DE10100819C2 - Herstellungsverfahren für Mikroträger und Prüfverfahren mit den Mikroträgern - Google Patents

Herstellungsverfahren für Mikroträger und Prüfverfahren mit den Mikroträgern

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt und Prüfen biologischer und genetischer Informationen sowie insbeson­ dere einen Träger und ein Prüfverfahren zur Identifizierung von DNA, Proteinen und anderer komplementärer Substanzen.
Die Biotechnologie hat sich in jüngster Zeit heftig ent­ wickelt, und es werden Produkte mit Hilfe der Molekularbio­ logie, biologischen Zellen und Metaboliten hieraus herge­ stellt. Sie kann weithin in der Pharmazie verwendet werden, für Pestizide, im Umweltschutz, für Verfahrensentwicklungen und in der Aquakultur.
Ein Trend ist das Zusammenbringen von Biotechnologie und elektrotechnischen Verfahren. Als besonders heiß gelten Biochips und DNA-Chips, oft auch Genchips genannt. Neben Silicium umfassen die Chip-Werkstoffe absorbierende Sub­ stanzen wie Glas, pflanzliche Cellulose, Gel und organische Polymere. Auf dem Genchip sind unterschiedliche Genfrag­ mente geordnet angeordnet, wobei auf einen nur fingernagel­ großen Chip oft viele tausende verschiedene Genfragmente aufgebracht werden. Der Anwender kann je nach Anwendungs­ zweck unter verschiedenen Genchips wählen.
Das Prinzip der vorgenannten Chips besteht darin, Gruppen von unterschiedlichen Genfragmenten auf den Chip aufzu­ bringen und dann den Chip in eine Lösung mit unbekannten Fluoreszenz-markierten Genen zu tauchen. Passt ein fluores­ zierend markiertes Gen mit einem spezifischen Genfragment auf dem Chip zusammen, kommt es zu einer komplementären Vereinigung und auf dem Chip ist unter dem Mikroskop ein Fluoreszenzsignal zu sehen. Man kann so ein nicht bekanntes Gen durch die komplementäre Sequenzen auf dem Chip identi­ fizieren.
Für die Massenanwendung müssen viele tausend Genfragmente oder Proteine auf dem Chip aufgebracht werden. Dabei sind Verwechslungen mit anderen Genfragmenten oder Proteinen zu vermeiden, bspw. wenn die Anordnungspunkte auf dem Chip sehr eng werden. Die Flecken auf dem Chip müssen also präzise angeordnet werden. Die präzise Anordnung verlangt wiederum eine teure Ausrüstung, was die Anwendung des Chip behindert. Es besteht daher Bedarf für die Schaffung von Biomolekül-Datenbanken und entsprechenden Testverfahren, die bei geringen Kosten noch effizienter und breiter ein­ gesetzt werden können.
Die JP 09292395 A offenbart ein Messverfahren für Mikro­ bereiche sowie einen Mikroträger. Gemäß dieser Druckschrift werden beschichtete und mit Antikörpern versehene Poly­ styrolkugeln auf einen Mikroträger aufgebracht. Zum Detek­ tieren von Protein auf der Oberfläche einer Zelle wird die Fluoreszenz derjenigen Seite der Mikrokugeln gemessen, die keine Beschichtung erfahren hat.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein bequemes, kostengünstiges und schnelles Verfahren für die Herstellung eines Mikroträ­ gers für Biomoleküle wie Gene oder Proteine bereitzustellen sowie ein Verfahren zum Prüfen von Biomolekülen mit Hilfe von Mikroträgern.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Prüfverfahrens zur Identifizierung von Biomolekülen, wobei die Zahl und Art der Mikroträger frei wählbar sein soll.
Erfindungsgemäß werden Strichcodes mit Hilfe eines Verfah­ rens für integrierte Schaltungen auf eine Maske aufge­ bracht. Es folgt eine Belichtung des photolithographisch mit einem Photoresist beschichteten Substrats. Nach dem Ätzen und Entfernen des anhaftenden Photoresists bleibt der gewünschte Strichcode auf dem Substrat zurück und es wird dann elektrisch eine Nickelplatierung aufgebracht. Vor oder nach der Beschichtung mit einem Biomoleküle bindenden Mate­ rial wird ein Kügelchen (mit Hilfe eines sogenannten Q-Bots bzw. eines multifunktionellen Microarray-Roboters) zwischen zwei Nickelplatten angeordnet und der Strichcode durch Heiß­ pressen auf die Oberfläche des Kügelchens übertragen. Man hat dann ein mit einem Strichcode versehenes, plätzchen­ artiges Mikroteilchen. Danach wird jedes der Teilchen wie erwähnt mit den entsprechenden Genen oder Proteinen zusam­ mengebracht und eine größere Menge markierter Mikroträger hergestellt. Für die beschriebenen Prüfverfahren auf Bio­ moleküle benötigt man eine große Anzahl Mikroträger, die mit markierten, bspw. Fluoreszenz-markierten unbekannten Biomolekülen zusammengebracht werden. Die Hybridisierungs­ stärken der mit Fluoreszenz- oder anderen Markern versehe­ nen unbekannten Biomoleküle können dann über den Strichcode auf dem Mikroträger und einem Bilderkennungssystem identi­ fiziert und bestimmt werden.
Die Erfindung und deren Vorteile werden nun an Beispielen und mit Bezug auf die beiliegende Zeichnungen beschrieben.
Es zeigt:
Fig. 1 eine Zeichnung von einem Insert zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikroträger; sowie
Fig. 2 eine Skizze von dem Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikroträger.
Die Erfindung zeichnet sich aus durch eine Kombination von Biotechnologie und Verfahren zur Herstellung integrierter Schaltungen mit dem Zweck der Herstellung von Mikroträgern für Biomoleküle. Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist ein Prüfverfahren auf unbekannte Biomoleküle mit Hilfe der Mikroträger.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikro­ trägers geht wie folgt: eine Schicht Biomoleküle bindendes Material wie Biotin, Poly-L-lysin etc. wird auf die Ober­ fläche eines Kügelchens gebracht. Die gesuchten einzelnen Biomoleküle wie Gene oder Proteine werden durch Strichcodes beschrieben. Hierzu werden eine Vielzahl Strichcodes mit typischen Verfahren zur Herstellung integrierter Schal­ tungen auf eine Maske aufgebracht und auf ein Substrat, das photolithographisch mit einem Photoresist beschichtet wurde, übertragen. Nach dem Ätzen und dem Entfernen des anhaftenden Photoresists liegt ein Strichcode auf dem Substrat vor und es wird dann eine Nickelplatierung elektrisch aufgebracht. Das vorgenannte Kügelchen wird zwischen zwei Nickelplatten gebracht und der Strichcode, der nach innen schaut, durch Heißpressen auf die Oberfläche der Kügelchen aufgebracht. Man erhält so plätzchenartige Mikroteilchen mit Strichcodes darauf. Vor oder nach dem Aufbringen der Strichcodes wird auf die Teilchen eine Schicht Biomoleküle bindendes Material aufgebracht und schließlich die Teilchen mit den zugehörigen Biomolekülen zusammengebracht. Man erhält so unterschiedlich markierte Mikroträger mit Biomolekülen. Der Anwender erhält dann ein Gefäß mit Strichcode-markierten unterschiedlichen Mikro­ trägern.
Die Bezeichnung "Mikroträger" umfasst Kügelchen, die mit einem Strichcode markiert sind, mit einer Schicht Biomole­ küle bindenden Material beschichtet wurden und entspre­ chende Biomoleküle tragen. Das Material des Kügelchens ist beliebig, unter anderem Silicium, Glas, Pflanzencellulose, Gel oder organische Polymere. Die Größe der Kügelchen reicht von 20 bis 200 Mikrometer, bevorzugt weniger als 100 Mikrometer Durchmesser.
Die verwendeten Biomoleküle umfassen, sind aber nicht be­ grenzt darauf, Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Peptid- Nukleinsäuren (PNA), Antigene, Antikörper, Enzyme oder Proteine. In dem Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Teilchen kann man alternativ auch halbkugelförmige Teilchen herstellen. Hierzu werden Teilchen zwischen zwei Nickel­ platten angeordnet, eine UV-photosensitive Mizelle, bspw. aus Gummi arabicum, auf die Nickelplatten fallen gelassen und dann durch UV-Bestrahlung gehärtet.
Zusätzlich kann ein plätzchenartiges Muster und ein Strich­ code gleichzeitig auf eine Maske, wie in Fig. 1 gezeigt, strukturiert werden, gefolgt von einem Ätzen, so dass man eine Form erhält. Das plätzchenartige Teilchen kann so spritzgegossen oder heißgepresst werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Prüfen unbekannter Biomoleküle mit Hilfe der vorgenannten Mikroträger. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Bereitstellen eines Gefäßes mit zahl­ reichen Strichcode-Mikroträgern, das Zugeben markierter, beispielsweise Fluoreszenz-markierter unbekannter Bio­ moleküle in das Gefäß und Mischen, das heißt Hybridisieren oder Umsetzen, so dass ein Signal, beispielsweise ein Fluoresenzsignal erhalten wird, ist der Mikroträger kom­ plementär mit bzw. erkennt er die unbekannten Biomoleküle; Überführen der Mikroträger von dem Gefäß auf einen Objektträger, wobei über den Objektträger ein mit einem Computer verbundenes Mikroskop angeordnet ist; und Identifizieren des Strichcodes auf signalgebenden Mikro­ trägern mit einem Bilderkennungssystem und Identifizieren des unbekannten Biomoleküls. Neben dem Strichcode zur Identifizierung der Biomoleküle können erfindungsgemäß auch die Form, die Größe oder die Farbe des Trägers, etc. als Codes verwendet werden, so dass die Mikroträger auch Kategorien klassifiziert werden können wie beispielsweise die Form (1): das vorgenannte Kugelteilchen kann ein Recht­ eck oder Polygon sein. So können beispielsweise bestimmte Längen oder Breiten ein bestimmtes Biomolekül darstellen, beispielsweise können Dreiecke oder Polygone mit unter­ schiedlichen Seitenlängen unterschiedliche Biomoleküle darstellen. (2) Größe. Ein großes Kugelteilchen kann beispielsweise für ein Biomolekül stehen und ein kleines für ein anderes. Der Durchmesser der Kugel kann ein weiterer Biomolekülmarker sein. (3) Farbe. Es können auch verschiedene Farben für die Darstellung von Biomolekülen verwandt werden. Beispielsweise können Rot, Gelb, Blau und Weiß für verschiedene Biomoleküle stehen. So kann ein jeder Mikroträger mit Hilfe eines Mikroskops, ausgestattet mit einem Computer und einem Bilderkennungssystem, identifi­ ziert und ausgewertet oder gezählt werden.
Das Insert 10 des vorgenannten Trägers kann unterschied­ liche Formen und/oder Größen aufweisen. Es wird photolitho­ graphisch hergestellt, wie in Fig. 1 gezeigt. Es folgt dann ein Spritzguss oder Heißpressen. Die resultierenden Teilchen 12 bleiben im Insert 10 aufgrund ihrer sehr ge­ ringen Größe eingekeilt. Das Insert 10 wird negativ elek­ trisch geladen und die Teilchen 12 auf eine positiv auf­ geladene Sammelplatte 14 (siehe Fig. 2) überführt. Die Äste oder Detouren zwischen den Teilchen können durch Presswalzen gebrochen werden. Haben die Teilchen abge­ brochene Äste, so können die Äste mit Hilfe einer Software zur Identifizierung verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren benötigen keine teure Ausrüstung und auch ein kleines Labor kann flexibel die Zahl und die Art der bekannten Mikroträger anpassen. Muss man beispielsweise auf fünf bekannte Biomoleküle unter­ suchen, so muss man nur fünf Gefäße von Mikroträgern mit Strichcodes herstellen und diese in einem Gefäß mischen. Andererseits weisen herkömmliche Biochips auch nur eine begrenzte Zahl an Genen auf, beispielsweise 10000 Gene pro Chip. Benötigt der Benutzer nur fünf Gene, so kann der Hersteller wegen der Kosten diesen Chip nicht anwenderge­ recht herstellen. Somit bietet das erfindungsgemäße Ver­ fahren erhebliche Vorteile hinsichtlich Flexibilität, Kosten und Bequemlichkeit. Auch vergleichsweise kleine Laboratorien können einen Biomolekültest selbst einrichten.
Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich weithin anwenden und ist eine Bereicherung der Biotechnologie. Die Erfindung wurde mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrie­ ben. Gegenstand der Erfindung und beanspruchter Schutz­ bereich ergeben sich aus den nachstehenden Ansprüchen.

Claims (10)

1. Verfahren zur Herstellung eines Mikroträgers für Biomoleküle, umfassend
das Herstellen von Kugeln und Beschichten der Kugel mit einer Schicht Biomoleküle bindenden Mate­ rials;
das Strukturieren einer Vielzahl Strichcodes auf einer Maske mit Verfahren für die Herstellung integ­ rierter Schaltungen, wobei der Strichcode das gesuchte Biomolekül angibt;
das Belichten von Strichcodes auf ein Substrat, welches photolithographisch mit einem Photoresist be­ schichtet wurde;
das Ätzen und Entfernen verbliebenen Photo­ resists, so dass ein Strichcode auf dem Substrat ausgebildet wird und elektrisches Aufbringen einer Nickelplatierung;
das Anordnen der Kugeln zwischen zwei Nickel­ platten und das Pressen von Strichcodes auf die Ober­ fläche der Kugeln, so dass plätzchenartige Mikro­ teilchen mit einem Strichcode erhalten werden;
das Aufbringen einer Schicht Biomoleküle bin­ dendes Material auf die Teilchen; und
das Zusammenbringen der Teilchens mit den ent­ sprechenden Biomolekülen, wobei Mikroträger mit einer Markierung erhalten werden.
2. Verfahren zur Herstellung von Mikroträgern des Typs von Anspruch 1, wobei die Teilchen aus Kügelchen hergestellt werden, welche zwischen zwei Nickelplatten angeordnet werden, indem eine UV-photosensitive Mizelle auf die Nickelplatten fallengelassen wird, gefolgt von einer UV-Bestrahlung zum Härten.
3. Verfahren zur Herstellung von Mikroträgern des Typs von Anspruch 1, wobei das plätzchenartige Mikroteilchen hergestellt wird durch gleichzeitiges Struktu­ rieren eines plätzchenartigen Musters und eines Strichcodes auf einer Maske, Ätzen und Herstellen einer Form und Spritzgießen oder Heißpressen.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroträger ferner durch Form, Größe oder Farbe kodiert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Biomoleküle um­ fassen Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Peptid-Nuklein­ säure, Antigene, Antikörper, Enzyme oder Proteine.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Biomoleküle bind­ ende Material Biotin oder Poly-L-Lysin umfasst.
7. Prüfverfahren zur Identifizierung eines Biomoleküls, umfassend
das Bereitstellen eines Gefäßes, das mindestens einen Mikroträger mit einem Strichcode hergestellt nach einem der Ansprüche 1-6, enthält;
das Zugeben eines markierten unbekannten Bio­ moleküls zu dem Gefäß und Mischen, so dass ein Signal erhalten wird, wenn der Mikroträger bei der Kombina­ tion mit dem unbekannten Biomolekül komplementär ist;
das Überführen des Mikroträgers in dem Gefäß auf einen Objektträger, wobei über dem Objektträger ein Mikroskop eingerichtet ist; und
das Identifizieren des Strichcodes des signal­ gebenden Mikroträgers und der unbekannten Biomoleküle.
8. Prüfverfahren nach Anspruch 7, wobei das Biomolekül umfasst Nukleinsäure, Oligonukleotide, Peptid-Nuklein­ säure, Antigen, Antikörper, Enzym oder Protein.
9. Prüfverfahren nach Anspruch 7, wobei das Biomolekül­ bindende Material Biotin oder Poly-L-Lysin umfasst.
10. Verfahren zur Identifizierung von unbekannten Biomolekülen, umfassend das Mischen und Zusammenbringen Strichcode-markierter, mit bindenden Biomolekülen be­ schichteter Mikroträger hergestellt nach einem der Ansprüche 1-6, mit unbekannten signalgebenden Biomolekülen und Identifizieren der Strichcodes auf signalgebenden Mikroträgern.
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