CN102533799A - 一种源于阴沟肠杆菌的泛醌辅酶q10合成酶基因及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种源于阴沟肠杆菌的泛醌辅酶Q10合成酶基因及其制备方法，其中所述泛醌辅酶Q10合成酶基因其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明从化工厂附件被污染的土壤中分离并提取阴沟肠肝菌总DNA，经检测得到的菌株与阴沟肠杆菌中的16s rRNA有99％的同源性，并经PCR扩增后得到的本发明的泛醌辅酶Q10合成酶基因及其表达载体可应用于培育产黑色素转基因植物中，本发明为培育出能产黑色素的转基因植物提供了重要的试验依据。

Description

一种源于阴沟肠杆菌的泛醌辅酶Q10合成酶基因及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种源于阴沟肠杆菌的泛醌辅酶Q10合成酶基因及其制备方法。

背景技术

黑色素是一种广泛存在于动植物和微生物中的非均质的色素。黑色素的形成是通过酪氨酸酶催化L-酪氨酸成多巴，再经过一系列聚合反应合成的。目前黑色素可以分为三类：1)真黑素(eumelanins)，含氮不含硫原子，主要是黑色和褐色的色素，是酪氨酸在酪氨酸酶的催化下被经化，接着在一系列的氧化和聚合反应中形成；2)棕黑素(phaeomelanins)，含氮和硫原子，常呈棕色、红色甚至黄色，和真黑素的合成途径类似，但有谷胱甘肽或半胱氨酸等的参与；3)异黑素(allomelanins)，不含氮，常呈棕色或黑色，主要存在于植物体内，通过多酚氧化酶将多酚氧化聚合而成。

在工农业上，黑色素可以作为吸收紫外线的化妆品成分、天然染发剂的成分、阳离子赘和剂、作为无定形的半导体以及生物杀虫剂的光保护剂；此外黑色素在医学上也具有很广的应用范围，具有清除自由基、阻止心磷脂脂质体的氧化、抗辐射及抗氧化、对病理学和分类学的研究具有重要意义、作为新型的天然药物载体、用来治疗某些与黑色素缺乏相关的神经性疾病、一些可溶性的黑色素在体外具有抑制爱滋病病毒感染宿主细胞的作用，因此有能成为一种有效的药物。

目前，黑色素的生产多是通过化学合成或从动、植物体进行提取，但是化学合成黑色素的反应过程多、程序复杂，且具有一定的毒害性；从动、植物体提取黑色素则存在样品来源难的问题。利用微生物生产黑色素具有反应条件温和、成本低、操作简单、无需大量的样品等优点。

发明内容

本发明公开了一种来源于阴沟肠杆菌的泛醌辅酶Q10合成酶基因及其制备方法，具体是从被污染的土壤中提取能产黑色素的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，并采用基因合成法克隆此细菌中的泛醌辅酶Q10合成酶基因，为培育出能产黑色素的转基因植物提供了重要的试验依据。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种源于阴沟肠杆菌的泛醌辅酶Q10合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列序列如SEQ ID NO 2所示。

所述的泛醌辅酶Q10合成酶基因的提取方法为：利用酪素培养基，从化工厂附近被污染的土壤中选择生长良好的阴沟肠杆菌菌株；再将选择出来的菌落置于LB液体培养基中培养12小时以上；之后提取总DNA，用0.02-0.5u/μL浓度限制性核酸内切酶Sau3A酶切提取所得的总DNA，时间20-60分钟。

所述的泛醌辅酶Q10合成酶基因的具体获取方法如下：

1)菌种分离

称取化工厂附近被污染的土壤样品1g，加入0.9％(wt/vol)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9％(wt/vol)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布于酪素固体培养基中培养24h。

2)总DNA提取及菌种鉴定

将分离获得的细菌单株在液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养过夜(16小时)，菌体培养液以6,000g重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。先将这些沉淀在-20℃下冷冻1hr，之后使用TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)清洗一次，然后悬浮于浓度为10mg/mL溶菌酶的无菌水中，37℃摇床培养1hr。

接着向培养液中加入0.5M EDTA，10％(w/v)SDS和浓度为5M的NaCl并轻轻振荡混匀后，再加入浓度为20mg/mL蛋白激酶K，37℃培养1hr。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)提取DNA；水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)萃取，振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇，振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA于4℃保存。

以P16SR(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和P16SF(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTTC-3’)为扩增引物，以菌株的DNA为模板进行16S rDNA的PCR扩增。随后对PCR产物进行凝胶回收，克隆和测序。

3)泛醌辅酶Q10合成酶基因获取和序列分析

提取所得的菌株总DNA用限制性核酸内切酶Sau34 I酶切，时间20-60分钟，然后0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为2-4kb的DNA片段，用胶试剂盒回收备用。选择pACYC184(NEB公司)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI酶切并进行胶回收。

先对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后(Sambrook，分子克隆手册，1989)，再与外源的DNA片段(即长度为2-4kb的阴沟肠肝菌DNA片段)连接。反应温度16℃，连接时间为10-12h。

连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5S。复苏后，将菌液涂布于LB固体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16h，而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行质粒提取。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

以p93z：5’-GGATCCATGACAACAACACGCTCCCATCA-3’和p93f：

5’-GAGCTCTTATTCCGCTTTTTGCGCTTCAG-3’为引物，上文制备好的含有目的基因的质粒为模板进行泛醌辅酶Q10合成酶基因的PCR扩增。将回收片段用BamHI和SacI双酶解，与pG251表达载体连接，将连接产物转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)中，涂布酪素培养基平板上培养48h，确定阅读框表达质粒的正确性。

4)泛醌辅酶Q10合成酶基因的合成和筛选

采用基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)将上述阴沟肠杆菌泛醌辅酶Q10合成酶基因克隆。具体是利用PCR进行泛醌辅酶Q10合成酶基因扩增，在Taq DNA聚合酶存在的反应体系中，使用17个扩增引物和2个外侧引物完成。扩增条件为：94℃预热1min；94℃30秒，50℃30秒，72℃延长10min，共25个循环。PCR结束后，0.8％(w/v)琼脂糖胶回收。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明从化工厂附近被污染的土壤中分离并提取阴沟肠肝菌总DNA，经检测得到的菌株与阴沟肠杆菌中的16s rRNA有99％的同源性，并经PCR扩增后得到的本发明的泛醌辅酶Q10合成酶基因及其表达载体可应用于培育产黑色素转基因植物中。

本发明所述的术语与其一般概念相同。

所述的“核苷酸”和“引物”序列均为5’端至3’端。

所述的“生物细胞”指微生物、植物细胞或组织。

所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要为细菌；真核微生物为真菌或藻类，真菌主要指酵母菌。

附图说明

图1为黑色素产生菌阴沟肠杆菌在酪素培养基上的筛选培养。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

rtaq酶、T/A载体、限制性核酸内切酶Sau3A和BamHI购于宝生物工程(大连)有限公司，KOD taq酶购于日本Toyobo公司。

本发明所用的试剂和材料若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。

实施例1菌种分离

称取化工厂附近被污染的土壤样品1g，加入0.9％(wt/vol)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9％(wt/vol)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布于酪素固体培养基(葡萄糖1g，蛋白陈10g，NaCl 5g，CaCl₂ 0.1g，L-酪氨酸1g，琼脂粉40g，定容至1L，pH7.0)中培养24h。将长出来的单菌落接种于加入1.6ml LB液体培养基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)的试管中，28℃培养48h，然后吸取150μl的培养液再次涂布酪素固体培养基中培养24h，黑色素产生菌阴沟肠杆菌在酪素培养基上的筛选培养参见图1，最后将生长良好的菌落选出来进行进一步研究。

实施例2总DNA的提取及菌种鉴定

将实施例1中分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养16小时，菌体培养液以6,000g重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。首先将菌体沉淀在-20℃下冷冻1hr，然后使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)清洗一次，再加入20μl溶菌酶(Sigma-Aldrich)浓度为10mg/mL的无菌水悬浮，在37℃下摇床培养1hr。

接着加入50μl浓度为0.5M EDTA，50μl浓度为10％(w/v)SDS和50μl浓度为5M的NaCl并轻轻振荡混匀后，再加入10μl浓度为20mg/mL蛋白激酶K(Takara日本)，反应物在37℃下培养1hr。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)萃取。振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇。振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮，所得总DNA于4℃保存。

以抽提的总DNA为模板，利用阴沟肠杆菌的16s rRNA特异性引物进行PCR扩增。扩增的引物如下：

P16SR：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

P16SF：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTTC-3’

以KOD Plus(Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，其中，扩增体系为：5.0μL10PCRbuffer，4μL dNTPS(2.5mmol/L)，1μL模板(20ng-50ng)，引物各1μL，0.2μL Taq酶，加无菌水定容至50μL。扩增条件依次为：94℃30秒，55℃30秒，72℃120秒，扩增30个循环。循环结束后，加入2个单位的rtaq酶，72℃延伸300秒，扩增片段长1500bp。PCR结束后，利用1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10μL回收产物直接与T/A载体相连，4℃连接过夜，得到DNA连接产物。

先将DNA连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自Takara公司)中，再用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与阴沟肠杆菌中的16s rRNA有99％的同源性，从而证实分离菌株为阴沟肠杆菌。

实施例3阴沟肠肝菌泛醌辅酶Q10合成酶基因片断分离和序列分析

阴沟肠杆菌DNA用Sau3A I酶切，时间20-60分钟。然后经0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳后，切下长度为2-4kb的DNA片段，用凝胶试剂盒(上海生物工程公司)回收。质粒载体pACYC184(NEB公司)用BamH I完全酶切后SAP碱性磷酸酯酶进行末端去磷酸化，以减少载体自连。上述回收后的菌株DNA(200ng)和末端去磷酸化的质粒载体pACYC184(150ng)用2U的T4ligase在4℃下连接16h。

将得到的连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤，最后用10μL的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5S。复苏后，将菌液涂布于LB固体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16h，而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行质粒提取。

将大量提取的质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲为2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5.S。复苏后，将菌液涂布酪素培养基平板上培养48h，而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行质粒提取。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

以p93z：5’-GGATCCATGACAACAACACGCTCCCATCA-3’和p93f：

5’-GAGCTCTTATTCCGCTTTTTGCGCTTCAG-3’为扩增引物，以上文制备好的含有目的基因的质粒DNA为模板，对泛醌辅酶Q10合成酶基因的阅读框进行PCR扩增。扩增体系为：5.0μL 10PCRbuffer，4μL dNTPS(2.5mmol/L)，1μL模板，引物各1μL，0.2μL KODFX taq酶，加无菌水定容至50μL。扩增条件依次为：94℃30秒，68℃30秒，72℃2分钟，30个循环。然后加入2单位rtaq酶，在72℃延伸30分钟。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为774bp的片段，即本发明的泛醌辅酶Q10合成酶基因，其序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸258个，其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。

选择pG251(CN1338515NCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamH I(大连宝生物工程公司)酶切并进行胶回收。对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后【Sambrook分子克隆手册1989】，再与外源的DNA片段(即长度为774bp的泛醌辅酶Q10合成酶基因)连接。连接前用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16℃，连接时间为10-12h。再将该载体转化入DH5α感受态细胞中。利用ABI PrismBig Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，确定774bp阅读框(泛醌辅酶Q10合成酶基因)表达质粒的正确性。

实施例4阴沟肠杆菌泛醌辅酶Q10合成酶基因的合成

通过基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)克隆得到本发明的阴沟肠杆菌泛醌辅酶Q10合成酶基因，所用的引物如下：

1.AraII-1：

ATGACAACAACACGCTCCCATCATGACAACGTAGAAAAACAGTTTGGTTCTCAGGCAAGT

2.AraII-2：

GATCGCGGCCAGAAGCATGCACGGCACTGCTCAGATAGGCACTTGCCTGAGAACCAAACT

3.AraII-3：

GCATGCTTCTGGCCGCGATCTGGTGCGTCTCGGTGAACGTCTGGCGGCGTTCCCGCAGGC

4.AraII-4：

GCTGGCATGCCCTGCCCCGCAGCCTAAATCCAGCACGTGCGCCTGCGGGAACGCCGCCAG

5.AraII-5：

GCGGGGCAGGGCATGCCAGCTTTACGGCTGCGCAGCGGGTCGCGCACGTTACCGCGTATG

6.AraII-6：

GCCGCCCCAGCAACGACGTCCAGCATCTGGCTGGATAAGTCATACGCGGTAACGTGCGCG

7.AraII-7：

GACGTCGTTGCTGGGGCGGCAAAAGCGAAAGGGCTGAACAACATCGATACGCGCCAGGGC

8.AraII-8：

CCTCAAACGATGCATCATCGAACGGTAAGGATTCGGCATAGCCCTGGCGCGTATCGATGT

9.AraII-9：

CGATGATGCATCGTTTGAGGTGGTGATCAGCCGTTATTCCGCGCACCACTGGCACGATGT

10.AraII-10：

CGGCTTCAGAACACGTTTGACCTCGCGCAATGCCTGGCCGACATCGTGCCAGTGGTGCGC

11.AraII-11：

TCAAACGTGTTCTGAAGCCGGGCGGCACCTTCATCATTATGGATGTGATGTCTCCCGGAC

12.AraII-12：

AGCGCTTCTACCGTCTGCAGCCAGATATTGCGCACCGGGTGTCCGGGAGACATCACATCC

13.AraII-13：

CTGCAGACGGTAGAAGCGCTGCGCGATACCTCGCACGTGCAAAATTACGCCAGCGGAGAG

14.AraII-14：

CGCGCGCGATCAGCCCCGCTTCAGTGATAAGCGACAACCACTCTCCGCTGGCGTAATTTT

15.AraII-15：

AGCGGGGCTGATCGCGCGCGCGTTGATTACCGATCGTTTACCGCTGGAGTTCAGCTCCTG

16.AraII-16：

CGCCTGGCTCAATGCTTCCGGGGTGCGCATACGCGCGATCCAGGAGCTGAACTCCAGCGG

17.AraII-17：

CGGAAGCATTGAGCCAGGCGATCAGACTGTATCAGGAGAGTGCGTCCGCGGAGGTAAAGG

18.AraII-18：

TCGCTGGTAAACGAGCCATCGTCCTGCAGTTCAAAGTACGCCTTTACCTCCGCGGACGCA

19.AraII-19：

TTATTCCGCTTTTTGCGCTTCAGCCATGATGGTATCGCTGGTAAACGAGCCATC

利用PCR进行泛醌辅酶Q10合成酶基因扩增，反应体系为：Probest buffer 10μL，dNTPs 8μL，AraII-2-AraII-18共17个内侧引物各2μL，AraII-1和AraII-19外侧引物各2μL，Probest酶0.4μL，加无菌水定容至100μL，以KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)为Taq DNA聚合酶。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃10min，共25个循环。

PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖胶回收，取10μl回收产物直接与T/A克隆载体相连，4℃连接过夜。高效转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得阳性克隆，其序列如SEQ IDNo 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，该阳性克隆即为本发明的阴沟肠杆菌泛醌辅酶Q10合成酶基因。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (5)

1.一种源于阴沟肠杆菌的泛醌辅酶Q10合成酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.根据权利要求1所述的泛醌辅酶Q10合成酶基因，其特征在于，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

3.权利要求1或2所述的泛醌辅酶Q10合成酶基因的制备方法，包括如下步骤：

1)菌种分离：利用酪素培养基，从被污染的土壤中选择生长良好的阴沟肠杆菌菌株，再将选择出来的菌落置于LB液体培养基中培养12小时以上；

2)总DNA提取和菌种鉴定；

3)泛醌辅酶Q10合成酶基因获取和序列分析；

4)采用基因合成方法克隆泛醌辅酶Q10合成酶基因：在Taq DNA聚合酶存在的反应体系中，利用19个引物完成。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述引物具体如下：

AraII-1：

ATGACAACAACACGCTCCCATCATGACAACGTAGAAAAACAGTTTGGTTCTCAGGCAAGT

AraII-2：

GATCGCGGCCAGAAGCATGCACGGCACTGCTCAGATAGGCACTTGCCTGAGAACCAAACT

AraII-3：

GCATGCTTCTGGCCGCGATCTGGTGCGTCTCGGTGAACGTCTGGCGGCGTTCCCGCAGGC

AraII-4：

GCTGGCATGCCCTGCCCCGCAGCCTAAATCCAGCACGTGCGCCTGCGGGAACGCCGCCAG

AraII-5：

GCGGGGCAGGGCATGCCAGCTTTACGGCTGCGCAGCGGGTCGCGCACGTTACCGCGTATG

AraII-6：

GCCGCCCCAGCAACGACGTCCAGCATCTGGCTGGATAAGTCATACGCGGTAACGTGCGCG

AraII-7：

GACGTCGTTGCTGGGGCGGCAAAAGCGAAAGGGCTGAACAACATCGATACGCGCCAGGGC

AraII-8：

CCTCAAACGATGCATCATCGAACGGTAAGGATTCGGCATAGCCCTGGCGCGTATCGATGT

AraII-9：

CGATGATGCATCGTTTGAGGTGGTGATCAGCCGTTATTCCGCGCACCACTGGCACGATGT

AraII-10：

CGGCTTCAGAACACGTTTGACCTCGCGCAATGCCTGGCCGACATCGTGCCAGTGGTGCGC

AraII-11：

TCAAACGTGTTCTGAAGCCGGGCGGCACCTTCATCATTATGGATGTGATGTCTCCCGGAC

AraII-12：

AGCGCTTCTACCGTCTGCAGCCAGATATTGCGCACCGGGTGTCCGGGAGACATCACATCC

AraII-13：

CTGCAGACGGTAGAAGCGCTGCGCGATACCTCGCACGTGCAAAATTACGCCAGCGGAGAG

AraII-14：

CGCGCGCGATCAGCCCCGCTTCAGTGATAAGCGACAACCACTCTCCGCTGGCGTAATTTT

AraII-15：

AGCGGGGCTGATCGCGCGCGCGTTGATTACCGATCGTTTACCGCTGGAGTTCAGCTCCTG

AraII-16：

CGCCTGGCTCAATGCTTCCGGGGTGCGCATACGCGCGATCCAGGAGCTGAACTCCAGCGG

AraII-17：

CGGAAGCATTGAGCCAGGCGATCAGACTGTATCAGGAGAGTGCGTCCGCGGAGGTAAAGG

AraII-18：

TCGCTGGTAAACGAGCCATCGTCCTGCAGTTCAAAGTACGCCTTTACCTCCGCGGACGCA

AraII-19：

TTATTCCGCTTTTTGCGCTTCAGCCATGATGGTATCGCTGGTAAACGAGCCATC。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶。

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