DE60107231T2

DE60107231T2 - Verfahren zur herstellung von kodierten teilchen

Info

Publication number: DE60107231T2
Application number: DE60107231T
Authority: DE
Inventors: Amit Kumar Harston SOM; Nigel Guy Harston SKINNER; Susan Louise Harston WATSON
Original assignee: 3D MOLECULAR SCIENCES Ltd; 3D MOLECULAR SCIENCES Ltd HARSTON
Current assignee: 3D MOLECULAR SCIENCES Ltd; 3D MOLECULAR SCIENCES Ltd HARSTON
Priority date: 2000-04-19
Filing date: 2001-04-18
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2021-04-19
Also published as: RU2002130821A; HUP0300488A3; HUP0300488A2; JP2004501344A; WO2001078889A3; DE60107231D1; AU2001293381B2; AU9338101A; EP1276555A2; CA2406635A1; WO2001078889A2; EP1276555B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung kodierter Partikel. Eine von vielen Verwendungsmöglichkeiten für solche Partikel liegt in der Identifizierung der Sequenz von Oligomeren.
In vielen biochemischen und chemischen Verfahren muss die Sequenz eines unbekannten Oligomers bekannter (relativ kurzer) Länge identifiziert werden. Das Oligomer kann aus Nucleotiden (RNA oder DNA), Aminosäuren (Peptiden und Proteinen), Zucker oder irgendeiner anderen oligomerisierbaren chemischen Verbindung bestehen. Das Oligomer kann sogar ein Antikörper/Antigen-Komplex sein, der zum Beispiel in Immunoassays verwendet wird.
Im Hinblick auf Oligonucleotide besteht ein Ansatz darin, den unbekannten (Ziel-) Strang in die Gegenwart aller möglichen (Analyt-) Stränge einer kürzerer Länge zu platzieren. Eine geringe Zahl komplementärer Analytstränge wird sich an den Zielstrang binden, wobei dieses Bindungsereignis durch jedes geeignete Mittel identifiziert werden kann, wie zum Beispiel durch Fluoreszenz, Elektrochemilumineszenz, Chemilumineszenz, Biochemilumineszenz oder Phosphoreszenz. Gemäß einer bestehenden Technologie sind die Analytstränge räumlich auf einer Oberfläche verteilt. Die Sequenz des Analytstrangs ist in ihrem Ort auf der Oberfläche kodiert. Die Identität des Zielstrangs kann daher vom physischen Ort des Bindungsereignisses mit Bezug auf die Oberfläche abgeleitet werden.
Eine alternative Technologie basiert auf kleinen, physikalisch differenzierbaren Kügelchen. Wenigstens ein Analytstrang bekannter Sequenz ist an ein Kügelchen in einer solchen Weise angelagert, dass alle angelagerten Stränge eine identische Sequenz haben. Auf diese Weise ist die Sequenz eines speziellen Strangs von dem speziellen Kügelchen identifizierbar, an das der Strang anlagert. Die Kügelchen werden dann mit dem Zielstrang in Kontakt gebracht, und eine Bindung zwischen dem Zielstrang und einem beliebigen Analytstrang kann mit jedem geeigneten Nachweismittel nachgewiesen werden, wie zum Beispiel durch Fluoreszenz. Die Kügelchen, auf denen ein Bindungsereignis stattfand, können dann von der Masse der Kügelchen getrennt und die Sequenz des Zielstrangs kann von der Sequenz des gebundenen Analytstrangs abgeleitet werden, der durch eine Reihe von Mitteln identifizierbar ist.
Ein Verfahren zur Herstellung maschinenlesbarer Kügelchen wird in der GB-A-2334347 und GB-A 2 306 484 beschrieben. Die Anmeldung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung kodierter Partikel, umfassend die folgenden Schritte:

– Beschichten einer Fläche eines Wafers aus Silizium oder einem ähnlichen kristallinen Material oder inertem Metall oder einer Metalllegierung mit einem Fotoresist-Polymer;
– Aussetzen der beschichteten Fläche des Wafers einer UV-Strahlung durch eine fotolithographische Maske, wobei die Maske die Partikelgröße und/oder die Position von Kodestellen auf dem Partikel definiert;
– Auflösen oder anderweitig Entfernen der UV-belichteten oder der nicht UV-belichteten Bereiche des Fotoresist-Polymers;
– Ätzen der belichteten Bereiche des Wafers, von denen das Fotoresist-Polymer entfernt wurde, mit einem geeigneten Ätzmittel; und
– Freisetzen der Partikel.

Eine Schwierigkeit bei beiden diesen Systemen besteht darin, Analytstränge so herzustellen, dass sie anschließend identifiziert werden können.
Die Anwendung solcher maschinenlesbarer Kügelchen auf die Lebenswissenschaften (kombinatorische Chemie, Proteomik, Genomik, Pharmakogenomik) setzt die weitere Derivatisierung geeigneter Liganden (Antikörper, Antigene, Oligonucleotide, usw.) voraus, oft zusammen mit der Zugabe von Markierungschemikalien (z. B. Fluorophore, Rutheniumsalze). Polymere liefern ein erwünschtes Substrat für viele solche Anwendungen, und die Kügelchen verbessern das Signal-Rausch-Verhältnis (ein größerer Oberflächenbereich erbringt die Bindung von mehr Molekülen). Einer der Nachteile, insbesondere für stark multiplexierte Assays (zum Beispiel DNA-Sequenzierung), bei denen eine Derivatisierung von 1 bis mehr als 60.000 verschiedenen Molekülen notwendig ist, ist die Beschichtung der Kügelchen. Um zum Beispiel jede einzelne mögliche Kombination der 4 Nucleotidbasen zu erhalten, die in einer Oligonucleotidsequenz mit einer Länge von 8 Nucleotiden (8mer) repräsentiert werden, wären 65.536 verschiedene Kügelchen erforderlich, um jede Zahl zu repräsentieren (4⁸ = 65.536). Hier gibt es zwei Kernpunkte:

– die Handhabung einer großen Zahl kleiner Kügelchen (Durchmesser kleiner als 100 Mikron) vor, während und nach dem Beschichtungsverfahren;
– die Fähigkeit, zur DNA-Sequenzierung die erforderlichen Sequenzen aufzubauen.

Zur Lösung dieses Problems wurde ein kombinatorisches Syntheseverfahren entwickelt. Dieser Ansatz schließt die selektive Maskierung/Demaskierung von Sequenzen und die Verwendung fotolabiler Gruppen für die Anlagerung von Basen ein. Dies ist ein komplexes und kostspieliges Verfahren, das aufgrund hoher nicht ersetzbarer technischer Kosten (Masken, Prozessoptimierung) nicht ohne weiteres sondergefertigt werden kann und außerdem unter einem geringen Signal-Rausch-Verhältnis und einer schlechten Diffusionsvermischung infolge der planaren Topologie leidet, die einer analythaltigen Probe präsentiert wird.
Die WO97/15390 offenbart das Konzept der Herstellung von formkodierten Mikropartikeln aus Polymer, liefert jedoch kein realisierbares Verfahren dafür.
Die vorliegende Erfindung versucht, diese und andere Nachteile oder Mängel konventioneller Verfahren zu überwinden. Demzufolge wird gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung kodierter Partikel bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen einer Polymermaterialschicht auf einem Substrat;
Unterteilen der Schicht in eine Mehrzahl von Partikeln, ohne die Integrität des Substrats zu zerstören;
maschinenlesbares Kodieren der Partikel; und Entfernen der Partikel von dem Substrat.
Die Herstellung maschinenlesbarer Polymerkügelchen ist aus mehreren Gründen attraktiv. Zunächst einmal ist sie eine kostengünstigere Herstellungsmethode als die für Siliziumkügelchen. Zum Zweiten sind Polymere (insbesondere Polystyrol, Polyimid und Polycarbonat) bevorzugte Substrate für eine anschließende Derivatisierung mit einer großen Auswahl von Liganden.
Im zweiten Aspekt der zweiten Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Herstellung kodierter Partikel in einem modifizierten Mikrotiterplattenformat bereit.
Die Partikel können von dem Substrat durch verschiedene Verfahren entfernt werden, die nachfolgend ausführlicher beschrieben werden. In einigen dieser Verfahren ist das Substrat ein Opfersubstrat, das zerstört wird, um die Partikel davon zu entfernen.
Werden chemische Bibliothekenmitglieder auf die Kügelchen oder Partikel vor dem Entfernen von einem Opfersubstrat platziert, dann darf das zum Freisetzen der Kügelchen und Zerstören der Opferlage angewendete Verfahren die angelagerten Moleküle nicht beschädigen. Dies gilt insbesondere für biologische Moleküle und trifft auf beide Formate zu: Wafer und Mikrotiterplatte. In beiden Fällen können die Kügelchen durch Zerstören der Integrität des Opfersubstrats freigesetzt werden. Wenn eine Lage aus SPLOR30B (wie unten beschrieben) vorliegt, dann kann hierzu die für SPLOR30B entwickelte Marken-Entwicklerlösung verwendet werden, die zufälligerweise alkalisch ist.
Dieses alkalische Material ist möglicherweise nicht für alle biologischen Moleküle geeignet, so dass andere Opferlagen verwendet werden können, damit biologische Moleküle am Substrat anlagern können, bevor die individuelle Kügelchenstruktur freigesetzt wird.
Die Opferlage kann ein Polyolefin (z. B. Polyethylen) oder in Lösungsmitteln oder Wasser löslich sein. Sie kann auch temperaturempfindlich, z. B. Gelatine, oder pH-empfindlich sein.
Die Kügelchen können, ob sie nun auf einem Wafer oder auf einem Mikrotitersubstrat vorliegen, mit mechanischer Energie entfernt werden, z. B. mit einem gerichteten Strahl Ultraschallenergie, um die Kügelchen vorsichtig vom Substrat weg zu bewegen oder zu kavitieren. Das Kopplungsmedium für die Ultraschallenergie kann ein biokompatibles Fluid wie Wasser oder ein Lösungsmittel sein.
Die Opferlage kann ein thixotropes Material sein, d. h. es ist in Ruhelage steif und hält die Kügelchen an ihrem Platz. Werden Ultraschallscherwellen auf diese Lage gerichtet, dann verliert das Material seine Steifheit und beginnt zu fließen, so dass die Kügelchen freigesetzt werden können.
Die Opferlage kann solche Eigenschaften haben, dass sie bei Raumtemperatur die Kügelchen an ihrem Platz hält. Wird der Wafer, z. B. mit einem Strahl Flüssigstickstoff eingefroren, dann gefriert die Lage und wird so brüchig, dass die Kügelchen freigesetzt werden.
Die Opferlage kann gegenüber Strahlung, z. B. UV-Strahlung, empfindlich sein, wobei dies zweifellos in Substraten funktioniert, die UV-durchlässig sind. Obwohl in einem folgenden Beispiel Silizium als Substrat verwendet wurde, kann als Wafer-Format jedes beliebige ähnliche flache Substrat verwendet werden, wie z. B. ein flacher Quarz-Wafer, der die UV-Energie zur Film/Kügelchen-Grenzfläche durchlässt.
Eine weitere Technik zum Anlagern und Freisetzen von Kügelchen schließt die Verwendung individuell adressierbarer Elektroden auf einem festen Wafer oder einem flexiblen Schaltkreismaterial ein, z. B. auf einer flachen, festen Struktur getragenes Polyimid. Die Kügelchen werden auf der Oberseite der Elektroden hergestellt und bleiben über elektrostatische Anziehung am Substrat angelagert.
Anstelle von einfachen, flachen Elektroden kann das obige Konzept so ausgeweitet werden, das MEMS (mikroelektro-mechanische) Ausleger an den Elektrodenorten aufgenommen werden, die die Kügelchen von dem Substrat abheben und die Brücken zerbrechen.
Zwischen den Kügelchen können dünne Brücken (etwa so, wie spritzgegossene Kunststoffteile an Angüssen befestigt werden) hergestellt werden. Die Brücken können auf der Oberseite von Stützen aus GMS-(Giant Magneto-Strictive)-Material sitzen. Bei der Aktivierung durchbrechen die Säulen aus GMS-Material die Brücken und setzen die Kügelchen frei. Die dünnen Brücken können auf vielfältige Art und Weise zerstört werden – die Partikel könnten alle in einer solchen Weise verknüpft werden, dass durch das Ziehen an einem Ende des Angusses alle Kügelchen in eine Suspension „ausgepackt" werden. Die Brücken können auch durch Lasertrennung, zum Beispiel mit einem Nd:YAG oder Kohlendioxid-Laser, zerstört werden.
Ein SU-8 oder anderes Polymerschutzmaterial kann auf einen Wafer geschleudert werden, mit Löchern, die der Größe der Kügelchen entsprechen. Dadurch wird gewährleistet, dass die Kügelchen, nachdem sie hergestellt wurden, auf einem Loch sitzen. Wenn die Kügelchen freigesetzt werden sollen, drückt ein dünner Stift die Kügelchen vom Wafer herunter oder ein Luftstrahl bläst die Kügelchen vom Substrat in das Suspensionsmedium. Die Oberflächenspannung des flüssigen Polymers wird so gewählt, dass es nicht an den Löchern herab läuft.
Die Kügelchen könnten entweder durch die Zugabe von Magnetpartikeln mit dem Schutzmaterial oder eine geeignete Beschichtung magnetisch gestaltet werden. Nach dem Freisetzen der Kügelchen können diese isoliert und durch die Wirkung eines externen Magnetfeldes aufgefangen werden. Dies kommt der Handhabung der Kügelchen zugute.
Ein Szintillationsmittel, z. B. Fluorid, kann während oder nach der Unterteilung zu den Kügelchen gegeben werden. Bindungsereignisse zwischen radioaktiv markierten Liganden in Lösung und dem Szintillationsmaterial werden durch die Erfassung von Lichtblitzen nachgewiesen.
Die Partikel sind vorzugsweise Mikropartikel mit einer maximalen Abmessung von 1 mm oder weniger, vorzugsweise 500 μm oder weniger, am bevorzugtesten 250 μm oder weniger. Eine zweite und optional dritte Abmessung dieser Mikropartikel liegt vorzugsweise bei 100 μm oder weniger, bevorzugter bei 50 μm oder weniger, z. B. 25 μm oder weniger.
Die Partikel können jede beliebige Gestalt haben und zum Beispiel platten- oder scheibenförmig sein, wobei jedoch strich- oder stabartige Partikel bevorzugt werden.
Um Raum für Markierungen bereitzustellen, die als Binärkode wenigstens 32.000 verschiedene Partikel mit einem Abstand von etwa 20 μm je Markierung unterschiedlich kodieren können, wird es bevorzugt, dass die Partikel eine maximale Abmessung von wenigstens 50 μm, bevorzugter wenigstens 100 μm haben. Partikel innerhalb eines Größenbereichs von 100 μm bis 250 μm werden daher bevorzugt. Eine Bibliothek von Partikeln braucht allerdings keine 32.000 verschiedenen kodierten Partikel zu enthalten, so dass Partikel, die weniger Markerkodierungselemente tragen können, noch immer nützlich sind. Eine Bibliothek von angenommen 4000 Partikeln könnte zum Beispiel nur durch 12 Kodierungselemente kodiert werden.
Markierungen können entlang wenigstens zwei Seiten jedes Partikels gebildet werden.
Die Partikel können während des Unterteilungsprozesses morphologisch kodiert werden, so dass mit der Definition der Gesamtgestalt der Partikel auch die Muster von dreidimensionalen Merkmalen definiert werden, die jedem Partikel seinen maschinenlesbaren Kode liefern.
Alternativ können die Partikel morphologisch oder anderweitig nach der Unterteilung ihrer Gesamtgestalt, aber vor der Trennung vom Substrat, kodiert werden.
Nichtmorphologische Kodierungsverfahren schließen selektive Flächenbleichung oder die Anwendung von Tinten, Anstrichstoffen oder Farbstoffen ein, die einfarbig oder mehrfarbig oder fluoreszierend oder phosphoreszierend sein können.
Das Substrat, auf dem die Partikel durch den Unterteilungsprozess gebildet werden, kann ein Wegwerfteil wie ein Wafer sein, der entsorgt wird, nachdem die Partikel von ihm entfernt wurden, oder es kann ein Teil sein, das einen strukturellen Bestandteil einer Vorrichtung darstellt, in der die Partikel anschließend verwendet werden, wie z. B. eine Basisplatte einer Mikrotiterplatte, wie nachfolgend ausführlicher beschrieben wird.
In einer bevorzugten Praxis der Erfindung umfasst das Substrat eine Basislage und eine Opferlage, auf der die Polymermaterialschicht zur Unterteilung in die Partikel getragen wird. Die Partikel werden dann durch Zerstören der Adhäsion der Partikel an der Opferlage freigesetzt. Dies kann so erfolgen, dass sie durch UV- oder andere Strahlung oder durch andere Mittel wie Lösungsmittelauflösung veranlasst wird, die Partikel freizusetzen.
Die Partikel werden vorzugsweise in einem Fotoresist-Polymer gebildet und darin durch Aufbringen von Licht über eine Maske unterteilt, die die Randkonturen der Partikel definiert. Alternativ können sie durch Laserbearbeitung unterteilt werden.
Die auf die Mikropartikel aufgebrachte Kodierung kann aus einer Sequenz von Binärmerkmalen bestehen, z. B. entlang der Ränder der Partikel. Jeder Partikel kann mit einem oder mehreren Kodierungsmerkmal(en) versehen werden, die als Lesesinn-Kennung dienen, d. h. die Richtung anzeigen, in der die Sequenz von Binärmerkmalen zu lesen ist.
Alternativ kann die Sequenz von Binärmerkmalen derart sein, dass kein Fehler in die Partikelidentifikation eingeführt wird, in welcher Richtung die Sequenz auch immer gelesen wird. Dies kann dadurch erreicht werden, dass nur Sequenzen verwendet werden, die, wenn sie rückwärts gelesen werden, nicht mit der Sequenz irgendeines anderen, vorwärts gelesenen Partikels übereinstimmen. Hat ein Kügelchen zum Beispiel die Sequenz 11101, dann gibt es kein Kügelchen mit der Sequenz 10111. Bei Bedarf können Kügelchen mit der Umkehrsequenz (d. h. 10111 in diesem Beispiel) vorliegen, und der zum Lesen der Sequenzen verwendete Leser kann so programmiert werden, dass er sie als dasselbe ansieht.
Optional unterliegt die Kügelchenkodierung einer Paritätsregel, um dazu beizutragen, dass Fehlablesungen des Kodes ausgeschlossen werden. Folglich kann die Kodierung derart sein, dass alle Kodes eine gerade Zahl von 1en haben. In alternativen paritätskodierten Schemata haben alle Kodes eine ungerade Zahl von 1en oder eine gerade oder ungerade Zahl von 0en. Das bedeutet, dass, wenn ein Bit falsch gelesen wird, das Ergebnis ein Nichtsinnkode ist und die Ablesung verworfen werden kann.
Die kodierten Partikel können für verschiedene Zwecke Anwendung finden und sind nicht auf die Verwendung in mit der kombinatorischen Chemie zusammenhängenden Anwendungen begrenzt. Sie können somit zum Beispiel dazu verwendet werden, einen zurückverfolgbaren Markierungskode zu liefern, indem sie in vielerlei Arten von Waren eingebaut werden. Einen speziellen Kode tragende Partikel können in einen Anstrichstoff gegeben werden, der auf einen Artikel aufgetragen wird, der zurückverfolgbar sein soll, wie zum Beispiel ein Kraftfahrzeug oder ein anderer Gegenstand von hohem Wert. Sie können in Chargen von Materialien wie Öl, Schmieröl, Automatikgetriebeschmiermittel, Hydraulikflüssigkeiten oder Chemikalien gegeben werden, um als Chargennummernnachweis zu dienen. Die Kodes auf den Partikeln können Termininformationen kodieren, wie ein Herstellungsdatum oder einen planmäßigen Austauschtermin.
Sie können natürlich auch als Substrate zur Bildung einer kombinatorischen chemischen Bibliothek verwendet werden, wobei eine große Anzahl chemisch unterschiedlicher Materialien auf jeweilige Partikel oder Abschnitte von Partikeln gesetzt werden. Hierbei kann es sich um oligomere Verbindungen handeln, die sich in den Sequenzen von Monomereinheiten voneinander unterscheiden, wie Nucleinsäuren oder deren Analoge (einschließlich DNA, RNA, PNA und andere modifizierte Rückgratnucleinsäureanaloge oder Hybriden davon), Proteine, Polypeptide oder Peptide und Oligosaccharide.
Im Allgemeinen können die Verbindungen der Bibliothek entweder zuerst synthetisiert und dann an ihre Partikel gebunden werden oder aber schrittweise auf den Partikeln synthetisiert werden. Bei beiden Verfahren können die Partikel während der Anlagerung der Verbindungen weiterhin am Substrat befestigt sein, auf dem sie unterteilt wurden, oder davon getrennt sein.
Im Allgemeinen ist es in einer chemischen Bibliothek beabsichtigt, dass jeder Partikel, der einen speziellen Kode trägt, eine bekannte Bibliothek von chemischen Verbindungen tragen sollte.
Vor allem dann, wenn die Anzahl chemischer Objekte in der Bibliothek groß ist, selbst wenn die Partikel klein sind, kann es vorkommen, dass das von der gesamten Bibliothek von Partikeln eingenommene Volumen für eine problemlose Handhabung unerwünscht groß ist. Im Prinzip könnte das Volumen des verwendeten Partikelmaterials reduziert werden, indem jeder Partikel verkleinert wird. Aus verschiedenen Gründen ist es möglicherweise jedoch nicht erwünscht, die Größe der Partikel weiter zu reduzieren, zum Beispiel aufgrund der Schwierigkeiten, die sich bei der Identifizierung der Partikel ergeben können.
Demzufolge können erfindungsgemäße Partikel in einer chemischen Bibliothek verwendet werden, umfassend Partikel, die jeweils wenigstens eine erste Zone und eine zweite Zone haben, wobei auf jeder genannten Zone ein entsprechendes chemisches Mitglied der genannten Bibliothek vorliegt, wobei jeder Partikel Markierungen hat, die die Aufgabe haben, den Partikel zu kennzeichnen und die genannten Zonen des Partikels zu kennzeichnen und somit das chemische Mitglied der Bibliothek auf jeder beliebigen selektierten Zone zu kennzeichnen.
Durch die Verwendung der jeweiligen Partikel für mehr als ein chemisches Objekt in der Bibliothek, wobei der Partikel jedoch so markiert wird, dass jedes chemische Objekt separat gemäß seiner lesbaren Position auf dem Partikel identifiziert werden kann, kann die Anzahl von Partikeln, die für eine Bibliothek mit einer speziellen Anzahl chemischer Objekte notwendig sind, zumindest halbiert werden.
Alternativ kann für eine bestimmte Zahl von Partikeln und eine bestimmte Zahl chemischer Bibliothekenmitglieder, die darauf getragen werden, die Zahl physischer Orte in der Partikelbibliothek, an denen jedes spezielle chemische Element anzutreffen ist, erhöht werden. Besteht eine Bibliothek gemäß der GB-A-2334347 zum Beispiel aus n Partikeln, die n Verbindungen tragen (eine Verbindung je Partikel), dann kann man die jeweiligen Verbindungen nur an einem Ort innerhalb der Masse von Partikeln antreffen, die die Bibliothek darstellen. Liegen jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung zwei Verbindungen auf jedem Partikel vor, ohne dass die Menge an Partikelmaterial oder die Menge der jeweiligen chemischen Verbindungen in der Bibliothek erhöht wird, dann kann man die jeweiligen Verbindungen an zwei verschiedenen Orten antreffen. Folglich kann die für eine Reaktion mit der Bibliothek erforderliche Zeit verringert werden.
Prinzipiell kann jede Partikelgestalt verwendet werden. Der Partikel kann zum Beispiel scheibenförmig sein, wobei die von den jeweiligen chemischen Bibliothekenmitgliedern eingenommenen Zonen sektorförmig sind und Kerben oder andere ähnliche Markierungen an einer oder mehreren Position(en) um die Peripherie vorliegen, um die Identität jeder Zone zu markieren. Eine solche periphere Markierung reicht aus, unabhängig davon, wie viele Sektoren verwendet werden, da jeder Sektor im Hinblick auf eine einzelne Markierung gemäß der Winkelposition in Bezug dazu positioniert sein kann.
Vorzugsweise hat jeder Partikel jedoch eine stabartige oder strichartige Gestalt mit einem ersten Ende und einem zweiten Ende, wobei die genannte erste Zone so angeordnet ist, dass sie sich von einem Ort bei oder nahe dem genannten ersten Ende erstreckt, und die genannte zweite Zone so angeordnet ist, dass sie sich von einem Ort bei oder nahe dem genannten zweiten Ende erstreckt.
Jeder Partikel kann dann Markierungen zur Kennzeichnung des Partikels und einen Endmarker haben, der dazu dient, das erste Ende oder das zweite Ende des Partikels zu kennzeichnen.
Die Markierungen können die Gestalt von Grübchen, Rillen, Kerben oder Wölbungen haben. Sie können außerdem fluoreszierende oder farbige oder einfarbige Markierungen umfassen, wie Striche oder Punkte, die zum Beispiel per Druck als Oberflächenmarkierungen aufgetragen werden können.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer chemischen Bibliothek, umfassend das Bereitstellen einer Substratmaterialschicht, die unterteilte angelagerte Partikel wie oben beschrieben trägt, (a) Bilden von Ablagerungen selektierter chemischer Bibliothekenmitglieder in jeweiligen bekannten Raumzonen auf der Oberfläche der genannten Partikel auf dem Substratmaterial, so dass jeder Partikel wenigstens zwei der genannten Raumzonen beinhaltet, die jeweils ein anderes der genannten chemischen Bibliothekenmitglieder tragen, wobei jeder Partikel mit einem Kode markiert ist, der den Partikel kennzeichnet und die Ausrichtung des genannten Partikels mit Bezug auf die genannten Zonen darstellt, so dass jede genannte Zone separat identifiziert werden kann.
Der Begriff „chemische Bibliothek" schließt „biologische Bibliotheken" ein.
Je nach dem Verfahren der Partikelunterteilung kann die Absetzung der chemischen Mitglieder der Bibliothek der Bildung der partikelkennzeichnenden Markierungen vorausgehen oder folgen.
Die chemischen Elemente der Bibliothek können oligomere Verbindungen wie Oligonucleotide oder Peptide sein, in denen Monomereinheiten, die von einer begrenzten Auswahl von chemisch verwandten Verbindungen selektiert werden, in einer Sequenz angeordnet sind, die das Oligomer charakterisiert. Sie können nichtoligomere Verbindungen sein, die möglicherweise mit anderen Mitgliedern der Bibliothek durch irgendeine gemeinsame Struktur oder konkrete oder potentielle Eigenschaft verbunden sind. Die Verbindungen können eine komplexe Struktur haben, sie können z. B. Antikörper oder andere Biomoleküle sein.
Die Verbindungen der Bibliothek können zuvor synthetisiert und dann auf die Partikel gesetzt oder sie können auf der Partikeloberfläche synthetisiert werden. Die Verbindungen können chemisch an die Oberfläche der Partikel gebunden oder physikalisch darauf adsorbiert werden. Die Partikel können porös sein und die Verbindungen der Bibliothek können in den Poren einer solchen Struktur vorliegen, obschon es bevorzugt wird, dass die Verbindungen auf der Oberfläche des Partikels vorliegen.
Die Kügelchen können jede beliebige geeignete Gestalt haben. Vorzugsweise sind die Kügelchen dünn, typischerweise 25 μm, rechteckig geformt, mit einer typischen Länge von 250 μm und einer Breite von 40 μm.
Nach dem Aufbringen der Oligomere oder anderen Verbindungen auf die Kügelchen können individuelle Gruppen von Kügelchen freigesetzt und verarbeitet werden, z. B. durch Durchflusszytometrie. Bei rechteckigen Kügelchen ist das lange Seitenverhältnis ohne weiteres für eine gute Vermischung innerhalb der Durchflusszelle geeignet, wodurch eine effektive Bindung der Basen eines Analytoligonucleotids an einer komplementären Zielsequenz unterstützt wird.
Jedes Kügelchen kann um seine Peripherie definierte Merkmale haben, um einen einzigartigen Kode zu liefern. Die nachfolgend erörterte strukturelle Ausgestaltung ist dafür vorgesehen, mit aktuellen Mikrotiterplatten mit 96 Wells kompatibel zu sein, allerdings sind die erwähnten Techniken ebenso für größere Well-Formate geeignet. Bei solchen Maßen könnte jedes quadratische Well von 3,5 mm ohne weiteres eine Anordnung von 100 mal 40 (oder 4000) Kügelchen aufnehmen. Die Gesamtzahl an in einer handelsüblichen 96-Well-Struktur definierten Kügelchen würde dann etwa bei 384.000 liegen.
Zur Veranschaulichung kann die Oberfläche eines 250 μm Kügelchens in zwei Zonen abgegrenzt werden, wobei die eine ein erstes chemisches Bibliothekenmitglied ('Biomolekül 1') und die andere ein zweites chemisches Bibliothekenmitglied ('Biomolekül 2') trägt. Ein Ende des Partikels kann mit einem T-förmigen Kopf mit einem längeren Stiel als ein ähnliches Gebilde am anderen Ende versehen sein, so dass die Enden voneinander unterscheidbar sind. Die Anwesenheit des Bibliothekenmitglieds kann an sich als Marker dienen, der die Oberseite kennzeichnet, um Unklarheiten darüber auszuschließen, welche lange Seite des Partikels welche ist. Alternativ kann ein weiterer Kodemarker vorgesehen sein, der die Aufgabe hat, eine Seite des Partikels zu kennzeichnen.
Nach dem Kontakt mit einer Testverbindung, die sich an eine kompatible Verbindung auf einem speziellen Kügelchen in einer Bibliothek solcher Kügelchen binden oder mit dieser reagieren kann, können die Kügelchen gescreent werden, um festzustellen, auf welchem Kügelchen und an welchem Ende des Kügelchens die Bindung oder sonstige Reaktion stattgefunden hat. Dazu werden die Kügelchen aus dem Well entfernt und durch ein geeignetes Durchflusssystem zu einem Detektor geleitet, wo sie nacheinander untersucht werden. Wenn die entsprechende Reaktion nachgewiesen wird, wird der Kügelchen-Kode gelesen, um die reagierende Bibliothekenverbindung zu identifizieren.
Optional kann jeder Partikel in einer Bibliothek von Partikeln, ob zur Verwendung oder anderweitig produziert durch ein Verfahren gemäß der Erfindung, ein fluoreszierendes Material umfassen, das an ausgewählten Orten selektiv gebleicht wurde, um Markierungen zu definieren, die den genannten maschinenlesbaren Kode darstellen.
Das fluoreszierende Material kann ein Polymer sein, das die Partikel bildet, oder es kann eine Materiallage sein, die auf ein solches Polymer aufgebracht wird. Es kann lokal durch Aufbringen einer ausreichend intensiven Lichtenergie, z. B. von einem Laser, gebleicht werden. Es kann ein Muster gebleichter Punkte oder Striche gebildet werden, das einen Binärkode darstellt. Alternativ kann die gesamte Fläche des Partikels, mit Ausnahme eines Musters aus Punkten oder Strichen gebleicht werden, das einen Binärkode darstellt.
Der Laserbleichvorgang kann anstelle des hierin beschriebenen Lasertrenn- oder -bearbeitungsvorgangs durchgeführt werden, während die Partikel auf einem Substrat durch eine fotoaktivierte oder lösungsmittelaktivierte Freisetzungspolymerlage festgehalten werden. Die Teilungen zwischen den Partikeln können durch Lasertrennung oder durch Fotolithografie erfolgen. Eine Vielzahl von Mikropartikeln definierende Maske kann zum Beispiel zum Belichten einer fotolithografischen, Fotoresist-Polymerlage verwendet werden, die auf einem Substrat durch ein fotoauslösbares Polymerfreisetzungsmaterial getragen wird. Das Fotoresist kann dann mit einem Lösungsmittel entwickelt werden, um Kanäle dadurch zu erzeugen, die freisetzbare Partikel wie oben beschrieben abgrenzen. Diese können zur Bildung von Kodemarkierungen mit einem Laser oder einer anderen Lichtquelle gebleicht werden; optional kann eine chemische Bibliothek aufgebracht werden und die Partikel können dann freigesetzt werden. Die freigesetzten Partikel können mit einem beliebigen der hierin beschriebenen Verfahren weiter verarbeitet werden.
Bei Bedarf können die Partikel jeweils wenigstens eine erste Zone und eine zweite Zone haben, wobei auf jeder der genannten Zonen ein jeweiliges chemisches Mitglied der genannten Bibliothek vorliegt, wobei jeder Partikel Markierungen hat, die dazu dienen, den Partikel zu kennzeichnen und die genannten Zonen des Partikels zu kennzeichnen und somit das chemische Mitglied der Bibliothek auf jeder beliebigen ausgewählten Zone zu kennzeichnen.
Prinzipiell kann jede Partikelgestalt verwendet werden. Der Partikel kann zum Beispiel scheibenförmig sein und gebleichte Markierungen haben, die an einer oder mehreren Position(en) um die Peripherie kodiert sind.
Vorzugsweise hat jedoch jeder Partikel eine stabartige oder strichartige Gestalt, wobei gebleichte Kodemarkierungen entlang jeder langen Seite ausgebildet sind.
Jeder Partikel kann Markierungen zur Kennzeichnung des Partikels und (einen) Endmarker zur Kennzeichnung eines ersten Endes oder des zweites Endes des Partikels haben.
Die Partikel haben vorzugsweise die hierin beschriebene Größe.
Markierungen können entlang wenigstens zwei Seiten jedes Partikels gebildet werden.
Die Absetzung der chemischen Mitglieder einer Bibliothek kann der Bildung der partikelkennzeichnenden Markierungen und der Teilung einer endlosen Schicht in trennbare Partikel vorausgehen oder folgen.
Die chemischen Mitglieder der Bibliothek können den oben beschriebenen entsprechen.
Die Verbindungen der Bibliothek können zuvor synthetisiert und dann auf die Partikel gesetzt werden oder sie können auf der Partikeloberfläche synthetisiert werden. Die Verbindungen können chemisch an die Oberfläche der Partikel gebunden oder physikalisch darauf adsorbiert werden. Die Partikel können porös sein und die Verbindungen der Bibliothek können in den Poren einer solchen Struktur vorliegen, obschon bevorzugt wird, dass die Verbindungen auf der Oberfläche des Partikels anwesend sind.
Erfindungsgemäß hergestellte chemische Bibliotheken können in einem beliebigen der verschiedenen Gebiete eingesetzt werden, in denen chemische Bibliotheken in der Vergangenheit verwendet oder zur Verwendung vorgeschlagen wurden, einschließlich Wirkstofferforschungsassays, DNA-Sequenzierung, Immunoassays und kombinatorische Chemie.
Es gibt drei Hauptmethoden, mit denen chemische Moleküle an die Partikel oder Kügelchen angelagert werden können. Zu solchen Molekülen gehören DNA, RNA, PNA, Antikörper, Antigene, Proteine, Peptide, Liganden, virale Partikel, Phagen, Zellen, chemische Verbindungen usw. Die Moleküle können an die Kügelchen angelagert werden, während sie sich auf dem Substrat befinden, oder die Anlagerung kann stattfinden, nachdem die Kügelchen freigesetzt wurden. Bei beiden Möglichkeiten sind die zur Herstellung der Kügelchen verwendeten Materialien und Verfahren vorteilhafterweise mit wenigstens einer oder mehreren, vorzugsweise mit allen drei Methoden vereinbar. Die drei Methoden werden nun ausführlich beschrieben.
Gemäß einer ersten Methode werden isolierte oder zuvor synthetisierte Biomoleküle direkt an die diskreten Polymerkügelchen angelagert. Während des Anlagerungsprozesses befinden sich die Kügelchen noch immer auf dem Wafer. Nach dem Anlagern werden die Kügelchen freigesetzt. Gemäß einer zweiten Methode werden die Kügelchen von dem Wafer freigesetzt und in separaten Gefäßen aufbewahrt, so dass die Kodes aufeinander folgend sind. Jedes Gefäß enthält eine Mehrzahl von Kügelchen mit dem gleichen Kode. Ein zuvor erzeugtes Oligomer nach Wahl wird dann direkt an das Kügelchen gebunden. Kügelchen von verschiedenen Gefäßen mit verschiedenen Oligomeren werden dann für eine Downstream-Analyse vermischt. Gemäß einem dritten Verfahren werden die Kügelchen von dem Substrat in eine Trägerflüssigkeit freigesetzt und mit den chemischen Bausteinen nacheinander vermischt. Alternativ befinden sich die Kügelchen noch immer auf dem Substrat und Oligomere werden auf den Kügelchen nacheinander und schrittweise aufgebaut. Diese Methode hat die folgenden Vorzüge: geringerer Handhabungsaufwand, direkter Aufbau verschiedener Moleküle über ein Substrat und Bereitstellung einer Vielzahl von Oligomeren in relativ wenigen Schritten.
Die folgenden vier Verfahren zum Lesen von Kodes auf Partikeln oder Kügelchen werden bevorzugt:
Die Ausgangsleistung eines Laserstrahls geeigneter Wellenlänge wird durch optische Elemente geleitet, die den Strahl in einen dünnen fächerförmigen Strahl umwandeln. Die Kerben des durch die Durchflusszelle fließenden Kügelchens blockieren den Strahl. Zum Erfassen der vorwärtsgestreuten Energie kann ein Sensor in-line mit der einfallenden Energie und jenseits des Kügelchens angeordnet werden. Der Ausgang dieses Sensors variiert je nach der auf ihn fallenden Energiemenge. Im Falle der vorwärtsgestreuten Energie hindern die Kerben die Energie daran, den Detektor zu erreichen, wohingegen die Energie den Detektor über die Lücken zwischen den Kerben erreichen kann. Zum Ableiten des Kodes auf dem Kügelchen können entweder die vorwärtsgestreuten oder seitlich gestreuten Signale oder eine Kombination dieser Signale verwendet werden.
In einer anderen Ausgestaltung können rechteckige Polymerkügelchen hergestellt werden, bei denen Metallstreifen den Kode bilden. Typische verwendbare Metalle sind Nickelchrom, Titan und Gold. Werden die Kügelchen in Verbindung mit dem obigen System verwendet, dann wird das Laserlicht in nichtmetallischen Regionen stark absorbiert und in den metallischen Regionen stark reflektiert. Der absorbierte oder reflektierte Ausgang ist für die Kodes charakteristisch.
In einem zweiten Verfahren erfasst eine High-Speed Imaging Camera das gesamte 2D-Bild des Kügelchens. Der Kode auf dem Kügelchen wird durch Bearbeiten des eingefangenen 2D-Bildes mit einer handelsüblichen Bildanalysesoftware abgeleitet. In einem alternativen Verfahren wird die Tatsache genutzt, dass das Kügelchen an der stationären Kamera vorbeifließt, und es werden 1D-Zeilenabtastungen mit hoher Geschwindigkeit erfasst. Ein komplettes 2D-Muster wird somit durch Addieren einer Serie dieser 1D-Zeilenabtastungen aufgebaut und wie zuvor analysiert.
In einem dritten Verfahren wird eine Mehrfachbildanalyse verwendet. Diese ist besonders für das Mikrotiterplattenformat relevant. Während sich die Kügelchen in den Wells befinden, müssen mehrere Kügelchen abgebildet werden, um einen Schnappschuss des Wells zu erhalten und die Bilder off-line zu analysieren.
In einem vierten Verfahren wird die natürliche Fluoreszenz des Kügelchens genutzt. Es können Polymerkügelchen hergestellt werden, die fluoreszieren, wenn Licht einer bestimmten Wellenlänge auf sie einfällt, und in dem oben in Verbindung mit dem ersten Ableseverfahren beschriebenen System ist diese Wellenlänge die des einfallenden Lasers. Diese Eigenschaft kann zum Lesen der Kodes auf den Kügelchen unter Verwendung von Fluoreszenzdetektoren genutzt werden. Wie nachfolgend ausführlicher beschrieben wird, könnte man anstelle einer Kodierung durch die Bildung von Kerben um die Peripherie eines Kügelchens den gleichen Kode auf ein Kügelchen mit einer einfachen rechteckigen Peripherie unter Ausnutzung der Eigenfluoreszenz des Kügelchens oder der Fluoreszenz eines anderen auf die Oberseite des Kügelchens abgesetzten Materials ritzen. In jedem Fall wird das Material lokal durch Einwirken einer ausreichend intensiven Lichtenergie, z. B. von einem Laser, gebleicht. Unterschiedliche Belichtungsanordnungen führen zur Bildung unterschiedlicher Kodetypen, wie die folgende nicht erschöpfende Liste zeigt:
Die einfachste ist die Verwendung eines hochfokussierten Laserenergiestrahls, um den Kode direkt auf das Kügelchen zu schreiben.
Man kann auch ein Interferometersystem als Belichtungssquelle verwenden. Diese Systeme werden konventionell in der Herstellung von Hologrammen eingesetzt.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Kodes umfasst das Leiten eines Laserstrahls durch zwei Beugungsgitter, von denen eines feststehend ist und das andere in kleinen Schritten rotiert. Dem resultierenden Beugungsmuster wird ein Kode zugeordnet.
Es folgt eine beispielhafte Beschreibung der zurzeit bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung unter Bezugnahme auf die Begleitzeichnungen. Dabei zeigt:
1 eine Querschnittsdarstellung einer Sektion einer Polymermaterialschicht auf einem UV-Freisetzungsfilm;
2 eine Draufsicht auf ein Beispiel eines kodierten Partikels;
3 eine Querschnittsdarstellung einer Sektion einer unterteilten Polymermaterialschicht auf einem UV-Freisetzungsfilm;
4 eine Querschnittsdarstellung einer Sektion einer unterteilten Polymermaterialschicht auf einem UV-Freisetzungsfilm auf der unteren Lage einer konventionellen Mikrotiterplatte;
5 eine Draufsicht auf eine konventionelle Mikrotiterplatte, einschließlich der unterteilten Polymermaterialschicht auf einem UV-Freisetzungsfilm;
6 eine Seitenansicht eines Teils der konventionellen Mikrotiterplatte, die in 5 dargestellt ist;
7 eine schematische Darstellung der Seitenansicht der in den 5 und 6 dargestellten konventionellen Mikrotiterplatte sowie ein Mittel zum Entfernen der Kügelchen von der Mikrotiterplatte; und
8 Ausgaben eines Kodelesegeräts.
Mit der nachfolgend beschriebenen Technik kann eine leicht zu handhabende Anordnung diskreter Partikel (alternativ als Kügelchen bezeichnet) in einem Polymermaterial erzeugt werden. Monomere wie Nucleotide können auf die Oberfläche der Kügelchen mit einem Tintenstrahldrucksystem gedruckt werden. Die Kügelchen können jede beliebige geeignete Gestalt haben. Vorzugsweise sind die Kügelchen so gestaltet, dass sie dünn sind, typischerweise 25 μm, und eine rechteckige Form mit einer typischen Länge von 250 μm und eine Breite von 40 μm haben.
Nach dem Aufbringen der Monomere auf die Kügelchen können individuelle Gruppen von Kügelchen freigesetzt und verarbeitet werden, z. B. mit Durchflusszytometrie. Bei rechteckigen Kügelchen eignet sich das lange Seitenverhältnis an sich ohne weiteres für eine gute Vermischung innerhalb der Durchflusszelle, wodurch eine effektive Bindung der Basen an die ursprüngliche Sequenz unterstützt wird.
Jedes Kügelchen kann um seine Peripherie definierte Merkmale haben, um einen einzigartigen Kode zu erhalten. Die nachfolgend erörterte strukturelle Ausgestaltung ist derart, dass sie mit aktuellen Mikrotiterplatten mit 96 Wells vereinbar ist, obschon die erwähnten Techniken ebenso für größere oder kleinere Well-Formate oder -Zahlen geeignet sind. Mit solchen Abmessungen könnte jedes quadratische 3,5 mm Well ohne weiteres eine Anordnung von 100 mal 40 (oder 4000) Kügelchen aufnehmen. Die Gesamtzahl an innerhalb einer handelsüblichen 96-Well-Struktur definierten Kügelchen würde dann bei etwa 384.000 liegen.
In der in 1 dargestellten erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird eine Kunststoffmaterialschicht 10, z. B. 20 oder 25 μm starkes Polyester oder Polycarbonat, auf eine andere Kunststoffschicht 12 gelegt, die die spezifische Eigenschaft hat, ein UV-Freisetzungsmaterial (z. B. 130 Mikron starkes Furukawa UV-Band SP-Serie) zu sein. Die beiden Schichten werden so übereinander gelegt, dass alle Luftspalten ausgeschlossen werden.
Diese Sandwichstruktur wird auf einen Vakuumsaugkopf mit ebener Fläche gelegt, der auf dem Koordinatentisch eines Laser-Mikrobearbeitungssystems positioniert ist. Vorzugsweise ist das Lasersystem ein Kohlendioxidlasersystem mit einem Galvanometerabtastkopf.
Typische Galvanometerabtastfelder liegen in der Größenordnung von 50 mm × 50 mm, wobei normalerweise 500 Merkmale pro Sekunde erzeugt werden. Aktuelle Systeme umfassen 4- bis 5-Bit-Kodiersysteme. Dieses Konzept gestattet zum Beispiel die Verwendung eines 18-Bit-Kodiersystems durch die Erzeugung von 18 „Elementen" 14, die nach Bedarf ein- oder ausgeschaltet werden können (2). Hier wird eine Elementbreite von 10 μm und ein Abstand zwischen den Elementen von 10 Mikron erwogen. Würden alle Elemente auf derselben Seite definiert, dann würde die Gesamtlänge eines Kügelchens knapp unter 500 μm liegen, und dies würde über der optimalen Länge liegen. Diese Länge kann auf 250 μm reduziert werden, wenn die Elemente auf beiden Seiten definiert werden. Der Leser würde dann Informationen bezüglich der Leserichtung des Kügelchens benötigen; eine fehlerhafte Ablesung des Kodes könnte sich zum Beispiel ergeben, wenn sich das Kügelchen umdreht, usw. Hier wird jedoch eine Technik entwickelt, bei der durch das Hinzufügen von zwei weiteren Merkmalen 15, 17 auf das Kügelchen alle Leserichtungskombinationen berücksichtigt werden.
Bei einem Abstand von 20 μm und 9 Elementen auf jeder Seite liegt die Länge des Kügelchens nun bei etwa 250 μm, was akzeptabel ist. Ein Beispiel für ein 18-Bit-Kügelchen ist in 2 dargestellt.
Die Spitzenleistung des Lasers wird so eingestellt, dass das Kunststoffmaterial 10 bei 16 ganz durchgeschnitten wird, das UV-empfindliche Band 12 aber nur um ein paar μm „eingeschnitten" wird und für alle Absichten und Zwecke ganz intakt bleibt. 3 zeigt, dass die Integrität der UV-Freisetzungslage im Wesentlichen unbeeinflusst ist. Dies wird für alle Ausgestaltungen bevorzugt.
Das bearbeitete Sandwich wird von dem Vakuumsaugkopf abgenommen und auf die untere Platte 18 einer konventionellen 96-Well-Mikrotiterplatte 24 (4) gelegt, um etwa 4000 Kügelchen je Well bereitzustellen. Im Allgemeinen gibt es Platten, die durch Spritzguss in einem Stück hergestellt werden, und andere, die in zwei Teilen hergestellt werden, wobei die flache Basisplatte an eine perforierte obere Platte 26 ultraschallgeschweißt wird. In der vorliegenden Ausgestaltung werden Nucleotide oder Oligonucleotide 20 auf die Oberfläche der auf der Basisplatte festgehaltenen Partikel vor dem Anbringen an der oberen Platte aufgebracht.
Die obere Platte der Mikrotiterplatte wird nun auf die Oberseite der Basisplatte gelegt, um die laserbearbeitete Kunststoffpartikellage in den resultierenden Wells 22 einzuschließen. Die resultierende Mikrotiterplatte ist in den 5 und 6 dargestellt.
Der nächste Schritt besteht darin, eine Gruppe von Kügelchen (genaue Anzahl ist unwichtig) in einem Vorgang zu entfernen und sie in der Pufferlösung des Durchflussystems zu bearbeiten.
Als erster Schritt wird die Adhäsionseigenschaft an der Grenzfläche zwischen dem UV-Band und einer bestimmten Gruppe von Kügelchen lokal zerstört. Typische Werte der Adhäsionskraft des UV-Bandes (derzeit erhältlich) sind 2,5 N/25 mm vor UV und 0,05 N/25 mm nach UV. Typische UV-Dosierungen, die hierfür erforderlich sind, liegen in der Größenordnung von 1000 mJ/cm². In dieser Ausgestaltung befindet sich eine UV-Quelle 30, z. B. ein Impulslaserstrahl, die diesen Energiewert je Impuls liefert, auf einem Präzisionskoordinatentisch und liefert ihre Energie von unterhalb der Mikrotiterplatte. Nachdem die erforderliche Energiemenge zu einer bestimmten Gruppe von Kügelchen geführt wurde, besteht die zweite Aufgabe darin, diese bestimmte Gruppe von Kügelchen zu entfernen.
Das Verfahren zum Entfernen der Kügelchen darf die Oberfläche, die die DNA-Basen enthält, nicht beschädigen. Eine Möglichkeit hierfür ist die Verwendung einer flachen präzisionsgeschliffenen Hohlnadel oder eines Saugabnehmers 32 mit einem Innendurchmesser zwischen beispielsweise 200 und 500 Mikron. Die Öffnung könnte mit einer mikroporösen Membran blockiert werden. Das Konzept besteht darin, diese Nadel auf einem Präzisionskoordinatentisch zu installieren, so dass sie in ein Well in Richtung der Anhäufung von 4000 Kügelchen hinabzeigt. Der Entfernungsvorgang ist in 7 dargestellt.
Bei Bedarf kann das Substrat porös sein und während der Verwendung der Partikel als Filter wirken. Folglich kann die Kunststofflage zur Bildung der Partikel zum Beispiel über eine Kunststoffopferlage auf der Oberfläche eines porösen Substrats wie Celluloseacetatnylon oder Polyethersulfon gelegt werden. Nach dem Unterteilen der Kügelchen und dem Aufbringen chemischer Bibliothekenmitglieder auf die Partikel kann eine perforierte Platte angebracht werden, um eine Mikrotiterplatte zu bilden. Nach oder vor der Zugabe von Assayreagenzien zu den Partikeln können sie in den Plattenwells freigesetzt werden. Nach jeder Zugabe von Flüssigkeit in diesen Prozessen kann Abfallflüssigkeit durch das Filtermaterial abgeführt werden. Vor allem dann, wenn die Opferlage durch Lösungsmittelzugabe zum Freisetzen der Partikel in den Wells zerstört wird, kann das Abfalllösungsmittel über den Filter/das Substrat ausgesaugt werden, so dass die Partikel in ihren Wells zurückgehalten werden.
Die vorliegende Erfindung resultiert in der Herstellung von Kügelchen mit räumlich definierten, maschinenlesbaren Kodes. Jeder einmalige Kode kann von einem oder mehreren Kügelchen getragen werden. Aktuelle Systeme auf der Basis von Silizium haben große Nachteile, wie ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und eine schlechte Diffusion während des Vermischens. Durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung würden die mit einer so großen Anzahl von Kügelchen in einem Well erhaltenen Ergebnisse zu einem höheren Grad an Vertrauen in der Sequenzierung führen. Bis zu insgesamt 4000 Kügelchen in einem Well können in das Durchflusssystem geführt werden, um eine gute Vermischung zu gewährleisten.
Optional könnte die gewünschte Oberflächenbeschaffenheit durch Mikroätzungs- oder Elektropolierverfahren erzeugt werden. Die funktionellen Lagen können elektrochemisch abgeschieden und/oder durch Passivierung aufgebracht werden.
Biolagen könnten durch Tintenstrahldruck direkt auf Polymerschichten „strukturiert" werden. Oligomere könnten durch direkten Tintenstrahldruck der Monomere erzeugt werden, so dass Reagensabfall und die Probleme im Zusammenhang mit der Kügelchenhandhabung reduziert würden. Dieser Prozess ist besonders für die Herstellung von Oligonucleotiden geeignet.
Im Folgenden wird ein alternatives Herstellungsverfahren für die Produktion von Mikropartikeln auf Polymerbasis beschrieben.
In diesem Verfahren wird bevorzugt ein Siliziumwafer als Substrat für die folgenden Schritte verwendet, obschon es der fachkundigen Person verständlich sein wird, dass jedes beliebige flache Substrat verwendet werden könnte, einschließlich der oben beschriebenen porösen Substrate. Der Siliziumwafer wird gereinigt und gebrannt und anschließend wird ein Fotoresist mit einer Dicke von etwa 3 μm, das als eine Opferlage fungiert, auf die Oberfläche des Substrats geschleudert. Ein typisches Beispiel für ein in diesem Schritt geeignetes Fotoresist ist SPOLR30B, das von MicroChem Corporation of Massachusetts erhältlich ist.
Diese Unterbaugruppe wird dann vor dem Auftragen einer weiteren Fotoresistlage durch Schleudern gebrannt. Die zweite Fotoresistlage hat eine Dicke von etwa 20 μm und ist ein chemisch amplifiziertes negatives Fotoresist wie SU8-25, das wie oben ebenfalls von MicroChem Corporation erhältlich ist. Diese wird dann vor der Bestrahlung gemäß Herstelleranweisungen gebrannt. Anschließend wird eine geätzte Chrom-auf-Glas-Maske über die SU8-Lage gelegt, die dann mit einem UV-Belichtungsinstrument oder einem ähnlichen Anregungsgerät belichtet wird. Es folgt ein Nachbelichtungsbrand, wieder gemäß Herstelleranweisungen, woraufhin das belichtete Material mit einem angemessenen Entwickler entwickelt wird, so dass eine Anordnung von offensichtlichen oder profilierten Mikropartikeln auf dem Substratwafer zurückbleibt.
Wie zuvor können die Mikropartikel vor oder nach der Freisetzung vom Wafer funktionalisiert werden. Die Freisetzung wird mit verdünntem Entwickler erreicht, der die SPLOR30B-Lage auflöst.
Mit den oben beschriebenen Techniken können Mikropartikel mit einer Länge von etwa 50 bis 200 μm erhalten werden. Typische Mikropartikelabmessungen sind wie folgt:
Zur Verwendung in einer chemischen Bibliothek ist eine Funktionalisierung der Mikropartikel notwendig, damit gewährleistet wird, dass sie für die chemischen oder biochemischen Vorgänge empfänglich sind, die sie bei der Aufarbeitung durchlaufen müssen. Die Funktionalisierung kann durch jedes beliebige geeignete chemische Mittel oder Gasmittel erfolgen, wie Plasmaätzung, wirksam überträgt eine gewünschte chemische Gruppe auf die Mikropartikeloberfläche zur Anlagerung eines Analys oder anderer Vorläuferspezies [sic].
Die oben beschriebenen Mikropartikel können zum Beispiel funktionalisiert werden, um die Anlagerung von DNA, insbesondere ein mit einer DNA zusammenhängendes Oligonucleotid, zu ermöglichen, die nachgewiesen werden soll. Im ersten Schritt der Funktionalisierung werden die Mikropartikel mit HMDS (Hexamethyldisilazan) silanbehandelt, gefolgt von einem Organosilan wie N-2-Aminoethyl-3-aminopropyl-trimethoxysilan, wodurch ein selbstassemblierter Film auf den hydroxylierten Oberflächen der Mikropartikel gebildet wird. Da unmodifizierte Oligonucleotide nicht direkt mit den Silanolgruppen gekoppelt werden können, kann die Oberfläche weiter mit NHS-Biotin funktionalisiert werden, das ein N-Hydroxysuccinimidester-Biotinkomplex ist. Dieses lagert sich an der Oberfläche der Aminogruppe an, die durch den Silanfilm präsentiert wird. Das Biotinmolekül wird dann mit Streptavidin, einem Protein, reagiert. Das Streptavidin wird dann zum Binden von biotinylierter DNA verwendet, wodurch eine starke nichtkovalente Interaktion entsteht. Die Interaktion ist ausreichend stark, um der stringenten Wäsche standzuhalten, die in späteren Schritten erforderlich ist, um unspezifische Hybridisierung zu minimieren.
Im Spezielleren kann die Silanabsetzung durch Spülen der Kügelchen in HMDS und 30-minütiges Härten bei 50°C erfolgen. 2% TMS (N-2-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilan) in Trockenaceton bei Raumtemperatur wird etwa 2 Minuten lang zugegeben. Die Kügelchen werden in Trockenaceton gespült und getrocknet.
Im Funktionalisierungsschritt mit Biotin werden die Partikel in 1 mg NHS-Biotin in 250 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) eingetaucht und vorsichtig gerührt. Nach vier Stunden werden die Partikel zweimal in DMSO und dann in phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen.
Im Anschluss an das obige Verfahren wurde die Bindung der Chemikalien über die Anlagerung eines FITC-Streptavidinkonjugats beurteilt. Eine 100 μg/ml Lösung von Streptavidin wurde in phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,5% Tween-20 resuspendiert. Tween-20 ist ein Tensid. Die Streptavidinlösung wurde mit den Partikeln zwei Stunden lang inkubiert. Unspezifisch gebundenes Streptavidin wurde dann durch Rühren der Partikel über einen Zeitraum von weiteren zwei Stunden in phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,5% Tween-20 (PBST) entfernt.
Für den Hybridisierungsassay wurde Streptavidin an die biotinylierte Oberfläche gebunden. Wie in dem oben beschriebenen Fluoreszenzstreptavidinassay wurden 100 μg/ml Streptavidinlösung in 0,05% PBST mit den Partikeln zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. Darauf folgte eine zweistündige Wäsche mit PBST, um unspezifisch gebundenes Streptavidin zu entfernen.
Ein alternatives Verfahren zum Anlagern eines aminomodifizierten Oligonucleotids ist die Verwendung eines homobifunktionellen Vernetzers wie Cyanurchlorid. Diese Verfahren dienen lediglich als Beispiele, und es gibt andere Verfahren, mit denen die Anlagerung von Molekülen an den Partikeln erreicht werden kann.
Nach der Funktionalisierung der Partikel mit NHS-Biotin und Streptavidin wurde biotinylierte DNA angelagert. Es wurden zwei Oligonucleotidsätze präpariert, wobei jeder Satz mit dem jeweils anderen perfekt zusammenpasste. Die Oligonucleotidsätze hatten eine Länge von 12 Nucleotiden. Ein Satz enthielt ein biotinyliertes Oligonucleotid, das an dem Partikel verankert war, wohingegen der andere Satz mit den komplementären Oligonucleotiden mit Fluorescein markiert war. Die beiden Sätze wurden dann miteinander unter Lösungsbedingungen, die zur Hybridisierung geeignet waren, vermischt, um die Brauchbarkeit des Systems zu testen.
Im Spezielleren wurden die biotinylierten Oligonucleotide eines Satzes mit den Partikeln bei einer Konzentration von 100 pM in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 2 M NaCl 20 Minuten lang bei 30°C inkubiert. Darauf folgten zwei Waschschritte, einer im Tris-Puffer, der zur Bindung verwendet wurde, gefolgt von einer Wäsche mit deionisiertem Wasser.
Der andere Satz von Oligonucleotiden mit dem fluoreszierenden Marker wurde mit den partikelgebundenen Oligonucleotiden in 50 mM Tris, 18 mM EDTA und 0,1% Triton bei einem pH-Wert von 8,5 30 Minuten lang bei einer Temperatur von 29°C inkubiert. Dies war zur Hybridisierung der Oligonucleotidsätze optimal.
Die Partikel wurden zweimal gewaschen, um ungebundene DNA zu entfernen und die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Die Partikel wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert und Fluoreszenz wurde mit der nachfolgend beschriebenen Anordnung nachgewiesen, damit die Anwesenheit der gebundenen DNA bestimmt werden konnte. Die Anwesenheit von Fluoreszenz auf der Oberfläche der Partikel zeigt, dass eine Hybridisierung stattgefunden hat und ist eine Bestätigung für die Brauchbarkeit dieses Ansatzes.
Fluoreszenzbilder der Mikropartikel wurden mit einem Mikroskrop, einem 25 Mw 488 nm Argonionenlaser und einer CCD-Kamera erhalten. Der Laserstrahl wurde durch eine Linse mit einer Brennweite von 50 cm verteilt und in das Auflichtsystem des Mikroskops mit justierbaren Spiegeln gekoppelt. Die Okulare wurden aus Sicherheitsgründen entfernt und durch eine integrierende CCD Kamera von Cohu ersetzt, mit einem 7-lagigen 550 nm Bandpassinterferenzfilter im Pfad, um den 488 nm Hauptstrahl zu entfernen. Die Kamera wurde an eine Scion LG-3 Nubus Bildfangschaltung in einem Macintosh Quadra 800 Computer angeschlossen, mit Einrichtungen zur Steuerung der Integrationsmerkmale der Kamera. Das Partikelbehandlungs- und Nachweissystem setzt ein Mikroskop zur Abbildung einer Durchflusszelle ein. Ein Durchflusszytometer wurde zur Behandlung der Kügelchen modifiziert, und die Kügelchen wurden durch das System mit etwa 1 Meter je Sekunde fließen gelassen. Obwohl jede beliebige Beleuchtungsquelle mit einer Lichtpunktgröße, die kleiner ist als das kleinste Merkmal auf den Kügelchen, verwendet werden kann, wurde in diesem Fall der Strahl eines Argonionenlasers (488 nm) verwendet. Die vorwärtsgestreuten und seitlich gestreuten Signale von den Kügelchen wurden mit einer Fotodioden/Fotovervielfacher-Anordnung nachgewiesen.
Mit Bezug auf 8 zeigen die Ansichten (a) und (b) Ausgabespuren, die von zwei unterschiedlich kodierten Partikeln erhalten wurden. Hierbei handelt es sich um Absorptionsspuren, so dass Täler in der Spur mit Ausstülpungen auf der Oberfläche des Mikropartikels übereinstimmen.
In einer Modifikation der oben beschriebenen Mikropartikel werden die Partikel mit einer NiCr oder anderen Reflektionsbeschichtung produziert. Würden Mikropartikel mit der Reflektionsbeschichtung mit dem hierin beschriebenen Nachweissystem nachgewiesen, dann könnte ein Reflektionsmuster anstelle eines Absorptionsmusters verfolgt werden. In dem Reflektionsmuster fallen Spitzen in der Spur mit Ausstülpungen auf der Mikropartikeloberfläche zusammen, während Täler in der Spur mit Vertiefungen in der Mikropartikeloberfläche übereinstimmen.
Eine zur Verwendung im obigen Verfahren geeignete fotolithographische Maske wird in eine Vielzahl von Regionen unterteilt, die jeweils eine Vielzahl von Kodes enthalten. Jedes Kügelchenmuster besteht aus 14 Bits und 7 μm Merkmalen. Die Länge eines typischen Kügelchens beträgt daher etwa 98 μm. Zwar führen 14 Bits zu einem Koderaum von insgesamt 16384 Kodes, doch gibt es eine Reihe von Verbesserungsmerkmalen, die diese Zahl auf eine reduziertere Anzahl von Kodes herabsetzen. Obwohl das Resultat ein reduzierter Koderaum ist, werden eindeutige Vorteile erhalten.
Die folgenden drei Verbesserungen bringen eindeutige Vorteile bezüglich eines verringerten Auftretens von Nachweisfehlern:

– Als maximale Zahl aufeinander folgender DC-Bits werden vier ausgewählt, so dass der ursprüngliche 16384 Koderaum auf 11072 herabgesetzt wird.
– Es wird eine Paritätsbeschränkung angewendet. Das heißt, man kann ein beliebiges der Bits in sein Komplement ändern, und das Ergebnis ist kein gültiger Kode. Dadurch werden Beschränkungen auferlegt, wie entweder eine gerade oder ungerade Zahl von 0en oder 1en in jedem gültigen Kode. Wir haben 1 Bit gerade Parität gewählt, so dass die Anzahl der 1en stets gerade ist. Dadurch wird der 11072 Koderaum auf 5536 herabgesetzt.
– Entfernen von Umkehrungen, um eine Leserichtung vorzuschreiben. Für jeden bestimmten Kode in dem Satz wird der Umkehrkode weggelassen; wenn ein Kode 321 lautet, dann kann er somit nur 321 sein, da 123 aus dem Koderaum beseitigt wurde. Durch diese Beseitigungen wird der 5536 Koderaum auf 2724 herabgesetzt.

Mit Folgendem werden eindeutige Vorteile im Hinblick auf Handhabung und Fehlernachweis erhalten:

– Redundanz – die Anzahl von Duplikatkodes. Die Anordnung der Kügelchen kann derart sein, dass die 2724 separaten und sequentiellen Kodes innerhalb von Rechtecken mit einer Größe von etwa 5 mm × 20 mm begrenzt sind. Dieses Maß wurde unter Berücksichtigung der Handhabung ausgewählt – nach der Kügelchenherstellung und Waferzerteilung kann das Rechteck in ein 1,5 ml Röhrchen (z. B. Eppendorf oder ähnliches) gegeben werden. Durch die Einführung dieses Merkmals kann nun ein kompletter Satz von Kügelchen in einem kleinen Volumen aufgenommen werden, das sich zentrifugieren lässt. 13.620 Kügelchen passen in dieses 5 mm × 20 mm große Rechteck, so dass eine Redundanzzahl von 5 je Kode erhalten wird.
– Der Kode erzeugt außerdem 88 'Palindrome', d. h. der Kode ergibt vorwärts wie rückwärts gelesen das Gleiche. Ein Beispiel hierfür ist 00001000010000. Die 88 Palindrome werden von dem Koderaum getrennt und für Test- und Fehlerprüfzwecke verwendet.

Die Erfindung wurde zwar hierin mit Bezug auf spezielle Ausgestaltungen beschrieben, doch wird es der fachkundigen Person verständlich sein, dass Variationen und Modifikationen möglich sind, ohne vom Umfang der folgenden Ansprüche abzuweichen.

Claims

Verfahren zur Herstellung kodierter Partikel, umfassend die folgenden Schritte: Bereitstellen einer Polymermaterialschicht auf einem Substrat; Unterteilen der Schicht in eine Mehrzahl von Partikeln, ohne die Integrität des Substrats zu zerstören; maschinenlesbares Kodieren der Partikel; und Entfernen der Partikel von dem Substrat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Partikel während der Unterteilung morphologisch kodiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Partikel nach dem Unterteilen, aber vor dem Entfernen von dem Substrat kodiert werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Adhäsion zwischen der genannten Schicht und dem Substrat durch eine strahlenempfindliche Opferlage erzeugt wird, deren Eigenschaften zur Verringerung der Stärke der Adhäsion modifiziert werden, um die Partikel freizugeben.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Partikel durch Laserbearbeitung unterteilt werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Kodieren die Bildung einer Mehrzahl von schaltbaren Elementen um die Peripherie jedes Partikels umfasst.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei jeder Partikel mit wenigstens einem Lesesinnidentifizierer gebildet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der maschinenlesbare Kode durch Bleichen der Fluoreszenz eines Bestandteils jedes Partikels gebildet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei definierte chemische oder biologische Bibliothekenmitglieder auf jeweiligen kodierten Partikeln getragen werden, bevor das Substrat entfernt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei definierte chemische oder biologische Bibliothekenmitglieder auf die genannten Partikel in einem Well einer Mikrotiterplatte aufgebracht oder darauf synthetisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei ein definiertes chemisches oder biologisches Bibliothekenmitglied auf jeden Partikel aufgebracht oder darauf synthetisiert wird, nachdem der genannte Partikel von dem genannten Substrat freigegeben wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei wenigstens zwei definierte chemische Bibliothekenmitglieder auf jedem Partikel vorgesehen werden, wobei jedes der genannten Mitglieder seinen eigenen jeweiligen Raum auf dem genannten Partikel einnimmt, der von dem Raum getrennt ist, der von dem oder jedem anderen Mitglied darauf eingenommen wird.