PL209100B1 - Zakodowany mikronośnik, sposób kodowania mikronośnika, sposób odczytu zakodowanego mikronośnika, sposób wykrywania obecności analitu w próbce i zastosowanie zakodowanego mikronośnika - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zakodowanego mikronośnika, sposobu kodowania takiego mikronośnika, sposób odczytu takiego zakodowanego mikronośnika, sposób wykrywania obecności lub nieobecności jednego lub kilku analitów w próbce i zastosowanie takiego zakodowanego mikronośnika do wytwarzania biblioteki chemicznej.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek odnosi się do zakodowanych mikronośników, a dokładniej mikronośników posiadających zapisane na sobie kody. Każde odniesienie w niniejszym ujawnieniu do kodów zapisanych „na mikronośnikach obejmuje zarówno kody zapisane na powierzchni mikronośników, jak też kody zapisane we wnętrzu mikronośników (na ich wewnętrznej głębokości). Niniejszy wynalazek odnosi się także do sposobów zapisywania kodów na mikronośnikach, sposobów odczytu kodów i w zastosowania zakodowanych mikronoś ników. Sposób kodowania mikronoś ników wedł ug wynalazku obejmuje eksponowanie mikronośników niosących substancję zdolną do wyświecania na źródło światła o wysokiej rozdzielczości przestrzennej w celu wyświecenia kodów na mikronośnikach. Zakodowane mikronośniki można wykorzystać, na przykład, jako materiały nośnikowe w oznaczeniach i syntezach chemicznych i biologicznych.

Opis stanu techniki

Odkrywanie i przeszukiwanie (skrining) leków w dziedzinach chemicznych i biologicznych zwykle wiąże się z przeprowadzaniem testów na bardzo dużej liczbie związków lub cząsteczek. Testy takie obejmują zazwyczaj przeszukiwanie bibliotek chemicznych pod kątem związków będących przedmiotem zainteresowania, przeszukiwanie pod kątem szczególnych cząsteczek docelowych w próbkach testowych i ogólnie testowanie mające na celu stwierdzenie występowania oddziaływań chemicznych lub biologicznych będących przedmiotem zainteresowania między cząsteczkami. Wyżej opisane testy często wymagają wykonania tysięcy pojedynczych reakcji chemicznych lub biologicznych. Na przykład, test mający na celu odkrycie leku może wiązać się z analizą tysięcy związków pod kątem specyficznego analitu docelowego. Każdy związek, dla którego obserwuje się reakcję, wiązanie lub inne oddziaływanie z analitem docelowym może być obiecujący w pewnej liczbie zastosowań, w których uważa się, że obserwowane oddziaływanie może mieć znaczenie.

Istnieje szereg problemów związanych z przeprowadzaniem dużej liczby pojedynczych reakcji wymaganych w wyżej opisanych testach. Prawdopodobnie najistotniejszym problemem jest konieczność znakowania i śledzenia każdej reakcji. Na przykład, jeśli reakcję będącą przedmiotem zainteresowania zaobserwuje się tylko w jednej z grupy tysięcy reakcji, badacz musi być zdolny do ustalenia, który z tysięcy wyjściowych związków lub cząsteczek wywołał tę reakcję.

Jedną z konwencjonalnych metod śledzenia tożsamości reakcji jest fizyczne oddzielanie każdej reakcji w indywidualnym naczyniu w obrębie macierzy o dużej gęstości i przechowywanie zapisu wskazującego jakie pojedyncze reagenty wykorzystano w każdym naczyniu. Tak więc na przykład, gdy reakcję będącą przedmiotem zainteresowania zaobserwuje się w naczyniu oznaczonym numerem 5 z 1000, badacz może odnieść się do zapisu reagentów użytych w naczyniach i z zapisu dla naczynia 5 dowie się jakie specyficzne reagenty były obecne w tym naczyniu i doprowadziły do powstania reakcji będącej przedmiotem zainteresowania. Przykładami macierzy o dużej gęstości opisanych powyżej są płytki do mikromiareczkowania o 384, 864, 1536, 3456 i 9600-studzienkach, gdzie każda studzienka płytki do mikromiareczkowania stanowi miniaturowe naczynie reakcyjne. Zminiaturyzowane studzienki reakcyjne wykorzystuje się dlatego, że pozwalają one zmniejszyć przestrzeń konieczną do przeprowadzenia testów i obniżają koszt odczynników stosowanych w testach.

Jednakże zastosowanie zbiorników będących płytkami do mikromiareczkowania w testach biologicznych i chemicznych ma pewne wady. Przykładowo zastosowanie płytek wymaga uważnego oddzielania bardzo dużej liczby pojedynczych naczyń reakcyjnych i raczej nie pozwala na zachodzenie wszystkich reakcji swobodnie i często wygodniej w jednym naczyniu reakcyjnym. Ponadto wymóg przestrzennego rozdzielenia objętości reakcyjnych wiąże się z fizycznym ograniczeniem co do rozmiaru zastosowanej płytki do mikromiareczkowania, a więc co do liczby różnych reakcji, które można przeprowadzić na płytce.

W świetle opisanych powyż ej ograniczeń dotyczących zastosowań płytek do mikromiareczkowania poczyniono pewne próby mające na celu opracowanie innych środków do śledzenia pojedynczych reakcji w testach o dużej wydajności. W sposobach takich porzucono koncepcję przestrzennego rozdzielania reakcji i zamiast tego śledzi się pojedyncze reakcje za pomocą innych środków. OpracoPL 209 100 B1 wano na przykład wysokowydajne metody przeprowadzania testów i reakcji na podłożach będących mikronośnikami. Każdy mikronośnik może zawierać jeden szczególny ligand związany ze swoją powierzchnią, w taki sposób aby działał jako reagent, przy czym taki mikronośnik może dodatkowo zawierać „kod identyfikujący mikronośnik, a zatem identyfikujący szczególny ligand związany z jego powierzchnią. Opisane powyżej metody pozwalają na „losową obróbkę, co oznacza, że tysiące unikalnie zakodowanych mikronośników, z których każdy posiada związany ze swoją powierzchnią ligand, można zmieszać i równocześnie poddać testowi. Z mikronośników, w których zajdzie będąca przedmiotem zainteresowania reakcja między związanym ligandem i analitem docelowym można następnie odczytać kod, co prowadzi do identyfikacji liganda, który skutkował zajściem odpowiedniej reakcji.

Opisana powyżej praktyka losowej obróbki wymaga dokładnego kodowania oddzielnie każdego mikronośnika, a ponadto wymaga dokładnej i konsekwentnej identyfikacji kodów. Ze względu na to, że testy wykorzystujące do uzyskania wyników losową obróbkę oparte są w dużym stopniu na kodowaniu mikronośników, to jakość testów w dużym stopniu zależy od jakości i możliwości odczytania kodów na mikronośnikach. Próby kodowania mikronośników są wciąż ograniczone do barwienia różnicowego (mikrosfery Dye-Trak), znakowania fluorescencyjnego (fluorosfery Nu-Flow), tak zwanych zdalnie programowanych macierzy z pamięcią (IRORI, Patent USA nr 5 751 629), odłączalnych znaczników, takich jak oligonukleotydy i małe peptydy (Patent USA nr 5 565 324; Patent USA nr. 5 721 099; Patent USA nr 5 789 172) oraz cząsteczek stałych niosących przekaźniki (Patent USA nr 5 736 332). Ujawnienia cytowanych powyżej patentów włącza się niniejszym jako odesłanie.

Wszystkie z opisanych powyżej znanych sposobów kodowania mikronośników mają wady. Na przykład, mikronośniki rozróżniane wyłącznie na podstawie rozmiaru, kształtu, koloru, intensywności fluorescencji lub ich kombinacji często nie mogą zapewnić wystarczająco unikalnej przy odczycie kombinacji tych zmiennych, by stworzyć ogromną liczbę unikalnych kodów niezbędnych przy testowaniu odpowiednio dużej liczby różnych cząsteczek. Dodatkowo, każdy mikronośnik niosący na swojej powierzchni ciało obce, służące jako kod, takie jak znaczniki odłączalne lub znaczniki fluorescencyjne, niesie ryzyko, że przyłączone reszty mogą zakłócać w testach wiązanie lub reakcję związanych z ligandem cząsteczek na mikronośnikach ukierunkowanych na anality docelowe. Po rozdzieleniu będących przedmiotem zainteresowana nośników wykazujących odpowiednią reakcję, metody kodowania mikronośników z odłączalnymi znacznikami wymagają także często konieczności przeprowadzenia dodatkowego etapu cięcia i analizy znaczników by ostatecznie poznać tożsamość odpowiadających im ligandów na mikronośnikach, gdzie zaszły odpowiednie reakcje. Etap cięcia naturalnie wydłuża czas trwania testów i zwiększa wysiłek potrzebny do ustalenia ich wyników.

W ś wietle powyż szego istnieje zapotrzebowanie na proste sposoby identyfikacji pojedynczych mikronośników w dużej populacji pod innymi względami identycznych mikronośników, w szczególności istnieje zapotrzebowanie na sposoby zapisywania wielu unikalnych kodów, których nie będzie trzeba przyłączać w postaci ciał obcych do powierzchni mikronośników.

Podsumowanie wynalazku

Celem wynalazku jest dostarczenie mikronośnika, zakodowanego bez konieczności przyłączania do jego powierzchni ciała obcego służącego jako kod. Ponadto celem wynalazku jest dostarczenie sposobu kodowania mikronośników, który może zapewnić w zasadzie nieskończenie wiele możliwości w postaci róż nych unikalnych kodów, które mogą być zapisywane i odczytywane z mikronoś ników.

Niniejszy wynalazek realizuje opisane powyżej cele poprzez dostarczanie mikronośników, na których zapisane są kody.

Przedmiotem wynalazku jest zakodowany mikronośnik, charakteryzujący się tym, że jest zakodowany zabezpieczonym kodem zapisanym na powierzchni mikronośnika albo na jego wewnętrznej głębokości, przy czym mikronośnik zawiera jeden lub więcej ligandów związanych z mikronośnikiem i przy czym kod jest wzorem zapisanym poprzez wytrawianie chemiczne albo z wykorzystaniem źródła światła o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, albo źródła emitującego promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie alfa lub beta, lub wiązki jonowe.

Korzystnie kod jest zapisany na wewnętrznej głębokości mikronośnika.

Korzystniej kod jest zapisany w płaszczyźnie środkowej mikronośnika.

Korzystnie mikronośnik stanowi mikrosferę.

Korzystniej mikrosfera ma średnicę od 1 do 200 μm.

Korzystnie źródło światła o wysokiej rozdzielczości przestrzennej stanowi laser lub lampa. Korzystnie kod zapisany jest poprzez fotowyświecanie, wyświecanie albo fotochromowanie.

PL 209 100 B1

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób kodowania mikronośnika, polegający na tym, że obejmuje etap, w którym zapisuje się zabezpieczony kod na powierzchni mikronośnika albo na jego wewnętrznej głębokości poprzez (i) ekspozycję mikronośnika na źródło światła o wysokiej rozdzielczości przestrzennej; albo (ii) ekspozycję mikronośnika na źródło emitujące promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie alfa lub beta, lub wiązki jonowe; albo (iii) wytrawianie chemiczne mikronośnika.

Korzystnie kod zapisuje się na wewnętrznej głębokości mikronośnika.

Korzystniej kod zapisuje się w płaszczyźnie środkowej mikronośnika.

Korzystnie stosuje się mikronośnik, który jest mikrosferą.

Korzystniej stosuje się mikrosferę o średnicy od 1 do 200 μm.

Korzystnie jako źródło światła stosuje się laser lub lampę.

Korzystnie kod zapisuje się na mikronośniku poprzez fotowyświecanie, wyświecanie albo fotochromowanie.

Korzystniej stosuje się mikronośnik zawierający cząsteczki fluorescencyjne, a kod zapisuje się na mikronośniku poprzez wyświecanie cząsteczek fluorescencyjnych.

Jeszcze korzystniej kod zapisuje się poprzez wyświecanie cząsteczek fluorescencyjnych z wytworzeniem dwóch lub więcej różnych poziomów intensywności fluorescencji w wyświeconej części kodu.

Korzystnie stosuje się mikronośnik zawierający materiał wybrany z grupy materiałów stałych, półstałych i ich kombinacji.

Korzystnie jako mikronośnik stosuje się komórkę prokariotyczną albo eukariotyczną.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób odczytu zakodowanego mikronośnika określonego powyżej, polegający na tym, że w jednym z etapów sposobu obserwuje się kod w mikroskopie konfokalnym.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania obecności lub nieobecności jednego lub kilku analitów docelowych w próbce, polegający na tym, że wybiera się jeden lub kilka ligandów, które wiążą lub reagują z jednym lub kilkoma analitami, wiąże się ligandy z różnorodnymi zakodowanymi mikronośnikami określonymi powyżej, koreluje się ligandy z kodami na mikronośnikach, z którymi ligandy są związane, kontaktuje się jeden lub kilka analitów z ligandami związanymi z mikronośnikami, obserwuje się mikronośniki, w przypadku których analit został związany lub przereagował z ligandem związanym z mikronośnikiem oraz odczytuje się kody na mikronośnikach i identyfikuje ligandy, z którymi przereagował jeden lub kilka analitów, przez co określa się obecność lub nieobecność jednego lub kilku analitów.

Korzystnie jako analit docelowy stosuje się kwas nukleinowy, przy czym stosuje się co najmniej jeden ligand związany z mikronośnikiem w postaci komplementarnego kwasu nukleinowego.

Korzystniej stosuje się hybrydyzację DNA.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie zakodowanego mikronośnika określonego powyżej do wytwarzania biblioteki chemicznej.

Korzystnie wytwarzana jest kombinatoryczna biblioteka chemiczna.

Korzystne mikronośniki zawierają zdolne do wyświecania substancje, przykładowo cząsteczki fluorescencyjne. W sposobie kodowania mikronośników według wynalazku wykorzystuje się ekspozycję mikronośników zawierających zdolną do wyświecania substancję na światło o wysokiej rozdzielczości przestrzennej w celu wyświecenia na nich kodów. Sposób ten może w korzystnym wykonaniu wykorzystywać wyświecanie kodów na mikronośnikach fluorescencyjnych, gdzie wyświecanie skutkuje powstaniem albo takich samych, albo zróżnicowanych, poziomów intensywności fluorescencji w obrębie wyświeconej części kodu. Innym korzystnym sposobem kodowania mikronośników jest zapisywanie kodów na wewnętrznej głębokości mikronośników.

W innym zalecanym wykonaniu dużą liczbę związków chemicznych lub cząsteczek biologicznych wiąże się z odpowiednio dużą liczbą mikronośników według wynalazku, po czym związane z mikronośnikami ligandy miesza się i poddaje jednoczesnej reakcji zgodnie z protokołem odpowiedniego testu lub przeszukiwania, a następnie identyfikuje się ligandy, które uległy reakcji poprzez odczyt kodów na mikronośnikach, z którymi te ligandy są związane.

Zakodowane mikrosfery według niniejszego wynalazku pozwalają na jednoczesną analizę wielu próbek w pojedynczym naczyniu, w którym przeprowadzana jest reakcja, przy wykorzystaniu pojedynczej porcji próbki. Zastosowanie mikronośników według niniejszego wynalazku w wysokowydajnych testach i reakcjach jest przez to dużo bardziej korzystne w porównaniu z zastosowaniem konwencjonalnych sposobów, wykorzystujących technologie płytek do mikromiareczkowania.

PL 209 100 B1

Mikronośniki według niniejszego wynalazku dostarczają również właściwie nieskończoną liczbę kodów, które mogą być zapisane i odczytane z mikrosfer, dzięki temu są korzystniejsze w porównaniu ze znanymi mikronośnikami kodowanymi przy zastosowaniu znaczników barwnych lub fluorescencyjnych, które mogą zapewniać dużo mniejszą liczbę możliwości kodowania. Mikronośniki według niniejszego wynalazku są również korzystniejsze niż mikronośniki zakodowane za pomocą przyłączonych do ich powierzchni ugrupowań. Jest tak, ponieważ zapisy na mikronośnikach według niniejszego wynalazku nie niosą ze sobą ryzyka potencjalnego zakłócania oddziaływań ligand-analizowana próbka, które może mieć miejsce na powierzchni mikronośnika.

Dodatkowe cechy i zalety wynalazku są przedstawione w następującym szczegółowym opisie i powinny być oczywiste lub wynikać z realizacji praktycznej wynalazku. Zalety wynalazku są zrealizowane i osiągnięte przez zakodowane mikronośniki i sposoby wyszczególnione w opisie i zastrzeżeniach. Zarówno ogólny, jak i szczegółowy opis wynalazku ma na celu prezentację wynalazku w sposób przykładowy a nie jego ograniczenie.

Krótki opis figur

Fig. 1 ilustruje kilka zasad konwencjonalnej mikrofotolizy i SCAMP.

Fig. 2a i 2b ilustrują kod paskowy i pierścieniowy wykorzystujące różne intensywności, gdzie każdą intensywność oznacza się jako inny kolor pokazany na rysunkach.

Fig. 3a i 3b ilustrują obrazy konfokalne płaszczyzny środkowej mikrosfery FD148-dex-ma przed (na górze) i po wyświecaniu (na dole) paska 3 μm około 10 μm pod powierzchnią mikrosfery.

Fig. 4 ilustruje krzywe odzyskiwania fluorescencji FD148 w mikrosferach 148-dex-ma (A) i FITC w mikrosferach dex-ma wypełnionych FITC poprzez zanurzenie w roztworze FITC (B).

Fig. 5 ilustruje obraz konfokalny płaszczyzny środkowej mikrosfery FD148-dex-ma po wyświeceniu dowolnego kształtu geometrycznego przez SCAMP.

Fig. 6a i 6b ilustruje obrazy konfokalne płaszczyzny środkowej 45 μm lateksowej kulki wyznakowanej FITC godzinę po wyświeceniu kodu paskowego (Fig. 6a) i kodu paskowego z numerem (Fig. 6b).

Fig. 7 ilustruje obraz konfokalny płaszczyzny środkowej 45 μm lateksowej kulki wyznakowanej FITC godzinę po wyświeceniu kodu R1247.

Fig. 8 ilustruje obraz konfokalny płaszczyzny środkowej 45 μm lateksowej kulki wyznakowanej FITC godzinę po wyświeceniu znaku Ghent University.

Fig. 9 ilustruje obraz konfokalny płaszczyzny środkowej 45 μm lateksowej kulki wyznakowanej FITC godzinę po wyświeceniu znaku firmy Tibotec.

Fig. 10a ilustruje obrazy konfokalne kodów wyświeconych do różnych intensywności, a Fig. 10b, 10c i 10d graficznie ilustrują różne intensywności w obrębie kodów.

Fig. 11a i 12a ilustrują obrazy konfokalne kodów wyświeconych do różnych intensywności, a Fig. 11b i 12b graficznie ilustrują różne intensywności w obrębie odpowiadających kodów.

Szczegółowy opis wynalazku

W jednym z zastosowań niniejszy wynalazek dotyczy mikronośników posiadających zapisane na sobie kody. Mikronośniki według wynalazku mogą być wykonane, przykładowo, z dowolnego materiału powszechnie wykorzystywanego w technologiach związanych z wysokowydajnym przeszukiwaniem i diagnostyce. Przykładowo, mikronośniki mogą być wykonane z materiałów stałych, półstałych lub ich kombinacji. Do nieograniczających przykładów tych materiałów należą: lateks, polistyren, sieciowane dekstrany, metylostyren, poliwęglan, polipropylen, celuloza, poliakrylamid i dimetylakrylamid. Do zalecanych materiałów zalicza się lateks, polistyren i sieciowane dekstrany. Mikronośnikami mogą być również komórki prokariotyczne albo eukariotyczne.

Mikronośniki mogą mieć dowolne kształty i rozmiary umożliwiające ich kodowanie i zastosowanie. Przykładowo, mikronośniki mogą mieć formę sferyczną lub kulistą, która nie koniecznie musi być sferyczna. Mikronośniki mogą mieć, na przykład, kształt cylindryczny lub owalny. W przypadku kształtu sferycznego mikronośniki mogą mieć na przykład średnicę 1-200 μm.

Kody zapisane na mikronośnikach mogą stanowić dowolny kształt geometryczny, wzór lub symbol, który może być zapisany i odczytany z mikronośnika. Przykładowo, kody mogą być zapisane jako numery lub litery oraz w postaci symboli, rysunków, kodów kreskowych, kodów pierścieniowych lub trójwymiarowych. Kody pierścieniowe są podobne do kodów kreskowych, z tym wyjątkiem, że zamiast pasków stosowane są koncentryczne pierścienie. Przykładowo, pierścień może zawierać tę samą informację co jeden pasek. Kody mogą być zapisane na powierzchni mikronośników lub na ich wewnętrznej głębokości. Przykładowo, kody mogą być zapisane na wewnętrznej głębokości mikrono6

PL 209 100 B1 śników, a w szczególności na płaszczyźnie środkowej mikronośników. W zależności od kształtów mikronośników, płaszczyzna środkowa może być zalecaną lokalizacją zapisu kodu, ponieważ może ona zapewnić największą powierzchnię do zapisu. Ponadto, w przypadku mikronośników mających zakrzywione powierzchnie bardziej zalecany może być zapis kodu raczej na ich wewnętrznych głębokościach niż na powierzchniach zakrzywionych. Jest to spowodowane tym, że często łatwiej jest zapisać i odczytać kody z powierzchni pł askiej niż powierzchni zakrzywionej.

Mikronośniki według niniejszego wynalazku mogą zawierać zdolne do wyświecania substancje a kody na mikronoś nikach mogą być w postaci wyświeconych wzorów w obrę bie zdolnych do wyś wiecania części mikronośników. Mikronośniki mogą zawierać zdolne do wyświecania substancje zarówno na powierzchni, jak i w środku. Każde odwołanie w niniejszym opisie do wyświecania substancji „na mikronośnikach obejmuje wyświecanie na powierzchni mikronośnika, jak również wyświecanie na jego wewnętrznej głębokości. Do zalecanych zdolnych do wyświecania substancji należą: substancje fluorescencyjne lub substancje absorbujące promieniowanie elektromagnetyczne. Mikronośniki mogą zawierać również luminofory. Przykładami luminoforów, które mogą być wykorzystywane są: substancje fluorescencyjne, substancje fosforescencyjne i scyntylatory. Ponadto mogą być zastosowane substancje chemiluminescencyjne, bioluminoscencyjne lub barwne. Do zdolnych do wyświecania substancji w szczególności należą izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), fikoerytryny, kumaryny, Lucifer yellow i rodamina. Zdolne do wyświecania substancje powinny być dobrane tak, aby w momencie gdy następuje wyświecanie kod pozostawał na mikronośniku przez czas wymagany przy danym zastosowaniu mikronośników i wystarczającym do odczytu kodów. Zatem pewna dyfuzja niewyświeconych cząsteczek w kierunku wyświeconych powierzchni jest dopuszczalna, pod warunkiem, że przez użyteczny okres czasu zapewniona jest możliwość odczytu kodu.

Kody wyświecone na mikronośnikach mogą być również zapisane z różną intensywnością fluorescencji lub koloru w obrębie wyświeconych powierzchni mikronośników. Przykładowo, wyświecony kod może zawierać kilka różnych stopni wyświecenia, a przez to posiadać kilka różnych intensywności fluorescencji w obrębie wyświeconego regionu jako takiego. Zatem, mikronośniki mogą być kodowane nie tylko poprzez różne kształty geometryczne wyświeconych wzorów na mikronośnikach, lecz również przy wykorzystaniu różnych intensywności fluorescencji w obrębie wzoru.

W innym wykonaniu wynalazek dotyczy sposobu kodowania mikronośników. Sposób ten może być zastosowany do zapisywania kodów zarówno na powierzchni mikronośników, jak i na ich wewnętrznej głębokości. Kody mogą być zapisane na mikronośnikach przykładowo poprzez użycie źródła światła o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, takiego jak: laser, lampa, lub źródła emitującego promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie α lub β, wiązki jonowe lub dowolną formę promieniowania elektromagnetycznego. Kody te mogą być również zapisywane na mikronośnikach poprzez fotochromowanie lub wytrawianie chemiczne. Korzystnym sposobem zapisywania kodów jest wykorzystanie źródła światła o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, w szczególności lasera lub lampy, w połączeniu z mikroskopem konfokalnym. Innym zalecanym sposobem zapisywania kodów jest wyświecanie kodu na zdolnej do wyświecania substancji na mikronośniku. Korzystnymi zdolnymi do wyświecania substancjami są substancje wymienione powyżej w opisie mikronośników i zawierające cząsteczki fluorescencyjne. Odnośnie objętości materiału, który może być wyświecony w obrębie mikronośników, przykładowo może to być objętość pomiędzy 1 nm³ a 8 mm³ mikronośnika.

Jednym z zalecanych sposobów zapisywania kodów na mikronośnikach jest wykorzystanie mikrofotolizy skanującej (SCAMP). Parametry techniczne SCAMP zostały po raz pierwszy opisane w P. Wedekind i wsp. „Scanning microphotlysis: a new photobleaching technigue based on fast intensity modulation of a scanned laser beam and confocal imaging. Journal of Micorscopy, tom 176, str. 23-32 (1994), które włącza się tutaj przez odesłanie. W powyższym artykule rozważane jest zastosowanie SCAMP do wyświecania i wizualizacji wzorów na cienkiej powierzchni fluorescencyjnej lakieru do paznokci. Wymieniony artykuł nie sugeruje zastosowania SCAMP do kodowania mikronośników.

W niniejszym wynalazku zastosowano SCAMP w celu zapisywania kodów na mikronoś nikach poprzez wyświecanie cząsteczek fluorescencyjnych w obrębie mikronośników. Fotowyświecanie jest dobrze znanym zjawiskiem dotyczącym blaknięcia kolorów, które związane jest z faktem, że określone długości fal światła padając na dany barwnik wywołują rezonans cząsteczek barwnika, a ostatecznie jego rozpad. To zjawisko jest również przyczyną tendencji cząsteczek fluorescencyjnych do wyświecania po wzbudzeniu przez silną wiązkę lasera o określonej długości fali.

Przez wiele lat techniki mikrofotolizy fluorescencyjnej (MP), znane również jako techniki odzyskiwania fluorescencji po fotowyświecaniu (FRAP), były wykorzystywane do badania ruchliwości cząPL 209 100 B1 steczek fluorescencyjnych zarówno w podłożach biologicznych, takich jak komórki i tkanki, jak i niebiologicznych. Peters i Scholtz, „Fluorescence photobleaching techniques, w New Techniques of Optical Microscopy and Microspectroscopy, R.J. Cherry (ed.), MacMillan, New York, str. 199-228 (1991); De Smedt i wsp. Structural Information on Hyaluronic Acid Solutions as Studied by Probe Diffusion Experiments, Macromolecules, tom. 27, str. 141-146 (1994), De Smedt i wsp., Diffusion of Macromolecules in Dextran Methacrylate Solutions and Gels as Studied by Confocal Scanning Laser Microscopy, Macromolecules, tom. 30, str. 4863-4870 (1997).

Ruchliwość cząsteczek fluorescencyjnych może być mierzona poprzez wyświecanie (fotolizę) cząsteczek fluorescencyjnych poruszających się w płaszczyźnie fokalnej wiązki światła, którą w szczególnoś ci moż e być wią zka lasera (Fig. 1: A, B). Zaraz po krótkim procesie wyś wiecania, zwykle około 10 ms, znacząco osłabiona wiązka lasera mierzy odzyskiwanie fluorescencji w powierzchni poddanej fotowyświecaniu, spowodowane dyfuzją cząsteczek fluorescencyjnych z pobliskich, niepoddanych wyświecaniu, powierzchni do powierzchni wyświeconej (Fig. 1: B, C). Charakterystykę czasu dyfuzji, miernika współczynnika dyfuzji, oraz frakcje odpowiednio nieruchomych i ruchomych cząsteczek fluorescencyjnych można wyprowadzić z odzyskiwania fluorescencji w wyświeconej powierzchni (Fig. 1 D).

Ruchoma frakcja, R, jest zdefiniowana jako:

_R = F(«>) - F(0)

F(i) - F(0) gdzie F(i) jest intensywnością fluorescencji w wyświeconym fragmencie przed wyświeceniem,

F(0) jest intensywnością fluorescencji w wyświeconym fragmencie tuż po wyświeceniu, a F(^) jest intensywnością fluorescencji w wyświeconym fragmencie długo po wyświeceniu.

W eksperymentach fotowyświecania wykorzystujących konwencjonalny (nie-skanujący) mikroskop świetlny stacjonarna wiązka światła jest zogniskowana na próbkę zarówno podczas procesu wyświecania, jak i odzyskiwania. Stacjonarne pozycjonowanie wiązki światła (laser) podczas procesu wyświecania powoduje, że fotowyświecona powierzchnia ma kształt koła. Chociaż nie-skanujące mikroskopy świetlne technicznie promieniują na powierzchnię o średnicy 2 μm lub mniej, to często może dochodzić do poszerzenia wyświecanego pola z powodu stacjonarnego umieszczenia wiązki lasera. Powoduje to, że wyświecone pola mają zazwyczaj średnicę 10-20 μm lub nawet więcej, tak jak przedstawiono schematycznie na Fig. 1:B-II.

Dostępność laserowych mikroskopów skanujących otworzyła nowe możliwości w metodach mikrofotolizy. Połączenie fotolizy, skanowania wiązką i mikroskopii konfokalnej doprowadziło do opracowania SCAMP. W technice SCAMP wyświecanie ma miejsce podczas skanowania próbki poprzez przełączanie pomiędzy niskim poziomem intensywności monitorującej a wysokim poziomem intensywności fotowyświecania laserem w czasie mniejszym niż mikrosekundy, z wykorzystaniem przyrządu do modulacji intensywności, takiego jak modulator akustooptyczny (AOM). Połączenie wyświecania podczas skanowania oraz zastosowania AOM, generującego wyjątkowo krótkie impulsy wyświecania, przeciwdziała potencjalnemu poszerzaniu wyświecanego pola, które ma miejsce przy zastosowaniu konwencjonalnych metod mikrofotolizy w powodu dłuższych czasów fotowyświecania i zastosowania stacjonarnej wiązki laserowej. SCAMP pozwala na wyświecanie pól w próbce mniejszych niż 1 μm.

Fig. 1 przestawia schematycznie, w jaki sposób SCAMP może być stosowane do mierzenia ruchliwości cząsteczek fluorescencyjnych. Po pierwsze, fluorescencja wzdłuż jednej osi X płaszczyzny będącej przedmiotem zainteresowania w próbce jest mierzona poprzez jej skanowanie (Fig. 1: A-linia przerywana). Po drugie, do wyświecania wybierany jest mały segment (np. 3 μm) osi x, w której ma być mierzona dyfuzja, (Fig. 1: B-I). Długość oraz pozycja, jak również numer segmentów mogą być w sposób dowolny wybierane przez oprogramowanie wykorzystywane w SCAMP. Fotowyświecanie takiego segmentu ma miejsce w czasie, gdy wiązka laserowa skanuje ten segment, czemu towarzyszy przejściowy, silny wzrost intensywności wiązki laserowej. Zwykle, stosunek pomiędzy poziomami intensywności przy fotowyświecaniu i intensywności przy monitorowaniu jest większy niż 100.

Ze względu na to, że w SCAMP wykorzystywany jest mikroskop konfokalny, detekcja fluorescencji jest możliwa nie tylko na powierzchni próbki, ale również na dowolnej głębokości próbki z lekką interferencją promieniowania z niezogniskowanych poziomów próbki (jak w konwencjonalnym mikroskopie). Przeciwnie, w przypadku stosowania lampy fluorescencyjnej do iluminacji oraz konwencjonalnego mikroskopu niekonfokalnego tylko powierzchnia próbki jest obserwowana. Kodowanie na wewnętrznej głębokości jest zatem trudne do zaobserwowania w zwykłym mikroskopie, podczas gdy jest

PL 209 100 B1 dobrze widoczne przy zastosowaniu optyki konfokalnej. Zarówno konfokalne, jak i skanujące cechy mikroskopu pozwalają na fotolizę i odczytywanie mikroregionów w dobrze zdefiniowanych pozycjach na mikronośniku. Opisywany wynalazek różni się od innych, znanych w dziedzinie, zastosowań, ponieważ zastosowanie SCAMP o wysokiej rozdzielczości przestrzennej pozwala w nieodwracalny sposób znakować mikrosfery w środku, na określonej głębokości i odczytywać kody technikami konfokalnymi.

Sposoby według wynalazku do zapisywania kodów na mikronośnikach mogą obejmować również wyświecanie mikronośników tak, aby w rezultacie otrzymywać różne poziomy intensywności substancji w kodzie. Oprócz przekazywania informacji w postaci wzoru kodu jako takiego, informacja może być również przekazywana poprzez różne intensywności wyświeconych wzorów. Możliwość kodowania mikronośników z różnymi intensywnościami pozwala na umieszczanie mniejszych kodów na mikronośnikach, tym samym pozwala na ograniczenie potrzebnej powierzchni przy zachowaniu tej samej lub większej liczby unikalnych identyfikatorów kodowanych na mikronośnikach. Przykładowo, zgodnie z wynalazkiem możliwe jest wyświecanie czterech różnych intensywności na próbce. Można to osiągnąć na kilka sposobów, przykładowo, przez powtarzanie wyświecania pewnych części próbki względem innych części, lub przez ustawianie różnych poziomów mocy akustycznej na AOM, w celu wytworzenia zróżnicowanych mocy lasera, co z kolei spowoduje wyświecenie wzorów mających różne intensywności w zależności od mocy wiązki laserowej użytej dla każdej z części kodu. Fig. 2a i 2b są przykładami kodów wyświeconych przy zastosowaniu różnych intensywności, pierwszy ze wzorem paskowym, a drugi ze wzorem pierścieniowym. Różne intensywności kodów są przedstawione przez różne kolory na Figurach. Różne poziomy intensywności mogą być również połączone z różnymi szerokościami elementów kodujących, takich jak paski w kodach kreskowych.

Zgodnie z wynalazkiem opisano odczytywanie kodów zakodowanych na mikrosferach. Odczytywanie kodów może być przeprowadzane przy zastosowaniu zwykłego mikroskopu, jeżeli kod jest na powierzchni mikronośnika lub, jeżeli mikronośnik jest wystarczająco przeźroczysty, na wewnętrznej głębokości mikronośnika. Odczytywanie kodów może być również przeprowadzane przy zastosowaniu mikroskopu konfokalnego. Dokładniej, kody mogą być odczytywane poprzez zawieszanie mikronośników w środowisku wodnym, umieszczanie mikronośników pomiędzy dwoma szkiełkami lub ich umieszczanie w mikrokapilarach, a następnie obserwowanie kodów poprzez mikroskop konfokalny.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też zastosowanie zakodowanych mikrosfer według wynalazku. Mikronośniki mogą być zastosowane jako nośniki do pomiaru oddziaływań biomolekularnych, w badaniach nad lekami, testach wiązania receptorów, środkach terapeutycznych, diagnostyce medycznej, chemii kombinatorycznej, izolacji i oczyszczaniu cząsteczek docelowych, wyłapywaniu i detekcji makrocząsteczek do celów analitycznych, selektywnym oczyszczaniu zanieczyszczeń, katalizie enzymatycznej, modyfikacji chemicznej, reakcjach hybrydyzacji oraz zastosowaniach w kryminalistyce.

Mikronośniki mogą być dogodnie zastosowane jako nośniki w testach biologicznych oraz chemicznych i syntezach. W tym przypadku mikronośniki mogą zawierać jeden lub więcej ligandów związanych z powierzchnią mikronośników. Mikronośniki ze związanymi ligandami mogą być następnie kontaktowane z analitami docelowymi w celu określenia obecności lub braku analitów docelowych będących przedmiotem zainteresowania, lub mogą służyć jako nośniki w reakcjach chemii kombinatorycznej przeprowadzanych z wykorzystaniem liqandów związanych z mikronośnikiem. Przykłady analitów docelowych dla ligandów związanych z mikronośnikami są antygeny, przeciwciała, receptory, hapteny, enzymy, białka, peptydy, kwasy nukleinowe, leki, hormony, patogeny, toksyny lub inne środki chemiczne lub cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania. Określenie czy ligand związany z mikronoś nikiem wiąże się lub reaguje z analitem docelowym, moż e być przeprowadzone przy zastosowaniu konwencjonalnych technik znanych w dziedzinie. Przykładowo, na zajście reakcji może wskazywać odpowiedź luminometryczna. Na zajście reakcji może wskazywać także odpowiedź kolorymetryczna, chemiluminometryczna i fluorometryczna. Ligand związany z mikronośnikiem będącym przedmiotem zainteresowania może być zaprojektowany w taki sposób, że w obecności analitu będącego przedmiotem zainteresowania, na który jest ukierunkowany, zmienia się optyczna sygnatura mikrosfery. Przykładowo, zmiana w sygnaturze optycznej może być wynikiem reakcji fotochemicznej, zachodzącej, gdy wiązanie lub reakcja ma miejsce pomiędzy ligandem a analitem. Mikronośniki mogą być później obserwowane pod mikroskopem w celu wykrycia fluorescencji związanej z reakcją fotochemiczną.

Do mikronośników według opisywanego wynalazku można przyłączyć, jako ligandy, szereg związków chemicznych i biologicznych. Do związków tych należą wszystkie rutynowo wykorzystywane

PL 209 100 B1 w technologiach przeszukiwania wysokowydajnego i diagnostyki. Ligandy mogą być przyłączone do mikronośników za pomocą środków konwencjonalnie używanych do przyłączania ligandów do mikronośników, włączając wiązanie kowalencyjne (przyłączanie bezpośrednie) lub wiązanie z udziałem łącznika. Ponadto, mikronośniki mogą być modyfikowane na różne sposoby, aby umożliwić przyłączanie wyżej wymienionych reagentów.

Mikronośniki według wynalazku mogą być zastosowane w sposobie wykrywania obecności lub braku jednego lub wielu analitów docelowych w próbce, na który składa się kontaktowanie ligandu związanego z mikronośnikiem z przynajmniej jednym analitem, detekcja czy analit związał się lub przereagował z ligandem oraz odczyt kodu mikronośnika, w przypadku którego reakcja lub wiązanie miało miejsce.

Dokładniej, wynalazek dotyczy sposobu wykrywania obecności lub braku jednego lub większej liczby analitów docelowych w próbce, obejmującego wybór jednego lub kilku ligandów, które wiążą lub reagują z jednym lub kilkoma analitami, wiązanie ligandów z różnorodnymi mikronośnikami według wynalazku, korelację ligandów z kodami na mikronośnikach, do których ligandy są przyłączone, kontakt jednego lub kilku analitów z ligandami związanymi z mikronośnikami, obserwację mikronośników, w przypadku których analit został zwią zany lub przereagował z ligandami, i odczyt kodów na mikronośnikach w celu identyfikacji ligandów, z którymi przereagował jeden lub kilka analitów, a przez to określenie obecności lub braku jednego lub kilku analitów.

Korzystnym wykonaniem powyższego sposobu jest zastosowanie jako badanego analitu docelowego kwasu nukleinowego, w szczególności DNA lub RNA, gdzie przynajmniej jeden z ligandów związanych z mikronośnikiem jest komplementarnym kwasem nukleinowym. Mikronośniki według wynalazku są tym samym użyteczne w hybrydyzacji DNA. Mikronośniki mogą być również pomocne w testach enzymatycznych i immunologicznych. Mikronoś niki są również użyteczne w testach przeprowadzanych w celu wyszukania danych związków w próbkach, jak również w celu detekcji i izolacji związków z tych próbek. Mikronośniki mogą być również wykorzystane jako nośniki do tworzenia kombinatorycznych bibliotek chemicznych.

Mikronośniki według wynalazku mogą być również wykorzystywane w sposobach i urządzeniach do wydajnego i szybkiego przeszukiwania dużej liczby komponentów, w których różnorodność komponentów może dotyczyć zarówno ligandu związanego z mikronośnikiem, jak również rozpuszczalnego analitu, i w których celem jest określenie występowania oddziaływania pomiędzy tymi dwoma związkami. Do urządzeń zaliczyć można mikromacierze, takie jak np. nośnik stały, na którym umieszczono związane ligandy w uprzednio ustalonym porządku oraz czytnik zdolny do wykrywania oddziaływań pomiędzy związkami. Sposób ten może wymagać przygotowania mikromacierzy, takiej przykładowo jak nośnik stały do przyłączania ligandu, a następnie zmieszania ligandu i analitu w celu wywołania oddziaływań pomiędzy związkami, po czym określania obecności oddziaływań pomiędzy związkami i określonymi miejscami.

Mikromacierz zazwyczaj zawiera wiele różnych związków. W teorii wystarczy jeden związek, ale można wykorzystać aż do 10⁵ związków. Mimo, że liczba związków zazwyczaj nie przekracza 10⁵, liczba pojedynczych zakodowanych mikronośników może być zasadniczo wyższa.

Związanym ligandem może być na przykład reszta organiczna, taka jak pojedyncza cząsteczka lub zbiór cząsteczek, ligandy i receptory, związki związane z kwasami nukleinowymi, RNA, białka wiążące się do pojedynczych lub podwójnych nici, które nie wymagają obecności wiązania ligandu przyłączonego do kwasu nukleinowego, oligonukleotydu lub białka.

Zakodowane mikronośniki w mikromacierzy mogą być zorganizowane w ścieżki. Nagłówki spełniają rolę definiującą, dzięki czemu poszczególne oddziaływania mogą być szybko wykrywane. W szczególności mogą być wykorzystywane dyski zawierające ścieżki w postaci kolistej, z nagłówkami określającymi pozycje na ścieżkach, po to by pozytywne sygnały mogły być łatwo interpretowane dzięki informacjom podanym w nagłówkach. Zalecane ścieżki w postaci kolistej są koncentryczne i mają przekrój w zakresie od 5 do 5000 μm. Różne modyfikacje są możliwe, przykładowo wstępnie przygotowane segmenty, które mogą być później przyłączane do dysku w celach testowych.

Niniejszy wynalazek jest ponadto zilustrowany przez następujące przykłady, które mają na celu zapoznanie specjalistów w dziedzinie z praktycznym wykorzystaniem wynalazku. Następujące przykłady mają charakter ilustracyjny i ujawniają różne korzystne właściwości konkretnych wykonań wynalazku. Następujące przykłady nie powinny być postrzegane jako limitujące zastrzegany wynalazek.

PL 209 100 B1

P r z y k ł a d 1

Metakrylan dekstranu („dexma), używany do przygotowania mikrosfer dex-ma, syntetyzowano i charakteryzowano jak szczegółowo opisano w W.N.E van Dijk-Wolthius i wsp. „Reaction of Dextran with Glycidyl Methacrylate: An Unexpected Transestrification. Macromolecules, tom. 30, str. 3411 do 3414 (1997) ujawnienie które niniejszym włącza się w formie odesłania. Mikrosfery dex-ma przygotowywano przez polimeryzację rodnikową, stosując N,N,N',N'-tetrametylenoetylenodiaminę i nadsiarczan potasowy z emulsji dex-ma/glikol polietylenowy (PEG). Patrz Stenekes i wsp., „The Preparation of Dextran Microspheres in an All-Aqueous System: Effect of the Formulation Parameters on Particles Characteristics, Pharmaceutical Research, tom. 15 str. 557-561 (1998), ujawnienie które niniejszym włącza się jako odesłanie. Stężenie roztworu dex-ma (w buforze fosforanowym w pH 7) wynosiło 10% (wag./wag.). Stopień substytucji dex-ma, będący liczbą cząsteczek matakrylanu na 100 jednostek glikopiranozylu wynosił 4. Stężenie roztworu PEG w buforze fosforanowym w pH 7 wynosiło 24% wag./wag., gdy średnia masa cząsteczkowa PEG wynosiła 10 000 g/mol (Merck). Jedną partię mikrosfer (mikrosfery FD148-dex-ma) przygotowano w obecności dekstranu wyznakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (posiadającego masę cząsteczkową 148,000 g/mol). Drugą partię mikrosfer załadowano izotiocyjanianem fluoresceiny („FITC,) poprzez zanurzanie mikrosfer dex-ma, po całkowitym przygotowaniu, w roztworze FITC (0,01 mg/ml w buforze fosforanowym w pH 7,2). Zarówno FD148, jak i FITC otrzymano z Sigma. Eksperymenty SCAMP przeprowadzano na obu partiach mikrosfer jak wyjaśniono w Przykładzie 2.

P r z y k ł a d 2

SCAMP zainstalowano na skanującym laserowym mikroskopie konfokalnym („CLSM) postępując zgodnie z pracą Wedekind i wsp., „Scanning microphotolysis: a New photobleaching technique based on fas intensity modulation of a scanned laser beam and confocal imaging, Journal of Microscopy, tom. 176, str. 23-32 (1994) oraz Wedekind i wsp., „Line-Scanning Microphotolysis for DiffractionLimited Mesurements of Lateral Diffusion, Biophysical Journal, tom. 71 str. 1621-1632 (1996), ujawnienia których niniejszym włącza się jako odesłanie. Obiektyw imersyjny 40x i silny laser argonowy 2W (posiadający maksymalną możliwą moc wyjściową, Spectra Physics 2017), stosowany do otrzymywania wystarczającego fotowyświecania w czasie ekstremalnie krótkich czasów wyświecania, zastosowano w eksperymentach SCAMP na mikrosferach dex-ma wykonanych zgodnie z przykładem 1. Długość fali wiązki laserowej, także w czasie wyświecania, wynosiła 488 nm.

W tym przykładzie eksperymenty SCAMP przeprowadzono na okoł o 10 μ m poniż ej powierzchni mikrosfer dex-ma. Eksperymentalnie zaszło to w następujący sposób. Wpierw zmierzono fluorescencję wzdłuż jednej osi x płaszczyzny środkowej mikrosfery dex-ma poprzez skanowanie tej osi przez

400 milisekund (Fig. 1 kropkowana linia A). Następnie wybrano do wyświecania segment tej osi x o długości 3 μm (Fig. 1 B-I). Długość, pozycję, jak też liczbę segmentów można dowolnie wybierać stosując oprogramowanie SCAMP. Fotowyświecanie tego segmentu zaszło w czasie, gdy wiązka lasera skanowała ten segment z czasowym silnym wzrostem intensywności wiązki lasera. Stosunek między poziomami intensywności monitorującej i fotowyświecającej wiązki lasera wynosił 1:500. By zmierzyć odzyskiwanie fluorescencji w wyświeconym pasku, silnie osłabiona wiązka lasera skanowała wzdłużnie wybraną oś x przez około 4 sekundy.

Figury 3a i 3b pokazują obrazy konfokalne płaszczyzny środkowej w mikrosferze FD148-dex-ma odpowiednio przed i 2 minuty po wyświecaniu segmentu 3 μm. Średnica mikrosfery wynosiła około 25 Lim. Drugi z rysunków pokazuje, że wyświecona plama pozostaje czarna, co wskazuje, że po 2 minutach nie zaszło odzyskanie fluorescencji w wyświeconym obszarze mikrosfery. Figura 4 (krzywa A) pokazuje, że fluorescencja wyświeconego segmentu w tym eksperymencie nie powracała, co pozwala na konkluzję, że w skali czasu eksperymentu „duże łańcuchy FD148 zostały całkowicie unieruchomione w badanym obszarze mikrosfery dex-ma.

Podczas gdy łańcuchy FD148 mogą być sferycznie uwięzione w sieci polimeru dex-ma, tak jak były obecne w czasie tworzenia mikrosfer, zjawisko takie nie może zachodzić w przypadku małych cząsteczek FITC gdy wprowadza się je do mikrosfer dex-ma przez zanurzenie w pełni spolimeryzowanych sfer dex-ma w roztworze FITC. W takim przypadku oczekiwano całkowitego przywrócenia fluorescencji co potwierdzono eksperymentalnie. Figura 4 (krzywa B) pokazuje, że cząsteczki FITC umieszczone około 10 L m pod powierzchnią mikrosfery pozostają ruchliwe.

Oprócz technicznej zdolności do fotowyświecania małych segmentów w próbce, stosowanie mikroskopów skanujących pozwala na łatwą specyficzną selekcję mikroobszarów w próbce, gdzie ma zajść wyświecanie, jako, że wiązkę lasera można pozycjonować. Co więcej, jako że w eksperymenPL 209 100 B1 tach SCAMP długość, pozycję, jak też liczbę segmentów można dowolnie wybrać, to fotowyświecaniu można poddać dowolny kształt geometryczny w próbce. Figura 5 pokazuje obraz konfokalny płaszczyzny środkowej mikrosfery FD148-dex-ma 2 minuty po wyświeceniu w mikrosferach krzyża, koła i prostokąta.

P r z y k ł a d 3

Eksperymenty SCAMP przeprowadzono także na 45 μm kulkach lateksowych wyznakowanych FITC zakupionych w PolylaB z Antwerpii, Belgia. SCAMP zainstalowano na Bio-Rad MRC1024 CSLM postępując zgodnie z pracami Wedekind i wsp. (1994) i Wedekind i wsp. (1996). Obiektyw 100x i silny laser argonowy (Spectra Physics 2017), stosowane do otrzymania wystarczającego fotowyświecania w czasie ekstremalnie krótkich czasów fotowyświecania, zastosowano w eksperymentach SCAMP na 45 urn kulkach lateksowych wyznakowanych FITC. Intensywność lasera Spectra Physics ustawiono na 300 mW, co prowadziło do otrzymania intensywności monitorującej i wyświecającej lasera odpowiednio 75 W i 20 mW (mierzonych na końcu światłowodu, który wprowadza wiązkę lasera do skanującego laserowego mikroskopu konfokalnego). W konsekwencji stosunek między intensywnością monitorującą a fotowyświecającą lasera wynosił 1:266. Długość fali wiązki lasera, także w czasie wyświecania, wynosiła 488 nm.

Pomiary SCAMP przeprowadzano w płaszczyźnie środkowej 45 um kulek lateksowych znakowanych FITC. Przeprowadzano to w następujący sposób. Wpierw obraz przybliżano dopóki kulka lateksowa nie zajmowała całkowicie obrazu. Następnie, definiowano znak będący przedmiotem zainteresowania i za pomocą oprogramowania SCAMP wskazywano gdzie na kulce lateksowej ma zostać wyświecony znak. Znakowanie zachodziło w czasie gdy wiązka lasera skanowała płaszczyznę środkową 45 um kulek lateksowych znakowanych FITC. Przejściowy silny wzrost intensywności wiązki lasera (z 75_W do 20 mW) zachodził, gdy wiązka lasera skanowała segmenty do wyświecenia w celu stworzenia znaku będącego przedmiotem zainteresowania. Jako, że skanowanie przeprowadzano z szybkością 6 ms na oś x (Fig. 1A) i jako, że jeden obraz płaszczyzny konfokalnej (tj. płaszczyzny środkowej kulki lateksowej) składa się z 512 „osi x - wyznakowanie kulki lateksowej zajmowało 3,072 sekundy.

Figury od 6 do 9 pokazują obrazy konfokalne płaszczyzny środkowej 45 um kulek lateksowych znakowanych FITC godzinę po wyświecaniu kodu kreskowego (Fig. 6a), kodu kreskowego z numerem (Fig. 6b), numeru R1247 (Fig. 7) znaku Ghent University (Fig. 8) i znaku Tibotec Company (Fig. 9). Obrazy pokazują, że wyświecone segmenty pozostają czarne, co wskazuje, że nie zachodzi znaczące odzyskiwanie fluorescencji przez wyświecone segmenty kulek lateksowych.

Wartości przybliżeń skanującego laserowego mikroskopu konfokalnego Bio-Rad MRC1024 były następujące: 1,61 na Fig. 6a, 1,00 na Fig. 6b, 3,07 na Fig. 7, 1,00 na Fig. 8 i 1,00 na Fig. 9. Na Fig. 6a i 6b można zaobserwować wysoką rozdzielczość przestrzenną SCAMP względem znaczników wyświecanych. Znacznik na Fig. 6a składa się z trzech różnych typów linii: jednej o dużej szerokości (2,5 um), jednej o średniej szerokości (1,25 um) i jednej o małej szerokości (0,62 um). Wszystkie linie umieszczono w odległości 1,25 um od siebie.

P r z y k ł a d 4

Następujące eksperymenty pokazują sposoby wyświecania kodów w mikronośnikach fluorescencyjnych, gdzie kody posiadają różne poziomy intensywności dzięki różnym stopniom wyświecania. Mikronośnikami używanymi w następujących eksperymentach były 45 um kulki lateksowe wyznakowane FITC zakupione w PolylaB z Antwerpii, Belgia.

Do jednego zestawu eksperymentów z wyświecaniem zastosowano powiększenie 60 x i moc lasera 300 mW, by uzyskać wzór pokazany na Fig. 10a. Kwadraty w górnym rzędzie rysunku mają w oprogramowaniu szerokość 32 pikseli (= 2,46 um) i są rozdzielane przez kolejne 32 piksele. Wyświecanie w rzeczywistości powiększa je. Kwadraty w dolnym rzędzie rysunku mają połowę tego rozmiaru.

Jak pokazano na Fig. 10a wyświecanie różnych intensywności jest możliwe. Zakładając, na przykład, poziom plateau 200 jednostek analogowych do jednostek cyfrowych [„ADU”] wyświecanie jest możliwe od poziomu co najmniej 50 do około 200 ADU. Tak więc, poziomy można wyświecać przy odstępie około 25% oryginalnej intensywności fluorescencji. Fotografia Fig. 10a ujawnia, na przykład, że można z pewnością uzyskać 6 poziomów wyświecania. Te sześć poziomów wyświecania jest widoczne na sześciu kwadratach wyświeconych w górnym rzędzie Fig. 10a. Intensywności fluorescencji tych kwadratów pokazano na wykresie Fig. 10c. Sześć kwadratów o różnych intensywnościach fluorescencji uzyskano przez powtarzanie wyświecania (1 do 6 razy). Stosowanie sześciu miejsc kodują12

PL 209 100 B1 cych posiadających sześć różnych poziomów intensywności fluorescencji pozwala na otrzymanie 6⁶ czyli 46656 różnych kodów.

Seria dziesięciu mniejszych wyświeconych kwadratów pokazana na Fig. 10a wyraźnie ujawnia, że wyświecanie poprzez powtarzanie skanowania nie jest liniowe. Te kwadraty są w połowie tak szerokie jak poprzednie, ale pozostają wyraźnie rozróżnialne. Poziomy intensywności dla tych oznakowań pokazano na wykresie na Fig. 10d. W końcu, intensywność pojedynczej wyświeconego pola między dwoma rzędami sześciu i dziesięciu miejsc kodujących pokazano na Fig. 10b.

Drugi eksperyment przeprowadzono w celu efektywnego wyświecenia kodu w 8 miejscach kodowania (szerokość w oprogramowaniu 1 paska = 24 piksele x 0,069 μm/piksel = 1,66 μm; rozdzielone przez kolejne 24 piksele) i z 8 różnymi intensywnościami (pozwalającymi na uzyskanie 8⁸ = 16777216 różnych kodów). Moc wyjściową lasera ustalono na 200 mW. Fotografię mikronośnika z tego eksperymentu ilustruje Fig. 11a, a wykres wskazujący różne poziomy intensywności indywidualnych kodów pokazano na Fig. 11b. Różne intensywności są wyraźnie widoczne. Kodem na Fig. 11a jest numer 1 5 2 6 3 7 4 8.

Fig. 12a i 12b ilustrują następny przykład ośmiu miejsc kodowania z ośmioma różnymi intensywnościami. W tym przypadku wyświecanie przeprowadzano przy 250 mW zamiast 200 mW w poprzednim przypadku, z zastosowaniem 0,056 mm/piksel. Kod w tym przypadku to 1 3 2 6 5 8 7 4. Fotografię kodów i wykres różnych intensywności kodów pokazano odpowiednio na Fig. 12a i 12b.

Inne wykonania wynalazku będą oczywiste dla specjalistów w dziedzinie na podstawie niniejszego opisu i realizacji praktycznej ujawnionego tu wynalazku. Opis i przykłady należy rozważać wyłącznie przykładowo, a rzeczywistym zakres i myśl przewodnią wynalazku wskazują następujące zastrzeżenia.

Claims (24)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zakodowany mikronośnik, znamienny tym, że jest zakodowany zabezpieczonym kodem zapisanym na powierzchni mikronośnika albo na jego wewnętrznej głębokości, przy czym mikronośnik zawiera jeden lub więcej ligandów związanych z mikronośnikiem i przy czym kod jest wzorem zapisanym poprzez wytrawianie chemiczne albo z wykorzystaniem źródła światła o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, albo źródła emitującego promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie alfa lub beta, lub wiązki jonowe.
2. 2. Zakodowany mikronośnik według zastrz. 1, znamienny tym, że kod jest zapisany na wewnętrznej głębokości mikronośnika.
3. 3. Zakodowany mikronośnik według zastrz. 2, znamienny tym, że kod jest zapisany w płaszczyźnie środkowej mikronośnika.
4. 4. Zakodowany mikronośnik według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że stanowi mikrosferę.
5. 5. Zakodowany mikronośnik według zastrz. 4, znamienny tym, że ma średnicę od 1 do 200 Lim.
6. 6. Zakodowany mikronośnik według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że źródło światła o wysokiej rozdzielczości przestrzennej stanowi laser lub lampa.
7. 7. Zakodowany mikronośnik według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że kod zapisany jest poprzez fotowyświecanie, wyświecanie albo fotochromowanie.
8. 8. Sposób kodowania mikronośnika, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym zapisuje się zabezpieczony kod na powierzchni mikronośnika albo na jego wewnętrznej głębokości poprzez (i) ekspozycję mikronośnika na źródło światła o wysokiej rozdzielczości przestrzennej; albo (ii) ekspozycję mikronośnika na źródło emitujące promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie alfa lub beta, lub wiązki jonowe; albo (iii) wytrawianie chemiczne mikronośnika.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że kod zapisuje się na wewnętrznej głębokości mikronośnika.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że kod zapisu je się w płaszczyźnie środkowej mikronośnika.
11. 11. Sposób według jednego z zastrz. 8 do 10, znamienny tym, że stosuje się mikronośnik, który jest mikrosferą.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się mikrosferę o średnicy od 1 do 200 L m.

    PL 209 100 B1
13. 13. Sposób według jednego z zastrz. 8 do 12, znamienny tym, że jako źródło światła stosuje się laser lub lampę.
14. 14. Sposób według jednego z zastrz. 8 do 13, znamienny tym, że kod zapisuje się na mikronośniku poprzez fotowyświecanie, wyświecanie albo fotochromowanie.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się mikronośnik zawierający cząsteczki fluorescencyjne, a kod zapisuje się na mikronośniku poprzez wyświecanie cząsteczek fluorescencyjnych.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że kod zapisuje się poprzez wyświecanie cząsteczek fluorescencyjnych z wytworzeniem dwóch lub więcej różnych poziomów intensywności fluorescencji w wyświeconej części kodu.
17. 17. Sposób według jednego z zastrz. 8 do 16, znamienny tym, że stosuje się mikronośnik zawierający materiał wybrany z grupy materiałów stałych, półstałych i ich kombinacji.
18. 18. Sposób według jednego z zastrz. 8 do 17, znamienny tym, że jako mikronośnik stosuje się komórkę prokariotyczną albo eukariotyczną.
19. 19. Sposób odczytu zakodowanego mikronośnika określonego w jednym z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że w jednym z etapów sposobu obserwuje się kod w mikroskopie konfokalnym.
20. 20. Sposób wykrywania obecności lub nieobecności jednego lub kilku analitów docelowych w próbce, znamienny tym, że wybiera się jeden lub kilka ligandów, które wiążą lub reagują z jednym lub kilkoma analitami, wiąże się ligandy z różnorodnymi zakodowanymi mikronośnikami określonymi w jednym z zastrz. 1 do 6, koreluje się ligandy z kodami na mikronoś nikach, z którymi ligandy są zwią zane, kontaktuje się jeden lub kilka analitów z ligandami związanymi z mikronośnikami, obserwuje się mikronośniki, w przypadku których analit został związany lub przereagował z ligandem związanym z mikronoś nikiem oraz odczytuje się kody na mikronośnikach i identyfikuje ligandy, z którymi przereagował jeden lub kilka analitów, przez co określa się obecność lub nieobecność jednego lub kilku analitów.
21. 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że jako analit docelowy stosuje się kwas nukleinowy, przy czym stosuje się co najmniej jeden ligand związany z mikronośnikiem w postaci komplementarnego kwasu nukleinowego.
22. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się hybrydyzację DNA.
23. 23. Zastosowanie zakodowanego mikronośnika określonego w jednym z zastrz. 1 do 6 do wytwarzania biblioteki chemicznej.
24. 24. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że wytwarzana jest kombinatoryczna biblioteka chemiczna.