.J., et al., J. Virol., 67(1):60-66 (1993)、Reah-Krantz, L.J., et al., J. Biol. Chem., 269:5635-5643 (1994)、Dong, Q., et al., J. Biol. Chem., 268:24163-24174 (1993)およびCopeland, W.C., et al., J. Biol. Chem., 268:11041-11049 (1993)、すべて引用によって本明細書の一部とする)。
全てのオリゴヌクレオチドはABI 394 DNA Synthesizer (Applied Biosystems Inc., Foster, CA)で合成された。FAM(Com 610 3’F)で標識されたオリゴヌクレオチドには、蛍光CPG(Glen Research) カラムが、オリゴヌクレオチドの3’末端に蛍光分子を導入するために使用された。オリゴヌクレオチドの、30%(重量/容量)水酸化アンモニウムによる支持体からの開裂には室温で2時間を要した。オリゴヌクレオチドはその後、55℃で4時間脱保護処理された。LDRに使用した全ての他のオリゴヌクレオチドは10%アクリルアミド/7M尿素ゲル上で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製された。電気泳動後、オリゴヌクレオチドは光sクリーンに対してUVシャドウ化することによって視覚化し、ゲルから剥ぎ取った(Applied Biosystems Inc., 1992)。それらは、500mM NaClおよび5mM EDTAを含むTNE緩衝液(100mM Trus/HCl pH 8.0)により64℃で一夜溶出し、Sec Pakカートリッジ(Millipore Corp, Milfford, MA)を業者の指示書に従って用いて回収した。
オリゴヌクレオチドは100μlのTEに溶解した。ストック溶液の一般的な濃度は凡そ1mMである。LDR用には、ゲル精製ストック溶液は約100μM=100 pmoles/μであった。
下流の共通のオリゴヌクレオチドは、化学的リン酸化試薬(Glen Research)を用いて5’末端をリン酸化した。この試薬の使用は、酵素によるオリゴヌクレオチドのリン酸化に代わるもので、リン酸化効率を決められと言う利点がある。化学的リン酸化試薬は、オリゴヌクレオチドの5’末端のリン酸化の迅速で簡便な方法であることを証明した。化合物は4℃で乾燥保存した。ABI394機器での合成は、0.1M溶液を、化合物100μモル当たり無水アセトニトリル1mlを加えることによって調製した。この液を完全な溶解を確実にするため時々振り混ぜながら約5分間放置した。オリゴヌクレオチドの合成は、業者の指示した合成サイクルに修飾を加えて実施した。たとえば、DMTグループは、カップリング効率を決定するために標準的な脱保護法により合成機上で除いた。
正常DNAの過剰存在下に低存在量配列(癌変異)を定量することが出来るアッセイ法が開発された。LDRアッセイにおける野生型および変異Tth DNAリガーゼを使用して、正常および癌DNA混合物中の癌DNAのフラクションを定量することが出来た。検出限界を決定するために使用したプローブを図19に示し、その配列を図20に示す。2種のオリゴヌクレオチドを標的に対して、上流プローブ(SLP3’TTT)の3’末端が下流プローブ(Com610−3’F)の5’末端に直ちに隣接するようにハイブリダイズさせた。接合部におけるヌクレオチドが標的鎖と正しく塩基対を構成する場合には、Tth DNAリガーゼで二つの隣接するオリゴヌクレオチドを接合することが出来る。この反応で使用したプローブは、連結反応部において、”正常”鋳型の上にT:Gミスマッチを、”癌”鋳型の上にT:Aマッチを作り出す。精製野生型酵素および変異酵素K294R(図21参照)の25fmoleの存在下、完全にマッチした鋳型(“癌”;ALg.m3AおよびAlg.m3Arev)の0−2.5nM(50fmole)を含むT:Gミスマッチ鋳型(“正常”;GLg.m3AおよびGlg.m3Arev)の12.5nM(250fmole)を使用して、LDR実験を3回に亙って行なった。産物をABI373ADNA配列決定用装置上で分離し、蛍光シグナルを定量する。収量が産物/(産物+プローブ)で定義されるのであれば、収量は過負荷プローブシグナルの停止により、人為的に高いものとなる。従って、希釈した産物標準を用いて検量数(1fmole=600ピーク面積単位)を発生させた。与えられたサンプル中の産物の量(fmole)は、産物の全ピーク面積を600で割ることによって算出した。この方法は、レーン当たり5μl以下の連結反応混合物を負荷させる場合、産物形成を過小に評価することになろう。両酵素共殆ど同量の産物を発生させたが、変異K294R酵素はより少ないバックグラウンドミスマッチ連結反応を与えた。従って、シグナル対ノイズ比率は野生型リガーゼに比較して変異酵素に対してほぼ2倍であった(図22参照)。K294R変異酵素の場合、シグナル対ノイズ比率は500の“正常”鋳型中、1個の”癌”鋳型を区別する場合、3.3であり、250の”正常”鋳型中、1個を区別する場合、5.4に増加した(図22の数値および表5に記載した類似の実験参照)。このアッセイを最も困難な場合、T:A完全マッチからT:Gミスマッチを区別するリガーゼの能力と比較する。
”癌”鋳型の量を正確に定量するためには、存在する”正常”鋳型の量を決定することが必要であり、これは二つの方法で行なうことが出来る。最も簡単な方法は、もとのPCR混合物中に少量比の蛍光標識プローブを含有させ、毛細管電気泳動または自動DNA配列決定装置を用いて、生成した産物の量を定量することである。第2の方法は、結合反応の定量的性質を利用して、もとの産物濃度を決定することである。図23は、接合部に完全にマッチしたプローブ(SLP3’TTCおよびCom610−3’F)を使用して、0.005nM(0.1fmol)−0.5nM(10fmol)の“正常”鋳型(GLg.m3AおよびGlg.m3Arev)から発生したLDR産物の量を示す。K294R変異酵素を使用した場合、シグナル対ノイズ比率は、0.005nM(0.1fmol)の”正常”鋳型を検出する場合、4.5であり、0.0125nM(0.25fmol)の“正常”鋳型を検出する場合、7.4に改善された(データを示さず)。未知サンプルからのLDR産物の量を検量曲線と比較することにより、サンプル中の全DNAを定量することが出来る。これは、100attomole(500nM)から10femtomole(0.5nM)量の未希釈サンプルを直接試験することにより、またはより大量/高濃度のDNAを使用した場合には、希釈サンプルを試験することにより、達成することが出来る。これらの結果は、未知量のサンプル中に存在する特異的DNAの量や、単一塩基(“癌”)変異を含む割合(量)を決定することが出来ることを証明するものである。
癌検出における野生型および変異Tth DNAリガーゼの使用をさらに探求するため、連結検出反応が過剰の正常細胞中の癌細胞を区別する生物学的問題をより密接に類似する競合アッセイにおいて、効果的に使用された。この型のアッセイは、リガーゼが正しい配列をシールすることのみならず、多くの酵素が正しくない基質に結合する場合、特にそうでなければならないことを要する。それ故、先のアッセイの場合よりもより高い濃度が要求されるが、このようなより高い濃度は、バックグラウンド(ミスマッチ)連結反応を上昇させる可能性がある。2種のオリゴヌクレオチド(SLP3’TTTおよびCom610 3’F)を変性標的に対して、1つのオリゴヌクレオチドの3’末端が蛍光標識オリゴヌクレオチドの5’末端に隣接しているようにハイブリダイズさせる(図19参照)。リガーゼは、次いで2つの隣接するオリゴヌクレオチドを、当該ヌクレオチドが連結反応部におい標的鎖と正しく塩基対を形成する場合、連結させることが出来る。LDRについての初期実験を、25fmolの精製野生型および変異酵素K294RおよびK294Lの存在下、ミスマッチ鋳型(”正常”)および完全マッチ鋳型(”癌”)を独立して、またはお互いを一緒にして使用し、3回にわたって実施した(表5)。
リガーゼ適合性比率を高めることを意図して、識別プローブの3’末端から第3位にQ2またはQ8(1−(2’−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピロール−3−カルボキシアミド)ヌクレオチド類似体を含むプローブを合成した(図24参照)。これらの実験において、プローブ類似体に対立する鋳型塩基は、AまたはTであり、より好ましいQ2:A、Q2:AおよびQ18:T対のアッセイを可能にする。これらの類似体プローブを使用して、ミスマッチ連結反応から生ずる産物は、正規のプライマーに比較して、約2〜3倍減少した(表6)。
このアッセイは、正常DNAの過剰存在下に低存在量配列(癌変異)を定量できるものであり、過剰のC:Aミスマッチの存在下でのC:Gマッチ検出限界を測定するのにも応用された。LDRアッセイにおいて野生型および変異Tth DNAリガーゼを使用して、正常および癌DNA混合物中の“癌”DNAのフラクションを定量した。検出限界を決定するために使用したプローブは図26に、配列は表7に示す。
アッセイは、与えられたサンプル中の癌変異の量を定量するために開発された。LDRアッセイにおいて、野生型および変異Tthリガーゼを使用して、正常および癌DNAの混合物中における癌DNAのフラクションを定量した。検出限界を決定するために使用されたプローブを第30図に示す。二つのオリゴヌクレオチドを標的に対して上流プローブの3’末端が下流プローブの5’末端に隣接するようにハイブリダイズさせた。Tth DNAリガーゼは、接合部におけるヌクレオチドが標的鎖と正しく塩基対を形成する場合には、二つの隣接するオリゴヌクレオチドを接合することが出来る。LDR実験は、25fmolの精製野生型および変異酵素K294Rの存在下、0から2.5nM(50fmole)完全マッチ鋳型(“癌”)を含む12.5nM(250fmole)のミスマッチ鋳型(“正常”)を用いて、3度にわたり行われた(図21参照)。両酵素はほぼ同量の産物を発生させたが、変異K294R酵素はより少ないバックグラウンドミスマッチ連結反応を与える。従って、シグナル対ノイズ比率は、野生型リガーゼに比較して変異酵素に対して多少ともより良好であった(約1.5倍)(図22)。K294R変異酵素により、シグナル対ノイズ比率は、500の“正常”鋳型中1個の“癌”鋳型を区別する場合3.3であり、250の”正常”鋳型中1個を区別する場合は5.4に増加した。このアッセイは、最も困難な場合のG:TミスマッチをA:T完全マッチから識別するためのリガーゼの能力を比較するものである。Tth DNAリガーゼはC:Aミスマッチ(第2の最も困難なケース)をG:Tミスマッチに比較して区別する場合に5倍以上の適合性を示すので、変異酵素は他のすべての他のミスマッチを2,500中1またはそれ以上で区別するものと推定される。
K−ras遺伝子は、変異検出技術に対する二つの有意な試みを提供する。H−、N−およびK−ras遺伝子の間の広範な配列ホモロジーは、正しい遺伝子を選択的に増幅するために、1次エクソン特異性PCR反応を必要とする。その後の対立遺伝子特異的PCRは、個々のK−ras変異を検出するために用いられたが、すべての変異を検出するための複合PCRは、コドン12とコドン13変異の近接によって複雑化される。
LDRプローブは、最も共通の変異が一般により小さな連結反応産物を提供するように設計される。結腸癌における7つの最も共通のK−ras変異に対して、産物はG12D(GAT)に対して44bp、G12A(GCT)に対して45bp、G12V(GTT)に対して46bp、G12S(AGT)に対して47bp、G12R(CGT)に対して48bp、G12C(TGT)に対して49bpおよびG13D(GAC)に対して51bpである。野生型DNAに対して特異的なプローブは、また、変異DNAの検出に先立って、PCR産物の量を定量するために設計された。PCR産物は、3%アガロースゲル中、エチジウムブロマイド染色により評価される。
この実験は、すべてのLDRプローブを複合して、K−rasのコドン12、13および61における変異を検出出来ることを証明する。DNAは、コドン12および13(SW620,G12V;SW1116,G12A;LS180,G12D;DLD1,G13D)における既知変異により、セルラインから製造された。特定の変異に相補的な個々のプローブを使用するPCR/LDRにより、正しい連結反応産物が産生された。更に、正常DNA過剰における別の変異(G12DおよびG12V)を含む2種のDNA標的の等量混合物は、おおよそ等モル量の両LDR産物を与えた。
すなわち、セルラインから誘導されたサンプル、微細切癌およびパラフィン包埋組織についての複合PCR/LDRの利用が示された。この技術は、非常に正確であり(99.3%)、高い感度を示す(すなわち、500正常配列中、1つの変異が検出される)。
LDR反応を94℃で15秒およびサイクル当たり65℃で4分を20サイクル行った。管をエタノール−ドライアイス浴中で冷却し、0.5mMEDTAの0.5μlを添加することにより、反応を完全に停止させた。反応産物の2.5μlの溶液を、2.5μlの増量緩衝液(83%ホルムアミド、8.3mMEDTAおよび0.17%ブルー・デキストラン)および0.5μlGene Scan TAMRA350分子量マーカーと混合し、94℃で2分間変性し、氷上で急速に冷却し、8M尿素−10%ポリアクリルアミドゲル上に加え、ABI373DNA配列決定機上1400ボルトで電気泳動を行った。蛍光連結反応産物を分析し、指数方程式のパラメターをDeltagraph Pro3.5ソフトウエアを用いてデータに適合させた。
Claims (61)
- 1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により1以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している1以上の少数標的ヌクレオチド配列を、前記少数標的ヌクレオチド配列が前記多数標的ヌクレオチドに対して1:10より小さく、且つ1:1000より大きい割合で、前記少数標的ヌクレオチド配列および前記多数標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中で、検出する方法であって、
該方法が、
1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは、(a)少数標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプローブおよび(b) 少数標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する少数標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、そして、1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットは標的核酸配列の相補物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブセットを含まないものであり;
リガーゼを準備し;
サンプル、1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合し、リガーゼ検出反応混合物を形成し;
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、この変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、このハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、その夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して線形的な増幅を達成し、各セットがリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別し得るために、連結反応産物配列と一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結反応産物配列を形成し、その中で、オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるが、1以上のミスマッチの存在によって一緒に連結せず、そして変性処理の際に個々に分離しているものであり;
サンプル中に存在する少数標的ヌクレオチド配列の結果として産生された連結反応産物配列の存在を検出する;
ことを含む方法であって、
多数標的ヌクレオチド配列の存在下で少数標的ヌクレオチド配列によって生成された連結反応産物配列量の、多数標的ヌクレオチド配列単独によって生成された連結反応産物配列量に対する割合という意味において測定される、3.4:1より大きく、106:1より小さいシグナル対ノイズ比率を達成する、方法。 - 特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別され得るようにユニーク長を有し、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し;
該検出後に、サイズの相違する連結反応産物配列を識別する;
ことを含む、請求項1の方法。 - 各セットの第2オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
1以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し、該検出は、アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列の存在を示し、それによってサンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す;
ことを含む、請求項1の方法。 - サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し;
サンプル中に存在する多数標的ヌクレオチドの結果として産生した多数連結反応産物配列を検出し;
検出した多数連結反応産物配列を定量し;
検出した少数連結反応産物配列を定量する;
ことを含む、請求項1の方法。 - サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し;
既知量の1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し;
マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む1以上の配列特異的プローブセットを準備し;
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し;
多数および少数の連結反応産物配列を定量し;
未知のサンプルから生じた多数および少数の連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項1の方法。 - 第2オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
1以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し;
アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を定量し;
未知のサンプルから生じた捕捉連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた捕捉連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項5の方法。 - 1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が1以上の単一ヌクレオチド位置における標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項5の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第2オリゴヌクレオチドプローブは異なる長さを有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し;
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する;
ことを含む、請求項5の方法。 - オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第2オリゴヌクレオチドプローブは異なるレポーター標識を有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し;
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する;
ことを含む、請求項5の方法。 - オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第2オリゴヌクレオチドプローブは異なるアドレス可能アレイ特異的部分を有する、請求項6の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、アドレス可能なアレイ特異的部分を有する共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第2オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能なレポーター標識を有する、請求項6の方法。
- 単一標的ヌクレオチド配列中の2以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違、または多数標的ヌクレオチド配列中の2以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違を、重複し得る部分を有するオリゴヌクレオチドプローブセットで識別する、請求項1の方法。
- サンプルにおいて、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の1以上のセットが共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、該検出において、連結反応産物配列の標識が検出され、それによって1以上の標的ヌクレオチド配列中の1以上のヌクレオチド位置における1以上の低存在量の対立遺伝子のサンプル中の存在が示される、請求項1の方法。
- サンプル中に未知量で存在する、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を定量し、該方法がさらに、
既知量の1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し;
1以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを準備し;
各セットは、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプローブおよび(b) マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第2オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定マーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、該複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよび該複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、マーカーヌクレオチド配列を含み、単一ヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し得、グループ内の1以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブとを分かち持ち、リガーゼ検出反応混合物を形成するための該混合が、マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出反応混合物に混合することを含み;
連結反応産物配列を定量し;
低存在量の未知のサンプルから生じた連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の1以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列のレベルについて定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項1の方法。 - 過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の1以上のセットが共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の1以上のセットが共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に、塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが変異対立遺伝子特異的プローブよりも低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し;
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し;
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける1以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項1の方法。 - 過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の1以上のセットが共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の1以上のセットが共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に、塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、および/または1以上の内部ミスマッチまたは修飾を含有し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し;
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し;
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける1以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項1の方法。 - 正常対立遺伝子特異的プローブが正常塩基を3’末端に含有する、請求項16の方法。
- 正常対立遺伝子特異的プローブが1以上の内部ミスマッチまたは修飾を3’末端から4塩基以内に含有する、請求項17の方法。
- 修飾が1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)イミダゾール−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3−ニトロピロール、4−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)イミダゾール−2−カルボキサミド、2'−デオキシ−5−フルオロウリジン、2−デオキシイノシン、6−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−6H,8H−3,4−ジヒドロピリミド〔4,5−C〕〔1,2〕オキサジン−7−オン、2−アミノ−7−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−6−メトキシアミノプリン、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−5−ニトロインドール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピラゾール−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド、3−アミノ−1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−1,2,4−トリアゾール、5−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−ピリミジノン、5−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−チオピリミジン、5−アミノ−1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)イミダゾール−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3−ニトロピラゾール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨードピラゾール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−プロピニルピラゾール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピロール−3−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピラゾン−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ニトロイミダゾールおよび1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項16の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、2'−メトキシまたは3'−アミノ−2',3'−ジデオキシ修飾をその糖ホスフェート・バックボーンに、連結反応部から4塩基の1つまたは組合せの位置に含有する、請求項16の方法。
- サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの1つとの間のG:TまたはT:Gミスマッチについて相対比率1:500で、識別される、請求項1の方法。
- サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの1つとの間のG:TまたはT:Gミスマッチについて相対比率1:2000で、識別される、請求項1の方法。
- 少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの1つとの間のすべてのミスマッチについて相対比率1:100で、識別される、請求項1の方法。
- 少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの1つとの間のG:TまたはT:G以外のミスマッチについて相対比率1:500で、識別される、請求項1の方法。
- 1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により1以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している1以上の少数標的ヌクレオチド配列を、前記少数標的ヌクレオチド配列が前記多数標的ヌクレオチドに対して1:10より小さく、且つ1:1000より大きい割合で、前記少数標的ヌクレオチド配列および前記多数標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中で、検出する方法であって、
該方法が、
1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは、(a)標的特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプローブおよび(b)標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有するものであり、連結反応部に3’末端を有する第1オリゴヌクレオチドプローブは1以上の修飾を有し、その修飾は、第1および第2オリゴヌクレオチドプローブが、少数標的ヌクレオチド配列と連結反応部に3’末端を有する第1オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部で完全マッチを有するサンプル中の少数標的ヌクレオチドにハイブリダイズするときの連結反応速度を、第1および第2オリゴヌクレオチドプローブが、多数標的ヌクレオチド配列と連結反応部に3’末端を有する第1オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でミスマッチを有するサンプル中の多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときの連結反応速度に比べて識別的に変えるものであり、修飾第1オリゴヌクレオチドプローブを用いた前記連結反応過程が、サンプル中の少数および多数標的ヌクレオチド配列から生成される連結反応産物合計の、少数標的ヌクレオチド配列が存在しないサンプル中の同じ量の多数標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物量に対する割合として定義されたシグナル対ノイズ比率を有し、この比率は修飾を欠く第1オリゴヌクレオチドプローブを用いた連結検出反応についてのシグナル対ノイズ比率よりも大きく、そして、1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットは標的核酸配列の相補物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブセットを含まないものであり;
リガーゼを準備し;
サンプル、1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合し、リガーゼ検出反応混合物を形成し;
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、この変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、このハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、その夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、線形的な増幅を達成するためのオリゴヌクレオチドプローブの修飾なしで互いに連結して、各セットがリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別し得るために、連結反応産物配列と一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結反応産物配列を形成し、その中で、オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるが、1以上のミスマッチの存在によって一緒に連結せず、そして変性処理の際に個々に分離しているものであり;
連結反応産物配列の存在を検出する;
ことを含む方法。 - 1以上の修飾が連結反応部から9塩基以内のヌクレオチド類似体である、請求項25の方法。
- 修飾がオリゴヌクレオチドプローブの3’末端から9塩基以内にある、請求項26の方法。
- 修飾がオリゴヌクレオチドプローブの3’末端から3塩基離れた位置のヌクレオチド類似体である、請求項26の方法。
- 修飾が1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)イミダゾール−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3−ニトロピロール、4−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)イミダゾール−2−カルボキサミド、2'−デオキシ−5−フルオロウリジン、2−デオキシイノシン、6−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−6H,8H−3,4−ジヒドロピリミド〔4,5−C〕〔1,2〕オキサジン−7−オン、2−アミノ−7−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−6−メトキシアミノプリン、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−5−ニトロインドール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピラゾール−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド、3−アミノ−1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−1,2,4−トリアゾール、5−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−ピリミジノン、5−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−チオピリミジン、5−アミノ−1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)イミダゾール−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3−ニトロピラゾール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨードピラゾール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−プロピニルピラゾール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピロール−3−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピラゾン−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ニトロイミダゾールおよび1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項28の方法。
- 修飾が連結反応部から9塩基内の1つまたは組合せた位置での第1オリゴヌクレオチドプローブの糖ホスフェートバックボーンにある、請求項25の方法。
- 修飾第1オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、2'−メトキシおよび3'−アミノ−2',3'−ジデオキシ修飾を含有する、請求項30の方法。
- 特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別され得るようにユニーク長を有し、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し;
該検出後に、サイズの相違する連結反応産物配列を識別する;
ことを含む、請求項25の方法。 - 各セットの第2オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
1以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し、該捕捉はアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を示し、それによってサンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す;
ことを含む、請求項25の方法。 - サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し;
サンプル中に存在する多数標的ヌクレオチドの結果として産生した多数連結反応産物配列を検出し;
検出した多数連結反応産物配列を定量し;
検出した少数連結反応産物配列を定量する;
ことを含む、請求項25の方法。 - サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し;
既知量の1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し;
マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブを含む1以上の配列特異的プローブセットを準備し;
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し;
多数および少数の連結反応産物配列を定量し;
未知のサンプルから生じた多数および少数の連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項25の方法。 - 各セットの第2オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
1以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し;
アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を定量し;
未知のサンプルから生じた捕捉連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた捕捉連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項35の方法。 - 1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が1以上の単一ヌクレオチド位置における標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項35の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第2オリゴヌクレオチドプローブは異なる長さを有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し;
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する;
ことを含む、請求項35の方法。 - オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第2オリゴヌクレオチドプローブは異なるレポーター標識を有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し;
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する;
ことを含む、請求項35の方法。 - オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第2オリゴヌクレオチドプローブは異なるアドレス可能アレイ特異的部分を有する、請求項36の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、アドレス可能なアレイ特異的部分を有する共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第2オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能なレポーター標識を有する、請求項36の方法。
- 単一標的ヌクレオチド配列中の2以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違および多数標的ヌクレオチド配列中の2以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違を、重複し得る部分を有するオリゴヌクレオチドプローブセットで識別する、請求項25の方法。
- サンプルにおいて、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の1以上のセットが共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、該検出において、連結反応産物配列の標識が検出され、それによって1以上の標的ヌクレオチド配列中の1以上のヌクレオチド位置における1以上の低存在量の対立遺伝子のサンプル中の存在が示される、請求項25の方法。
- サンプル中に未知量で存在する、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を定量し、該方法がさらに、
既知量の1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し;
1以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを準備し;
各セットは、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプローブおよび(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第2オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、該複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよび該複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、マーカーヌクレオチド配列を含み、単一ヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し得、グループ内の1以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、リガーゼ検出反応混合物を形成するための該混合が、マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出反応混合物に混合することを含み;
連結反応産物配列を定量し;
低存在量の未知のサンプルから生じた連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の1以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列のレベルについて定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項25の方法。 - 過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の1以上のセットが、共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の1以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが変異対立遺伝子特異的プローブよりも低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し;
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し;
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける1以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項25の方法。 - 過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の1以上のセットが、共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の1以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第1オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第2オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、および/または1以上の内部ミスマッチまたは修飾を含有し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し;
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し;
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける1以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する;
ことを含む、請求項25の方法。 - 正常対立遺伝子特異的プローブが正常塩基を3’末端に含有する、請求項46の方法。
- 正常対立遺伝子特異的プローブが1以上の内部ミスマッチまたは修飾を3’末端から4塩基以内に含有する、請求項47の方法。
- 修飾が1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)イミダゾール−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3−ニトロピロール、4−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)イミダゾール−2−カルボキサミド、2'−デオキシ−5−フルオロウリジン、2−デオキシイノシン、6−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−6H,8H−3,4−ジヒドロピリミド〔4,5−C〕〔1,2〕オキサジン−7−オン、2−アミノ−7−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−6−メトキシアミノプリン、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−5−ニトロインドール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピラゾール−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド、3−アミノ−1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−1,2,4−トリアゾール、5−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−ピリミジノン、5−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−チオピリミジン、5−アミノ−1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)イミダゾール−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3−ニトロピラゾール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨードピラゾール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−プロピニルピラゾール、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピロール−3−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピラゾン−4−カルボキサミド、1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ニトロイミダゾールおよび1−(2'−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項46の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、2'−メトキシまたは3'−アミノ−2',3'−ジデオキシ修飾をその糖ホスフェート・バックボーンに含有する、請求項46の方法。
- サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの1つとの間のG:TまたはT:Gミスマッチについて相対比率1:500で、識別される、請求項25の方法。
- サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの1つとの間のG:TまたはT:Gミスマッチについて相対比率1:2000で、識別される、請求項25の方法。
- 少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの1つとの間のすべてのミスマッチについて相対比率1:100で、識別される、請求項25の方法。
- 少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの1つとの間のG:TまたはT:G以外のミスマッチについて相対比率1:500で、識別される、請求項25の方法。
- リガーゼ検出混合物が、ミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを含まない、請求項1に記載の方法。
- リガーゼ検出混合物が、多数標的ヌクレオチド配列に対するミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを、少数標的ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの量より少量で、且つサンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効である量で、含む、請求項1に記載の方法。
- リガーゼ検出混合物が、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効な形態で、多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項1に記載の方法。
- リガーゼ検出混合物が、ミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを含まない、請求項25に記載の方法。
- リガーゼ検出混合物が、多数標的ヌクレオチド配列に対するミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを、少数標的ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの量より少量で、且つサンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効である量で、含む、請求項25に記載の方法。
- リガーゼ検出混合物が、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効な形態で、多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項25に記載の方法。
- 第1および第2オリゴヌクレオチドプローブが連結反応部において完全マッチで標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズされるとき、第2オリゴヌクレオチドプローブに、連結反応部で、その3’末端で連結するために好適な第1オリゴヌクレオチドプローブであって、該第1オリゴヌクレオチドプローブはヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログは、第1および第2オリゴヌクレオチドプローブが多数標的ヌクレオチド配列と第1オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でミスマッチを伴ってサンプルの多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときのライゲーション速度に比較して、第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブが少数標的ヌクレオチド配列と第1オリゴヌクレオチドプローブとの間において完全マッチでハイブリダイズするときのライゲーション速度を、異なるように変化させ、そして、第1オリゴヌクレオチドプローブを用いる連結が、同量の多数標的ヌクレオチド配列のみから生成される連結反応産物配列の量に対する、小数および多数標的ヌクレオチド配列から生成される連結反応産物配列の量である、シグナル対ノイズ比率を有し、それが、修飾のない第1オリゴヌクレオチドプローブを用いる連結のシグナル対ノイズ比率より大きく、該第1オリゴヌクレオチドプローブが20−28ヌクレオチド長である、第1オリゴヌクレオチドプローブ。
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