DE112015004899B4 - Spot-array-substrat, verfahren zum herstellen eines solchen und nukleinsäurepolymer-analyseverfahren und -vorrichtung - Google Patents

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Abstract

Spot-Array-Substrat umfassend:ein Harzsubstrat (204) mit einer Oberfläche, auf der ein unregelmäßiges Muster ausgebildet ist, das eine Vielzahl von konkaven Teilen aufweist, und eine Vielzahl von in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen; undauf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats (204) geladene oberflächenmodifizierte Kügelchen,wobei ein loses Material der oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) einen kleineren Wärmedehnungskoeffizienten aufweist als das Material des Harzsubstrats (204),wobei ein Wärmeausdehnungskoeffizient eines Materials von des Harzsubstrat in einem Bereich von 10-5bis 10-4/°C liegt,wobei die mehreren Kügelchen-LagepositionenSchnittpunkte der Vielzahl von konkaven Teilen, die in dem Harzsubstrat vorgesehen sind, sind,wobei eine Epoxygruppe als Film nur an Innenflächen der jeweiligen Vielzahl von konkaven Teilen des Harzsubstrats angeordnet ist,wobei die jeweiligen oberflächenmodifizierten Kügelchen, die in die Kügelchen-Lagepositionen geladen sind, physisch durch innere Oberflächen der konkaven Teile der Kügelchen-Lagepositionen geklemmt werden, die physisch zusammengezogen sind, undwobei die oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) funktionsgruppen-oberflächenmodifizierte Kügelchen sind oderwobei die oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) oligo-DNA-oberflächenmodifizierte Kügelchen sind.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Analyse eines Biomoleküls, insbesondere ein Spot-Array-Substrat zum Decodieren der Basensequenz eines Nukleinsäurepolymers mit hoher Effizienz und hoher Genauigkeit, ein Verfahren zum Herstellen eines solchen und ein Nukleinsäurepolymer-Analysesystem unter Verwendung des Spot-Array-Substrats.
  • Bisheriger Stand der Technik
  • Die Patentschrift 1 beschreibt ein Verfahren zum Verwenden eines DNA-Chips zum Ermitteln des Ausdrucks von herkömmlich bekannten Genen und beschreibt, dass ein transparentes Harz (Polycarbonat, Polypropylen und cycloolefin-basiertes Polymer) mit geringer Eigenfluoreszenz zum Ermitteln von Fluoreszenzlicht zum Anzeigen des Vorhandenseins eines Gens verwendet wird. Die Patentschrift 1 beschreibt, dass eine Vielzahl von konkaven Teilen auf der Substratoberfläche als Array-Spot ausgebildet (angeordnet) ist, dass die Unterfläche des Substrats vorzugsweise flach ist und dass das Ermitteln der Ziel-DNA durch Immobilisieren einer Oligo-DNA auf der Innenfläche des konkaven Teils, Immobilisieren einer Sonden-DNA nach dem Stand der Technik vorab auf der Unterfläche eines konkaven Teils und Hinzufügen einer mit der Probe, die Gegenstand der Analyse ist, gefüllten Lösung durchgeführt werden kann.
  • Die Patentschrift 2 beschreibt ein Verfahren zum Verwenden eines Mikroarrays zum Ermitteln des Ausdrucks von herkömmlich bekannten Genen und beschreibt, dass ein transparentes Harz (cycloolefin-basiertes Polymer) mit geringer Eigenfluoreszenz zum Ermitteln von Fluoreszenz zum Anzeigen des Vorhandenseins eines Gens verwendet wird. Die Patentschrift 2 beschreibt das Verfahren zum Immobilisieren einer Oligo-DNA auf einem Substrat als ein Verfahren nach dem Stand der Technik im Gebiet und beschreibt, dass das Vorhandensein oder Fehlen eines Ausdrucks durch Hybridisieren mit der Ziel-DNA auf einem Substrat ermittelt werden, auf der vorab eine Sonden-DNA nach dem Stand der Technik auf einem Array-Spot immobilisiert wird.
  • Die Patentschrift 3 beschreibt ein Verfahren zum Verwenden eines Mikroarrays zum Ermitteln des Ausdrucks von Genen nach dem Stand der Technik und beschreibt, dass eine Funktionsgruppe zum Immobilisieren einer Oligo-DNA auf einem Substrat verwendet werden kann und dass ein Polymer mit chemische und thermischer Stabilität, geringer Fluoreszenz und optischer Stabilität, vorzugsweise ein Cycloolefin-Polymer und vorzugsweise Zeonex(R) oder Zeonor(R) im Substrat verwendet wird.
  • Die Patentschrift 4 beschreibt ein Verfahren zum Verwenden eines Mikroarrays zum Ermitteln des Ausdrucks eines Gens nach dem Stand der Technik und beschreibt die Hybridisierung mit der Ziel-DNA auf einem Substrat, auf der vorab eine Sonden-DNA nach dem Stand der Technik auf dem Array-Spot immobilisiert wird, und zum Verwenden eines Substrats umfassend ein Multi-Well-Cycloolefin-Polymer (das heißt den konkaven Teil des Arrays) beim Durchführen der Fluoreszenzermittlung mit dem Substrat.
  • Die Patentschrift 5 beschreibt ein Verfahren zum Verwenden eines Si-Substrats, das ein hoch integriertes Array des konkaven Teils mit einer Elektrode auf der Unterfläche durch einen Halbleiterprozess zum Analysieren eines Nukleinsäurepolymers bildet. Die Patentschrift 5 beschreibt, dass die Basensequenz durch Laden der Kügelchen, die das Replikat der vorab vom Gegenstand der Analyse auf der Oberfläche im konkaven Teil abgeleiteten Vorlage-DNAs, der als ein Array auf der Substratoberfläche ausgebildet ist, bilden, und Ermitteln der vom Replikat dieser Vorlage-DNAs aufgrund der Reaktion mit einem Reagens mit einer auf der Unterfläche des konkaven Teils angeordneten Elektrode ausgegebenen Ionen decodiert werden kann.
  • Liste der Anführungen
  • Die Patentschrift 6 offenbart eine Reaktionsvorrichtung zur Nukleinsäureanalyse, bei der Mikropartikel, die eine darauf immobilisierte nachzuweisende Nukleinsäure tragen, gitterförmig auf einem Substrat entsprechend der Pixelgröße eines zweidimensionalen Sensors ausgerichtet sind.
  • Die Patentschrift 7 beschreibt Verfahren zum Bestimmen einer Nukleinsäuresequenz durch Durchführen aufeinanderfolgender Zyklen der Duplexverlängerung entlang einer einzelsträngigen Matrize.
  • Patentliteratur
    • Patentschrift 1: JP 2009-60859 A
    • Patentschrift 2: JP 2009-513137 A ( US 2007/0099222 A1 )
    • Patentschrift 3: JP 2009-537126 A
    • Patentschrift 4: JP 2004-500867 ( US 2003/0003496 A1 )
    • Patentschrift 5: JP 2010-513869 A
    • Patentschrift 6: US 2012 / 0 316 087 A1
    • Patentschrift 7: WO 2006/ 084 132 A2
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Technische Aufgabe
  • Verschiedene Verfahren wie ein Verfahren zum optischen Messen und Unterscheiden von Basen und ein Verfahren zum elektrischen Messen und Unterscheiden von Basen wurden als Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäurepolymeren wie DNA und RNA untersucht. Als ein Verfahren decodiert ein Fluoreszenzsystem-DNA-Sequenzer die Basen durch Analysieren der beim Reagieren eines Reagens umfassend einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Enzym mit einer DNA erzeugten Fluoreszenz. Es wird davon ausgegangen, dass das Untersuchen und Verstehen der Ursachenbeziehung zwischen Nukleotidinformation und Pathologie, die durch solche Nukleinsäurepolymer-Analyseverfahren ermittelt wird, die Anwendungen in der medizinischen Diagnose erweitern. Momentan werden aber die Verfahren meist in Forschungsanwendungen eingesetzt und die Kosten für eine Analyse sind ebenfalls hoch. Es ist ferner wünschenswert, die Analysekosten erheblich zu senken, damit sich das Verfahren als eine medizinische Diagnosetechnologie in der nahen Zukunft in einem großen Umfang ausbreiten kann. Dabei werden Verbesserungen zum Erzielen einer großen Menge von Daten aus einer kleinen Zahl von Proben in einem hohen Durchsatz und Verbesserungen zum Senken (Kostensenkung einschließlich Verbrauchsmittel für Analyse, Reagentien usw.) der erforderlichen Analysekosten zum Erzielen der gleichen Menge von Daten kontinuierlich angestrebt.
  • Die Datenerfassungseffizienz muss verbessert werden, um die Verringerung der Menge der Proben, die Miniaturisierung der Analysezelle und des Volumens der erfassten Daten zu steigern. Nach dem Stand der Technik misst ein Fluoreszenzsystem-DNA-Sequenzer die von der Reaktion in einem Zustand, in dem der Gegenstand der Analyse nach dem Zufallsprinzip auf einer Ebene verstreut ist, erzeugte Fluoreszenz und die praktische Anwendung hat in der Form begonnen, dass die Basen von der Datenanalyse eines hellen Fluoreszenzflecks von Zufallspositionen unterschieden werden. Da aber die Analyse nach dem Zufallsprinzip erfolgt, bestand ein Bereich, in dem der Gegenstand der Analyse gegebenenfalls nicht vorhanden war, und ein Bereich, in dem die Analyse aufgrund des Überlappens und Mischens der Fluoreszenz von einem angrenzenden Gegenstand der Analyse nicht möglich war, und die Nutzungseffizienz im Bereich auf dem Substrat einer Durchlaufzelle, in der das Reaktionsereignis stattfindet, war gering. Somit wurde die Probe, die der Gegenstand der Analyse war, die nicht zur Analyse beitrug, erzeugt und die Fläche der Durchlaufzelle zur Analyse musste vergrößert werden, um eine Trennung von den Ereignissen eines benachbarten Bereichs zu bewirken und damit eine ausreichende Menge von Daten zu erzielen.
  • Ein integriertes Array wurde als ein vielversprechendes Verfahren zum Lösen dieses Problems betrachtet. Es handelt sich um ein allgemeines Konzept zur hocheffizienten Durchführung der Aufgabe im kleinstmöglichen Bereich. Wechselwirkungen mit einem angrenzenden Fluoreszenzereignis können beseitigt werden und das pro Einheit Substratfläche erfasste Volumen von Daten kann durch Erhalten des Flecks, in dem der Gegenstand der Analyse auf dem auf dem Substrat der Durchlaufzelle in einer Teilung, die ein spezifisches Intervall oder mehr von einem angrenzenden Fleck ist, und diskontinuierliches und so nahes Anordnen wie möglich maximiert werden.
  • Um ein hochintegriertes Spot-Array auf dem Substrat der Durchlaufzelle zu bilden, muss eine Feinmusterbildungstechnologie verwendet werden, etwa ein Halbleiterprozess wie Lithographie und Trockenätz-Mikrobearbeitung oder Zeichnen und Bearbeiten durch einen Strahl in der Herstellung des Substrats. Wenn der Halbleiterprozess verwendet wird, der verschiedene Muster auf einem Si-Wafer bilden kann, kann selbstverständlich eine Massenproduktion des Substrats erfolgen, auf dem ein hochintegriertes Spot-Array ausgebildet ist; allerdings ist ein erheblicher Anstieg der Kosten zum Herstellen des Substrats unvermeidbar im Vergleich zu flachen Substraten, die bei der herkömmlichen Analyse der Zufallsfluoreszenz verwendet wurden. Somit ist ein Herstellungsverfahren wünschenswert, das die Substratmaterialkosten und die Kosten zum Herstellen des Spot-Arrays wesentlich senkt.
  • Dieses Verfahren unterscheidet sich von einem DNA-Sequenzer zum Decodieren einer unbekannten Basensequenz; es kann aber ein DNA-Chip (Mikroarray) als Verfahren zum Ermitteln des Vorhandenseins oder Fehlens einer Basensequenz nach dem Stand der Technik bereitgestellt werden. Dies ist aber auf die Anwendung zum Ermitteln des Vorhandenseins oder Fehlens der gleichen Ausrichtung wie eine Sonden-DNA nach dem Stand der Technik beschränkt; somit unterscheidet sich die Zahl von auf dem Chip angeordneten Array-Spots von der Situation, in der die DNA-Sequenz, für die Durchsatz gesucht wird, durch die Erfordernis von lediglich der Anzahl von Gegenständen der Analyse und das Erfassen so vieler Daten wie möglich durch paralleles Erhöhen des Integrationsgrads des Arrays so viel wie möglich. Daher ist momentan der Integrationsgrad von DNA-Chips nicht so hoch und viele werden mit einem Array-Spot mit großen Maßen von bis zu einer Ebene von mehreren 100 bis mehreren 10 µm gemessen. Der Spot-Bereich ist in einem Array zum Untersuchen der Ziel-DNA, die der Gegenstand der Analyse ist, angeordnet und die entsprechenden Spot-Bereiche werden einer Funktionsgruppenmodifizierung, der Immobilisierung der Oligo-DNA, der Immobilisierung der Sonden-DNA usw. unterzogen. Da aber die Maße groß sind, kann der Spot-Bereich ohne Mustern auf der Mikronisierungsebene (Ebene von mehreren µm bis mehreren 100 nm) erzeugt werden, was einen kostspieligen Halbleiterprozess erfordert. Wenn die Eigenfluoreszenz des Substratmaterials, welche die Fluoreszenmessung beeinflusst, ausreichend niedrig ist, bestehen wenige weitere Einschränkungen bezüglich eines Änderns des Substratmaterials. Daher wurden Kostensenkungen etwa durch die Anwendung eines Harzsubstrats für DNA-Chips erzielt. Die Patentschriften 1 bis 4 offenbaren die Bildung von DNA-Chips, die ein Harzsubstrat mit niedriger Eigenfluoreszenz im DNA-Chip verwenden, um Funktionsgruppen und einen Spot wie Oligo-DNA in einer Array-Form auf der Oberfläche zu bilden.
  • In einem DNA-Sequenzer ist es aber in Zukunft erforderlich, kontinuierlich unbekannte Sequenzdaten in großen Mengen und mit einem hohen Durchsatz zu erfassen; somit ist eine noch höhere Integration erforderlich. Daher muss ein Spot-Array auf einer Maßebene von mehreren Mikrometern bis mehreren µm oder mehreren 100 nm zu bilden, die wenigstens eine Größenordnung höher ist als der Chip. Momentan weist die hohe Integration (Teilung) des Spot-Arrays eine Grenze aufgrund von Einschränkungen wie die Teilung der Pixel des Fotodetektor-Arrays, der die Fluoreszenz vom Array-Spot ermittelt, auf und somit bleibt die Integration im aktuellen Bereich der Mikronisierung; es müssen aber unbekannte Sequenzdaten in großen Mengen sowie mit einem hohen Durchsatz erfasst werden und somit ist eine noch höhere Integration in der Zukunft erforderlich. Beim Verwenden eines Halbleiterprozesses zum Bilden eines hochintegrierten Array-Spots auf einer Maßebene von mehreren µm bis mehreren 100 nm sind aber hohe Kosten mit dem Herstellungsprozess verbunden, so dass beispielsweise die Senkung der Gesamtkosten der Herstellung nicht ausreichend ist, selbst wenn ein Harzsubstrat verwendet wird, um die Materialkosten niedrig zu halten. Selbst wenn das Harzsubstratmaterial selbst gleich- oder höherwertig mit einem Material wie Quarz und Si bezüglich Schicht und optischer Leistung (niedrige Eigenfluoreszenz usw.) ist, wird in einem DNA-Sequenzer, der die Datenerfassungseffizienz durch weitere Mikronisierung und höhere Integration verbessern muss, wenn Herstellungskosten bei der Bildung eines hochintegrierten Arrays gesenkt werden müssen, beispielsweise die Wirkung der Senkung der Endanalysekosten verringert, selbst wenn sich die Datenerfassungseffizienz aufgrund der höheren Integration verbessert.
  • Die Anwendung eines hochintegrierten Arrays hat sich aber nicht nur in der Analyse von Nukleinsäurepolymeren durch optische Messung verbreitet, sondern auch in der Analyse durch elektrische Messung. Die Patentschrift 5 offenbart die Bildung eines Si-Substrats, auf dem ein hochintegriertes Array durch den Halbleiterprozess im konkaven Teil mit einer Elektrode auf der Unterseite gebildet wird, und ein Verfahren zum Laden der Kügelchen, die das Replikat der vorab vom Gegenstand der Analyse auf der Oberfläche in jedem konkaven Teil der Si-Substratoberfläche abgeleiteten Vorlage-DNA gebildet haben, und elektrischen Messen sowie Decodieren der Basensequenz. Bei diesem Verfahren müssen aber eine feine Elektrode zum Erfassen der Signale im konkaven Teil, Leitungen zum Anschluss an diesen und Schalter im zu verwendenden Substrat angeordnet werden und somit ist das Substrat komplexer als das bei optischen Messungen verwendete. Daher ist die Herstellung unter Verwendung des Harzsubstrats mit niedrigen Materialkosten nicht einfach und alle Substrate müssen in einem kostspieligen Halbleiterprozess hergestellt werden.
  • Wie zuvor erwähnt besteht bei einem DNA-Sequenzer, der eine weitere Mikronisierung und höhere Integration erfordert, selbst bei einem kostengünstigen Substratmaterial oder selbst bei optischer Messung oder elektrischer Messung, solange ein Halbleiterprozess wie Lithographie oder Trockenätz-Mikrobearbeitung zum Hersteller aller hochintegrierter Array-Substrate verwendet wird, eine Beschränkung der Senkung der Herstellungskosten. Es besteht ein Bedarf eines großtechnischen Herstellungsverfahrens ohne Verwenden des Halbleiterprozesses bei der Herstellung aller Substrate.
  • Technische Lösung
  • Das Spot-Array-Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein Harzsubstrat mit einer Oberfläche, auf der ein unregelmäßiges Muster ausgebildet ist, einer Vielzahl von in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen und auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats geladene oberflächenmodifizierte Kügelchen.
  • In einem Beispiel ist das unregelmäßige Muster ein Muster, bei dem angrenzende Kügelchen-Lagepositionen miteinander durch eine Nut mit einer Breite kleiner als das Maß der Kügelchen-Lagepositionen verbunden sind.
  • Die oberflächenmodifizierten Kügelchen sind auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats durch physikalisches Einpassen oder eine chemische Bindung oder beides immobilisiert.
  • Die oberflächenmodifizierten Kügelchen können die funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen oder die oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen sein. Ferner können die oberflächenmodifizierten Kügelchen die Kügelchen sein, die vorab das Replikat der vom Gegenstand der Analyse auf den oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen abgeleiteten Vorlage-DNA bilden.
  • Die Oberflächendichte der Kügelchen-Lagepositionen beträgt zum Beispiel vorzugsweise 6,6×106/cm2 bis 180×106/cm2.
  • Das Verfahren zum Herstellen des Spot-Array-Substrats gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst einen Schritt zum Vorbereiten eines Harzsubstrats mit einer Oberfläche, auf der ein unregelmäßiges Muster ausgebildet ist, einer Vielzahl von in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen und einen Schritt zum Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats.
  • Eine Zentrifugalkraft oder eine magnetische Kraft kann im Schritt zum Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats verwendet werden.
  • Ein Spot-Array-Substrat-Herstellungspaket gemäß der vorliegenden Erfindung weist das Harzsubstrat mit einer Oberfläche, auf der ein unregelmäßiges Muster ausgebildet ist, einer Vielzahl von in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen und auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats geladenen oberflächenmodifizierten Kügelchen auf. Das Spot-Array-Substrat kann durch Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen wie die funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen oder die oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats vorbereitet werden. Ferner kann, wenn beispielsweise die Kügelchen, die das Replikat der vorab vom Gegenstand der Analyse abgeleiteten Vorlage-DNA auf den der Oberflächenmodifizierung unterzogenen Kügelchen wie die Oligo-DNA bilden, als die oberflächenmodifizierten Kügelchen verwendet werden, der Anwender der Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung das Spot-Array-Substrat durch Laden dieser Kügelchen auf die Kügelchen-Lagepositionen nach Bilden des Replikats der Vorlage-DNA auf der Oberfläche der im Paket enthaltenen oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen durch ein Verfahren wie die Emulsions-PCR vorbereiten.
  • Die Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist mit einer Durchlaufzelle, in der das zuvor genannte Spot-Array-Substrat integriert ist, einer Reagensversorgungseinheit zum selektiven Versorgen der Durchlaufzelle mit einer Vielzahl von Reagenzien umfassend ein Reaktionsreagens umfassend Fluoreszenzfarbstoffe, welche die Basen eines DNA-Moleküls unterscheiden können, ein Reaktionsreagens, das einen Farbstoff von dNTP abschneiden kann, und ein Waschreagens zum Waschen in der Durchlaufzelle, einer Temperatursteuereinheit zum Steuern der Temperatur der Durchlaufzelle, einer Lichtquelle zum Ausstrahlen des Erregerlichts auf das Spot-Array-Substrat, einem Fotodetektor-Array zum Messen der von jeder Kügelchen-Lageposition des Spot-Array-Substrats erzeugten Fluoreszenz und einer Analysevorrichtung zum Analysieren eines Ermittlungssignals vom Fotodetektor-Array ausgestattet.
  • Das Nukleinsäurepolymer-Analyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst in einem Beispiel einen ersten Schritt zum Immobilisieren der vorbereiteten Vorlage-DNA durch Replizieren der vorab auf einer Oberfläche von einer Probe, die Gegenstand der Analyse ist, abgeleiteten Vorlage-DNA auf den funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen des Spot-Array-Substrats, einen zweiten Schritt, in dem das Reagens umfassend den Fluoreszenzfarbstoff eine Dehnungsreaktion von einer Base der Vorlage-DNA auf den auf den funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen immobilisierten Vorlage-DNA-Kügelchen durchführt, einen dritten Schritt zum Messen der von den Kügelchen-Lagepositionen des Spot-Array-Substrats durch Ausstrahlen von Erregerlicht nach der Reaktion erzeugten optischen Signale, einen vierten Schritt zum Spalten des Fluoreszenzfarbstoffs von den Basen, in denen die optischen Signale gemessen werden, einen fünften Schritt zum Waschen der Lösung umfassend den gespaltenen Fluoreszenzfarbstoff und einen sechsten Schritt zum Analysieren der durch den dritten Schritt erhaltenen optischen Signale zum Ermitteln der Basensequenz der Vorlage-DNA.
  • Das Nukleinsäurepolymer-Analyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst in einem Beispiel einen ersten Schritt zum Laden von durch Replizieren vorab auf einer Oberfläche der von einer Probe, die Gegenstand der Analyse ist, abgeleiteten Vorlage-DNA vorbereiteten Vorlage-DNA-Kügelchen in den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats mit der beschriebenen Oberfläche, auf der ein unregelmäßiges Muster ausgebildet ist, und einer Vielzahl von in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen, einen zweiten Schritt, in dem das Reagens umfassend den Fluoreszenzfarbstoff eine Dehnungsreaktion von einer Base der Vorlage-DNA auf den auf den Kügelchen-Lagepositionen geladenen Vorlage-DNA-Kügelchen durchführt, einen dritten Schritt zum Messen der von den Kügelchen-Lagepositionen des Spot-Array-Substratsdurch Ausstrahlen des Erregerlichts nach der Reaktion erzeugten optischen Signale, einen vierten Schritt zum Spalten des Fluoreszenzfarbstoffs von den Basen, in denen die optischen Signale gemessen werden, einen fünften Schritt zum Waschen der Lösung umfassend den gespaltenen Fluoreszenzfarbstoff und einen sechsten Schritt zum Analysieren der im dritten Schritt erhaltenen optischen Signale zum Ermitteln der Basensequenz der Vorlage-DNA.
  • Das Nukleinsäurepolymer-Analyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst in einem Beispiel einen ersten Schritt zum Immobilisieren der von einer Probe, die Gegenstand der Analyse ist, abgeleiteten Vorlage-DNA auf den oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen des Spot-Array-Substrats, einen zweiten Schritt zum Replizieren der auf den oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen, einen dritten Schritt, in dem das Reagens umfassend den Fluoreszenzfarbstoff eine Dehnungsreaktion von einer Base der Vorlage-DNA auf den oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen durchführt, einen Schritt zum Messen der von den Kügelchen-Lagepositionen des Spot-Array-Substrats durch Ausstrahlen des Erregerlichts nach der Reaktion erzeugten optischen Signale, einen fünften Schritt zum Spalten des Fluoreszenzfarbstoffs von den Basen, in denen die optischen Signale gemessen werden, einen sechsten Schritt zum Waschen der Lösung umfassend den gespaltenen Fluoreszenzfarbstoff und einen siebten Schritt zum Analysieren der im vierten Schritt erhaltenen optischen Signale zum Ermitteln der Basensequenz der Vorlage-DNA.
  • Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Bildung einer Feinstruktur auf einer Maßebene von mehreren µm bis mehreren 100 nm möglich und das durch Mustern des Materials (Funktionsgruppen-Spot, Oligo-DNA-Spot usw.) des Array-Spots in einer Array-Form hergestellte Spot-Array-Substrat (oder ein Paket zum Vorbereiten des Spot-Array-Substrats) kann mit niedrigen Kosten in Massenproduktion hergestellt werden. Ferner kann eine Nukleinsäurepolymer-Analyse zu niedrigen Verbrauchsmaterialkosten durch Verwenden eines auf diese Weise hergestellten Substrats (oder eines Pakets zum Vorbereiten eines Substrats) durchgeführt werden.
  • Andere Probleme, Konfigurationen und Wirkungen gehen aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsformen hervor.
  • Figurenliste
    • 1 zeigt eine erläuternde Zeichnung zur Darstellung eines Beispiels des Herstellungsschritts zum Bilden des Spot-Arrays auf dem Harzsubstrat.
    • 2 zeigt ein Diagramm zum Erläutern eines Beispiels des Herstellungsablaufs zum Bilden des Spot-Arrays auf einem Si-Substrat durch einen Halbleiterherstellungsprozess.
    • 3 zeigt eine Draufsicht einer Ni-Konkavform und ein schematisches Diagramm des durch Verwenden der Form hergestellten Harzsubstrats.
    • 4 zeigt eine Draufsicht der Ni-Form und ein schematisches Diagramm des durch Verwenden der Form hergestellten Harzsubstrats.
    • 5 zeigt eine erläuternde Zeichnung eines Beispiels der Verwendung einer magnetischen Kraft bei der Spot-Array-Bildung.
    • 6 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des auf der Oberfläche des Harzsubstrats angeordneten unregelmäßigen Musters.
    • 7 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des auf der Oberfläche des Harzsubstrats angeordneten unregelmäßigen Musters.
    • 8 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des auf der Oberfläche des Harzsubstrats angeordneten unregelmäßigen Musters.
    • 9 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des auf der Oberfläche des Harzsubstrats angeordneten unregelmäßigen Musters.
    • 10 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des auf der Oberfläche des Harzsubstrats angeordneten unregelmäßigen Musters.
    • 11 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung des Schritts zum Herstellen des Spot-Array-Substrats.
    • 12 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung des Schritts zum Herstellen des Spot-Arrays mit dem Si-Substrat.
    • 13 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung des Herstellungsschritts mit einem zusätzlichen Schritt zum Bilden einer chemischen Bindung.
    • 14 zeigt eine erläuternde Zeichnung eines Verfahrens zum einfachen Hinzufügen eines Schritts zum Bilden einer chemischen Bindung.
    • 15 zeigt eine schematische Zeichnung zur Darstellung eines Konfigurationsbeispiels der Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung.
    • 16 zeigt einen Graphen zur Darstellung eines Beispiels des Messergebnisses der Fluoreszenz.
    • 17 zeigt eine schematische Zeichnung zur Darstellung eines Konfigurationsbeispiels der Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung.
    • 18 zeigt einen Graphen zur Darstellung eines Beispiels des Messergebnisses der Fluoreszenz.
  • Beschreibung der Ausführungsformen
  • Zur Zusammenfassung des herkömmlichen Array-Substrat-Herstellungsverfahrens stellt 2 ein Beispiel des Herstellungsschritts zum Bilden eines Spot-Arrays auf einem Si-Substrat durch einen Halbleiterherstellungsprozess dar. Beispielsweise wird beim Bilden eines Aminogruppen-Spots als Funktionsgruppen-Spot ein Resist-Muster 102 durch Fotolithographie auf einem Si-Wafer 101 gebildet und dessen Öffnung (beispielsweise in der Draufsicht eine Öffnung wie ein Kreis oder ein Quadrat) einer leichten Oxidationsbehandlung mit Sauerstoffplasma 103 unterzogen; anschließend wird ein Aminosilan-Film 105 durch ein Gas auf Aminosilan-Basis 104 aufgedampft und das Substrat, auf dem ein Aminogruppen-Spot-Array gebildet wird, kann schließlich durch einen Strom, der das Resist-Muster 102 durch Nassreinigung entfernt, hergestellt werden. Alternativ kann nach dem ersten Bilden des Aminosilan-Films auf dem Si-Wafer und Bilden einer Spot-Mustermaske (beispielsweise in der Draufsicht eine Maske wie ein Kreis oder ein Quadrat) durch Fotolithographie der Aminogruppen-Spot-Array durch Entfernen des Aminosilan-Films eines anderen planaren Bereichs als der Spot durch Trockenätzen und anschließend Abziehen der Resist-Maske hergestellt werden.
  • Bei solch einem Herstellungsverfahren war aber die Verwendung eines Si-Substrats für den Halbleiterprozess in den entsprechenden Substratmaterialien erforderlich und es mussten alle Wafer einer Behandlung durch einen Halbleiterprozess wie Lithographie, Plasmabehandlung oder Trockenätzen oder Aufdampfen unterzogen werden. Somit war die Senkung der Herstellungskosten beschränkt. Ferner gab es neben dem zuvor dargestellten Herstellungsschritt Verfahren, die den Spot-Array bilden können, wie die Bearbeitung durch Ionenstrahl- und Elektronenstrahl-Filmdeposition; solch ein Strahlzeichnungs-Herstellungsverfahren wird aber mit der Zunahme der Zahl von Spots kostspieliger. Somit kann es nicht für ein kostengünstiges Massenproduktionsverfahren im Vergleich zur Wafer-Batchverarbeitung verwendet werden.
  • Nachfolgend sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausführlich in Bezug auf die Zeichnungen erläutert. Die Konfiguration und die in den Ausführungsformen beschriebenen Materialien dienen ausschließlich zum Darstellen von Ausführungen des Gedankens der vorliegenden Erfindung und sollen nicht strikt Materialien, Maße und andere solche Variablen in irgendeiner Weise festlegen.
  • Erste Ausführungsform
  • Eine erste Ausführungsform beschreibt ein Beispiel für die Herstellung des Spot-Array-Substrats, das ein Harzsubstrat zum Bilden eines Funktionsgruppen-Spot-Arrays oder eines Oligo-DNA-Spot-Arrays verwendet.
  • 1 zeigt eine erläuternde Zeichnung zur Darstellung des grundlegenden Herstellungsprozesses der vorliegenden Erfindung, der den Spot-Array auf dem Harzsubstrat bildet. Zusammenfassend handelt es sich um ein Verfahren zum Herstellen eines Spot-Array-Substratsmit niedrigen Kosten durch Erzeugen des Harzsubstrats, auf dem das unregelmäßige Muster auf der Oberfläche gebildet wird und in dem eine Vielzahl von Kügelchen-Lagepositionen in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordnet ist, und Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen wie die funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen oder die oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen auf die Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats. Die Kügelchen-Lageposition ist ein Raum, in dem der Bereich teilweise oder vollständig vom konveven Teil des unregelmäßigen Musters umgeben ist und der Maße aufweist, in welche die Kügelchen genau passen.
  • 1(a) zeigt ein Verfahren zum direkten Verwenden einer Si-Form. Bei diesem Verfahren wird der Si-Wafer durch einen Halbleiterprozess (Lithographie, Trockenätzen und Ablösen) zum Herstellen einer Si-Konvex-Kleinform (Master) 201 bearbeitet. 1(b) zeigt ein Verfahren zum Verwenden der Ni-Elektroformung. Dieses Verfahren erzeugt einen Untermaster durch Ni-Elektroformung und überträgt die Si-Konkav-Kleinform (Master) 202 nach der Herstellung zur Ni-Konvexform (Untermaster) 203. Zunächst wird wenigstens eine der konvexen Formen 201 und 203 durch eines der Verfahren vorbereitet. Anschließend wird wie in 1(c) dargestellt die Form zum Herstellen des Harzsubstrats 204 verwendet, auf dem der Array 205 des konkaven Teils gebildet wird. In diesem Bildungsschritt ist eine Massenproduktion des Harzsubstrats 204 aus dem Harzrohmaterial durch Spritzgießen möglich. Ferner kann das Harzsubstrat 204 durch Wärmeverformung (Heißprägung) einer Harzplatte (oder falls in dünner Form einer Harzfolie), die zuvor als ein plattenförmiges oder folienförmiges Material vorbereitet wurde, in Massenproduktion hergestellt werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform wurde als ein Beispiel die Ni-Konvexform (Untermaster) 203 wie in 1(b) dargestellt verwendet, ein cycloolefin-basiertes Polymer wie ein Cycloolefin-Polymer (COP) oder ein Cyclooolefin-Copolymer (COC) als ein Beispiel des Harzmaterials verwendet und 1000 Gussteile wurden durch Spitzgießen hergestellt; das Ergebnis war, dass die Teile problemlos hergestellt werden konnten. Schließlich wurde der Spot-Array gebildet. In diesem Schritt wie in 1(d) dargestellt wurde das Harzsubstrat 204, auf dem der Array 205 des konkaven Teils gebildet wurde, in eine Zentrifuge 207 gesetzt, um eine Zentrifugalkraft in der Richtung zu erzeugen, in der Kügelchen in den konkaven Teil in einem Zustand eindringen, in dem beispielsweise das Harzsubstrat 204 in einer Flüssigkeit 206 mit den darin verteilten silica-aminogruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen (Durchmesser: 1 µm) getaucht wurde, und 10 Minuten lang mit 3000 U/min gedreht. Die verwendeten kugelförmigen Kügelchen wiesen eine Variation im Partikeldurchmesser von CV 10 % auf.
  • Ob die Kügelchen in die vom konkaven Teil gebildeten Kügelchen-Lagepositionen eindrangen oder nicht, wurde mit einem Elektronenmikroskop geprüft, und die amino-modifizierten Kügelchen waren in 40 % aller konkaven Teile geladen; aber die Kügelchen waren in 60 % der konkaven Teile nicht geladen. Zum Beurteilen der Ursache hierfür wurde das Substrat sorgfältig mit einem optischen Mikroskop in einem Zustand beobachtet, in dem es in die Flüssigkeit, in dem die Kügelchen verteilt waren, getaucht wurde, und als ein Ergebnis wurde eine Situation beobachtet, in der eine Vielfalt von großen und kleinen Luftblasen verblieb. Es ist festzustellen, dass die Luftblasen das Laden der Kügelchen beeinflussen. Daher wurde angenommen, dass die Tatsache, dass die Luftblasen dazu neigten zu bleiben und die Flüssigkeit nicht dazu neigte, in den von der konvexen Form gebildeten konkaven Teil einzudringen, die Ursache dafür war, dass das Einpassen der Kügelchen schwerfiel, und die zwei Maßnahmen zum Verringern der Luftblasen durch Ändern des Layouts der Form und zum Ersetzen der Flüssigkeit in Form von Alkohol durch die wässrige Lösung wurden als Maßnahmen gegen das beschriebene Problem durchgeführt.
  • 3 zeigt eine Draufsicht der in der zuvor beschriebenen Testproduktion verwendeten Ni-Konvexform 203 und zeigt ein schematisches Diagramm des mit der Form hergestellten Harzsubstrats 204. Der konvexe Teil 301 der Form wird auf das Harz übertragen, um den konkaven Teil im Harzsubstrat 204 zu bilden. In Bezug auf die kugelförmigen Kügelchen mit einem Durchmesser von 1 µm wies der zylindrische konkave Teil einen Durchmesser von 1 µm auf und die Dichte des konkaven Teils betrug 6,6×106/cm2 (4,2-µm-Teilung). Der abgekürzte Ausdruck „runde 1-µm-Kügelchen werden in den zylindrischen konkaven Teil mit einem Durchmesser von 1 µm geladen“ beschreibt lediglich ein Beispiel der Maße. Tatsächlich ist es beispielsweise vorteilhaft, den konkaven Teil mit einer normalen Verjüngung auszustatten (beispielsweise wird nur +5° von der Vertikale ein Beispiel für die normale Verjüngung im konkaven Teil gewählt, in dem die Tiefe 1, 1 µm, der Durchmesser der oberen Öffnung des konkaven Teils 1, 1 µm beträgt und der Durchmesser des Bodens des konkaven Teils 0,9 µm beträgt), so dass die Kügelchen nur schwer herausfallen, da die Kügelchen dadurch leichter in die obere Öffnung eindringen, und die Kügelchen sind nach dem Eindringen in die obere Öffnung eingepasst. Selbstverständlich dringen aber die Kügelchen leichter in die obere Öffnung ein, wenn der Durchmesser der oberen Öffnung des konkaven Teils etwas größer ist als die Kügelchen, und das ordnungsgemäße Einpassen der Kügelchen in eine in etwa normale Verjüngung führt dazu, dass die Kügelchen schwerer herausfallen durch ordnungsgemäßes Einpassen der Kügelchen in eine in etwa normale Verjüngung, und der Zustand, in dem diese Art der Detailgestaltung ausgeführt ist, kann einfach durch „kugelförmige 1-µm-Kügelchen werden in den zylindrischen konkaven Teil mit einem Durchmesser von 1 µm geladen“ ausgedrückt werden. Andere Gestaltungen, die beispielsweise die Variation der Kügelchen berücksichtigen und eine etwas normalere Verjüngung vorsehen (beispielsweise durch Wählen eines normalen Scheitelpunkts auf nur +10°), und andere als diese Gestaltungen, die der oberen Öffnung Rundheit (R) geben oder die einem Abschrägen (C) unterworfen sind, sind ohne weiteres denkbar.
  • 4 zeigt eine Draufsicht der verbesserten Ni-Form 305 und ein schematisches Diagramm des durch Verwenden der Form hergestellten Harzsubstrats 306. Die Ni-Form 305 weist ein unregelmäßiges Muster auf, in dem der Teil der dicht angeordneten Rauten (genau gesagt Rauten mit einem abgeschrägten Scheitelpunkt) hohl ist und der Teil zwischen den angrenzenden Rauten hervorragt. Das in der Form hergestellte Harzsubstrat 306 wird als eine Maßnahme zum Verbessern der Füllrate der Kügelchen erzeugt und die Anordnung der Kügelchen-Lagepositionen ist die gleiche wie in 3; es wird aber ein gerader Strömungsweg in der Strömungsrichtung der Flüssigkeit gebildet und die Flüssigkeit strömt ungehindert ein. (Die Luftblasen neigen nicht zum Bleiben.) Es ist daher zu erwarten, dass die Kügelchen problemlos eingepasst werden. Der konvexe Teil 304 der Form 305 wird auf das Harz übertragen und die Nut wird im Harzsubstrat 306 als der konkave Teil gebildet. In diesem Beispiel bekommt er das Layout einer schneidenden Nut. Als ein Beispiel der Maße weist die Nut eine Tiefe von 1, 1 µm sowie eine Breite von 0,6 µm auf und die Breite ist kleiner als der Durchmesser der Kügelchen von 1 µm. Somit werden die Kügelchen nicht in die Nut geladen. Die Nuten schneiden sich und der Schnittpunktteil ist die Kügelchen-Lageposition. Der Schnittpunktteil wurde mit 1 µm (wie zuvor beschrieben ist die Breite des oberen Teils tatsächlich ein Maß, das etwas größer ist als der Schnittpunkt und eine gewisse normale Verjüngung) für das Maß des schmälsten Teils ausgestattet und es wurde eine Layoutgestaltung verwendet, bei der die Kügelchen mit einem Durchmesser von 1 µm geladen werden konnten.
  • Die in 4 dargestellte Form wurde zum Herstellen 1000 von Gussteilen durch Spritzgießen verwendet. Im Vergleich zum Substrat von 3 besteht ein Strömungsweg und die Form ist etwas komplex; aber als ein Ergebnis der Testproduktion durch Spritzgießen wurde ermittelt, dass Teile problemlos ebenfalls wie in 4 hergestellt werden könnten.
  • Daher wurde schließlich das Harzsubstrat mit dem verbesserten Layout in die Flüssigkeit 206 getaucht, in der die silica-aminogruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen verteilt wurden wie in 1(d) dargestellt. In diesem Fall wurde aber das Harzsubstrat mit dem verbesserten Layout einmal in Isopropylalkohol getaucht, bevor es in die Flüssigkeit 206 getaucht wurde, in der die silica-aminogruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen verteilt wurden. Anschließend wurde das Substrat durch die wässrige Lösung ersetzt, während sorgfältig darauf geachtet wurde, dass sich keine Luftblasen bilden, und durch die Flüssigkeit 206 ersetzt, in der die silica-aminogruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen verteilt wurden. In diesem Zustand wurde zum Laden der aminogruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen in den im Schnittpunkt der Nut angeordneten Kügelchen-Lagepositionen in einem Muster, in dem der konkave Teil, insbesondere der Teil zwischen den Rauten, die Nut war, das Substrat in die Zentrifuge 207 gesetzt und 10 Minuten lang mit 3000 U/min gedreht. Mit einem Elektronenmikroskop wurde geprüft, ob die Kügelchen in die Kügelchen-Lagepositionen des Schnittpunkts der Nut eingedrungen waren oder nicht, und die aminogruppen-modifizierten Kügelchen waren in 80 % aller Kügelchen-Lagepositionen eingedrungen; somit war eine Verbesserung festzustellen, aber die Kügelchen drangen immer noch nicht in 20 % der Kügelchen-Lagepositionen ein.
  • Nach dem Durchlaufen der wässrigen Lösung des Reagens zur Analyse über 12 Stunden während des Wiederholens der Temperatursteuerung (10 bis 70 °C) zum Steuern der Enzymreaktion, um die Verwendung in der folgenden Analyse zu simulieren, wurden die Kügelchen, die in die Kügelchen-Lagepositionen des Schnittpunkts der Nuten eingedrungen waren, erneut mit einem Elektronenmikroskop überprüft. Als ein Ergebnis fielen 10 % der Kügelchen heraus und die Füllrate nahm auf insgesamt 70 % ab. Während die Füllrate des Substrats der vorliegenden Ausführungsform etwas niedrig war, handelte es sich um ein Herstellungsverfahren ausschließlich zum Einpassen des Array-Spot-Materials auf einem kostengünstigen gegossenen Harzsubstrat; somit wurde bestätigt, dass das Substrat zu erheblich niedrigeren Kosten hergestellt werden konnte, und das Verfahren war ein überlegenes Herstellungsverfahren.
  • Als ein Beispiel wurde in der vorliegenden Ausführungsform das lose Material, in dem die Aminogruppe modifiziert war, als ein Beispiel einer Funktionsgruppe auf der Oberfläche der Silica-Kügelchen als das Material des Array-Spots verwendet. Ferner wurde ein Beispiel zum Laden der Kügelchen im konkaven Teil des Harzsubstrats durch eine Zentrifuge (oder eine ähnliche umlaufende Maschine) beschrieben. Selbstverständlich kann die vorliegende Ausführungsform ebenfalls auf die oberflächenmodifizierten Kügelchen in anderen Funktionsgruppen angewendet werden und das lose Material der Kügelchen ist nicht auf Silica beschränkt.
  • Die aminogruppen-oberflächenmodifizierten magnetischen Kügelchen 208 enthaltend ein magnetisches Material können beispielsweise als loses Material der Kügelchen verwendet werden. In diesem Fall können wie in 5 dargestellt die Kügelchen in den konvexen Teil des Arrays 205 durch Setzen des Harzsubstrats 204, das den konkaven Teil des Arrays 205 bildet, in einen Behälter, Tauchen der Lösung 209, in der die aminogruppen-oberflächenmodifizierten magnetischen Kügelchen 208 verteilt sind, und anschließend Verwenden der Vorrichtung 211, die den Magneten während des Anziehens der magnetischen Kraft zu den magnetischen Kügelchen durch einen Magneten 210 von der Rückseite des Harzsubstrats bewegt, geladen werden. Ebenfalls im Fall des Verwendens einer Vorrichtung 211, in der sich der Magnet während des Anziehens mit dem Magneten 210 von der unteren Seite bewegt, war die Laderate höher beim Laden der Kügelchen nach ausreichendem Entfernen der Luftblase auf die gleiche Weise wie im Fall des Verwendens der Zentrifuge, und das Phänomen, bei dem einige der Kügelchen herausfallen, wurde durch einen Wärmezyklustestlauf über 12 Stunden, der die folgende Temperatursteuerung (10 bis 70 °C) wiederholte, beobachtet. Wie zuvor beschrieben ist, selbst wenn das lose Material der Kügelchen geändert wird und die Kraft zum Laden der Kügelchen von einer Zentrifugalkraft zu einer magnetischen Kraft geändert wird, das Laden der Kügelchen auf die Kügelchen-Lagepositionen des Substrats auf die gleiche Weise möglich.
  • Ferner wurden in der vorhergehenden Beschreibung die detaillierten Ergebnisse wie die Laderate in Bezug auf das Laden der Kügelchen in den konkaven Teil des einfachen Spot-Array-Layouts (Grundloch) wie in 3 dargestellt und das Laden der Kügelchen in den konkaven Teil (Schnittpunktposition der Nut) der Nut des Layouts, in dem sich die Nuten schneiden und der Schnittpunkt hiervon so bemessen ist, dass die Kügelchen geladen werden können wie in 4 dargestellt, als ein Beispiel erläutert. Die Gestaltung des konkaven Teils der Oberfläche ist aber nicht hierauf beschränkt.
  • 6 bis 10 zeigen schematische Diagramme zur Darstellung anderer Beispiele des auf der Oberfläche des Harzsubstrats angeordneten unregelmäßigen Musters. In allen Zeichnungen ist die linke Seite der Zeichnung die schematische Draufsicht des Harzsubstrats, in dem die Kügelchen nicht eingepasst sind, und die rechte Seite der Zeichnung ist die schematische Draufsicht des durch Einpassen der oberflächenmodifizierten Kügelchen in die Kügelchen-Lagepositionen hergestellten Spot-Array-Substrats. Das gemeinsame Konzept der auf der Oberfläche des in 6, 7 und 10 dargestellten Harzsubstrats gebildeten ungleichmäßigen Muster ist, dass die Muster, welche die angrenzenden Kügelchen-Lagepositionen mit der Nut verbunden, eine Breite schmaler als das Maß der Kügelchen-Lagepositionen aufweisen.
  • 6 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des Harzsubstrats 307, in dem eine Vielzahl von Nuten orthogonal zueinander vertikal und horizontal auf der Oberfläche ausgebildet sind und der Schnittpunkt der vertikalen Nut und der horizontalen Nut zur Kügelchen-Lageposition wird. Die Kügelchen-Lagepositionen 308 bilden den zweidimensionalen Array und sind auf dem Harzsubstrat 307 angeordnet. Die Breite der Nut wird als etwas kleiner als der Durchmesser der Kügelchen gewählt; somit können die Kügelchen nicht in die linearen Nuten eindringen, welche die Schnittpunkte miteinander verbinden. Die durch die Schnittpunkte der vertikalen Nut und der horizontalen Nut erzeugten Kügelchen-Lagepositionen 308 weisen aber solche Maße auf, dass ausschließlich Kügelchen mit einem Durchmesser von 1 µm passen. Daher können die Kügelchen in die Kügelchen-Lagepositionen aufgrund der Zentrifugalkraft und der magnetischen Kraft eingepasst werden. Wie in der Figur dargestellt werden die Kügelchen mit einem größeren Durchmesser als die Breite der Nut in die von den Schnittpunkten der vertikalen Nut und der horizontalen Nut des Harzsubstrats gebildeten Kügelchen-Lagepositionen eingepasst und als ein Ergebnis kann das Spot-Array-Substrat 309, in dem die oberflächenmodifizierten Kügelchen 310 in einem zweidimensionalen Array auf der Oberfläche angeordnet sind, erzielt werden.
  • 7 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des Harzsubstrats, in dem eine Vielzahl von Nuten mit Verengungen parallel auf der Oberfläche ausgebildet ist. Auf der Oberfläche des Harzsubstrats 311 ist eine Vielzahl von Nuten, in denen die Stellen, an denen die Breite zunimmt, und die Stellen, an denen die Breite abnimmt, abwechselnd verbunden sind, parallel ohne Schnittpunkte miteinander ausgebildet. Die Breite der Nut ist ein Maß, welches das Einpassen der Kügelchen an den Stellen ermöglicht, an denen die Breite zunimmt. Somit werden die Teile mit der größeren Breite zwischen den Nuten mit Verengungen die Kügelchen-Lageposition 312, und es kann ein Spot-Array-Substrat 313, in dem die oberflächenmodifizierten Kügelchen in einem zweidimensionalen Array auf der Oberfläche angeordnet sind, durch Einpassen der oberflächenmodifizierten Kügelchen 310 in den Kügelchen-Lagepositionen erzielt werden. Im Falle des Harzsubstrats 311 schneiden sich die Nuten nicht; aber da eine Flüssigkeit leicht in diese fließt, dringen in diese die Kügelchen leichter ein als in die von wenigstens einem isolierten runden Grundloch gebildeten Kügelchen-Lagepositionen und die Kügelchen-Laderate kann erhöht werden.
  • 8 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des Harzsubstrats, in dem die aus einem quadratischen Grundloch gebildeten Kügelchen-Lagepositionen in einem zweidimensionalen Array auf der Oberfläche ausgebildet sind. Das Harzsubstrat 314 ähnelt dem in 3 dargestellten Harzsubstrat; die Luftblasen und die Lösung an der Innenseite treten aber leichter aus als beim runden konkaven Teil, indem die planare Form des konkaven Teils, der zu Kügelchen-Lagepositionen 315 wird, als ein Quadrat gestaltet wird, wodurch die Laderate problemlos zunimmt. Das Spot-Array-Substrat 316, in dem die oberflächenmodifizierten Kügelchen auf der Oberfläche in einem zweidimensionalen Array angeordnet sind, können durch Einpassen der oberflächenmodifizierten Kügelchen 310 in den aus einem quadratischen Grundloch des Harzsubstrats 314 gebildeten Kügelchen-Lagepositionen 315 erzielt werden.
  • 9 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des Harzsubstrats, in dem die aus einem sechseckigen Grundloch gebildeten Kügelchen-Lagepositionen in einem zweidimensionalen Array auf der Oberfläche ausgebildet sind. Das Harzsubstrat 317 ähnelt dem in 3 dargestellten Harzsubstrat; aber die planare Form des konkaven Teils, die zu Kügelchen-Lagepositionen 318 als ein Sechseck wird, macht es den Luftblasen und der Lösung an der Innenseite auszutreten als beim runden konkaven Teil, wodurch die Laderate der Kügelchen problemlos zunimmt. Ferner kann das sechseckige Loch die Zahl von Kügelchen erhöhen, die pro Einheitsfläche im Vergleich zum quadratischen Loch geladen werden können. Das Spot-Array-Substrat 319, in dem die oberflächenmodifizierten Kügelchen auf der Oberfläche in einem zweidimensionalen Array angeordnet sind, können durch Einpassen der oberflächenmodifizierten Kügelchen 310 in den aus dem sechseckigen Grundloch des Harzsubstrats 317 gebildeten Kügelchen-Lagepositionen erzielt werden.
  • 10 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung eines Beispiels des Harzsubstrats, in dem die säulenförmigen Stützen regelmäßig auf der Oberfläche angeordnet sind. Eine Vielzahl von säulenförmigen Stützen 322 ragen regelmäßig zur Oberfläche des Harzsubstrats 320 hervor und der von sechs Stützen umgebene Raum wird zur Kügelchen-Lageposition 321. Durch Gestalten des von den säulenförmigen Stützen umgebenen Raums als die Kügelchen-Lageposition, selbst wenn die Zahl von Kügelchen, die feingeladen werden kann, die gleiche ist, fließt die Lösung ungehindert und die Kügelchen werden problemlos geladen im Vergleich zum Fall des Konfigurierens der Kügelchen-Lagepositionen durch das sechseckige Grundloch. Ein Spalt der säulenförmigen Stützen entspricht der Konfiguration, die zwischen der angrenzenden Kügelchen-Lageposition und den Kügelchen-Lagepositionen mit der Nut verbindet, und bewirkt, dass die Lösung ungehindert fließt. Der Spalt zwischen den säulenförmigen Stützen kann als die Länge der Nut verkürzt auf eine Distanz, bei der die Kügelchen am dichtesten gepackt sind, betrachtet werden. Das Spot-Array-Substrat 323, in dem die oberflächenmodifizierten Kügelchen auf der Oberfläche in einem zweidimensionalen Array angeordnet sind, können durch Einpassen der oberflächenmodifizierten Kügelchen 310 in den von der säulenförmigen Stütze des Harzsubstrats 320 umgebenen Kügelchen-Lagepositionen 321 erzielt werden.
  • Während die in 3 bis 10 dargestellten Harzsubstrate verschiedene Bildungszustände der Kügelchen-Lageposition aufweisen, resultierend in einem Unterschied in der Laderate der Kügelchen usw. , ändert dies nicht das Wesen des Herstellungsverfahrens eines kostengünstigen Spot-Array-Substrats, das eine Musterübertragung von der Form gemäß der vorliegenden Erfindung auf das Harz und das Laden der Kügelchen auf die im zweidimensionalen Array durch das Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen verwendet. Lediglich als ein Beispiel ist Feinladen usw. für Kügelchen mit einem Durchmesser von 1 µm dargestellt; es können aber noch kleinere Kleinformen erzeugt werden. Da aber Kügelchen mit noch kleineren Durchmessern wie 0,8 µm oder 0,6 µm erhältlich sind, kann aufgrund des Fortschritts bei Fotosensor-Arrays und optischen Systemen, die in der Fluoreszenzbeobachtung wie nachfolgend beschrieben verwendet werden, wenn die Pixelzahl zunimmt und die optische Auflösung hoch wird, eine praktische Anwendung eines höher integrierten Arrays mit kleineren Maßen entsprechend den Spezifikationen erfolgen. Gemäß der vorliegenden Ausführungsform kann ein Spot-Array-Substrat, in dem die oberflächenmodifizierten Kügelchen in einem zweidimensionalen Array mit der Oberflächendichte von 6,6×106/cm2 bis 180×106/cm2 (4,2-µm-Teilung bis 0,8-pm-Teilung) auf der Oberfläche angeordnet sind, mit niedrigen Kosten hergestellt werden. Die Teilung von 0,8 µm ist die Grenze des engsten Füllens, wenn 0,6-µm-Kügelchen verwendet werden, und entspricht einer Oberflächendichte von 180×106/cm2.
  • Der Schritt zum Laden der Kügelchen, die das Array-Spot-Material sind, mit Zentrifugalkraft und magnetischer Kraft ist der Herstellungsschritt des Spot-Array-Substrats und erfolgt vor dem Vorbereitungsvorgang aus dem Blickwinkel des Anwenders der Analysevorrichtung. Somit ist es sinnvoll, vorzugsweise einen Anwender mit dem Spot-Array-Substrat mit diesem Schritt des Herstellers des Spot-Array-Substrats zu versorgen. Ein Spot-Array-Substrat-Herstellungspaket, das ein Harzsubstrat, auf dem ein unregelmäßige Muster auf der Oberfläche gebildet ist und in dem eine Vielzahl von Kügelchen-Lagepositionen in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordnet ist, und oberflächenmodifizierte Kügelchen wie die funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen oder oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen, die auf die Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats geladen sind, umfasst, und eine Vorrichtung, die eine Zentrifuge (oder eine ähnliche umlaufende Maschine) oder einen Magneten zum Laden der magnetischen Kügelchen werden dem Anwender zur Verfügung gestellt und der Anwender kann den Schritt zum Laden des Materials des Array-Spots selbst mit lediglich einem geringen Unterschied an Arbeit und Kosten durchführen oder es wird das Basiselement selbst zu geringen Kosten hergestellt. Somit geht der Vorteil, dass eine kostengünstige Analyse durch den Anwender ausgeführt werden kann, nicht verloren.
  • Zweite Ausführungsform
  • Die Füllrate der Kügelchen ist vorzugsweise in der praktischen Anwendung hoch und wünschenswerterweise werden wenigstens 90 % des wirksamen Array-Spots gebildet. Daher stellt die zweite Ausführungsform ein Beispiel zum Herstellen des Chips, der das Harzsubstrat zum Bilden eines oberflächenmodifizierten Spot-Arrays wie des Funktionsgruppen-Spot-Arrays und des Oligo-DNA-Spot-Arrays verwendet, und zu diesem Zeitpunkt Verbessern der Füllrate der Kügelchen sowie Durchführen von Maßnahmen, so dass die Kügelchen während der Analyse nicht herausfallen, dar.
  • 11 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung des Herstellungsschritts des verbesserten Spot-Array-Substrats; 11(a) zeigt den Formerzeugungsschritt, 11(b) zeigt den Bildungsschritt und 11(c) zeigt den Spot-Array-Bildungsschritt. Zusammenfassend umfasst das Verfahren zum Herstellen des Spot-Array-Substrats einen Schritt zum Vorbereiten des Harzsubstrats, in dem eine Form zum Bilden des unregelmäßigen Musters auf der Oberfläche verwendet wird und eine Vielzahl von Kügelchen-Lagepositionen in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordnet wird, und einen Schritt zum Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen auf die Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats, wobei der Schritt zum Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen auf die Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats einen ersten Schritt zum Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen auf die Kügelchen-Lagepositionen in einem Zustand, in dem das Harzsubstrat zur Wärmedehnung des Harzsubstrats erwärmt wird, und einen zweiten Schritt zum Absenken der Temperatur des Harzsubstrats und Zusammenziehen des Harzsubstrats, um ein Herausfallen der in den Kügelchen-Lagepositionen geladenen oberflächenmodifizierten Kügelchen zu erschweren, umfasst. Bei diesem Verfahren muss das lose Material der oberflächenmodifizierten Kügelchen verwendet werden, in dem der Wärmedehnungskoeffizient im Vergleich zum Material des Harzsubstrats niedrig ist.
  • Die in 11(a) dargestellte Form 401 ist die gleiche wie die in 4 dargestellte, die ein Ni-Elektroformungsteil war, in dem der Teil der dicht angeordneten Rauten hohl war, mit einem unregelmäßigen Muster, in dem der Teil zwischen den angrenzenden Rauten hervorragte. In der ersten Ausführungsform wurde bestätigt, dass die Flüssigkeit ungehindert in das Muster floss, zu dem es übertragen wurde, und somit die Kügelchen problemlos eingepasst wurden. Anschließend wurde wie in 11(b) dargestellt das Harzsubstrat 402, auf dem das Rautenmuster 403 gebildet wurde, durch das Spritzgießen eines Cycloolefin-Polymers hergestellt. Die Oberflächendichte der im unregelmäßigen Muster des Harzsubstrats 402 angeordneten Kügelchen-Lagepositionen beträgt 6, 6×106/cm2. Schließlich wurde wie in 11(c) dargestellt, nachdem das Harzsubstrat 402, welches das Rautenmuster 403 bildete, einmal in Isopropylalkohol getaucht worden war und anschließend mit der Flüssigkeit 404 ausgetauscht worden war, in der die silica-aminogruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen verteilt waren, während sorgfältig darauf geachtet wurde, dass sich keine Luftblasen bildeten, das Harzsubstrat 402 in eine Zentrifuge 405 mit einer Temperatureinstellfunktion 406 gesetzt und die Temperatur wurde auf 90 °C erhöht, was niedriger war als die Wärmebeständigkeitstemperatur des Harzsubstrats, während 10 Minuten lang mit 3000 U/min gedreht wurde. Anschließend, wenn die Heizung der Zentrifuge 405 mit einer Temperatureinstellfunktion abgeschaltet wurde und das Drehen für weitere 5 Minuten fortgesetzt wurde, wurde die Temperatur auf 40 °C verringert und das Drehen wurde beendet. Die Kügelchen wiesen in der vorliegenden Ausführungsform ebenfalls einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 1 µm und eine Variation im Partikeldurchmesser von CV 10 % auf.
  • Wenn die magnetischen Kügelchen nicht durch eine Zentrifuge, sondern durch eine magnetische Kraft geladen werden, kann nach dem Verwenden der Vorrichtung mit einer Temperatureinstellfunktion, die einen Magneten zum Laden von magnetischen Kügelchen und Einpassen der Kügelchen in die Kügelchen-Lagepositionen des unregelmäßigen Musters während des Erhöhens der Temperatur in der gleichen Richtung die Anwendung der magnetischen Kraft abgeschaltet werden, nachdem die Temperatur abgesenkt ist, oder das Harzsubstrat kann von der die magnetische Kraft ausübenden Vorrichtung abgesenkt werden, nachdem die Temperatur abgesenkt ist.
  • Der Wärmedehnungskoeffizient eines Harzmaterials liegt allgemein im Bereich von 5×10-5 und halb oder größer als 10-4[/°C] und das in der vorliegenden Ausführungsform verwendete cycloolefin-vasierte Polymer gehört ebenfalls zu dieser Kategorie. Aufgrund der Größenordnungen größerer Stärke im Vergleich beispielsweise zum Wärmedehnungskoeffizienten von 10-7 von SiO2, welches das Hauptrohmaterial von Silica-Kügelchen darstellt, kann ein problemloses Einpassen der Kügelchen aufgrund der Wärmedehnung bei erhöhten Temperaturen und eine Befestigungswirkung durch das Spannen der Kügelchen bei einer abgesenkten Temperatur erwartet werden. Wenn aber die magnetischen Kügelchen statt der Silica-Kügelchen gewählt werden, ist beispielsweise der Wärmedehnungskoeffizient von Eisen und Eisenoxid nicht größer als 5×10-5 und halb oder kleiner und ist ebenfalls kleiner als der Wärmedehnungskoeffizient des Harzes. Durch die Auswahl der Kombination des Harzmaterials des Substrats und des Materials der Kügelchen kann, selbst wenn Details unterschiedlich sind wie die optimalen Temperaturbedingungen, die optimale Maßgestaltung von beispielsweise dem konkaven Teil des unregelmäßigen Musters und der Kügelchen, der Kügelchen-Lagepositionen darstellt, insbesondere die Spaltgestaltung zum problemlosen Laden und Erschweren des Herausfallens, und die optimale Gestaltung des normalen schrägen Winkels des konkaven Teils, wenn der Wärmedehnungskoeffizient des Harzsubstrats größer ist als der von wenigstens der Kügelchen, obwohl der Bereich der Wirkung unterschiedlich wird, eine Verbesserung der Füllrate der Kügelchen und eine Verringerung der Herausfallrate erwartet werden.
  • Die spezifischen Maße der Dehnungsmenge beispielsweise im Falle einer Kombination aus Silica-Kügelchen mit einem Durchmesser von 1 µm und cycloolefin-basierten Polymeren betreffen die detaillierte Maßgestaltung des konkaven Teils. Wenn der Durchmesser (Maß des oberen Teils des Lochs) des Eingangs des konkaven Teils (beispielsweise des Lochs) zum Laden der Silica-Kügelchen so gestaltet ist, dass er etwas größer ist als 1 µm, und der Durchmesser (Maß des unteren Teils des Lochs) der Bodenfläche des konkaven Teils so gestaltet ist, dass er etwas kleiner als 1 µm, wie in der ersten Ausführungsform beschrieben, lassen sich die Kügelchen problemlos laden. Im Falle der Verwendung des Unterschieds im Wärmedehnungskoeffizienten wie in der zweiten Ausführungsform beschrieben, wird, wenn die Maße im Falle des Erhöhens der Temperatur auf 90 °C berechnet werden, das Loch des cycloolefin-basierten Polymersubstrats etwa 5 nm größer. Die Menge der Zunahme des Durchmessers der Silica-Kügelchen ist hingegen zwei Stellen kleiner als dies und kann als nahezu unverändert betrachtet werden. Aufgrund der Zunahme des Durchmessers des Lochs um 5 nm lassen sich die Kügelchen problemlos in das Loch laden und diese passen, genau in eine tiefere Tiefe. Anschließend zieht sich durch Abkühlen des cycloolefin-basierten Polymers der Durchmesser des Lochs um 5 nm zusammen und es ist somit zu erwarten, dass die Kügelchen nach dem Laden sicher geklemmt werden und nur schwer herausfallen.
  • Ob die Kügelchen in die im Schnittpunkt der das Rautenmuster umgebenden Nut angeordneten Kügelchen-Lagepositionen eingedrungen waren oder nicht, wurde mit einem Elektronenmikroskop geprüft, um die Wirkung der Verbesserungsmaßnahmen der vorliegenden Ausführungsform zu verifizieren. Es wurde verifiziert, dass sich die Füllrate verbesserte und die aminogruppen-modifizierten Kügelchen in 92 % aller Kügelchen-Lagepositionen geladen wurden. Es wird angenommen, dass sich das Harz mehr dehnte als die Kügelchen durch das Erhöhen der Temperatur auf 90 °C und als ein Ergebnis due Kügelchen problemlos einzupassen waren und sich die Laderate der Kügelchen verbesserte.
  • Anschließend wurden auf die gleiche Weise wie bei der ersten Ausführungsform nach dem Durchlaufen der wässrigen Lösung des Reagens zur Analyse über 12 Stunden während des Wiederholens der Temperatursteuerung (10 bis 70 °C) zum Steuern der Enzymreaktion, um die Verwendung in der folgenden Analyse zu simulieren, die Kügelchen, die in die Kügelchen-Lagepositionen eingedrungen waren, erneut mit einem Elektronenmikroskop überprüft und als ein Ergebnis wurde ermittelt, dass die Füllrate von 92 % von allen erhalten wurde. Es ist davon auszugehen, dass, wenn die Verbesserungsmaßnahmen verwendet wurden, die Kügelchen eingepasst und sicher immobilisiert wurden sowie ein Herausfallen der Kügelchen erschwert wurde. Im Vergleich zur ersten Ausführungsform ist eine zusätzliche Temperatureinstellfunktion in der Vorrichtung erforderlich, die eine Zentrifuge oder einen Magneten zum Laden der magnetischen Kügelchen verwendet; der Anstieg der Kosten der Herstellung ist aber nicht groß. Es ist davon auszugehen, dass im Vergleich zum Verwenden eines Si-Wafers für alle Chips und das Herstellen durch einen Halbleiterprozess die Wirkung des Hinzufügens der Temperatureinstellfunktion beim Kostenanstieg im Wesentlichen gering ist.
  • Zum Vergleich wurde das Material des Substrats aus Si hergestellt und die Bewertung des Ladens und Herausfallens der Kügelchen wurde auf die gleiche Weise durchgeführt. Wie zuvor beschrieben nahmen, wenn das Material des Substrats ein cycloolefin-basiertes Polymer war, die Maße des konkaven Teils der Kügelchen-Lagepositionen aufgrund des Temperaturanstiegs des Substrats zu und die Kügelchen waren problemlos einzupassen. Wenn aber Si das Material des Substrats ist, ist der Wärmedehnungskoeffizient 10-6 und halb oder kleiner; somit ist die Maßänderung des konkaven Teils der Kügelchen-Lagepositionen klein. (Si dehnt sich im Vergleich zu Harz kaum, selbst wenn die Temperatur ansteigt.) Ferner ändern sich die Maße der Silica-Kügelchen kaum. Daher ist davon auszugehen, dass eine ausreichende Wirkung zum Bewirken, dass die Kügelchen problemlos passen und schwer herausfallen, durch Steuern der Temperatur nicht erzielt werden kann.
  • Die Verfahren der Bewertung sind in 12 dargestellt. In 11 wurde das Harzsubstrat 402, auf dem das in 11(b) dargestellte Rautenmuster 403 durch die in 11(a) dargestellte Ni-Elektroformungsform 401 gebildet wurde, bei der Bewertung des Ladens der Kügelchen verwendet; beim Erzeugen der Ni-Elektroformungsform 401 von 11(a) wurde aber ein Si-Substrat 1201 mit der gleichen Oberflächenausbildung wie die als Master verwendete Si-Form bei der Bewertung verwendet. Wie in 1 einfach dargestellt weist die Si-Konkav-Kleinform (Master) 202 die gleiche Oberflächenausbildung auf wie das Harzsubstrat 204, das den Array 205 des konkaven Teils bildet und es unterscheiden sich lediglich die Materialien.
  • Ein Halbleiterprozess (Lithographie, Trockenätzen, Ablösen) wurde auf die gleiche Weise wie beim Erzeugen der Form zur Mikrobearbeitung des Si-Wafers verwendet und wie in 12(a) dargestellt wurde das Si-Substrat 1201 mit der gleichen Oberflächenausbildung wie die Si-Konkav-Kleinform (Master) erzeugt. Das gleiche Rautenmuster 403 wie bei der Oberfläche des in 11(b) dargestellten Harzsubstrats 402 wurde auf der Oberfläche des Si-Substrats 1201 gebildet. Anschließend wurde wie in 12(b) dargestellt das Si-Substrat 1201 einmal in Isopropylalkohol getaucht und anschließend mit der Flüssigkeit 404 ausgetauscht, in der die silica-aminogruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen verteilt waren, während sorgfältig darauf geachtet wurde, dass sich keine Luftblasen bildeten, das Harzsubstrat 1201 in eine Zentrifuge 405 mit einer Temperatureinstellfunktion 406 gesetzt und die Temperatur wurde auf 90 °C erhöht, was niedriger ist als die Wärmebeständigkeitstemperatur des Harzsubstrats, während das Si-Substrat 1201 10 Minuten lang mit 3000 U/min gedreht wurde. Wenn die Heizung der Zentrifuge 405 mit einer Temperatureinstellfunktion abgeschaltet wurde und das Drehen für 5 Minuten fortgesetzt wurde, wurde die Temperatur auf 40 °C verringert und das Drehen wurde beendet. Die Kügelchen wiesen in der vorliegenden Ausführungsform ebenfalls einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 1 µm und eine Variation im Partikeldurchmesser von CV 10 % auf.
  • Mit einem Elektronenmikroskop wurde geprüft, ob die Kügelchen in die am Schnittpunkt der das Rautenmuster umgebenden Nuten angeordneten Kügelchen-Lagepositionen eingedrungen waren, und es wurde verifiziert, dass die Füllrate der Kügelchen im Vergleich zum Fall, in dem das Material ein cycloolefin-basiertes Polymer war, abnahm und dass die aminogruppen-modifizierten Kügelchen in 70 % aller Kügelchen-Lagepositionen geladen waren. Ferner wurden nach dem Durchlaufen der wässrigen Lösung des Reagens zur Analyse über 12 Stunden während des Wiederholens der Temperatursteuerung (10 bis 70 °C) zum Steuern der Enzymreaktion, um die Verwendung in der folgenden Analyse zu simulieren, die Kügelchen, die in die Kügelchen-Lagepositionen eingedrungen waren, erneut mit einem Elektronenmikroskop überprüft und als ein Ergebnis wurde ermittelt, dass die Füllrate weiter auf 60 % von allen abnahm. Somit wurde ermittelt, dass, wenn das Substratmaterial aus Si hergestellt wurde, die Wirkung, dass die Kügelchen aufgrund der Wärmedehnung durch einen Anstieg der Temperatur des Substrats problemlos einzupassen sind, und die Wirkung, dass die geladenen Kügelchen aufgrund der Abnahme der Temperatur des Substrats gespannt werden und schwer herausfallen, nicht erzielt werden konnten.
  • Zuvor wurde beim Verfahren zum Herstellen des oberflächenmodifizierten Spot-Arrays, in dem ein Harzsubstrat eine Form zum Bilden eines unregelmäßigen Musters auf der Oberfläche verwendet und in dem ein Harzsubstrat mit einer in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Vielzahl von Kügelchen-Lagepositionen verwendet wird, nachgewiesen, dass nicht nur die Materialkosten und die Herstellungskosten niedriger waren, sondern die Eigenschaft, dass das Harz einen hohen Wärmedehnungskoeffizienten aufweist, aktiv verwendet wurde, um die Laderate der Kügelchen durch die Temperatureinstellfunktion zu verbessern und den Anteil von herausfallenden Kügelchen zu verringern; insbesondere konnte die Ausbeute der Array-Spot-Herstellung verbessert werden.
  • Auf die gleiche Weise wie bei der ersten Ausführungsform ist es wünschenswert, dass das Spot-Array-Substrat dem Anwender als ein fertiges Produkt vom Hersteller zur Verfügung gestellt wird. Es wird aber eine Vorrichtung umfassend das Spot-Array-Herstellungspaket, welches das geformte Substrat und die Kügelchen, die das Material des Array-Spots sind, umfasst, und eine Zentrifuge mit einer Temperatureinstellfunktion (oder eine ähnliche umlaufende Maschine) oder eine Temperatureinstellfunktion, die einen Magneten zum Laden der magnetischen Kügelchen verwendet, dem Anwender zur Verfügung gestellt und der Anwender kann den Schritt zum Laden des Materials des Array-Spots selbst durchführen und das Basiselement selbst zu geringen Kosten herstellen. Somit geht der Vorteil, dass eine kostengünstige Analyse durch den Anwender ausgeführt werden kann, nicht verloren.
  • Dritte Ausführungsform
  • Anschließend verwendete die dritte Ausführungsform das Harzsubstrat zum Herstellen eines Chips, der den Funktionsgruppen-Spot-Array oder einen Oligo-DNA-Spot-Array bildete, und insbesondere zu diesem Zeitpunkt wurden die Wirkung der chemischen Bindung an einer festen Position der Kügelchen und die Wirkung der Verengung der Partikelgrößenverteilung der Kügelchen als andere Maßnahmen zum Erhöhen der Füllrate der Kügelchen und Vermeiden des Herausfallens der Kügelchen während der Analyse untersucht.
  • 13 zeigt ein schematisches Diagramm zum Darstellen des Schritts zum Herstellen des Spot-Array-Substrats, in dem ein Schritt zum Bilden der chemischen Bindung hinzugefügt wird, um die Wirkung der chemischen Bindung in der festen Position der Kügelchen zu untersuchen. Der Formerzeugungsschritt, der Bildungsschritt und der Spot-Array-Bildungsschritt, der als letzter erfolgt, sind identisch mit denen in der zweiten Ausführungsform; daher wird auf eine Erläuterung verzichtet. 13(a) zeigt den Gasphasen-CVD-Schritt nach dem Bildungsschritt, 13(b) zeigt den Resist-Harz-Spin-Coating-Schritt, 13(c) zeigt den O2-Trockenätzschritt und 13(d) zeigt den Schritt zum Entfernen des Resist-Harzes zum Schutz. Zusammenfassend handelt es sich um ein Spot-Array-Vorrichtung-Herstellungsverfahren, welches das Substrat verwendet, in dem die Kügelchen-Lagepositionen vorab oberflächenmodifiziert werden, so dass ein ungleichmäßiges Muster in einem Harz mit einer Form gebildet werden kann, und die chemische Bindung kann beim Einpassen der mit einer Funktionsgruppe oder Oligo-DNA modifizierten Kügelchen in Kügelchen-Lagepositionen mit einem unregelmäßigen Muster gebildet werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform ist die Zahl der Schritte größer und es wurden die folgenden vier Schritte hinzugefügt, um die chemische Bindung nach dem Herstellen des Harzsubstrats mit einer Vielzahl von im unregelmäßigen Oberflächenmuster in einem zweidimensionalen Array angeordneten Kügelchen-Lagepositionen durch die in der zweiten Ausführungsform dargestellten Bildungsschritte zu bilden.
  • Zunächst wurde wie in 13 (a) dargestellt ein epoxidbasiertes Silan-Haftmittel 504 in einem Vorläufer zum Bilden eines Epoxysilan-Films 505 im Harzsubstrat 502, das die Rautenmuster durch Spritzguss bildete, durch Gasphasen-CVD verwendet und eine Epoxidgruppe wurde auf der Oberfläche gebildet. Anschließend wurde wie in 13(b) dargestellt das Resist-Harz 507, das vollständig in Aceton löslich ist, auf der Oberfläche des Harzsubstrats 502 aufgetragen, auf dem der Epoxysilan-Filme 505 durch einen Spin-Coater 506 gebildet wurde. Anschließend wurde wie in 13(c) dargestellt eine RIE-(Reactive-Ion-Etching-)Vorrichtung verwendet und die obere Oberfläche 509 des Substrats wurde durch O2-Plasma 508 hinterätzt, bis sie freigelegt war. Sobald das Trockenätzen abgeschlossen war, wurde die obere Oberfläche des Rautenmusters bis zum cycloolefin-basierten Polymer freigelegt, während das Resist-Harz 510, das in die Nut eingedrungen war, verblieb. Daher befindet sich die Innenfläche der Nut in einem Zustand, in dem die Epoxidgruppe vom Resistharz abgedeckt und geschützt ist. Anschließend wurde wie in 13 (d) dargestellt durch Entfernen des Resist-Harzes, das die Epoxidgruppe in der Nut bedeckt, das cycloolefin-basierte Polymersubstrat 511 des Rautenmusters, in dem ausschließlich die Innenfläche der Nut durch eine Epoxidgruppe modifiziert, hergestellt wurde. Das cycloolefin-basierte Polymerharz löst sich nicht in Aceton; somit wird ein Beispiel dargestellt, bei dem das aufgetragene Resist-Harz durch Lösen in Aceton entfernt wird. Aber im Beispiel wird das Harzsubstratmaterial in Aceton gelöst; somit muss eine für das Substratmaterial geeignete Kombination aus einem schützenden Harz und einem Lösemittel gewählt werden. Es gibt hingegen Harze mit einer hohen Beständigkeit gegen organische Lösemittel wie ein cycloolefin-basiertes Polymer, es können somit andere Resist-Abziehmittel zum Entfernen des Resist-Harzes verwendet werden und das Lösemittel zum Resist-Abziehen ist nicht auf Aceton beschränkt.
  • Nach dem Hinzufügen dieser 4 Schritte wurde schließlich zur Bewertung der Füllrate der Kügelchen, nachdem das cycloolefin-basierte Substrat 511 des Rautenmusters, in dem ausschließlich die Innenfläche der Nut von der Expoxidgruppe modifiziert, einmal in Isopropylalkohol auf die gleiche Weise wie im Fall von 11(c) getaucht und wurde anschließend durch die Flüssigkeit ersetzt, in der die silica-aminogruppen-modifizierten Kügelchen verteilt waren, während sorgfältig darauf geachtet wurde, dass sich keine Luftblasen bildeten. Anschließend wurde das Substrat 511 in eine Zentrifuge mit einer Temperatureinstellfunktion gesetzt und die Temperatur wurde auf 90 °C erhöht, während 10 Minuten lang mit 3000 U/min gedreht wurde. Anschließend, wenn die Heizung der Zentrifuge mit einer Temperatureinstellfunktion abgeschaltet wurde und das Drehen für weitere 5 Minuten fortgesetzt wurde, wurde die Temperatur auf 40 °C verringert. Somit wurde die Drehung beendet. Selbst bei der Bewertung der Wirkung der chemischen Bindung wiesen die Kügelchen einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 1 µm und eine Variation im Partikeldurchmesser von CV 10 % auf.
  • Wenn die magnetischen Kügelchen mit einem Magneten und nicht mit einer Zentrifuge geladen werden, reicht es aus, wenn die Vorrichtung mit einer Temperatureinstellfunktion zum Laden der magnetischen Kügelchen mit einem Magneten auf die gleiche Weise verwendet wird, und nachdem die Kügelchen bei Erhöhen der Temperatur eingepasst sind, wird die Temperatur abgesenkt und die Anwendung der magnetischen Kraft wird abgeschaltet oder die Temperatur wird abgesenkt und die geladenen Kügelchen werden von der Vorrichtung zum Beeinflussen der magnetischen Kraft entfernt.
  • Bei der Bewertung wurde daher davon ausgegangen, dass sich eine chemische Bindung durch die Aminogruppe der aminogruppen-modifizierten Kügelchen bilden würde, was ein Beispiel des Spot-Array-Materials und der Epoxidgruppe an der Innenseite der Nut des Substrats darstellt, und es wurde angenommen, dass die Füllrate der Kügelchen weiter zunehmen würde. Zum Verifizieren der Wirkung der chemischen Bindung wurde mit einem Elektronenmikroskop geprüft, ob die Kügelchen in die im Schnittpunkt der das Rautenmuster umgebenden Nut angeordneten Kügelchen-Lagepositionen eingedrungen waren oder nicht. Es wurde verifiziert, dass sich die Füllrate noch mehr verbesserte und die amino-modifizierten Kügelchen in 96 % der Kügelchen-Lagepositionen der Gesamtheit geladen wurden. Es ist anzunehmen, dass sich die Füllrate der Kügelchen durch das Hinzufügen einer Immobilisierungswirkung aufgrund der chemischen Bindung verbesserte.
  • Anschließend wurden wie in der ersten und zweiten Ausführungsform nach dem Wiederholen der Temperatursteuerung (10 bis 70 °C) zum Steuern der Enzymreaktion während des Durchlaufens der wässrigen Lösung des Reagens zur Analyse über 12 Stunden zum Simulieren der Verwendung in der folgenden Analyse die Kügelchen, die in die Kügelchen-Lagepositionen eingedrungen waren, erneut mit einem Elektronenmikroskop geprüft und als ein Ergebnis nahm die Füllrate etwas ab und betrug 94 % von allen. Während eine Verringerung von 2 % festgestellt wurde, wurde eine hohe Füllrate der Kügelchen und ein hoher Kügelchen-Restanteil (=Füllrate - Herausfallrate) wurde durch die Immobilisierungswirkung aufgrund der chemischen Bindung im Vergleich zum Fall ohne Immobilisierungswirkung erzielt. Statt dem durch das epoxidbasierte Silan-Haftmittel gebildeten Epoxysilan-Film kann beispielsweise ein durch ein isocyanat-basiertes Silan-Haftmittel gebildeter Isocyanat-Silan-Film u. Ä. als das Material verwendet werden, das eine chemische Bindung mit den aminogruppen-modifizierten Kügelchen bilden kann. Es wurde eine Untersuchung probeweise auf die gleiche Weise durchgeführt und als ein Ergebnis konnten Kügelchen mit einer Füllrate von 95 % erzielt werden, was nahezu identisch ist wie im Fall des Epoxysilan-Films, und es konnte ein Kügelchen-Restanteil von 94 % nach einem 12-Stunden-Durchlauf, der die Analyse simulierte, erzielt werden.
  • Selbst im Fall, in dem eine von beiden Funktionsgruppen verwendet wird, kann davon ausgegangen werden, dass die chemische Bindung die Fähigkeit zum Halten der Kügelchen in den Kügelchen-Lagepositionen auf dem Substrat erhöht. Im Vergleich allerdings zur ersten und zweiten Ausführungsform besteht ein Hinzufügen der 4 Schritte von 13(a) bis (d) ; somit sind die Herstellungskosten etwas höher. Allerdings wird wenigstens im Vergleich zum Herstellen aller Chips durch einen Halbleiterprozess unter Verwendung eines Si-Wafers ein Feinmustern (Lithographie) nicht für alle Chips verwendet und somit handelt es sich um ein Verfahren, das die Chips zu geringen Kosten herstellen kann.
  • Ebenfalls beim Verfahren, das die Wirkung durch die chemische Bindung verwendet, ist es wünschenswert, dass das Spot-Array-Substrat dem Anwender auf die gleiche Weise wie bei der ersten und zweiten Ausführungsform als ein fertiges Produkt vom Hersteller zur Verfügung gestellt wird. Sicherlich ist es möglich, eine Form zu verwenden, in welcher der Anwender den Einpassschritt des Array-Spot-Materials ausführt, und in diesem Fall wird das Basiselement selbst zu geringen Kosten hergestellt; somit geht der Vorteil, dass die Analyse zu geringen Kosten ausgeführt werden kann, nicht verloren. Im Fall der vorliegenden Ausführungsform hingegen beim Bereitstellen des Satzes aus geformtem Substrat, Kügelchen, die das Array-Spot-Material werden, und der Vorrichtung mit einer Temperatureinstellfunktion, welche die Zentrifuge mit der Temperatureinstellfunktion und den Magneten zum Laden der magnetischen Kügelchen verwendet, ist es aus dem Blickwinkel des Schutzes der Funktionsgruppe (in der vorliegenden Ausführungsform der Epoxidgruppe oder der Isocyanatgruppe) in einer Position, in der die Kügelchen des gebildeten Substrats immobilisiert sind, sicherer, den Anwender mit einer angebrachten Abdeckung des Resist-Harzes zu versorgen, welche die Funktionsgruppe an der Innenseite der Nut schützt. In diesem Fall muss der Anwender zunächst das Resist-Harz mit einem organischen Lösemittel (Aceton usw.) entfernen, was zu mehr Arbeitsschritten führt und die Komplexität im Vergleich zur ersten und zweiten Ausführungsform erhöht.
  • Es wurde aber ein spezifisches Problem festgestellt, als die chemische Bindung in der vorliegenden Ausführungsform verwendet wurde. Wie zuvor beschrieben wurde, in Bezug auf die im Schnittpunkt der das Rautenmuster umgebenden angeordneten Kügelchen-Lagepositionen, während die Ergebnisse, dass die Laderate der aminogruppen-modifizierten Kügelchen 96 % betrug und dass der Kügelchen-Restanteil nach dem Simulieren der Analyse mit einem 12-Stunden-Durchlauf 94 % betrug, gut waren, die nichtspezifische Adsorption der aminogruppen-modifizierten Kügelchen an einigen Stellen auf der oberen Oberfläche des Rautenmusters ungeachtet der Kügelchen-Lagepositionen, insbesondere auf der Oberfläche, in der das cycloolefin-basierte Polymer durch Entfernen des die Funktionsgruppe bildenden Films durch Trockenätzen freigelegt wurde. In der ersten und zweiten Ausführungsform behält die Oberfläche des cycloolefin-basierten Polymersubstrats mit einem auf der Oberfläche durch Spritzgießen und Wärmeverformung (Heißprägung) ausgebildeten unregelmäßigen Muster die Hydrophobie und eine nichtspezifische Adsorption stellte kein Problem dar. Die Oberfläche des Substrats des cycloolefin-basierten Polymers der vorliegenden Ausführungsform ist aber die Oberfläche des cycloolefin-basierten Polymers, die erneut nach Bilden eines weiteren Films darauf freigelegt und bei welcher der Film durch O2-Plasmaätzen entfernt wurde. Daher wurde angenommen, dass, wenn das cycloolefin-basierte Polymer beispielsweise durch Trockenätzen freigelegt wurde, die Oberfläche des cycloolefin-basierten Polymers ein Zustand der Oberflächen-Funktionsgruppe war, der sich von der üblichen Oberfläche des cycloolefin-basierten Polymers wie O, das am C-Atom auf der Oberfläche des Cycloolefin-Polymers gebunden war, um beispielsweise eine an C auf der Oberfläche aufgrund des beim Trockenätzen verwendeten O2-Plasmas gebundene -OH-Gruppe zu bilden, unterschied.
  • Daher wurde nach dem O2-Trockenätzschritt von 13(c) ein Gasphasen-CVD-Schritt mit einem fluorcarbon-basierten (CFx-basierten) Silan-Haftmittel als ein Vorläufer als eine nichtspezifische Adsorptionsmaßnahme hinzugefügt. Zu diesem Zeitpunkt sind die Funktionsgruppen der Kügelchen-Lagepositionen vom Resist-Harz abgedeckt; somit ist nach dem Hinzufügen des Schritts, wenn Aceton zum Entfernen des schützenden Resist-Harzes wie in 13(d) verwendet wird, die gewünschte Funktionsgruppe (in der vorliegenden Ausführungsform eine Epoxidgruppe oder eine Isocyanatgruppe) in der Kügelchen-Lageposition freigelegt und andere flache Teile als diese (bei einem Rautenmuster die rautenförmige obere Oberfläche) führen zu einem Substrat, auf dem eine hydrophobe Oberflächenbehandlung durchgeführt wird, so dass keine nichtspezifische Adsorption erfolgt.
  • Der Kügelchen-Ladetest und der Herausfalltest, welche die Temperatureinstellfunktion verwendeten, wurden an diesem Substrat auf die gleiche Weise durchgeführt, und die guten Ergebnisse, etwa dass die Laderate der aminogruppen-modifizierten Kügelchen 96 % betrug und der Kügelchen-Restanteil nach dem Simulieren der Analyse mit einem 12-Stunden-Durchlauf 94 % betrug, blieben unverändert. Ferner wurde keine nichtspezifische Adsorption im Bereich durch das Elektronenmikroskop festgestellt. Es ist anzunehmen, dass selbst im gleichen Harzsubstrat, wenn Oberflächenoxidation u. Ä. aufgrund einer Plasmabehandlung usw. auftritt, sich der Oberflächenzustand ändert, und in diesem Fall wurde festgestellt, dass die Oberfläche mit ähnlichen Merkmale wie die Oberfläche aus dem ursprünglichen Harzmaterial (hydrophober Kunststoff) durch Durchführen einer fluorcarbon-basierten usw. hydrophoben Oberflächenbehandlung gebildet werden konnte und zum Verhindern einer nichtspezifischen Adsorption verwendet werden konnte.
  • Es wurden aber neben der nichtspezifischen Adsorption auf der Oberfläche (bei einem Rautenmuster die rautenförmige obere Oberfläche), die einem O2-Plasma aufgrund des Trockenätzens des cycloolefin-basierten Substrats ausgesetzt war, die Kügelchen mit einer kleinen Partikelgröße in einer Position immobilisiert vorgefunden, die kein Schnittpunkt in der das Rautenmuster umgebenden Nut war, obgleich dies nicht häufig war. Wie in 4 dargestellt können in einem Rautenmuster die Kügelchen in die die Rauten umgebenden Nuten und die Position des Schnittpunkts der Nut durch die Gestaltung eindringen; aber die Nut, die kein Schnittpunkt ist, weist eine kleinere Breite auf als der Kügelchen-Durchmesser und ist somit so gestaltet, dass die Kügelchen nicht eindringen können. Da aber tatsächlich eine Verteilung von Partikelgrößen in den Kügelchen besteht, ist davon auszugehen, dass die Kügelchen, in denen die Maße übermäßig in der Richtung abweichen, die kleiner ist als der Durchschnittsdurchmesser, chemisch gebunden oder physikalisch mit der Epoxidgruppe oder der Isocyanatgruppe an der Innenseite der Nut eingepasst sind.
  • Unter Berücksichtigung der Variation im Partikeldurchmesser der Kügelchen kann das zuvor beschriebene Problem ebenfalls durch Ändern der Nutbreite so, dass sie kleiner ist, vermieden werden; aber davon ausgenommen kann durch leichtes Ändern des in 13 dargestellten Herstellungsverfahrens die Epoxidgruppe oder die Isocyanatgruppe nur im Schnittpunkt in der Nut verbleiben. Insbesondere sind die Epoxidgruppe oder die Isocyanatgruppe nicht mit der Resist-Harz-Abdeckung wie durch den in 13(b) dargestellten Resist-Harz-Spin-Coating-Schritt geschützt und statt dieses Schritts kann als ein Beispiel das Verfahren zum Laden der Silica-Kügelchen, die nicht chemisch im Schnittpunkt der das Rautenmuster umgebenden Nutzen durch die Zentrifuge modifiziert waren, und Verwenden der Abdeckung mit den Silica-Kügelchen in der Schutzmaske der Epoxidgruppe oder Isocyanatgruppe in Betracht gezogen werden. Nach dem physikalischen Einpassen der Silica-Kügelchen im Schnittpunkt der das Rautenmuster umgebenden Nutzen wird die RIE-Vorrichtung auf die gleiche Weise wie in 13 (c) verwendet und ein O2-Plasma wird zum Entfernen der anderen Epoxidgruppen oder Isocyanatgruppen als die in den Kügelchen durch Rückätzen verborgenen Teile verwendet. Schließlich kann das Substrat, in dem der Spot der Epoxidgruppe oder der Isocyanatgruppe entfernt wurde, ausschließlich im unteren Teil des Schnittpunkts der die Rauten umgebenden Nuten durch Wenden des Substrats und Setzen in die Zentrifuge in einem Zustand, in dem die Temperatur auf 90 °C erhöht wird, und Entfernen der Kügelchen durch die Zentrifuge hergestellt werden. Die im Teil in der Nut, die keine Schnittpunktposition ist, immobilisierten Kügelchen mit einer kleinen Partikelgröße konnten im geprüften Sichtfeld durch Ändern der Gestaltung zum Verkleinern des Nutmaßes auf Null gebracht werden. Dieses Verfahren erfordert aber kein Resist-Harz-Spin-Coating, erfordert aber stattdessen das Hinzufügen der zwei Schritte des Ladens der Silica-Kügelchen und des Entfernens der Silica-Kügelchen; somit nimmt die Zahl der Herstellungsschritte zu, während sich die Funktion zum Verhindern der Immobilisierung in der Nut verbessert.
  • Daher wurde eine weitere Vereinfachung der Schritte zum Bilden der Epoxidgruppe oder Isocyanatgruppe für die chemische Bindung als eine weitere Untersuchung des Verfahrens unter Verwendung der Wirkung der chemischen Bindung untersucht. Dies stellt kein komplexes Verfahren wie das Entfernen einer Epoxidgruppe oder einer Isocyanatgruppe des unnötigen Teils (der oberen Oberfläche des Rautenmusters) nach Durchführen einer Gasphasen-CVD oder der Resist-Harzbeschichtung (oder dem Laden der Silica-Kügelchen als Schutzmaske) wie in 13 dargestellt dar und es wurde ein einfaches Verfahren untersucht, bei dem die Behandlung ausschließlich durch ein Silan-Haftmittel in der das Rautenmuster umgebenden Nut und dem Schnittpunkt der Nut untersucht wurde.
  • 14 zeigt ein schematisches Diagramm zur Darstellung der einfachen Abläufe des Verfahrens. 14(a) zeigt den Schritt zum Anhaften mit einer flachen Platte, 14(b) zeigt den Oberflächenbehandlungsschritt in der Nut durch das Kapillarphänomen und 14 (c) zeigt den Waschschritt. Zunächst wurde wie in 14 (a) dargestellt die Musteroberfläche des cycloolefin-basierten Polymersubstrats 601, auf dem das Rautenmuster gebildet wurde, mit der flachen Platte 602 eng angehaftet. Anschließend wird wie in 14 (b) dargestellt das Ende in ein epoxidbasiertes oder isocyanat-basiertes Silan-Haftmittel (flüssig) 603 getaucht. Durch diesen Schritt dringt das Silan-Haftmittel in die Innenseite der Nut durch das Rautenmuster ein. Anschließend wurde wie in 14(c) ein Substrat 601 mit einer flachen Platte (602) angehaftet, in die Flüssigkeit 604 zum Waschen getaucht, das überschüssige Silan-Haftmittel an der Innen- und Außenseite der Nut abgewaschen und mit so viel Flüssigkeit zum Waschen wie möglich ersetzt und ferner wurde die flache Platte 602 entfernt, um das überschüssige Silan-Haftmittel sorgfältig abzuwaschen, so dass auschließlich das mit dem Substrat gebundene Silan-Haftmittel auf der Oberfläche in der Nut verblieb.
  • Das so erzeugte Substrat wurde evaluiert und als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass 95 % der Amino-Kügelchen auf nahezu die gleiche Weise wie das durch das Herstellungsverfahren von 13 erzeugte Substrat geladen werden konnten. Ferner wurde probeweise ein Tropfen Silan-Haftmittel direkt auf das Ende des Rautenmusters ohne Verwendung der flachen Platte 602 getropft und in diesem Fall konnte das Silan-Haftmittel in die Nuten der Rauten durch das Rautenmuster aufgrund der Kapillarwirkung eindringen; aber im Teil, in den ein Tropfen tropfte, wurde das Silan-Haftmittel zum großen Teil verdrängt und haftete ebenfalls am planaren Teil der oberen Oberfläche des Rautenmusters zusätzlich zur Nut.
  • Neben dem Bilden eines Films mit dem flüssigen Silan-Haftmittel durch die Gasphase der Vakuumvorrichtung konnte ein Verfahren, das die Innenseite der Nut durch die Kapillarwirkung im flüssigen Zustand modifizieren kann, durch einen manuellen Vorgang bestätigt werden. Wenn das Anhaften mit der flachen Platte und das Verdrängen am Teil, in den der Tropfen tropfte, sorgfältig vermieden wird, können die Amino-Kügelchen-Lagepositionen chemisch durch die Behandlung mit einem Silan-Haftmittel in einem flüssigen Zustand modifiziert werden und kann die Füllrate der Amino-Kügelchen verbessert werden.
  • Schließlich wurde der Blickwinkel etwas verändert und es wurde die Wirkung der Verengung der Partikelgrößenverteilung der Kügelchen als eine weitere Maßnahme zum weiteren Verbessern der Füllrate der Kügelchen und des Restanteils des Array-Spot-Materials untersucht. Zunächst wird angenommen, dass der Grund dafür, dass die Füllrate der Kügelchen durch das Verfahren, das die Wirkung der chemischen Bindung wie zuvor beschrieben verwendet, verbessert wurde, und der Grund dafür, dass der Restanteil der Kügelchen um lediglich 2 % abnahm nach dem Verwenden zum Simulieren der Analyse, darin lag, dass aufgrund des Ausmaßes der Partikelgrößenverteilung der Kügelchen die Kügelchen, die wesentlich kleiner als der Durchschnittspartikeldurchmesser waren, physikalisch nicht eng genug eingepasst waren, sondern ausschließlich durch chemische Bindung immobilisiert wurden, und die Kügelchen während der Verwendung zum Simulieren der Analyse herausfielen; somit war es wesentlich, die Partikelgröße der Kügelchen entsprechend zu gestalten, um die Verteilung zu verengen. Ferner wird davon ausgegangen, dass die Kügelchen, die in einer Position, die nicht der Schnittpunkt in der Nut ist, immobilisiert sind, durch das Verengen der Partikelgrößenverteilung der Kügelchen entfernt werden können. Aufgrund dieser Überlegung wurde die gleiche Behandlung wie in 11 der zweiten Ausführungsform ohne Verwenden der Wirkung der chemischen Bindung wie in 13 dargestellt durchgeführt. Im Spot-Array-Bildungsschritt wird ebenfalls die Temperatureinstellfunktion zum Durchführen des Einpassens der Kügelchen auf die gleiche Weise wie bei der zweiten Ausführungsform verwendet. Dieses Verfahren unterscheidet sich aber von der zweiten Ausführungsform insofern, als CV 3% als Variation im Partikeldurchmesser der Kügelchen verwendet wurde.
  • Zum Verifizieren der Wirkung der Verengung der Partikelgrößenverteilung der Kügelchen wurde mit einem Elektronenmikroskop geprüft, ob die Kügelchen in die im Schnittpunkt der das Rautenmuster umgebenden Nut angeordneten Kügelchen-Lagepositionen eingedrungen waren, und es wurde verifiziert, dass sich die Füllrate im Vergleich zum Fall von CV 10 % wie in der zweiten Ausführungsform dargestellt verbesserte und die aminogruppen-modifizierten Kügelchen in 95 % aller Kügelchen-Lagepositionen geladen waren. Ferner blieb der Kügelchen-Restanteil nach dem Simulieren der Analyse mit einem 12-Stunden-Durchlauf bei 95 % und zusätzlich wurde überhaupt keine spezifische Adsorption im vom Elektronenmikroskop beobachteten Bereich festgestellt. Es wird festgestellt, dass als ein Ergebnis des Wechsels von CV 10 % zu CV 3 % der Anteil der Kügelchen, die zu groß sind, um geladen zu werden, weil sie im Vergleich zum Durchschnitt zu groß sind, und der Kügelchen, die geladen werden können, aber unmittelbar herausfallen, weil sie im Vergleich zum Durchschnitt zu klein sind, abnahm, um die Maßkompatibilität mit den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats zu verbessern, und die Füllrate der Kügelchen und der Restanteil groß wurde.
  • In der dritten Ausführungsform wurden zum weiteren Verbessern der durch die zweite Ausführungsform erzielten Ergebnisse der Füllrate der Kügelchen von 92 % und des Kügelchen-Restanteils von 92 % nach der Analysesimulation eine Kügelchen-Füllrate von 96 % und ein Kügelchen-Restanteil von 94 % durch die kombinierte Verwendung von chemischer Bindung an den Kügelchen-Lagepositionen und einer hydrophoben Behandlung zum Verhindern einer nichtspezifischen Adsorption erzielt. Wenn aber die Partikelgrößenverteilung der Kügelchen von CV 10 % auf CV 3 % verringert wurde, wurden eine Füllrate der Kügelchen von 95 % und ein Kügelchen-Restanteil von 95 % erzielt. Es wurden ausschließlich die Kügelchen mit einer engen Partikelgrößenverteilung während des Herstellungsprozesses verwendet, die höhere Kosten als die Kügelchen mit einer weiten Partikelgrößenverteilung aufweisen; es ist aber festzustellen, dass wenigstens aufgrund des Herstellungsprozesses zum Unterziehen jedes Massenproduktionssubstrats einer Filmbildung, einem Ätzen u. Ä. zum Durchführen einer oberflächenmodifizierten Behandlung für die chemische Bindung und einer Behandlung zum Verhindern einer nichtspezifischen Adsorption der Kostenanstieg gering ist und der Herstellungsprozess ebenfalls bemerkenswert einfach ist.
  • Zuvor wurden Beispiele in Bezug auf mehrere Verfahren zum Bilden des Array-Spots mit einer Bildungsrate von 90 % oder mehr dargestellt und es wurden die relativen Vorzüge wie die Kosten der Herstellung untersucht. Somit gibt es mehrere Ausführungsverfahren; aber folgende vierte und fünfte Ausführungsform zeigen Beispiele zwischen den Verfahren unter Verwendung „der Herstellungsschritte als die zweite Ausführungsform, aber ein unter Verwendung der CV-3-%-Kügelchen hergestelltes Substrat mit einer Array-Spot-Bildungsrate von 95 % wie am Ende der dritten Ausführungsform dargestellt zum Durchführen der Analyse eines Nukleinsäurepolymers und einem Decodieren der Basensequenz.
  • Vierte Ausführungsform
  • Die vierte Ausführungsform stellt ein Beispiel der Analyse dar, welche die Durchlaufzelle verwendet, die das Spot-Array-Substrat umfasste.
  • 15 zeigt eine schematische Zeichnung zur Darstellung eines Konfigurationsbeispiels der in der vorliegenden Ausführungsform verwendeten Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung. Das aus Harz hergestellte Spot-Array-Substrat wurde in die Durchlaufzelle 701 eingebracht. Die Lösung, die durch den Lösungseinlauf der Durchlaufzelle 701 eingeführt wurde, benetzt die Oberfläche des Spot-Array-Substrats und wird aus dem Lösungsauslauf in einem Abfallflüssigkeitsbehälter entsorgt. Die Kügelchen-Lagepositionen des Cycloolefin-Substrats, in dem das unregelmäßige Muster durch den konvexen Teil der dicht angeordneten Rauten und die Form der den konvexen Teil umgebenden Nut gebildet wurde, wurden als das Spot-Array-Substrat verwendet; insbesondere wurden die aminogruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen 714 vorab durch die Zentrifugalkraft in der Schnittpunktposition der das Rautenmuster umgebenden Nut eingepasst. Das Basismaterial der Kügelchen ist Silica. Ferner verwendeten die Kügelchen ein Silica, in dem die Partikelgrößenverteilung CV 3 % beträgt, und die Füllrate der Kügelchen in die Kügelchen-Lagepositionen des Spot-Array-Substrats beträgt 95 %. Die Vorlage-DNA mit einer unbekannten Sequenz in wenigstens dem Teil, welcher der Gegenstand der Analyse ist, wurde vorab auf den Kügelchen durch Emulsions-PCR verstärkt, die verstärkte Vorlage-DNA wurde auf dem Array-Spot mit einer Aminogruppe oberflächenmodifiziert und durch die Fluoreszenzmessung analysiert und die Basensequenz wurde decodiert.
  • Wie in der ersten bis dritten Ausführungsform können das Harzsubstrat (beispielsweise die in der Durchlaufzelle angeordnete Form), in das die Kügelchen-Lagepositionen des zweidimensionalen Array mit dem auf der Oberfläche gebildeten unregelmäßigen Muster angeordnet wurden, und die mit einer Funktionsgruppe (in der vorliegenden Ausführungsform eine Aminogruppe) oberflächenmodifizierten Kügelchen (beispielsweise die Flüssigkeit, in der die Kügelchen verteilt waren) dem Anwender separat zur Verfügung gestellt werden und der Anwender passt die Kügelchen in die Kügelchen-Lagepositionen des Substrats ein, um das Funktionsgruppen-Spot-Array-Substrat zu bilden, und verwendet dieses Substrat.
  • Die Temperatursteuerung der Durchlaufzelle 701 ist durch die Temperatureinstellfunktion 712 möglich. Ferner wird die Reaktionsreagenseinheit 702, die mehrere Reaktionsreagenzien liefert, installiert und auf einer niedrigen Temperatur gehalten, bei der die Enzymreaktion im Reagens nicht fortschreitet, sowie mit Rohrleitungen mit der Durchlaufzelle 701 verbunden. In der vorliegenden Ausführungsform können vier Arten von Reagenzien 703 bis 706 durch die Reaktionsreagenseinheit 702 bereitgestellt werden. Das Reagens 703 wird auf der Kügelchenoberfläche, auf der die durch die Oligo-DNA vorab modifizierte Vorlage-DNA mit einer unbekannten Sequenz in wenigstens dem Teil, welcher der Gegenstand der Analyse ist, aufgebracht und umfasst die durch Emulsions-PCR verstärkten Kügelchen (Kügelchen 715, die das Replikat der Vorlage-DNA auf der Oberfläche durch Emulsions-PCR bilden). Das Reagens 704 umfasst den dATP-Fluoreszenzfarbstoff 1, den dGTP-Fluoreszenzfarbstoff 2, den dCTP-Fluoreszenzfarbstoff 3, den d-TTP-Fluoreszenzfarbestoff 4, eine im kügelchenseitigen befestigten Anschluss der Kügelchen zur Emulsions-PCR verwendete bekannte Sequenz (Oligo-DNA) und das Dehnungsreaktionsenzym. Das Reagens 705 ist ein Farbstoff-Bindungsspaltungsreagens, das die Bindung zwischen den vier Arten von dNTP und dem Fluoreszenzfarbstoff spaltet. Das Reagens 706 ist eine Elektrolytlösung.
  • Ferner wurden Isopropylalkohol 707 und eine Elektrolytlösung 708, die ein Äquivalent des Reagens 706 ist, getrennt vorbereitet. Diese Lösungen werden mit einer Pipette in die Durchlaufzelle eingespritzt. Isopropylalkohol 707 wird im Lösungsersatz in der Durchlaufzelle verwendet und es kann ein anderer Alkohol wie Ethylalkohol verwendet werden.
  • Eine Lichtquelle 709 zum Erzeugen des Erregerlichts zum Erregen von jeder Art von im Reagens 704 enthaltenem Fluoreszenzfarbstoff, ein optisches System 710 zum Messen der Fluoreszenz vom Fluoreszenzfarbstoff und ein Fotodetektor-Array 711 sind oberhalb der Durchlaufzelle 701 angeordnet. Das Ausstrahlen des Erregerlichts und die Fluoreszenzermittlung sind selbst mit einem nicht transparenten Substrat möglich und wenn ein transparentes dünnes Substrat verwendet wird, sind die Erregung und die Ermittlung selbst von unterhalb des Substrats möglich; somit sind in der vorliegenden Ausführungsform die vertikale Anordnung des optischen Systems und der Detektor nicht spezifisch beschränkt. Wenn die Temperatureinstellung, Fotoanregung und Fluoreszenzbeobachtung durchgeführt werden können, kann das optische System entweder oberhalb oder unterhalb der Durchlaufzelle angeordnet werden. Ferner werden die vom Fotodetektor-Array 711 empfangenen optischen Signale in elektrische Signale umgewandelt und an die Analysevorrichtung 713 übertragen. Die Analysevorrichtung 713 führt Analysen wie die Unterscheidung der Basen von den übertragenen Signalen und das Verbinden von Fragmentdaten durch und decodiert die Basensequenz des Nukleinsäurepolymers.
  • Es ist allgemein bekannt, dass als Fluoreszenzfarbstoff, der in den im Reagens 704 enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffen 1 bis 4 verwendet werden kann, Alexa488, Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa555, Alexa647, Alexa680, dN6G (Dichlorrhodamin 6G), dN110, dTAMNA (Dichlor-carboxytetramethyl-rhodamin), dROX (Dichlor-carboxy-X-rhodamin) usw. verwendet werden können sowie verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe im Handel erhältlich sind, und es kann ein geeigneter Farbstoff ausgewählt werden, so dass die Wellenlängen nicht teilweise überlappen. Ferner ist allgemein bekannt, dass das Auswählen von wenigstens einem Typ oder mehr geeigneten Wellenlängen als die Wellenlängen einer Lichtquelle 709 zum wirksamen Erregen des Fluoreszenzfarbstoffs durch die Auswahl dieser Farbstoffe möglich ist.
  • In der vorliegenden Ausführungsform wurde zunächst Isopropylalkohol 707 durch den Einlauf der Durchlaufzelle 701 durch einen manuellen Vorgang mit einer Pipette eingespritzt, und nach dem Überprüfen, dass keine Luftblasen vorhanden waren, wurde der Isopropylalkohol 707 durch die Elektrolytlösung 708 durch einen manuellen Vorgang mit einer Pipette ersetzt. Der Vorgang zum Ersetzen von Alkohol durch die Elektrolytlösung 708 kann ebenfalls durch eine automatische Lösungszuführung erfolgen und in einigen Fällen kann ebenfalls ein Verfahren usw. zum Ersetzen eines Alkohols durch eine Elektrolytlösung 708 seitens des Durchlaufzellenherstellers und Füllen der Flüssigkeit vorab zum Bereitstellen für den Anwender durchgeführt werden. In jedem Fall wurde anschließend die Durchlaufzelle 701 in die Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung mit der in die Zelle gefüllten Elektrolytlösung 708 und ohne Luftblasen gesetzt.
  • Anschließend wurde das die Kügelchen 715, die das Replikat der Vorlage-DNA auf der Oberfläche bildeten, enthaltende Reagens 703 automatisch in die Durchlaufzelle 701 durch eine Lösungszufuhreinheit eingespritzt, die Lösungszufuhreinheit wurde in diesem Zustand gestoppt, das Reagens 703 wurde auf die optimale Temperatur gebracht, drei Stunden stehen gelassen und auf dem aminogruppen-oberflächenmodifizierten Spot-Array immobilisiert. Das Spot-Array-Material (aminogruppen-oberflächenmodifizierte Kügelchen 714), von dem 95 % aller Kügelchen-Lagepositionen mit der Aminogruppe während der Herstellung oberflächenmodifiziert wurden, war in dem in der Durchlaufzelle 701 integrierten Cycloolefin-Substrat eingebettet, aber die Kügelchen 715, die das Replikat der Vorlage-DNA durch Emulsions-PCR bildeten, konnten auf der Oberfläche in 92 % der Spots zwischen diesen 95 % immobilisiert werden. 3 % der Spots wurden nicht immobilisiert. Anschließend wurde eine geeignete Temperatur eingestellt, das Reagens 704 wurde der Durchlaufzelle zugeführt, mit einem Primer hybridisiert und die Dehnungsreaktion wurde mit einem Enzym durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt, da das dNTP im Reagens vom Fluoreszenzfarbstoff beendet wurde, wurde nach dem Durchführen der Dehnungsreaktion am ersten Basentyp der Vorlage-DNA die Reaktion gestoppt. Anschließend wurde das Erregerlicht von der Lichtquelle 709 ausgestrahlt und die zu diesem Zeitpunkt ausgestrahlte Fluoreszenz wurde vom optischen System 710 und vom Fotodetektor-Array 711 gemessen.
  • 16 zeigt ein Beispiel des Messergebnisses der durch Erregen mit der Lichtquelle 709 nach dem Durchführen einer Dehnungsreaktion einer der Array-Spots auf dem in der Durchlaufzelle 701 integrierten Cycloolefin-Substrat ausgestrahlten Fluoreszenz. Da die Fluoreszenz des an dCTP gebundenen Fluoreszenzfarbstoffs 3 in den ersten Daten 801 verifiziert wurde, wurde die erste Base als G decodiert. Anschließend wurde der Farbstoff bei einer geeigneten Temperatur vom das Farbstoff-Bindungsspaltungsreagens umfassenden Reagens 705 gespalten und nach dem Waschen der Flüssigkeit in der den gespaltenen Farbstoff enthaltenden Durchlaufzelle mit der Elektrolytlösung des Reagens 706 wurde das Reagens 704 erneut automatisch eingespritzt und die zweite oder folgende Analyse der Basen wurde auf die gleiche Weise wiederholt. Wie in 16 dargestellt wurde die Messung bis zum fünften Mal (bis zur fünften Base) wiederholt und als ein Ergebnis konnte die Sequenz bis zur fünften Base vom Anschlussstück der Oligo-DNA auf den Kügelchen für die Emulsions-PCR in einer der ausgewählten Array-Spots als GAGTC decodiert werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform muss ein Kügelchen, das die Vorlage-DNA durch Emulsions-PCR vorab repliziert, das Kügelchen sein, in dem ein Typ von Vorlage-DNA repliziert wird. In der Emulsions-PCR gibt es mit der Ausnahme, dass ein Typ von Vorlage-DNA auf den Kügelchen repliziert wird, in Bezug auf die Wahrscheinlichkeit Fälle, in denen die Kügelchen, in denen die Vorlage-DNA nicht immobilisiert werden konnte und wenn zwei verschiedene Arten von Vorlage-DNA auf einem Kügelchen repliziert wurden als defekte Kügelchen vorhanden waren. In diesen Fällen konnten die Signale der Basen nicht erhalten werden oder es werden zwei Arten von Signalen gleichzeitig erhalten und können somit nicht als Daten verwendet werden. Es gibt ein weiteres Verfahren in Bezug auf das Verfahren u. Ä. für das Einstellen der Konzentration der wässrigen Lösung zum Verringern der defekten Kügelchen, in der zwei Arten von Vorlage-DNA repliziert wurden, und das Auswählen der Kügelchen, in denen die Vorlage-DNA immobilisierte Kügelchen waren und in denen die Vorlage-DNA nicht immobilisiert war; somit kann die Gültigkeit der vom Array-Spot erhaltenen Daten verbessert werden. Hierbei handelt es sich aber um eine allgemein bekannte Technologie in der Emulsions-PCR und das Vorhandensein oder Fehlen der Verwendung dieser Technologien ist nicht spezifisch auf die vorliegende Ausführungsform beschränkt.
  • Die vorliegende Ausführungsform zeigt ein Beispiel, in dem die Vorlage-DNA vorab auf der Oberfläche der Kügelchen durch Emulsions-PCR verstärkt wurde, und die auf dem Array-Spot immobilisierte Vorlage-DNA, auf dem die Kügelchen durch eine Aminogruppe oberflächenmodifiziert wurden, wurde durch Fluoreszenzmessung analysiert. Es kann aber ebenfalls ein Paket der Kügelchen mit dem Harzsubstrat in der Analyse der Kügelchen verwendet werden, welche die Vorlage-DNA auf der Oberfläche durch Emulsions-PCR verstärkten. Beispielsweise werden das Harzsubstrat (ohne das Laden der funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen, beispielsweise die in der Durchlaufzelle angeordnete Form), in dem die Kügelchen-Lagepositionen des zweidimensionalen Arrays aufgrund des auf der Oberfläche gebildeten unregelmäßigen Musters angeordnet sind, und das Paket der oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen (beispielsweise die Flüssigkeit, in der die Kügelchen verteilt sind) dem Anwender separat zur Verfügung gestellt; die oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen des Pakets werden zum Verstärken der Vorlage-DNA, die der Gegenstand der Analyse ist, auf den Kügelchen vorab durch Emulsions-PCR verwendet. Ohne Zuführen der das Reagens 703 enthaltenden Vorlage-DNA-Kügelchen zur Durchlaufzelle wird eine Zentrifugalkraft u. Ä. zum Bilden der Spot-Array-Substanz durch Einpassen in die Kügelchen-Lagepositionen des Substrats verwendet und dies kann zum Durchführen der Analysen verwendet werden. In diesem Fall muss der Anwender ebenfalls den Schritt zum Laden der Kügelchen selbst durchführen; das Basiselement selbst aber wird zu geringen Kosten hergestellt und der Vorteil, dass der Anwender eine kostengünstige Analyse durchführen kann, bleibt somit erhalten.
  • Fünfte Ausführungsform
  • Die fünfte Ausführungsform stellt ein weiteres Beispiel der Analyse dar, welche die Durchlaufzelle verwendet, die das Spot-Array-Substrat umfasst.
  • 17 zeigt eine schematische Zeichnung zur Darstellung eines Konfigurationsbeispiels der in der vorliegenden Ausführungsform verwendeten Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung. Ein aus Harz hergestelltes Spot-Array-Substrat wird in eine Durchlaufzelle 901 eingebracht. Die durch den Lösungseinlauf der Durchlaufzelle 901 eingeführte Lösung benetzt die Oberfläche des Spot-Array-Substrats und wird aus dem Lösungsauslauf in einem Abfallflüssigkeitsbehälter entsorgt. Die Kügelchen-Lagepositionen des Cycloolefin-Substrats, in dem das unregelmäßige Muster durch den konvexen Teil der dicht angeordneten Rauten und die Form der den konvexen Teil umgebenden Nut gebildet wurde, werden als das Spot-Array-Substrat verwendet; insbesondere wurde ein Substrat, in dem oligo-DNA-oberflächenmodifizierte Kügelchen 915 durch die Zentrifugalkraft in der Schnittpunktposition der das Rautenmuster umgebenden Nut eingepasst wurden, verwendet. Das Basismaterial der Kügelchen ist Silica. Ferner verwendeten die Kügelchen ein Silica, in dem die Partikelgrößenverteilung CV 3 % beträgt, und die Füllrate der Kügelchen in die Kügelchen-Lagepositionen des Spot-Array-Substrats betrug 95 %. Die Vorlage-DNA mit einer unbekannten Sequenz in wenigstens dem Teil, welcher der Gegenstand der Analyse war, wurde auf dem mit einer Oligo-DNA oberflächenmodifizierten Array-Spot immobilisiert und anschließend auf dem Spot repliziert, das Replikat der Vorlage-DNA wurde durch Fluoreszenzmessung analysiert und die Basensequenz wurde decodiert.
  • Wie in der ersten bis vierten Ausführungsform beschrieben können das Harzsubstrat, in das die Kügelchen-Lagepositionen des zweidimensionalen Array mit dem auf der Oberfläche gebildeten unregelmäßigen Muster angeordnet wurden, und die mit einer Oligo-DNA oberflächenmodifizierten Kügelchen dem Anwender separat zur Verfügung gestellt werden und der Anwender passt die Kügelchen in die Kügelchen-Lagepositionen des Substrats ein, um das Funktionsgruppen-Spot-Array-Substrat zu bilden, und verwendet dieses Substrat.
  • Die Temperatursteuerung der Durchlaufzelle 901 ist durch eine Temperatureinstellfunktion 912 möglich. Ferner wird eine Reaktionsreagenseinheit 902 zum Bereitstellen der Reaktionsreagenzien installiert und auf einer niedrigen Temperatur gehalten, bei der die Enzymreaktion im Reagens nicht fortschreitet, sowie mit Rohrleitungen mit der Durchlaufzelle 901 verbunden. In der vorliegenden Ausführungsform können fünf Arten von Reagenzien 903 bis 906 und 914 durch die Reaktionsreagenseinheit 902 bereitgestellt werden. Das Reagens 903 enthält das Material (mit komplementärer Sequenz gebundene Vorlage-DNA 916), das die Vorlage-DNA mit einer unbekannten Sequenz in wenigstens dem Teil, welcher der Gegenstand der Analyse ist, an die Oligo-DNA (bekannte Sequenz) auf dem Array-Spot zur komplementären Sequenz bindet. Das Reagens 914 umfasst dATP, dGTP, dCTP, dTTP und ein Enzym und ist ein Reagens zum Replizieren auf dem Array-Spot. Das Reagens 904 umfasst dATP-Fluoreszenzfarbstoff 1, dGTP-Fluoreszenzfarbstoff 2, dCTP-Fluoreszenzfarbstoff 3, dTTP-Fluoreszenzfarbstoff 4, einen Primer einer zur Oligo-DNA (bekannte Sequenz) auf dem Array-Spot komplementären Sequenz und das Dehnungsreaktionsenzym. Das Reagens 905 ist ein Farbstoff-Bindungsspaltungsreagens zum Spalten der Bindung zwischen den vier Arten von dNTP und dem Fluoreszenzfarbstoff. Das Reagens 906 ist eine Elektrolytlösung. Ferner wurden auf die gleiche Weise wie bei der vierten Ausführungsform Isopropylalkohol 907 und eine Elektrolytlösung 908,die das Äquivalent des Reagens 906 ist, getrennt vorbereitet. Isopropylalkohol 907 wird im Lösungsersatz in der Durchlaufzelle 901 verwendet und es kann ein anderer Alkohol wie Ethylalkohol verwendet werden.
  • Eine Lichtquelle 909 zum Erregen von jeder Art von im Reagens 904 enthaltenem Fluoreszenzfarbstoff, ein optisches System 910 zum Messen der Fluoreszenz von den verschiedenen Farbstoffen und ein Fotodetektor-Array 911 sind oberhalb der Durchlaufzelle 901 angeordnet. Die vom Fotodetektor-Array 911 empfangenen optischen Signale werden in elektrische Signale zur Übertragung zur Analysevorrichtung 913 für das Analysieren der Fluoreszenz umgewandelt. Die Analysevorrichtung 913 führt Analysen wie die Unterscheidung der Basen von den übertragenen Signalen und das Verbinden von Fragmentdaten durch und decodiert die Basensequenz des Nukleinsäurepolymers. Auf die gleiche Weise wie bei der vierten Ausführungsform sind verschiedene Auswahlen der Fluoreszenzfarbstoffe 1 bis 4 im Reagens 904 enthalten und können somit zum Auswählen eines geeigneten Farbstoffs verwendet werden. Ferner kann eine geeignete Wellenlänge von der Lichtquelle 909 zum wirksamen Erregen dieser Fluoreszenzfarbstoffe durch die Auswahl dieser Farbstoffe ausgewählt werden.
  • Zunächst wurde Isopropylalkohol 907 durch den Einlauf der Durchlaufzelle 901 durch einen manuellen Vorgang mit einer Pipette eingespritzt, und nach dem Überprüfen, dass keine Luftblasen vorhanden waren, wurde der Isopropylalkohol 907 durch die Elektrolytlösung 908 durch einen manuellen Vorgang mit einer Pipette ersetzt. Anschließend wurde die Durchlaufzelle 901 in die Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung mit der in die Zelle gefüllten Elektrolytlösung 908 und ohne Luftblasen gesetzt.
  • Anschließend wurde das die mit der komplementären Sequenz gebundene Vorlage-DNA 916 enthaltende Reagens 903 automatisch in die Durchlaufzelle 901 durch eine Lösungszufuhreinheit eingespritzt, die Lösungszufuhreinheit wurde in diesem Zustand gestoppt, das Reagens 903 wurde auf die optimale Temperatur gebracht, 10 Minuten stehen gelassen und auf dem oligo-DNA-modifizierten Spot-Array immobilisiert. Da das Material des Substrats hydrophob war, wurde kein Nachweis festgestellt, dass die mit der komplementären Sequenz gebundene Vorlage-DNA 916 nicht ausschließlich im Spot-Array adsorbiert wurde, und die nichtspezifische Adsorption stellte kein Problem dar. Anschließend wurde eine geeignete Temperatur eingestellt, das Reagens 914 zum Replizieren auf dem Array-Spot wurde der Durchlaufzelle zugeführt, das Zuführen der Lösung wurde in diesem Zustand gestoppt, die optimale Temperatur wurde zum Wiederholen der Dehnungsreaktion und der Denaturierung eingestellt und die Vorlage-DNA wurde auf dem Array-Spot repliziert. 95 % des während der Herstellung oligo-DNA-modifizierten Spot-Array-Materials (oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen 915) wurde in das in der Durchlaufzelle 901 integrierten Cycloolefin-Substrat eingebettet. Darunter konnte die mit der komplementären Sequenz gebundene Vorlage-DNA 916 in einem bestimmten Anteil von Spots, der durch die Wahrscheinlichkeitstheorie bestimmt wurde, immobilisiert werden. In diesem Fall ist die Konzentration der Vorlage-DNA im Reagens 903 verschieden. Anschließend wurde eine geeignete Temperatur eingestellt, das Reagens 904 wurde der Durchlaufzelle zugeführt, mit einem Primer hybridisiert und die Dehnungsreaktion wurde mit einem Enzym durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt, da das dNTP im Reagens vom Fluoreszenzfarbstoff beendet wurde, wurde nach dem Durchführen der Dehnungsreaktion am ersten Basentyp der Vorlage-DNA die Reaktion gestoppt. Anschließend wurde das Erregerlicht von der Lichtquelle 909 ausgestrahlt und zu diesem Zeitpunkt wurde die ausgestrahlte Fluoreszenz vom optischen System 910 und vom Fotodetektor-Array 911 gemessen.
  • 18 zeigt ein Beispiel des Messergebnisses der durch Erregen mit der Lichtquelle 909 nach dem Durchführen einer Dehnungsreaktion einer der Array-Spots auf dem in der Durchlaufzelle 901 integrierten Cycloolefin-Substrat ausgestrahlten Fluoreszenz. Da die Fluoreszenz des an dATP gebundenen Fluoreszenzfarbstoffs 1 in den ersten Daten 1001 verifiziert wurde, wurde die erste Base als T decodiert. Anschließend wurde der Farbstoff bei einer geeigneten Temperatur vom das Farbstoff-Bindungsspaltungsreagens zum Spalten der Bindung zwischen den vier Arten von dNTP und den Fluoreszenzfarbstoffen umfassenden Reagens 905 gespalten und nach dem Waschen der Flüssigkeit in der den gespaltenen Farbstoff enthaltenden Durchlaufzelle mit der Elektrolytlösung des Reagens 906 wurde das Reagens 904 erneut automatisch eingespritzt und die zweite oder folgende Analyse der Basen wurde auf die gleiche Weise wiederholt. Wie in 18 dargestellt wurde die Messung bis zum fünften Mal (bis zur fünften Base) wiederholt und als ein Ergebnis konnte die Anordnung der Basen bis zur fünften Base vom Anschlussstück der Oligo-DNA auf den oligo-DNA-modifizierten Kügelchen in einer der ausgewählten Array-Spots als TCATG decodiert werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform muss das Replikat der auf dem einen Array-Spot, der durch die Oligo-DNA modifiziert wurde, immobilisierten Vorlage-DNA das Replikat von einer Art der Vorlage-DNA sein. Im Replikat auf dem Array-Spot, der durch die Oligo-DNA modifiziert wurde, gibt es mit der Ausnahme, dass die auf einem Spot replizierte Vorlage-DNA eine Art ist, in Bezug auf die Wahrscheinlichkeit Fälle, in denen der Spot, in dem die Vorlage-DNA nicht immobilisiert werden konnte und in denen zwei verschiedene Arten von Vorlage-DNA auf einem Spot repliziert wurden als defekte Kügelchen vorhanden sind. In diesen Fällen konnten die Signale der Basen nicht erhalten werden oder es werden zwei Arten von Signalen gleichzeitig erhalten und können somit nicht als Daten verwendet werden. Ein weiteres Verfahren in Bezug auf das Verfahren u. Ä. für das Einstellen der Konzentration der wässrigen Lösung zum Verringern der defekten Spots, in denen zwei Arten von Vorlage-DNA repliziert wurden, und zum Immobilisieren der Vorlage-DNA zum Spot, in dem die Vorlage-DNA nicht immobilisiert werden konnte, wurde vorgeschlagen und somit kann die die Gültigkeit der vom Array-Spot erhaltenen Daten verbessert werden. Beispielsweise kann das in US 2012/0156728 A1 usw. verwendete Verfahren als das Protokoll für das Replikat auf dem Substrat der Vorlage-DNA verwendet werden. Die vorliegende Ausführungsform ist nicht spezifisch auf die Details der Replikattechnologie auf diesen Substraten beschränkt und die Details des Protokolls sind nicht spezifisch dargestellt.
  • In der vierten und fünften Ausführungsform wird die Durchlaufzelle, die das Spot-Array-Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung umfasste, zum Durchführen des Replikats auf den Kügelchen durch Emulsions-PCR und des Replikats auf dem Array-Spot des Substrats sowie Decodieren der DNA, welche die teilweise unbekannte Basensequenz, die der Gegenstand der Analyse ist, enthält, verwendet; selbstverständlich kann die Durchlaufzelle, die das Spot-Array-Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, zum Decodieren nicht nur von DNA, sondern auch von anderen Nukleinsäurepolymeren wie RNA verwendet werden.
  • Ferner werden in den Zeichnungen entsprechend der Erläuterung der vorliegenden Erfindung symbolisch ein Zeichen eines Heizdrahts und ein Zeichen einer konvexen Linse in der Temperatureinstellfunktion und im optischen System verwendet. Die Temperatureinstellfunktion umfasst aber ebenfalls Funktionen zum Kühlen wie Luftkühlung, Wasserkühlung und ein Kühlelement und kann auf eine feste Temperatur durch ein allgemeines Temperatursteuerverfahren wie die PID-Steuerung gesteuert werden, und das optische System weist eine andere Lichttrennfunktion wie ein Spektrometer und ein Farbfilter als eine konvexe Linse auf; somit kann die Farbe der Fluoreszenz selbstverständlich unterschieden werden.
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die zuvor beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern umfasst verschiedene Modifizierungen. Die zuvor beschriebenen Ausführungsformen wurden ausführlich zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung erläutert und sind nicht auf diese umfassend alle zuvor beschriebenen Konfigurationen beschränkt. Ein Teil der Konfiguration einer Ausführungsform kann mit dem einer anderen Ausführungsform ersetzt werden; und die Konfiguration einer Ausführungsform kann in die Konfiguration einer anderen Ausführungsform integriert werden. Ein Teil der Konfiguration von jeder Ausführungsform kann hinzugefügt, entfernt oder durch den einer anderen Konfiguration ersetzt werden.
  • Bezugszeichenliste
    • 204
    Harzsubstrat
    207
    Zentrifuge
    208
    aminogruppen-oberflächenmodifizierte magnetische Kügelchen
    210
    Magnet
    304
    konvexer Teil
    305
    Form
    306
    Harzsubstrat
    405
    Zentrifuge
    701
    Durchlaufzelle
    702
    Reaktionsreagenseinheit
    709
    Lichtquelle
    710
    optisches System
    711
    Fotodetektor-Array
    712
    Temperatureinstellfunktion
    713
    Analysiervorrichtung
    714
    oberflächenmodifizierte Aminogruppen-Kügelchen
    715
    Kügelchen, die ein Replikat der Vorlage-DNA auf der Oberfläche bildeten
    915
    oligo-DNA-oberflächenmodifizierte Kügelchen
    916
    mit Komplentärsequenz gebundene Vorlage-DNA

Claims (11)

  1. Spot-Array-Substrat umfassend: ein Harzsubstrat (204) mit einer Oberfläche, auf der ein unregelmäßiges Muster ausgebildet ist, das eine Vielzahl von konkaven Teilen aufweist, und eine Vielzahl von in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen; und auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats (204) geladene oberflächenmodifizierte Kügelchen, wobei ein loses Material der oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) einen kleineren Wärmedehnungskoeffizienten aufweist als das Material des Harzsubstrats (204), wobei ein Wärmeausdehnungskoeffizient eines Materials von des Harzsubstrat in einem Bereich von 10-5 bis 10-4 /°C liegt, wobei die mehreren Kügelchen-Lagepositionen Schnittpunkte der Vielzahl von konkaven Teilen, die in dem Harzsubstrat vorgesehen sind, sind, wobei eine Epoxygruppe als Film nur an Innenflächen der jeweiligen Vielzahl von konkaven Teilen des Harzsubstrats angeordnet ist, wobei die jeweiligen oberflächenmodifizierten Kügelchen, die in die Kügelchen-Lagepositionen geladen sind, physisch durch innere Oberflächen der konkaven Teile der Kügelchen-Lagepositionen geklemmt werden, die physisch zusammengezogen sind, und wobei die oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) funktionsgruppen-oberflächenmodifizierte Kügelchen sind oder wobei die oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) oligo-DNA-oberflächenmodifizierte Kügelchen sind.
  2. Herstellungsverfahren für das Spot-Array-Substrat umfassend: einen Schritt zum Vorbereiten des Harzsubstrats (204) mit einer Oberfläche, auf der ein unregelmäßiges Muster ausgebildet ist, das eine Vielzahl von konkaven Teilen aufweist, und eine Vielzahl von in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen; und einen Schritt zum Laden von oberflächenmodifizierten Kügelchen auf die Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats (204), wobei ein Wärmeausdehnungskoeffizient eines Materials von des Harzsubstrat in einem Bereich von 10-5 bis 10-4 /°C liegt, wobei die mehreren Kügelchen-Lagepositionen Schnittpunkte der Vielzahl von konkaven Teilen, die in dem Harzsubstrat vorgesehen sind, sind, wobei eine Epoxygruppe als Film nur an Innenflächen der jeweiligen Vielzahl von konkaven Teilen des Harzsubstrats angeordnet ist, wobei die jeweiligen oberflächenmodifizierten Kügelchen, die in die Kügelchen-Lagepositionen geladen sind, physisch durch innere Oberflächen der konkaven Teile der Kügelchen-Lagepositionen geklemmt werden, die physisch zusammengezogen sind, wobei die oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) funktionsgruppen-oberflächenmodifizierte Kügelchen sind oder wobei die oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) oligo-DNA-oberflächenmodifizierte Kügelchen sind.
  3. Herstellungsverfahren für das Spot-Array-Substrat nach Anspruch 2, wobei das Laden unter Verwendung einer Zentrifugalkraft im Schritt zum Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats (204) des Harzsubstrats (204) erfolgt.
  4. Herstellungsverfahren für das Spot-Array-Substrat nach Anspruch 2, wobei die oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) magnetische Kügelchen sind, und im Schritt zum Laden der magnetischen Kügelchen (208) auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats (204) das Laden durch Anwenden einer magnetischen Kraft auf die magnetischen Kügelchen (208) von der Rückseite des Harzsubstrats (204) erfolgt.
  5. Herstellungsverfahren für das Spot-Array-Substrat nach Anspruch 2, wobei der Schritt zum Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats (204) einen ersten Schritt zum Laden der oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) auf den Kügelchen-Lagepositionen in einem Zustand, in dem das Harzsubstrat (204) zur Wärmedehnung des Harzsubstrats (204) erwärmt wird, und einen zweiten Schritt zum Absenken der Temperatur des Harzsubstrats (204) und Zusammenziehen des Harzsubstrats (204), um ein Herausfallen der auf den Kügelchen-Lagepositionen geladenen Kügelchen (208) zu erschweren, umfasst.
  6. Herstellungsverfahren für das Spot-Array-Substrat nach Anspruch 5, wobei ein loses Material der oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) einen kleineren Wärmedehnungskoeffizienten aufweist als das Material des Harzsubstrats (204).
  7. Spot-Array-Substrat-Herstellungspaket umfassend: ein Harzsubstrat (204) mit einer Oberfläche, auf der ein unregelmäßiges Muster ausgebildet ist, und eine Vielzahl von in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen; und auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats (204) geladene oberflächenmodifizierte Kügelchen, wobei die oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) funktionsgruppen-oberflächenmodifizierte Kügelchen sind oder wobei die oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) oligo-DNA-oberflächenmodifizierte Kügelchen sind; und wobei ein loses Material der oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) einen kleineren Wärmedehnungskoeffizienten aufweist als das Material des Harzsubstrats (204).
  8. Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung umfassend: eine Durchlaufzelle, in der das Spot-Array-Substrat nach Anspruch 1 integriert ist; eine Reagensversorgungseinheit zum selektiven Versorgen der Durchlaufzelle mit einer Vielzahl von Reagenzien umfassend ein Reaktionsreagens umfassend einen Fluoreszenzfarbstoff, der die Basen eines DNA-Moleküls unterscheiden kann, ein Reaktionsreagens, das einen Farbstoff von dNTP abschneiden kann und ein Waschreagens zum Waschen in der Durchlaufzelle; eine Temperatursteuereinheit zum Steuern der Temperatur der Durchlaufzelle; eine Lichtquelle (709) zum Ausstrahlen von Erregerlicht auf das Spot-Array-Substrat; einen Fotodetektor-Array zum Messen der von jeder Kügelchen-Lageposition des Spot-Array-Substrats erzeugten Fluoreszenz; und eine Analysevorrichtung zum Analysieren der Ermittlungssignale vom Fotodetektor-Array.
  9. Nukleinsäurepolymer-Analysevorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Reagensversorgungseinheit ein Reaktionsreagens umfasst, das ein DNA-Molekül replizieren kann.
  10. Analyseverfahren für ein Nukleinsäurepolymer umfassend: einen ersten Schritt zum Immobilisieren von durch Replizieren vorab auf einer Oberfläche der von einer Probe, die Gegenstand der Analyse ist, abgeleiteten Vorlage-DNA vorbereiteten Vorlage-DNA-Kügelchen (208) auf den funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) des Spot-Array-Substrats nach Anspruch 1; einen zweiten Schritt, in dem das Reagens umfassend den Fluoreszenzfarbstoff eine Dehnungsreaktion von einer Base der Vorlagen-DNA auf den auf den funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) immobilisierten Vorlage-DNA-Kügelchen durchführt; einen dritten Schritt zum Messen von den Kügelchen-Lagepositionen des Spot-Array-Substrats durch Ausstrahlen des Erregerlichts nach der Reaktion erzeugten optischen Signalen; einen vierten Schritt zum Spalten des Fluoreszenzfarbstoffs von den Basen, in denen optische Signale gemessen werden; einen fünften Schritt zum Waschen der Lösung umfassend den gespaltenen Fluoreszenzfarbstoff; und einen sechsten Schritt zum Analysieren der im dritten Schritt erhaltenen optischen Signale zum Ermitteln der Basensequenz der Vorlage-DNA.
  11. Analyseverfahren für ein Nukleinsäurepolymer umfassend: einen ersten Schritt zum Laden einer der funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) oder der oligo-DNA-oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) auf den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats (204) mit einer Oberfläche, auf der ein unregelmäßiges Muster ausgebildet ist, und eine Vielzahl von in einem zweidimensionalen Array im unregelmäßigen Muster angeordneten Kügelchen-Lagepositionen; einen zweiten Schritt zum Immobilisieren von durch Replizieren vorab auf einer Oberfläche der von einer Probe, die Gegenstand der Analyse ist, abgeleiteten Vorlage-DNA vorbereiteten Vorlage-DNA-Kügelchen auf den funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen (208); einen dritten Schritt, in dem das Reagens umfassend den Fluoreszenzfarbstoff eine Dehnungsreaktion von einer Base der Vorlagen-DNA auf den auf den funktionsgruppen-oberflächenmodifizierten Kügelchen (208) immobilisierten Vorlage-DNA-Kügelchen durchführt; einen vierten Schritt zum Messen der von den Kügelchen-Lagepositionen des Harzsubstrats (204) durch Ausstrahlen des Erregerlichts nach der Reaktion erzeugten optischen Signale; einen fünften Schritt zum Spalten des Fluoreszenzfarbstoffs von den Basen, in denen optische Signale gemessen werden; einen sechsten Schritt zum Waschen der Lösung umfassend den gespaltenen Fluoreszenzfarbstoff; und einen siebten Schritt zum Analysieren der im vierten Schritt erhaltenen optischen Signale zum Ermitteln der Basensequenz der Vorlage-DNA.
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