CZ20013706A3

CZ20013706A3 - Kódovaný mikronosič

Info

Publication number: CZ20013706A3
Application number: CZ20013706A
Authority: CZ
Inventors: Smedt Stefaan Cornelis De; Joseph Demeester; Christiaan Hubert Simon Roelant; Rudi Wilfried Jan Pauwels
Original assignee: Tibotec Nv; Universiteit Gent
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2002-07-17
Also published as: KR100660600B1; NO329706B1; CN1355883A; CZ301174B6; AU4295200A; US8939376B1; TWI249033B; AU771517B2; EP1173760A1; JP4500455B2; DE60021070T2; US8967483B2; SK287052B6; DE60021070D1; ATE298888T1; PL351793A1; RU2242746C2; MY132268A; CA2370315C; NZ515214A

Description

Kódováni mikronosičů

Tato přihláška nárokuje prioritu pro předběžnou US ořihlášku č. 60/129,551, registrovanou 16. dubna 1999. Obsah této předběžné přihlášky je v tomto textu začleněn formou odkazu.

Oblast techniky

Předložený vynález se týká kódovaných míkronosičů a zejména mikronosičů, na nichž jsou zapsány kódy. Jakýkoliv odkaz v tomto zveřejnění na kódy zapsané „na mikronosičích zahrnuje kódy zapsané na povrchu mikronosičů a rovněž kódy zapsané ve vnitřní hloubce mikronosičů. Předložený vynález se týká rovněž způsobů zapisování kódů na mikronosiče, způsobů čtení kódů a způsobů použití kódovaných mikronosičů. Přednostní způsob kódováni mikronosičů zahrnuje vystavení mikronosičů, které nesou odbarvitelnou látku, světelnému zdroji s vysokou prostorovou rozlišovací schopností za účelem odbarvení kódů na mikronosičích. Kódované mikronosiče se mohou použít například jako nosné materiály v chemických a oíologických zkouškách a syntézách.

Dosavadní stav techniky

Výzkum a skrínink léčiv v chemických a biologických oborech obvykle zahrnuje provádění zkoušek na velmi velkém oočtu sloučenin nebo molekul. Tyto analýzy zahrnují typicky skrínink chemických knihoven významných sloučenin, skrínink specifických cílových molekul v testovaných vzorcích a obecné testování významných chemických a biologických zájmových ·» ···· ·· *♦·· ♦· *· • 9 ««« * * · 9 • · · · « 999 9 9 9 • 9 9999 999 9 9 «·99 99 9 999 ·· ·· 9« 999 «« 9999 interakcí mezi molekulami. Výše popsané zkoušky vyžadují často provádění tisíců jednotlivých chemických nebo oiologických reakcí. Například zkoušky při výzkumu léků mohou zahrnovat testování tisíců sloučenin vzhledem k specifickému sílovému analytu. Jakékoliv sloučeniny, u kterých se oozoruje, že reagují, vážou se nebo jiným způsobem interaguji s cílovým analytem, mohou být vhodné pro jakékoliv použití, oro které by pozorovaná interakce mohla být významná.

Při manipulaci s velkým počtem individuálních reakcí vyžadovaných ve zkouškách popsaných výše existuje mnoho oraktických problémů. Možná nej závažnějším problémem je značení a sledování každé reakce. Například pokud se sleduje významná reakce samotná ve skupině tisíců reakcí, výzkumník tuší být schopen určit, která z tisíců výchozích sloučenin nebo molekul způsobuje tuto reakci.

Jedním z konvenčních způsobu sledování identity reakcí je fyzikální separace každé reakce do samostatné reakčni nádoby v rámci velkokapacitního seskupení a udržování záznamu s jednotlivých reaktantech, které byly použity v každí nádobě. Tedy například, když se pozoruje významná reakce v nádobě označené číslem 5 z 1000, výzkumník se může advolávat na záznam o reaktantech použitých v nádobách a ze záznamu o nádobě 5 zjistí, které specifické reaktanty byly přítomny u provedení této významné reakce. Příklady •velkokapacitních seskupení s odvoláním na výše uvedené jsou kontejnery pro mikrotitrační plotny s 384, 864, 1536, 3456 a 9600 jamkami, kde každá jamka mikrotitrační plotny představuje miniaturní reakčni nádobu. Miniaturizované reakčni jamky se používají proto, že šetří prostor a snižují náklady na činidla použitá při zkoušce.

Použití kontejnerů s mikrotitračními plotnami při chemických a biologických zkouškách však přináší mnoho nevýhod. Například použití ploten vyžaduje opatrnou separaci »» v···

I

4 4 *44 • 4 « • 4 4 4 ·· »4 • 4 »44* • 4 • 444 *4

4 4

4 • 4 4 · 4

44·4 a velmi velký počet izolovaných reakčních nádob, spíše než například pro všechny reakce při volném provedení a často oěžněji v jedné reakční nádobě. Dále požadavek, aby reakční objemy byly prostorově odděleny, přináší s tím fyzikální omezení velikosti použité mikrotitrační plotny, a tedy omezení množství rozličných reakcí, které se mohou provádět na plotně.

Ξ ohledem na výše popsaná omezení při použití mikrotitračních ploten se provedly jisté pokusy pro vývoj jiných prostředků pro sledování jednotlivých reakcí při vysokovýkonných zkouškách. Tyto způsoby nesledovaly koncept prostorové separace reakcí a místo toho sledovaly individuální reakce pomocí jiných prostředků. Například se vyvinuly způsoby provádění vysokovýkonných zkoušek a reakcí na mikronosičích jako nosných materiálech. Každý mikronosič může obsahovat jeden specifický ligand navázaný na jeho oovrchu pro působení jako reaktant a mikronosič může kromě toho obsahovat „kód, který identifikuje mikronosič, a tím identifikuje specifický ligand navázaný na jeho povrchu. Tyů výše popsané způsoby umožňují „náhodný proces, který znamená, že tisíce jedinečně kódovaných mikronosičů, z nichž každý má na svém povrchu navázaný ligand, mohou být smíchány a současně podrobeny zkoušce. Tyto mikronosiče, které projevují příznivou významnou reakci mezi navázaným ligandem a cílovým analytem, potom mohou zajišťovat čtení jejich kódu, a tím vést k identifikaci ligandu, který poskytuje příznivou reakci.

Provádění výše popsaného náhodného procesu vyžaduje přesné kódování každého z mikronosičů odděleně a vyžaduje přesnou a důslednou identifikaci kódů. Protože zkoušky využívající náhodný proces často spoléhají při svých výsledcích na kódování mikronosičů, kvalita zkoušek velmi závisí na kvalitě a čitelnosti kódů na mikronosičích. Pokusy • 4 444· 44 4·4·

44 * · ·

4 4 »4 · 4 4 4 • · 4 4 4 444

4 4 4 4 4

4 4 4

kódovat mikronosiče jsou stále omezeny rozdílným zbarvením (mikrokuličky Dye-Trak), fluorescenčním značením („fluorosféry; „tok v), takzvanými na dálku programovatelnými matricemi s pamětí (IRORI; US patent č. 5,751,629), výměnným značkami, jako jsou oligonukleotidy a jednoduché peptidy (US patent č. 5,565,324; US patent č. 5,721,099; US patent č. 5,789,172) a pevnými částicovými fázemi, které nesou zprostředkovače (US patent č. 5,736,332). Tato výše uvedená zveřejnění patentů jsou v tomto textu začleněna pomocí idkazu.

Všechny tyto výše popsané známé způsoby kódování mikronosičů nesou nevýhody. Například mikronosiče, které se odlišují pouze na základě své velikosti, tvaru, barvy, intenzity fluorescence nebo jejich kombinací, nemohou často ooskytnout dostatečně jedinečné čitelné kombinace těchto oroměnných veličin pro vytvoření velkého počtu jedinečných kódů pro skombinování testování příslušně velkého počtu odlišných molekul. Kromě toho jakékoliv mikronosiče nesoucí cizí tělesa na svém povrchu sloužící jako kódy, jako jso^ například výměnné značky nebo fluorescenční markéry, způsobují riziko, že navázané složky mohou interferovat prostřednictvím navázání nebo reakce molekul s navázanými Ligandy na mikronosičích, které se zaměřují na analyty ve zkouškách. Po separaci významných mikronosičů, které projevují příznivou reakci, zahrnují způsoby kódování mikronosičů s výměnnými značkami často také přídavný stupeň štěpení a^; analyzování značek pro konečné zjištění identity základních ligandů na mikronosičích, které poskytují příznivou reakci. Tento stupeň štěpení přirozeně prodlužuje lobu a úsilí potřebné pro určení výsledků testů.

Vzhledem k výše uvedenému přetrvává v oboru nezbytnost jednoduchých způsobu identifikace jednotlivých mikronosičů v masové populaci jinak identických mikronosičů, obzvláště *· *♦ χ «· :

• φ <

«Φ *··· • · » * ♦ · • · » • · · φ • Φ ·♦ • Φ »·»· φ · * • * φφφ způsobů kódování velkého počtu jedinečných kódů, které nemus... oýt navázány jako cizí tělesa na povrchu mikronosičů.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je poskytnutí mikronosiče, který je kódován bez nutnosti připojení cizího předmětu, který by sloužil jako kód, na povrch mikronosiče. Jiným předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí způsobu kódování mikronosičů, který může poskytovat v podstatě neomezené možnosti, co se týče rozmanitosti jedinečných kódů, které se mohou zapsat a číst na mikronosičích.

Předložený vynález splňuje tyto předměty poskytnutím mikronosičů s kódy, které jsou na nich zapsány. Přednostními mikronosiči jsou mikronosiče obsahující odbarvitelné látky, například fluoreskující molekuly. Přednostní způsob kódování mikronosičů zahrnuje vystavení mikronosičů nesoucích odbarvitelnou látku světelnému zdroji s vysokou prostorovou rozlišovací schopností za účelem odbarvení kódů na mikronosičích. Tento způsob může přednostně zahrnovat odbarvování kódů na fluoreskujících mikronosičích, kde odbarvení vytváří stejné nebo odlišné úrovně intenzity fluorescence na odbarvených částech kódu. Dalším přednostním způsobem kódování mikronosičů je zapsání kódů do vnitřní hloubky mikronosičů.

V dalším přednostním provedení se naváže velký počet chemických sloučenin nebo biologických molekul na příslušně velký počet mikronosičů podle vynálezu, ligandy navázané na mikronosičích se smíchají a současně reagují podle skríninkového nebo zkušebního protokolu a ty ligandy, které reagují, se identifikují pomocí čtení kódu na mikronosičích, na kterých jsou navázány.

·· φ* j r s • * ·

Kódované mikrokuličky podle vynálezu umožňuji současné snalýzy velkého počtu analytů v jednodílných reakčních nádobách použitím jednoduchého alikvotu vzorku. Použití mikronosičů podle vynálezu při vysokovýkonných zkouškách a reakcích je proto mnohem lepší ve srovnání s použitím konvenční techniky s mikrotitračními plotnami.

Mikronosiče podle vynálezu poskytují také prakticky neomezený počet kódů, které mohou být zapsány a čteny na mikrokuličkách, a jsou proto mnohem lepší než známé mikronosiče kódované barevnými nebo fluorescenčními značkami, které nesou více omezený počet možnosti kódování. Mikronosič· oodle vynálezu jsou rovněž lepší než mikronosiče kódované složkami navázanými na povrchu mikronosičů. Je to z toho důvodu, že zapisování na mikronosiče podle vynálezu nenese riziko spojené se známými mikronosiči potenciálně interferujícími s interakcemi analytu/ligandu, které se uskutečňují na povrchu mikronosičů.

Přídavné znaky a výhody vynálezu jsou zveřejněny v níže uvedeném popisu a částečně budou zřejmé z popisu nebo s? mohou zjistit z provedení vynálezu. Výhody vynálezu se realizují a získají pomocí kódovaných mikronosičů a způsobů zdůrazněných zejména v písemném popisu a nárocích. Výše uvedený obecný popis a rovněž následující podrobný popis vynálezu jsou pouze vzorové a vysvětlující a neomezují nárokovaný vynález.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje některé principy konvenční mikrofotolýzy a SCAMP.

Obrázek 2a a 2b znázorňuje čárový kód a kruhový kód za použití odlišné intenzity, přičemž každá intenzita je vyznačená odlišnými barvami znázorněnými na obrázcích.

• · · • · · · « · • · · · * · • · · ·

Obrázky 3a a 3b znázorňují konfokální obrazy středové roviny FD148-dex-ma-mikrokuličky před (nahoře) a po odbarven; (dolu) 3 pm proužku přibližně 10 pm pod povrchem míkrokuličky.

Obrázek 4 znázorňuje získané fluorescenční křivky FD148 v 148vdex-ma-mikrokuličkách (A) a FITC v dex-ma-mikrokuličkách opatřených FITC ponořením do roztoku FITC (B).

Obrázek 5 znázorňuje konfokální obraz středové roviny FI) L4 8-dex-ma~mikrokujLičky po odbarvení libovolné geometrie pomocí SCAMP.

Obrázky 6a a 6b znázorňují konfokální obrazy středové roviny v 45 pm latexové perličce značené pomocí FITC hodinu po odbarvení čárového kódu (obrázek 6a) a čárového kódu a čísla (obrázek 6b).

Obrázek 7 znázorňuje konfokální obrazy středové roviny v 45 pm latexové perličce značené pomocí FITC hodinu po odbarvení kódu R1247.

Obrázek 8 znázorňuje konfokální obrazy středové roviny 45 pm latexové perličce značené pomocí FITC hodinu po odbarvení loga Gentské univerzity.

Obrázek 9 znázorňuje konfokální obrazy středové roviny λ 45 pm latexové perličce značené pomocí FITC hodinu po odbarvení loga firmy Tibotec.

Obrázek 10a znázorňuje konfokální obrazy kódů odbarvených na odlišnou intenzitu a obrázky 10b až lOd graficky znázorňují odlišné intenzity v kódech.

Obrázky 11 a 12a znázorňují konfokální obrazy kódů odbarvených na odlišnou intenzitu a obrázky 11b a 12b graficky znázorňují odlišné intenzity v příslušných kódech.

Následuje podrobný popis vynálezu.

V jednom provedení se předložený vynález týká mikronosičů s kódy zapsanými na nich. Mikronosiče podle vynálezu ·« • · «· ··»· • · · • « **· • 9 9

9 9 ··» >« *·»* « · • · • · · • · · ··

nohou být vyrobeny například z jakéhokoliv materiálu, který se běžně používá ve vysokovýkonné skríninkové technice a diagnostice. Mikronosiče mohou být například vyrobeny z tuhé Látky, polotuhé látky nebo kombinace tuhé a polotuhé látky. Neomezující příklady takových materiálů zahrnují latex, polystyren, zesítěné dextrany, methylstyren, polykarbonáty, polypropylen, celulózu, polyakrylamid a dimethylakrylamid. Přednostní materiály zahrnují latex, polystyren a zesítěné dextrany. MikronosiČi mohou být rovněž prokaryotické nebo eukaryotické buňky.

Mikronosiče mohou mít libovolné tvary a velikosti, které se propůjčují ke kódování a použití mikronosičů. Například mikronosiče mohou být ve tvaru kuliček nebo ve tvaru perliček, které nejsou nezbytně kulovité. Mikronosiče mohou mít například válcovitý nebo oválný tvar. Když mají mikronosiče kulovitý tvar, mohou mít průměr například 1 až 200 μη.

Kódy zapsané na mikronosičích mohou mít libovolnou geometrii,, oizajn nebo znak, který se může zapsat a čist na mikronosičích. Například kódy mohou být zapsány jako čísla nebo znaky nebo jako kódy ve formě symbolů, obrázků, čárových, kódů, kruhových kódů nebo trojrozměrných kódů. Kruhové kódy jsou podobné jako čárové kódy s tím rozdílem, že koncentrickí* ,<ruhy se spíše používají než rovné čáry. Kruh může například obsahovat stejnou informaci jako jedna čára. Kódy se mohou zapisovat na povrch mikronosičů nebo do vnitřní hloubky mikronosičů. Například mohou být kódy zapsány ve vnitřní nloubce mikronosičů a zejména ve středové rovině mikronosičů. V závislosti na tvaru mikronosičů může být středová rovina přednostním místem pro zapsání kódu, protože může poskytovat největší povrchovou plochu vhodnou pro zapisování. Dále může být pro mikronosiče se zakřiveným povrchem výhodnější zapisovat kódy do vnitřní hloubky než na zakřivený povrch. Je »« ···· • · « · «

to proto, že často může být vhodnější zapisovat a Číst kódy aa ploché rovině než na zakřiveném povrchu.

Mikronosiče podle vynálezu mohou obsahovat odbarvitelné Látky a kódy na mikronosičích mohou být ve formě odbarvených obrazců v odbarvítelných částech mikronosičů. Mikronosiče nohou obsahovat odbarvitelné látky na povrchu mikronosičů .nebo rovněž uvnitř mikronosiče. Jakékoliv odkazy v této přihlášce na odbarvování látek „na mikronosičích zahrnují odbarvováni na povrchu mikronosiče a také odbarvování ve vnitřní hloubce mikronosičů. Přednostní odbarvitelné látky zahrnují odbarvitelné látky absorbující fluorescenční nebo elektromagnetické záření. Mikronosiče mohou obsahovat □dbarvítelné luminofory. Příklady luminoforů, které se mohou použít, zahrnují fluorescenční, fosforescenční nebo scintilační látky. Použít se mohou chemiluminiscenční, oioluminiscenční nebo barevné látky. Těmito odbarvitelnými Látkami konkrétněji mohou být fluoresceinisothiokyanát (FITC), fykoerytriny, kumariny, luciferova žlutá a rhodamin. Odbarvitelné lárky by se měly volit tak, aby při odbarvování zůstával kód na mikronosiči po dobu, která je potřebná pro použití mikronosičů a jakékoliv potřebné Čtení kódů. Tedy přijatelné je jisté množství difúze neodbarvených molekul do odbarvených oblastí, pokud se zachovává životnost kódu.

Odbarvené kódy na mikronosičích mohou být zapsány rovně tak, aby měly odlišné intenzity fluorescence nebo zbarvení v odbarvených oblastech mikronosiče. Odbarvené kódování může obsahovat například několik rozdílných stupňů odbarvení, a tím celkem několik rozdílných intenzit fluorescence v odbarvené oblasti. Tedy mikronosiče mohou být kódovány nejenom pomocí geometrie odbarveného obrazce na mikronosičích, ale také použitím rozdílných intenzit fluorescence v obrazcích.

• · ·· »·· * « • · · • · • · ·

V jiném provedení se vynález týká způsobu zapisování kódů na mikronosice. Tento způsob se může využívat .< zapisování kódů na povrch mikronosičů nebo do vnitřní doubky mikronosičů. Kódy se mohou zapisovat například za soužití zdroje světla s vysokou prostorovou rozlišovací schopností, jako je například laser, výbojka nebo zdroj,

Který emituje rentgenové záření, záření a a β, paprsky iontů nebo jakoukoliv formu elektromagnetického záření. Kódy se mohou na mikronosice zapisovat rovněž pomocí světlotisku neb< chemického leptání. Přednostním způsobem zapisování kódů je způsob za použití zdroje světla s vysokou prostorovou rozlišovací schopností a zejména laseru nebo výbojky v kombinaci s konfokálním mikroskopem. Jiným přednostním způsobem zapisování kódů je způsob za použití odbarvení kódů v odbarvitelné látce na mikronosiči. Přednostní odbarvitelné látky při tomto způsobu zahrnují látky popsané výše v popisu mikronosičů a zahrnují fluoreskující molekuly. Co se týče objemu materiálu, který se může odbarvovat v mikronosičích, příkladem takového objemu je jeden kubický nanometr až osm kubických milimetrů mikronosiče.

Přednostním způsobem zapisování kódů na mikronosiče je způsob za použití snímací (skenovací) mikrofotolýzy (SCAMP). Technické znaky SCAMP byly poprvé popsány v práci P. Wedekind et al., „Scanníng microphotolysis: a new photobleaching technique based on fast intensity modulation of scanned laser beam and confocal imaging”, Journal of Mícroscopy, sv. 176, str. 23-32 (1994), přičemž obsah této oráče je zde začleněn pomocí odkazu. Výše uvedený článek zveřejňuje použití SCAMP pro odbarvování a vizualizací obrazců v tenké fluorescenční vrstvě laku na nehty. Článek nenavrhuje použití SCAMP pro kódování mikronosičů.

My jsme použili SCAMP pro zapisování kódů na míkronosiče pomocí odbarvení fluoreskujících molekul v mikro11 · · ·· ·· nosičích. Odbarvování světlem je velmi dobře známý jev týkající se slábnutí barev v důsledku té skutečnosti, že jisté vlnové délky světla při dopadu na dané barvivo zapříčiňují rezonancí molekul barviva a případně jejich rozklad. To je rovněž příčinou toho, proč fluoreskující molekuly mají často tendenci se odbarvovat, když se excitují vysokovýkonným laserovým paprskem specifické vlnové délky.

Mnoho let se techniky fluorescenční mikrofotolýzy (MP), nazývané také obnovení fluorescence po odbarvení světlem (FRAP), používaly pro zkoumání pohyblivosti fluoreskujících molekul v biologických prostředích, jako jsou buňky a tkáně, a rovněž v nebiologických prostředích. Peters and Scholtz „Fluorescence photobleaching techniques v New Techníques of íptical Microscopy and Microspectroscopy, R. J. Cherry (ed.) MacMillan, New York, str. 199-228 (1991); De Smedt at al., „Structural Information on Hyaluronic Acid Solutions as Studied by Probe Diffusion Expoeriments, Macromolecules , sv. 27, str. 141-146 (1994); De Smedt et al., Diffusion of Macromolecules in Dextran Methacrylate Solutions and Gels as Studied by Confocal Scanning Laser Microscopy, Macromolecules, sv. 30, str. 4863-4870 (1997) .

Mobilita fluoreskujících molekul se může měřit odbarvením (fotolýzou) fluoreskujících molekul pohybujících se v ohniskovém prostoru světelného paprsku, kterým může být zejména laserový paprsek (obrázek 1: A, B). Ihned po krátkém odbarvování, typicky přibližně 10 milisekund, měří vysoce zeslabený laserový paprsek obnovení fluorescence v oblasti zdbarvené světlem způsobené difúzí fluoreskujících molekul z okolních neodbarvených oblastí do odbarvené oblasti (obrázek 1: B, C). Charakteristická doba difúze, měření iifúzního koeficientu a frakcí imobilních a mobilních fluoreskujících molekul se může odvodit z obnovení fluorescence v odbarvené oblasti (obrázek 1: D).

4 ·

4 • 4

4

4444 • 4 ”’ϊ • · 4

4 · • 44«

44 * 4 ··· • · ·

··♦ •

Mobilní frakce R je definována jako:

F{«) - F(0)

R - --- ,

F(i) - F(0) kde F(i) je intenzita fluorescence odbarvené plošky před odbarvením, F(0) je intenzita fluorescence odbarvené plošky okamžitě po odbarvení a F(oo) je intenzita fluorescence odbarvené plošky po dlouhou dobu po odbarvení.

V pokusech s odbarvováním světlem za použití konvenčníno (nesnímacího) mikroskopu se stacionární (laserový) světelný paprsek soustředí na vzorek během odbarvování a tak' oěhem doby obnovení. Stacionární poloha (laserového) světelného paprsku během odbarvování má za následek oblast odbarvenou světlem, která má kruhový tvar. I když nesnímací světelné mikroskopy technicky poskytují ozařovanou oblast o průměru 2 μτη nebo méně, vyskytuje se často rozšíření odbarvené plošky způsobené stacionárním laserovým paprskem, /ýsledkem toho jsou velké kruhové odbarvené plošky, které mají typicky průměr 10 μη až 20 μη nebo větší, jako schématicky znázorňuje obrázek 1: B-II.

Použitelnost laserových světelných snímacích mikroskopů otevřela nové možnosti pro mikrofotolytícké metody. Kombinace fotolýzy, snímání paprskem a konfokální mikroskopie vedou x vývoji SCAMP. Při SCAMP vystupuje odbarvování během snímán vzorku pomocí přepínání mezi nízkou monitorovací úrovní intenzity a vysokou úrovní intenzity laseru pro odbarvování světlem za méně než jednu mikrosekundu za použití zařízení modulujícího intenzitu, jako je optoakustický modulátor (AOM). Kombinace odbarvování během snímání a použití AOM, xteré vytváří mimořádně krátké impulsy odbarvování, zabraňuj rozšiřování odbarvené plošky, které existuje při konvenční mikrofotolýze v důsledku delších dob odbarvování světlem a *·

A

AA · A *

A · • * « A A

A A ·* ·* AA·^- • · A • A A·· ♦ · * !

» A A *A AAA

AB

AA

A A A A • A • A AAAA stacionárního laserového paprsku. SCAMP poskytuje odbarvené došky menší než mikrometr ve vzorku.

Obrázek 1 schématicky znázorňuje, jak se provádí SCAMP oři měření mobility fluoreskujících molekul. Nejdříve se měř: fluorescence podél jedné přímky x zájmové roviny ve vzorku oomocí snímání této přímky (obrázek 1: A - tečkovaná přímka) Potom se vybere malý úsek (například 3 pm) na této přímce x, na kterém se má zkoumat difúze, za účelem odbarvování (obrázek 1: B-I) . Délka, poloha a počet úseků se může volit libovolně pomocí programového vybavení SCAMP. Odbarvování tohoto úseku světlem probíhá v té době, když laserový paprse. snímá tento úsek s dočasně silně zvýšenou intenzitou laserového paprsku. Typicky je poměr úrovní intenzity laserového paprsku při odbarvování světlem a při monitorován větší než 100.

Protože SCAMP využívá konfokální mikroskop, fluorescenční detekce je možná nejenom na povrchu vzorku, ale rovněž v libovolné hloubce ve vzorku s malou interferencí rozptýleným zářením z mimoohniskových úrovní preparátu (jak se stává v konvenčním mikroskopu). Naopak, když se používá oro osvětlení zářivka a konvenční (nefokální) mikroskop, oozoruje se typicky pouze povrch kuličky. Kódování ve vnitřn doubce je proto obecně obtížné pro pozorování běžným mikroskopem, ale stává se dobře viditelné pomocí konfokální optiky. Konfokální i snímací charakteristiky mikroskopu ooskytují mikrooblasti fotolýzy a čtení při dobře definovaných polohách v mikronosiči. Tento vynález se jasně odlišuje od jiných aplikací popsaných dosud ve stavu techniky například tím, že použití vysoké prostorové rozlišitelnosti SCAMP může nevratně značit mikrokuličky uvnitř v specifické doubce a číst tento kód konfokální technikou.

Způsoby zapisování kódů na mikronosiče podle vynálezu mohou zahrnovat také odbarvování mikronosičů za účelem

4» • 4 « ·44·

4 • 44·

4 «4 444· ·· • •4» • « 9 ·

9

9 · »4 4*4 · 4 vytvoření rozdílných úrovní intenzity v odbarvených látkách v kódu. Přídavně k přenosu informace ve vzoru kódu samotném se může informace přenášet rovněž pomocí rozdílných intenzit v odbarvených obrazcích. Schopnost kódovat mikronosiče pomoc', sdlišných intenzit může dovolovat menší kódy na mikronosičích, tedy šetří prostor, ale stále přenáší stejný oočet nebo více jedinečných identifikátorů pro kódování mikronosičů. Například podle vynálezu je možno odbarvit čtyři odlišné intenzity v perličce. To se může provádět velkým oočtem způsobů, například opakovaným odbarvováním jistých částí perličky vzhledem k jiným nebo v důsledku rozptylu rozdílných úrovní akustické energie v AOM za účelem vytvořeni množiny rozdílných výkonů laseru, které budou vytvářet odbarvené obrazce s rozdílnými intenzitami na základě energie laserového světla použitého pro každou část kódu. Obrázky 2a o 2b jsou dva příklady kódů odbarvených použitím rozdílných intenzit, jeden s čárovým obrazcem a druhý s kruhovým obrazcem. Rozdílné intenzity kódů jsou reprezentovány rozdílnými barvami na obrázcích. Rozdílné úrovně intenzity se mohou také kombinovat s rozdílnými rozlohami kódujících prvků, jako jsou čáry nebo čárové kódy.

Jiné provedení vynálezu se týká čtení kódů na kódovaných mikrokuličkách podle vynálezu. Čtení kódů se může uskutečňovat pomocí běžného mikroskopu, pokud je kód na oovrchu mikronosiče nebo ve vnitřní hloubce mikronosiče, pokud je mikronosič dostatečně průhledný. Čtení kódů se může provádět rovněž za použití konfokálního mikroskopu. Kódy se mohou číst zejména pomocí suspendování mikronosičů ve vodném orostředí, umístění mikronosičů mezi dvě sklíčka nebo jejich rmístěním do mikrokapilár a pozorováním kódů mikroskopem neb< Konfokálním mikroskopem.

Jiné provedení vynálezu se týká způsobů použití Kódovaných mikrokuliček podle vynálezu. Mikronosiče se mohou v« ···» «9

9 999

9 ·

9 · • 9 ·»9 **

9 9 J · *

9·9 «··

9999 použít například jako nosné materiály pro měření biomolekulárních interakcí, pro výzkum léčiv, ověřování vázání receptorů, terapii, lékařskou diagnostiku, kombinatorickou chemii, izolaci a purifikaci cílových molekul, získání a detekci makromolekul pro analytické účely, selektivní odstraňování kontaminujících látek, enzymatickou katalýzu, chemickou modifikaci, hybridizační reakce a forenzní aplikace.

Mikronosiče mohou přednostně sloužit jako nosné materiály v chemických a biologických zkouškách a syntézách.

V tomto případě mohou mikronosiče obsahovat jeden nebo více Ligandů navázaných na povrchu mikronosičů. Mikronosiče 3 navázanými ligandy se potom mohou přivést do styku s cílovými analyty za účelem určení přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických významných analytů nebo mohou sloužit jako nosné materiály pro reakce kombinatorické chemie prováděné na ligandech navázaných na mikronosičích. Příklady cílových analytů pro ligandy navázané na mikronosičích zahrnují antigeny, protilátky, receptory, hapteny, enzymy, proteiny, peptidy, nukleové kyseliny, léčiva, hormony, patogeny, toxiny nebo jakékoliv jiné významné chemikálie nebo molekuly. Zda ligand navázaný na mikronosiči se váže nebo reaguje s cílovým analytem nebo nikoli, se může určit konvenčními technikami používanými v tomto oboru pro takové určení. Reakce se může dokázat například pomocí luminometrické odpovědi. Reakce se může dokázat pomocí kolorimetrické, chemiluminometrické nebo fluorimetrické odpovědi. Ligand navázaný na mikronosiči se může navrhnout tak, aby v přítomnosti významného analytů, na který je zaměřen, se měnila optická signatura mikrokuličky. Taková změna optické signatury může být například výsledkem fotochemické reakce, která probíhá, když se uskutečňuje navázání nebo reakce mezi Ligandem a analytem. Mikronosiče se potom mohou pozorovat po;

• · • ···

• · ·

0· ···· ·· mikroskopem za účelem detekce fluorescence spojené s touto fotochemickou reakcí.

Jako ligandy se k mikronosičům podle vynálezu může vázat široké spektrum chemických a biologických funkčností. Tyto funkčnosti zahrnují všechny funkčnosti, které se běžně používají ve vysokovýkonné skrininkové technice a diagnostice. Ligandy mohou být k mikronosičům navázány konvenčním způsobem obecně používaným pro navázání ligandů k mikronosičům včetně kovalentní vazby a přímého připojení nebo připojení přes linker. Dále se mikronosiče mohou funkcionalizovat různými způsoby za účelem připojení k výchozímu reaktantu.

Mikronosiče podle vynálezu se mohou použít při způsobech detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti jednoho nebo více cílových analytů ve vzorku, které zahrnují přivedení ligandu navázaného na mikronosiči s alespoň jedním analytem, detekci, zda analyt reagoval nebo se navázal k ligandu a čtení kódu Kteréhokoliv mikronosiče, na němž se vyskytla jakákoliv reakce nebo navázání.

Konkrétněji se vynález týká způsobu detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti jednoho nebo více cílových analytů ve vzorku, který zahrnuje výběr jednoho nebo více ligandů, které se vážou nebo reagují s jedním nebo více analyty, navázání Ligandů na velké množství mikronosičů podle vynálezu, korelaci identity ligandů s kódy na mikronosičích, na kterýcr jsou ligandy navázány, přivedení jednoho nebo více analytů dr styku s mikronosiči s navázanými ligandy, pozorování kterýchkoliv mikronosičů, na které se analyt navázal nebo reagoval s ligandem navázaným na mikronosiči, a čtení kódů n; mikronosičích za účelem identifikace jakýchkoliv ligandů, se kterými reagoval jeden nebo více analytů, a tím určení přítomnosti nebo nepřítomnosti jednoho nebo více analytů.

V přednostním provedení výše uvedeného způsobu je cílovým analytem nukleová kyselina, zejména DNA nebo RNA, a ©· ··© • · • * ·©♦ • © · • · » ·· · · · ·· ···© ·· ©· *♦ • · · · • © · • © · • © · «β «··· alespoň jeden ligand navázaný na mikronosiči je reverzním komplementem této nukleové kyseliny. Mikronosiče podle vynálezu jsou tedy užitečné při hybridizací DNA. Mikronosiče jsou rovněž užitečné pro analýzy založené na enzymech a pro imunoanalýzu. Mikronosiče se mohou použít také ve zkouškách orováděných pro skrínink určitých sloučenin ve vzorcích a rovněž pro detekci a izolaci sloučenin z těchto vzorků. Mikronosiče se mohou použít také jako nosné materiály pro vytváření nebo reakci členů knihovny kombinatorické chemie.

Mikronosiče podle vynálezu se mohou použít také při způsobech a zařízeních používaných pro účinný a rychlý skrínink velkého počtu složek, kde může být rozdíl v lígandu navázaném na mikronosiči nebo v rozpustné analytové složce nebo v obou, kde je zájem o určení výskytu inetrakce mezí těmito dvěma složkami. Tato zařízení zahrnují mikrosystém, jako je například tuhý nosný materiál, na kterém jsou umístěny navázané ligandy v předem určeném seznamu a snímač pro detekci interace mezi složkami. Způsob může zahrnovat rřípravu mikrosystému, jako je například tuhý nosný materiál, pro navázání ligandu, potom smíchání ligandu a analytu za íčelem uskutečnění interakce mezi těmito složkami a potom rrčení přítomnosti interakce mezi složkami a přesných poloh.

Mikrosystém bude obvykle zahrnovat množinu rozdílných složek. Teoreticky je potřebná pouze jedna složka, ale může jích být až 10⁵. Zatímco počet složek nebude obvykle přesahovat 10⁵, počet jednotlivých kódovaných mikronosičů může být podstatně vyšší.

Navázaný ligand může být například organického původu, jako například jednotlivá molekula nebo množina molekul, Ligandy a receptory, složky navázané na nukleové kyselině, RNA, jednou a dvěma větvemi vázající se proteiny, které nevyžadují, aby byl ligand vázán k nukleové kyselině, oligonukleotidy a proteiny.

99*9

9 ·11* ·9 · «9 · · 9 • 999 * * • 9 ·

Kódované mikronosiče v mikrosystému mohou být uspořádán·;, v pásech. Pro definované polohy se poskytují sběrače tak, ab> se jednotlivé interakce rychle detektovaly. Zejména kotouče Kruhovými pásy se sběrači definujícími polohy na pásech tak, aby se pozitivní signály mohly interpretovat vzhledem k informaci poskytované sběračem. Kruhové pásy jsou přednostně koncentrické a mají průřez v rozsahu 5 až 5000 pm. Jsou možn< různé modifikace, jako předem připravené úseky, které se potom mohou připojit ke kotouči pro zkoušku.

Předložený vynález se v dalším textu ilustruje pomocí následujících příkladů, které odborníkům v daném oboru dále vysvětlují realizaci vynálezu. Následující příklady pouze ilustrují vynález a zveřejňují různé užitečné vlastnosti jistých provedení vynálezu. Následující příklady by se neměl zhápat jako omezující nárokovaný vynález.

Příklady provedení vynálezu tříklad 1

Dextran-methakrylát (dex-ma) použitý pro přípravu dex-mamikrokuliček, se syntetizoval a charakterizoval tak, jak se popisuje podrobně ve W. N. E. van Díjk-Wolthius et al., „Reaction of Dextran with Glycidyl Methacrylate: An ónexpected Transesterification, Macromolecules, sv. 30, str 3411 až 3413 (1997), přičemž toto zveřejnění je zde začleněn pomocí odkazu. Dex-ma-mikrokuličky se připravily radikálovou polymerací použitím Ν,Ν,Ν' ,Ν'-tetramethylenethylendiaminu a peroxosíranu draselného z emulze dex-ma a polyethylenglykolu (PEG), viz Stekenes et al·., „The Preparation of Dextran Microspheres in an All-Aqueous System: Effect of the Formulation Parameters on Particle Characteristics, Pharmaceutical Research, sv. 15, str. 557-561 (1998), přičemž toto zveřejnění je zde začleněno pomocí odkazu. Koncentrace

4* **·* • 4 • ··« ♦ · · • · · · ·· ·· ·· ··· roztoku dex-ma (ve fosfátovém pufru při pH 7) byla 10 % nmotn. Stupeň substituce dex-ma, která představuje počet methakrylátových molekul na 100 glykopyranosylových jednotek, oyl 4. Koncentrace roztoku PEG ve fosfátovém pufru při pH 7 oyla 24 % hmotn., zatímco průměrná molární hmotnost PEG byla 10 000 g/mol (Merck). Jedna dávka mikrokuliček (FDl48-dex-mamikrokuliček) se připravila v přítomnosti dextranu značeného fluoresceinisothiokyanátem (s molární homotností 148 000 g/mol). Druhá dávka mikrokuliček se opatřila fluoresceinisothiokyanátem (FITC) ponořením dex-ma-mikrokuliček po kompletní přípravě do- roztoku FITC (0,01 mg/ml ve fosfátovém pufru pří pH 7,2). FD148 a FITC se získaly od firmy Sigma. Experimenty s použitím SCAMP se prováděly na obou dávkách mikrokuliček, jak se vysvětluje v příkladu 2.

Příklad 2

SCAMP se instalovala na konfokální laserový snímací mikroskop (CLSM) Bio-Rad MRC1024 podle práce P. Víedekind et sl., „Scanning micropnotoiysis: a new photobleaching technique based on fast intensity modulation of scanned laser oeam and confocal imaging, Journal of Microscopy, sv. 176, str. 23-32 (1994) a P. Wedekind et al., „Line-Scanning Microphotolysis for Diffraction-Limited Measurements of Lateral Diffusion, Biophysical Journal, sv. 71, str. 16211623 (1996), přičemž obsah těchto zveřejnění je zde začleněn pomocí odkazu. Argonový laser (Spectra Physics 2017) se 40x olejovým objektivem a výkonem 2 W (představujícím maximální možný výkon), používaný pro získání dostatečného odbarvení světlem během velmi krátkých dob odbarvování světlem, se použil v pokusech za použití SCAMP na dex-ma-míkrokuličkách vytvořených podle příkladu 1. Vlnová délka laserového paprsku oyla během odbarvování 488 nm.

• * » · « » · « ··

V tomto příkladu se prováděly pokusy za použití SCAMP přibližně 10 pm pod povrchem dex-ma-mikrokuliček. Pokusy orobíhaly následovně. Nejdříve se měřila fluorescence podél jedné přímky x středové roviny dex-ma-mikrokuličky pomocí .snímání této přímky po dobu 400 milisekund (obrázek 1: A tečkovaná přímka) . Potom se vybral 3 pm úsek na této přímce .< za účelem odbarvování (obrázek 1: B-I). Délka, poloha a počet úseků se může volit libovolně pomocí programového vybavení SCAMP. Odbarvování tohoto úseku světlem probíhalo v té době, Když laserový paprsek snímal tento úsek s dočasně silně zvýšenou intenzitou laserového paprsku. Typicky byl poměr úrovní intenzity laserového paprsku při monitorování a při odbarvování světlem 1:500. Pro měření obnovení fluorescence v odbarveném proužku se provádělo snímání silně zeslabeným laserovým paprskem podél zvolené přímky x přibližně 4 sekundy.

Obrázky 3a a 3b znázorňují konfokální obrazy středové roviny FD148-dex-ma-mikrokuličky před a 2 minuty po odbarven' pm úseku. Průměr mikrokuličky je přibližně 25 pm. Pozdější cbraz znázorňuje, že odbarvená ploška zůstává černá naznačujíc tak, že po 2 minutách se nepozorovalo žádné obnovení fluorescence v odbarvené oblasti mikrokuličky. Obrázek 4 (křivka A) znázorňuje, že fluorescence v odbarveném óseku v tomto příkladu se neobnovila, což vede k úsudku, že v časovém rozsahu pokusu se při zkoumání úplně imobilizovaly „velké řetězce FD148 v oblasti dex-ma-míkro-kuliček.

Zatímco řetězce FD148 by se mohly stericky zachytit v síti dex-ma-polymeru, protože jsou přítomny během tvorby mikrokuliček, není to možné pro malé molekuly FITC, když jsou vloženy do dex-ma-mikrokuliček ponořením úplně oolymerizovaných dex-ma-kuliček do roztoku FITC. V tomto ořípadé bylo kompletní obnovení fluorescence vyloučeno a experimentálně potvrzeno. Obrázek 4 (křivka B) znázorňuje, že • · • · • ··* «« ·*·· molekuly FITC umístěné přibližně 10 μτη pod povrchem mikrokuličky zůstávají mobilní.

Kromě toho technická schopnost odbarvování malých úseků světlem ve vzorku za použití snímacího mikroskopu je otevřenoro specifické zvolení mikrooblastí ve vzorku, kde se vyskytlo odbarvení, protože laserový paprsek se může oolohovat. Kromě toho protože délka, poloha a počet úseků se mohou v pokusech s použitím SCAM volit libovolně, může se ve vzorku odbarvovat světlem jakákoliv geometrie. Obrázek 5 znázorňuje konfokální obraz středové roviny FD148-dex-mamikrokuličky 2 minuty po odbarvení kříže, kruhu a oravoúhelníku v mikrokuličkách.

Příklad 3

Pokusy s použitím SCAMP se provedly rovněž na 4 5 μτη Latexových perličkách značených pomocí FITC zakoupených od firmy PolylaB v Antverpách v Belgii. SCAMP se instalovala na ILSM Bio-Rad MRC1024 podle práce P. Wedekind et al·., (19°4)

P. Wedekind et al., (1996}. Výkonný argonový laser (Spectra Physics 2017) se lOOx objektivem, používaný pro získání lostatečného odbarvení světlem během velmi krátkých dob odbarvování světlem, se použil v pokusech s použitím SCAMP n 45 μτη latexových perličkách značených pomocí FITC.· Intenzit Laseru Spectra Physics byla instalována na 300 mW, čehož výsledkem byla monitorovací intenzita laseru 75 _W a intenzita laseru při odbarvování světlem 20 mW (měřeno na Konci optického vlákna, které vysílá laserový paprsek do konfokálního snímacího laserového mikroskopu. Následkem toho oyl poměr intenzity laserového paprsku při monitorování a intenzity při odbarvování světlem 1:266. Vlnová délka Laserového paprsku rovněž během odbarvování byla 488 nm.

Měření s použitím SCAMP se prováděla ve středové rovině 4 5 pm latexových perliček značených pomocí FITC. Nejdříve se »· *·· • * · • · ··· ·· >··· » · · * · ** · · · ·♦ «· • Φ ··· ·· ···· zaostřil obraz, dokud latexová perlička celkem nepokryla obraz. Potom se definovala značka a pomocí programového /ybavení SCAMP se určilo, kde má být odbarvena značka na ^atexové perličce. Značení probíhalo v době snímání středové roviny 45 pm latexových perliček značených pomoci FITC laserovým paprskem. Dočasně silně zvýšená intenzita laserového paprsku (od 75 _W do 20 mW) se vyskytovala v době snímání úseků laserovým paprskem, které se měly odbarvit, za íčelem vytvoření značky. Protože snímání trvalo 6 ms pro „přímku x (obrázek IA) a protože jeden obraz konfokální roviny (tj. středové roviny latexové perličky) obsahuje 512 „přímek x, značení latexové perličky trvalo 3 072 sekund.

Obrázky 6 až 9 znázorňují konfokální obrazy středové roviny v 45 pm latexových perličkách značených pomocí FITC jednu hodinu po odbarvení čárového kódu (obrázek 6a), žárového kódu a čísla (obrázek 6b), čísla R1247 (obrázek 7), Loga Gentské univerzity (obrázek 8) a loga firmy Tibotec (obrázek 9). Obrazy znázorňují, že odbarvené úseky zůstí”ají žerné naznačujíc tak, že v odbarvených úsecích latexových oerliček se nevyskytlo žádné významné obnovení fluorescence.

Hodnoty volby proměnné ohniskové vzdálenosti <onfokálního snímacího laserového mikroskopu Bio-Rad MRC1024 oyly následující: 1,61 na obrázku 6a, 1,-00 na obrázku 6b,

3,07 na obrázku 7, 1,00 na obrázku 8 a 1,00 na obrázku 9. íysoká prostorová rozlišovací schopnost SCAMP pro odbarvován značek se pozoruje na obrázcích 6a a 6b. Značka na obrázku 6 je tvořena 3 typy odlišných čár. Jedna má velkou šířku (2,5 pm), další má střední šířku (1,25 pm) a další má malou šířku (0,62 pm). Všechny čáry jsou umístěny ve vzájemné vzdálenost 1,25 pm.

·» • · · • * ···

• · « • · • · ····

Příklad 4

Následující pokusy demonstrují způsoby odbarvování kódu /e fluoreskujících mikronosičích, přičemž kódy obsahují rozdílné úrovně intenzity způsobené rozdílnými stupni odbarvení. MikronosiČi použitými v následujících pokusech oyly 45 pm latexové perličky značené pomocí FITC, zakoupené od firmy PolylaB'v Antverpách v Belgii.

Pro jednu řadu pokusů odbarvování se použil laser s velikostí 60x a výkonem 300 mW pro vytvoření obrazců znázorněných na obrázku 10a. čtverce v horní řadě mají rozlohu 32 pixelů (2,46 pm) v programovém vybavení a jsou odděleny jinými 32 pixely. Odbarvení je zvětšilo na skutečnou /elikost. Čtverce v dolní řadě obrázku mají poloviční velikost.

Jak znázorňuje obrázek 10a, je možné odbarvení s několika intenzitami. Za předpokladu například úrovně plató o 200 analogů digitálních jednotek („ADU) je možno odbarvení přibližně od alespoň 50 do 200 ADU. Proto se úrovně mohou odbarvit v intervalu přibližně 25 % původní intenzity fluorescence. Fotografie na obrázku 10a ukazuje, že je například určitě možných 6 úrovní odbarvení. Těchto šest úrovní odbarvení je zřejmých ze šesti čtverců odbarvených / horní řadě na obrázku 10a. Intenzita fluorescence těchto ótverců je znázorněna v grafu na obrázku 10c. Šest čtverců o odlišné intenzitě fluorescence se získalo opakováním odbarvování (1 až 6-krát). Za použití šesti kódovaných poloh se šesti rozdílnými intenzitami fluorescence poskytuje 6⁶neboli 46656 rozdílných kódů.

Řada deseti malých odbarvených čtverců znázorněná ¹ na obrázku 10a jasně ukazuje, že odbarvování opakovaným snímáním není lineární. Tyto čtverce jsou pouze dvakrát širší než předcházející jednotka, ale zůstávají jasně rozlišitelné. Úrovně intenzity těchto značek jsou znázorněny na grafu » · © ··· jedné odbarvené skvrny mezi kódujícími polohami je «« «·©* • © · • · · • · Σ • * · · «· ·· ·· ·♦· :· :

©.

» · ·· ·· sbrázku lOd. Konečně intenzita ivěma řadami se šesti a deseti znázorněna na obrázku 10b.

Druhý pokus se prováděl za účelem účinného odbarvování <ódu s 8 kódovanými polohami (softverová šířka jedné čáry = 24 pix x 0,069 μιη/pix = 1,66 pm; oddělená jinými 24 píxely) _c3 rozdílnými intenzitami (za poskytnutí 8⁸ = 16777216 rozdílných kódů). Zvolil se výkon laseru 200 mW. Fotografie mikronosiče v tomto pokusu je znázorněna na obrázku 11a a graf ukazující rozdílné úrovně intenzity jednotlivých kódů j· znázorněn na obrázku 11b. Jasně jsou viditelné rozdílné intenzity. Kód na obrázku 11a je číslo 15263748.

Obrázky 12a 12b znázorňují jiný příklad osmi kódovaných poloh rozdílné intenzity. V tomto případě se odbarvení orovedlo pomocí 250 mW místo 200 mW jako v předcházejícím ořípadě a provedlo se za použití 0,056 mm/pix. Kód v tomto případě byl 13265874. Fotografie kódů a graf rozdílných intenzit kódů je znázorněn na obrázcích 12a a 12b

Jiná provedení vynálezu budou zřejmá odborníkům v daném iboru z opisu a vynálezu zde zveřejněných. Uvažuje se, že opis a příklady jsou určeny pouze jako příklady s rozsahem a oodstatou vynálezu určenými následujícími nároky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kódovaný míkronosič, vyznačující se í í m , že je kódován kódem se zachovanou životností a zapsaným na mikronosiči jinými prostředky, než je přenos elektronických dat.
2. Kódovaný míkronosič podle nároku 1, vyznačující se tím, že kód je zapsán ve vnitřní hloubce mikronosiče.
3. Kódovaný míkronosič podle nároku 2, vyznačující se tím, že kód je zapsán ve středové rovině mikronosiče.
4. Kódovaný míkronosič podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že mikronosičem je mikrokulička.
5. Kódovaný míkronosič podle nároku 3, vyznačující se tím, že míkronosič má průměr 1 až 200 μπι.
6. Kódovaný míkronosič- podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že kód byl zapsán pomocí vystavení mikronosiče světelnému zdroji s vysokou orostorovou rozlišovací schopností.
7. Způsob kódování mikronosiče, vyznačuj ící se t í m , že zahrnuje zapisování kódu se zachovávanou životností na míkronosič jinými prostředky, než je přenos elektronických dat.

Změněný list • · •4 «44« • · · • 44 • 4 • · 4 • 4 «· v* ··»» · ·

4 «444

4 · ·· ·

4 · · «4 «·«

4 * • 4 • · ««««
8. Způsob podle nároku 7,vyznačující se Lim, že kód se zapisuje do vnitřní hloubky mikronosiče.
9. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že kód se zapisuje do středové roviny mikronosiče.
10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9, v y značující se tím, že mikronosičem je mikrokulička.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se t í m , že mikrokulička má průměr 1 až 200 μπι.
12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 11, vyznačující se tím, že zahrnuje vystavení mikronosiče světelnému zdroji s vysokou prostorovou rozlišovací schopností za účelem zapisování kódu na mikronosič.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že světelným zdrojem je laser nebo výbojka.
14. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačuj í z í se tím, že kód se zapisuje na mikronosič odbarvováním mikronosiče.
15. Způsob podle nároku 14,vyznačující se tím, že mikronosič obsahuje fluoreskující molekuly a že tód se zapisuje pomocí odbarvení fluoreskujících molekul.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že kód se zapisuje pomocí odbarvení fluoreskujících

Změněný list * » * ·*♦ « • · · ·· *· «· ··· :· :

• · • * • ·*·· molekul za účelem vytvoření dvou nebo více rozdílných úrovní /ýsledné intenzity fluorescence v odbarvených částech kódu.
17. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 16, vyznačující se tím, že mikronosič obsahuje materiál zvolen ze souboru zahrnujícího tuhou látku, oolotuhou látku a kombinaci tuhé a polotuhé látky.
18. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7, 8 a 12, vyznačující se tím, že mikronosičem je orokaryotická nebo eukaryotická buňka.
19. Způsob čtení kódovaného mikronosiče podle kteréhokoliv z nároku 1 až 6, vyznačující se tím, že zahrnuje pozorování kódu konfokálním mikroskopem.
20. Způsob detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti jednoho nebo více cílových analytů ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje výběr jednoho nebo více ligandů, které se vážou nebo reagují s jedním nebo více analyty, navázání ligandů na velké množství kódovaných mikronosičů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, korelaci identity ligandů s kódy na mikronosičích, na kterých jsou í-igandy navázány, přivedení jednoho nebo více analytů do styku s mikronosiči s navázanými ligandy, pozorování kteréhokoliv mikronosiče, na který se analyt navázal nebo reagoval s ligandem navázaným na mikronosiči, a čtení kódů nu níkronosičích za účelem identifikace kterýchkoliv ligandů, se Kterými reagoval jeden nebo více analytů, a tím určení ořítomnosti nebo nepřítomnosti jednoho nebo více analytů.

>
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se c i m , že cílovým analytem je nukleová kyselina a že alespoň •φ ♦··· • · · φ > · ϊ * · φ φ φ · •· ·· • φ · * · Φ·· φφ ···· jeden ligand navázaný na mikronosiči je reverzním komplementem nukleové kyseliny.
22. Způsob podle nároku 21,vyznačující se tím, že zahrnuje hybridizaci DNA.
23. Způsob detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti jednoho nebo více cílových analytů ve vzorku, v y z n a č u jící se tím, že zahrnuje přivedení ligandu navázaného na mikronosiči s alespoň jedním analytem, přičemž mikronosičem je kódovaný mikronosič podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, detekci toho, zda analyt reagoval nebo se navázal k ligandu a čtení kódu kteréhokoliv mikronosiče, na němž se vyskytla reakce nebo navázání.
24. Mikronosič s navázaným ligandem, vyznačuj í c i se t í m , že obsahuje kódovaný mikronosič podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 s navázaným ligandem na mikronosiči.
25. Chemická knihovna, vyznačující se tím, že obsahuje individuální členy knihovny navázané na množinu kódovaných mikronosičů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
26. Chemická knihovna podle nároku 25, vyznačující se tím, že je kombinatorickou chemickou knihovnou.