JP2003185663A - Ｄｎａプローブアレー製造方法、製造装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 任意のＤＮＡプローブを多種類固定した多種
類のＤＮＡ検出用のプローブアレーを提供する。 【解決手段】 種々のプローブ２を固定した粒子（プロ
ーブ粒子）１を一定の順序で整列させたプローブアレー
４を用いる。各プローブ粒子を充填した細管又は溝を複
数本並列に並べ、各細管又は溝から各々粒子の１個ずつ
を、他の細管又は溝に注入して、種々のプローブ粒子１
を常に一定の順序で整列させたプローブアレー４を作成
する。粒径の異なる粒子に多種のプローブを結合して、
多種類の蛍光標識ＤＮＡを同時計測する。 【効果】 多種類のＤＮＡプローブを固定したアレーが
簡単に調製できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、検出対象をＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、及びタンパク質として種々の検査項目を１
度に検査するプローブアレーに関し、特に、最近注目を
集めているプローブアレーの製造方法及び装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベル
で生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしよう
とする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子
の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有
効である。この遺伝子の発現状況を調べる有力な方法と
して、固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に
区分けして固定したＤＮＡプローブアレー、又はＤＮＡ
チップが用いられ始めている。このチップを作るには、
光化学反応と半導体工業で広く使用されるリソグラフィ
ーを用いて区画された多数のセルに、設計された配列の
オリゴマーを１塩基づつ合成して行く方法（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５１、７６７−７７３（１９９１））、又はＤ
ＮＡプローブを各区画に１つ１つ植え込んでいく方法等
がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来技術では、ＤＮＡ
プローブアレー、又はＤＮＡチップの作成の何れの方法
も制作に手間と時間がかかり、製作費が高価になる難点
がある。特に、プローブアレー（プローブの配列）が高
密度であり微細な部分からできていると製作は一層手間
と時間のかかるという難点がある。また、使用者が簡単
に作れない不便さもある。プローブアレーが粗に配列す
る場合には、製作する上では楽になるが、全体として検
出反応に要する体積、従ってサンプル量が多くなり、計
測の面でも時間がかかったり、高感度が得られない等の
問題がある。

【０００４】本発明は上記の難点を解決するためになさ
れたもので、本発明の目的は、簡単に望むＤＮＡプロー
ブアレー（ＤＮＡプローブの配列）を密集した状態で作
ることができ、製造コストも安価な方法を提供すること
にある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明では、各プローブを保持した固体を移動できる
様に微粒子で構成し、微粒子をまばらに配列させた後に
移動させ、密集構造のプローブアレーを作製する。ま
ず、種々のＤＮＡプローブを合成して用意する。これら
のＤＮＡプローブをプローブの種類毎に微粒子の表面に
結合させる。固体表面へのＤＮＡプローブの固定は、ビ
オチンとアビジンの結合を利用する方法、Ａｕ（金）表
面にＳＨ基を介して固定する方法（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ７１、１０７９−１０８６（１
９９６）、ガラス表面に固定する方法（Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７、９６−１
０１（１９９７））、ガラス表面に塗布したアクリルア
ミドゲルのエレメントマトリックスに固定する方法（Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３、
４９１３−４９１８（１９９６））等を利用して、簡単
に固体表面に多量のＤＮＡプローブを固定できる。

【０００６】ＤＮＡプローブを表面にそれぞれ保持した
種々の微粒子を、検査用のホルダーにＤＮＡプローブの
種類毎に決められた順序で入れ、又は固体表面に種類毎
に一定の順序で配列させて固定してプローブアレーを構
成する。微粒子は球状でありサイズは用途にもよるが、
直径数μｍから１ｍｍである。微粒子は、用途によって
は、角形、円盤形等を使用しても良い。通常の検査には
直径０．１―０．２ｍｍの球形の微粒子が使いやすい。

【０００７】溶媒と共にプローブを保持した微粒子（以
下、プローブ微粒子とも言う）は１つづつプローブアレ
ー作成用の溝に供給される。検査用途に応じて、必要な
種類のプローブを簡単に溝の中に並べることができる。
各プローブを固定した微粒子の作製は安価にできるの
で、プローブアレー自身も安価に作ることができる。溝
に並べられたプローブ付きの微粒子は検査用の毛細管、
又は細い隙間のセルに入れられ、使用される。毛細管を
プローブアレーホルダーに使用したときには、検査しよ
うとする試料ＤＮＡの量を少なくすることができる利点
がある。また、溶液導入系との結合も簡単にできる利点
がある。

【０００８】以下に本発明の構成の特徴の詳細を説明す
る。本発明の多項目検査を行なうプローブアレーの特徴
は、（１）異なる検査対象（ＤＮＡ又は蛋白等）とそれ
ぞれ結合可能なプローブを固定した粒子を複数並べたこ
と、（１）に於いて、（２）各プローブを保持した粒子
が予め決められた順序でライン状に並べられ、この順序
又は並べられた位置と粒子に固定されたプローブの種類
が対応づけられていること、（３）各プローブを保持し
た粒子は、粒子の持つ特徴とプローブの種類が対応づけ
られていることに特徴があり、（１）又は（３）に於い
て、（４）各プローブを保持した粒子のサイズ又は形状
と、粒子の表面に固定されたプローブの種類が対応対応
づけられていること、（５）各プローブを保持した粒子
は、保持したプローブの種類に応じて異なる色素又は蛍
光体で標識されていること、（３）から（５）の何れか
に於いて、（６）プローブを２次元平面上に１層に並べ
たこと、（７）プローブを１次元に並べたこと、（８）
プローブを透明な窓を持つ容器内に保持したこと、
（１）から（５）の何れかに於いて、（９）プローブを
保持した粒子を、毛細管内に保持したこと、（１０）プ
ローブを保持した粒子を、固体平面に形成された溝又は
２枚の平面の間に形成された溝に保持されること、（１
１）プローブを保持した粒子を複数の毛細管内に保持し
た複数の毛細管を複数個並べるか、又はプローブを保持
した粒子を平面に設けた溝に保持して、プローブを保持
した粒子を２次元に配列したこと、（１２）（１）から
（７）の何れかに於いて、プローブを保持した粒子を、
アガロース等のゲル状物質の中に保持したこと、等に特
徴がある。

【０００９】本発明の多項目検査を行なうプローブアレ
ーの製造方法の特徴は、（１３）粒子の表面にプローブ
を固定する工程と、プローブが固定された複数の粒子を
配列する工程とを有すること、（１４）粒子の表面にプ
ローブを固定する工程と、プローブが固定された複数の
粒子を混合して平面上に配列する工程とを有し、粒子に
固定されたプローブの種類を粒子の形状、サイズ、又は
粒子を標識する蛍光体により識別すること、（１５）
（１２）に於いて、粒子に固定されたプローブの種類に
より、予め定められた順序で粒子を直線上に並べるこ
と、（１６）（１４）に於いて、プローブを固定した粒
子を、プローブの種類毎に異なる粒子溜に保持し、毛細
管又は溝を通じて粒子を配列するための溝に１つづつ供
給して配列させ、該配列を保持してプローブアレーホル
ダーに移送してプローブアレーを作成すること、（１
６）において、粒子溜から粒子を配列するための溝、又
はプローブアレーホルダーへの移送を電気的な力により
行なうこと、（１８）粒子溜から粒子を配列するための
溝、又はプローブアレーホルダーへの移送を溶液の流れ
を用いて行なうこと、（１９）（１４）から（１７）の
何れかに於いて、プローブを固定した粒子を移送するた
めの毛細管又は溝を複数個用いて、異なるプローブがそ
れぞれ固定された複数の粒子を同時に粒子を配列するた
めの溝又はプルーブアレーホルダーに移送すること、に
特徴がある。

【００１０】粒子の表面に保持されたプローブに結合す
る検査対象を検出する本発明の方法の特徴は、（２０）
検査対象を蛍光体又は燐光物質で標識する工程と、粒子
に光（レーザー）を照射して発する蛍光又は燐光を光学
的に検出する工程とを有すること、（２０）に於いて、
（２１）粒子が配列した直線に沿って、光（レーザー）
を発する光源とアレーセンサーをスキャンして、粒子が
配列する位置毎に蛍光又は燐光を検出すること、（２
２）粒子が配列した直線に沿って、光（レーザー）を照
射して、粒子が配列する位置毎に蛍光又は燐光を検出
し、各プローブに結合した検査対象の量を求めること、
（２３）光の照射により得られる各粒子による光の散乱
画像と、粒子に固定されたプローブに結合した検査対象
から発する蛍光とを検出し、粒子の形状又は粒子を標識
する蛍光体から発する蛍光と、検査対象から発する蛍光
又は燐光の強度の関係を検出し、各プローブに結合した
検査対象の量を求めること、（２４）粒子をフローさせ
ながら検出すること、（２５）粒子に固定されたプロー
ブに結合した検査対象を蛍光画像として計測すること、
（２６）粒子を粒子画像として計測すること、等に特徴
がある。

【００１１】本発明のプローブアレーの製造方法は、
（２７）粒子の表面にプローブを固定する第１の工程
と、プローブが固定された複数の粒子を郡に分けて固体
表面の各区画に配列する第２の工程と、各位区画に於い
て粒子に固定されたプローブと検査対象とを反応させる
第３の工程と有し、第３の工程が行なわれる各区画での
粒子の分布状態と、第１の工程での粒子の分布状態が異
なることに特徴がある。

【００１２】本発明の代表例を要約すると以下の通りで
ある。本発明の代表例では、種々のプローブを固定した
粒子（プローブ粒子）を一定の順序でホルダーに整列さ
せたプローブアレーを用いる。各プローブ粒子を充填し
た細管又は溝を複数本並列に並べ、各細管又は溝から各
々粒子の１個ずつを、他の細管又は溝に注入して、種々
のプローブ粒子を常に一定の順序で整列させたプローブ
アレーを作成する。粒径の異なる粒子に多種のプローブ
を結合して、多種類の蛍光標識ＤＮＡを同時計測する。
本発明では、多種類のＤＮＡプローブを固定したプロー
ブアレーが簡単に調製でき、任意のＤＮＡプローブを多
種類固定した多種類のＤＮＡ検出用のプローブアレーを
提供する。

【００１３】本発明のほかに以下の構成の特徴を有す
る。本発明の多項目検査を行なうプローブアレーの特徴
は、（１）複数の粒子の表面にプローブを結合させ、前
記プローブが固定された複数の前記粒子を前記プローブ
の種類ごとに区分けして複数の溝１に保持し、前記溝１
に保持された前記粒子を溝２に１つづつ導き、前記溝２
に導かれた前記粒子を前記溝２の内部での配列順序を保
ちながら、プローブアレーホルダーへと送って配列させ
ること、（２）プローブが表面に固定された複数の粒子
を前記プローブの種類ごとに区分けして保持する複数の
溝１と、前記溝１に保持された前記粒子を１つづつ導入
させて配列させて保持し、かつプローブアレーホルダー
へ連結する溝２と、前記粒子を前記溝１から前記溝２
へ、および前記溝２から前記プローブアレーホルダーへ
と移動させるための移動手段とを有すること、等があ
る。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を図を参照
して詳細に説明する。 （第１の実施例）図１は、本発明の第１の実施例のＤＮ
Ａプローブアレーの製作手順、ＤＮＡプローブアレーを
用いる検査装置を示す図である。アビジン７０を表面に
保持した球形のプラスチック粒子１（直径０．２ｍｍ）
を用意する。微粒子１の直径の精度は５％である。ビオ
チン付きのプライマーを用いてＰＣＲ増幅して得たＤＮ
Ａプローブを１本鎖とし、ビオチン７１が結合されたＤ
ＮＡプローブ２と、アビジンを保持した微粒子（プロー
ブ粒子）とを結合させる。このようにしてＤＮＡプロー
ブを種類毎に微粒子に捕獲し、複数のプローブが捕捉さ
れた微粒子３の群ができる。もちろんＤＮＡプローブと
して合成ＤＮＡ鎖を用いても良く、この場合、ビオチン
ーアビジン結合でなく固体（微粒子）表面に直接ＤＮＡ
プローブを結合させる事もできる。固体表面にＤＮＡプ
ローブを結合させる方法は、例えば、上記した文献
（（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ７１、
１０７９−１０８６ （１９９６）やＡｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４７、９６−１０１
（１９９７））に記載がある。また、固体（微粒子）表
面に全て同じ特定の配列、例えばＴＴＴＴＴ………ＴＴ
等を固定しておき、ポリＡ鎖を持ったＤＮＡオリゴマー
をハイブリダイズさせ、相補鎖合成により、ＤＮＡオリ
ゴマーを上記の特定の配列と結合させ固体（微粒子）表
面に導入しても良い。

【００１５】このようにして作成したプローブが捕捉さ
れた微粒子を１つづつ透明なキャピラリー管（プローブ
アレーホルダー７）の中に並べてプローブアレー４とす
る。キャピラリー管（プローブアレーホルダー７）の中
に並べる順番から、並べられた何番目の微粒子がいかな
る種類のプローブを表面に持つかを知ることができるの
で、ＤＮＡプローブ２と蛍光標識８が結合された試料Ｄ
ＮＡとをハイブリダイズした（９は相補鎖結合により微
粒子１に捕捉された試料ＤＮＡ断片である）後、光を照
射して発する蛍光から検査体中のＤＮＡの種類を知るこ
とができる。

【００１６】プローブ１、２、…、ｎからなるプローブ
アレー４を持つキャピラリー管（プローブアレーホルダ
ー７）の試料注入口５の試料流入方向６から蛍光標識８
が結合された試料ＤＮＡを注入してＤＮＡプローブ２と
蛍光標識８が結合された試料ＤＮＡとをハイブリダイズ
させた後、プローブアレーホルダー７を検査装置の移動
台（図示せず）にセットして、レーザー光源１１からの
レーザーをレンズ１２で集光して移動するプローブアレ
ーホルダー７に照射する。５”は、試料出口である。レ
ーザーが照射された部位に存在する微粒子１に捕捉され
た蛍光標識８が結合された試料ＤＮＡから発する蛍光は
フイルター１２により波長選択され、ＣＣＤカメラ１３
等の光検出器により、レーザーの照射方向とほぼ直交す
る方向から検出される。検出された蛍光信号はモニター
１７にリアルタイムで表示されると共に、データ処理装
置１５に入力され所定の信号処理（蛍光強度の変化曲線
の平滑化、ピークの位置及び強度の検出等）が施され結
果が表示装置１６に出力される。モニター１７に表示さ
れる出力図形の横軸は、キャピラリー管（プローブアレ
ーホルダー７）の中に並べられた微粒子１の位置、従っ
てプローブの種類に対応し、縦軸は各プローブと相補鎖
結合した試料ＤＮＡ断片の存在を示す蛍光強度である。
なお、コントローラー１４は、上記の移動台の移動制
御、ＣＣＤカメラ１３からの信号取り込み制御、データ
処理装置１５、及びモニター１７への信号伝送を制御す
る。モニター１７、又は表示装置１６での出力から、試
料ＤＮＡ（断片）に検査目的の塩基配列が存在するか否
かが判定できる。

【００１７】なお、上記の説明では、蛍光標識を試料Ｄ
ＮＡ（断片）に結合したが、プローブ１、２、…、ｎの
それぞれ異なる蛍光標識を結合しておき、試料ＤＮＡ
（断片）に蛍光標識を結合しない構成としても良く、こ
の場合フイルター１２は、複数の波長帯域を選択できる
多色フイルタの構成とするか、フイルター１２の代わり
に、分光結晶、回折格子等を使用して蛍光の分光を行な
う構成とする。

【００１８】次に、第１の実施例に於ける、微粒子をプ
ローブ固定媒体とするプローブアレーの作製方法につい
て説明する。

【００１９】図２は、（ａ）微粒子をプローブ固定媒体
とするプローブアレー作製治具の部品である細溝を持つ
プレートの平面図、（ｂ）プローブアレー作製治具の断
面図である。プローブ付き微粒子１は細溝を用いた微粒
子配列用の治具により並べることができる。図２（ａ）
の平面図に示す、微粒子配列用細溝治具の細溝を持つプ
レート１８に、図２（ｂ）の断面図に示す透明カバー２
３をつけて使用する。プレート１８には、異なる種類の
プローブを保持する微粒子をそれぞれ異なる溝に並べる
複数の溝１９と、溝１９に交叉（直交）し、プローブを
保持した種々の微粒子を配列するための溝（プローブア
レー作製用細溝）２０と、送液を排泄する送液出口用の
溝２１とが形成されている。溝１９、２０の溝幅方向及
び溝深さの最大値は２つの微粒子が同じに入れない寸法
（即ち、微粒子の直径をＲとする時最大値を２Ｒ未満と
する条件１を満たす）とし、溝２１の溝幅方向及び溝深
さの最大値は微粒子が通過できない寸法（即ち、微粒子
の直径をＲとする時最大値をＲ未満とする条件２を満た
す）とする。即ち、プレート１８に形成される細溝１
９、２０と透明カバー２３により形成される細管の内部
を微粒子１は通過できる。なお、溝１９、２０、２１の
断面形状、寸法は、上記条件１、２を満たすものであれ
ば、溝の断面形状は任意である。

【００２０】細溝１９の１つの溝には同一種類のプロー
ブを保持する微粒子が、ランダムな間隔で並んでいる。
細溝１９の各細溝毎に異なるプローブを保持する微粒子
が区分けして保持される。例えば、細溝１９の第１の溝
１９−１にはプローブ１を保持する微粒子が、第２の溝
１９−２にはプローブ２を保持する微粒子が、…、第ｎ
の溝１９−ｎにはプローブｎを保持する微粒子が、それ
ぞれ並べられる。複数の溝１９に直交して設けられた溝
２０にはプローブを保持した種々の微粒子が配列され
る。プローブ付き微粒子１は溶液の流れ、又は電界によ
り配列用の溝２０に導かれる。溝１９には横方向には２
つの微粒子はサイズの関係で入れないので、各種プロー
ブを保持した微粒子（プローブ粒子）が１つづつ複数の
細溝１９のアレーとプローブ配列用溝２０との交点に並
ぶ。この交点から先の溝２１は細くなり粒子は先へ進め
ないようになっている。粒子の間隔はこの時点でまばら
（ランダム）である。溝２０に並んだ微粒子は、溝１９
と直行する方向、即ち配列用の溝２０に沿って溶液流、
又は電界によりプローブアレー保持キャピラリー（プロ
ーブアレーホルダー７）（内径０．３ｍｍ）に送り込ま
れ隙間無く配列する。２２は、微粒子配列用の治具（２
３、２０）とプローブアレーホルダー７とを結合するプ
ローブアレーホルダーコネクターであり、５’はストッ
パーチューブである。細溝１９の各溝に通じる粒子溜
（図９の３８参照）には、用いようとするＤＮＡプロー
ブを固定した粒子を供給しておく。このプローブを固定
した粒子を保持する粒子溜の配列順序が、溝２０、プロ
ーブアレー保持キャピラリーに於けるプローブの配列順
序となる。プローブを固定する粒子の間にマーカーとな
る粒子を入れて順序をわかりやすくすることもできる。

【００２１】次に、第１の実施例に於ける、キャピラリ
ー管中にプローブを保持するプローブアレーホルダー７
の例について説明する。

【００２２】図３は、第１の実施例に於けるプローブア
レーホルダーの例を示す図である。プローブ付き微粒子
は試料注入口、及び排出口のついたプローブアレーホル
ダー７（キャピラリー）に保持されている。プローブア
レーホルダー７の両端には、微粒子１が流出しないよう
にストッパーチューブ５’、及びプローブアレーホルダ
ーコネクター２２を介してキャピラリーホルダー用末端
アダプター２４が取り付けられている。もちろんアダプ
ター２４は微粒子をキャピラリー（プローブアレーホル
ダー７）に導入してから取り付ける。

【００２３】検査しようとするＤＮＡ試料を蛍光標識
（ここでは、Ｃｙ−５（発光極大波長６５０ｎｍ）を用
いた）し、溶媒と共にプローブアレーを保持するキャピ
ラリー（プローブアレーホルダー７）中に導入し、ハイ
ブリダイゼーションをＤＮＡ試料とプローブとの間で起
こす。ハイブリダイゼーションにより目的ＤＮＡをプロ
ーブに結合した後、余剰のＤＮＡサンプルを洗浄除去し
て蛍光検出をするが、ライン状のプローブアレーでは、
プローブアレーを保持するプローブアレーホルダー７の
機械的な走査が容易であり、試料の消耗が少ない利点が
ある。なお、標識蛍光体としてはテキサスレッド（発光
極大波長：６１５ｎｍ）、フルオレセインイソチオシア
ネート（発光波長：５２０ｎｍ）等があり、これら標識
蛍光体に加えて燐光を発する標識体を用いても良い。未
反応のＤＮＡを洗浄除去し、計測装置に挿入する。計測
装置は励起用レーザー、及び蛍光検出器からなってい
る。キャピラリー管（プローブアレーホルダー）に沿っ
てレーザーをスキャンしたり、キャピラリー管の内側を
管に沿ってレーザーを照射し多数の微粒子を同時に光照
射し得られる蛍光画像を検出したりする。また、キャピ
ラリー管を動かし微粒子を順次照射部へ送り込んでも良
い。

【００２４】次に、ＤＮＡプローブアレーを用いる検査
装置の例について説明する。

【００２５】図４は、ライン状プローブアレーと光源と
を相対的にスキャンするＤＮＡプローブアレーを用いる
検査装置の例を示す模式図である。図４では、図１に示
す構成と同様とし、レーザー照射位置と検出器１３を相
対的に固定し、レーザー照射位置と検出器１３とを固定
してプローブを保持したプローブアレーホルダー７を相
対的に移動させて照射するか、又はプローブアレーホル
ダー７を固定してレーザー照射位置と検出器１３を相対
的に移動させて照射する方式とする。検出器１３には光
電子増倍管やレンズ付き冷却ＣＣＤカメラが用いられ、
蛍光はレーザの照射方向とほぼ直交する方向から検出さ
れる。

【００２６】図５は、レーザー光をライン状に配列した
微粒子に沿って照射するＤＮＡプローブアレーを用いる
検査装置の例を示す模式図である。図５では、レーザー
光源１１からのレーザーをプローブアレーホルダー７の
軸に沿って同軸方向に照射する例である。標識蛍光体か
ら発する蛍光を、レーザーの照射方向と交叉する方向か
らマイクロレンズアレー（セルホックレンズ）２５で集
光し、フイルター２６を介してラインセンサー２７に結
像させる。図５に示すその他の構成要素は、図１に示す
構成と同様である。図５に示す構成は、効率の良い方法
であるが微粒子が透明な場合に限られる。

【００２７】図６は、プローブアレーの存在する領域
（プローブの並ぶ照射領域）３０の全体を全面照射する
ＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置の例を示す模式
図である。図６に示す構成では、プローブアレーは１次
元に配列しているが２次元に配列した場合にも適用でき
るように、冷却ＣＣＤエリアセンサー等を蛍光の検出に
用いる。レーザー光源１１からのレーザー光はミラー２
８で進行方向を変えてビームエクスパンダー２９により
レーザー光の照射領域を１次元方向に拡大して、プロー
ブアレーホルダー７のうちプローブが並ぶ照射領域３０
の全体を全面照射する。ＣＣＤエリアセンサー等の２次
元光検出器を使用する場合には、蛍光の２次元像が得ら
れ、発光点の位置からプローブの種類がわかる。図６に
示すその他の構成は基本的に図１と同様である。また、
図６に於いて、更に、コンフォーカル顕微鏡、及び類似
技術を用いても良い。例えば、ビームエクスパンダー２
９を使用せず、ミラー２８を回転させてレーザーの進行
方向を変えてレーザースキャンを行ない、レーザーが照
射されるプローブアレーホルダー７の部位に存在する標
識蛍光体から発する蛍光を検出する構成とする。

【００２８】図７は、微粒子型プローブアレーを使用す
る図６に示す構成により得られるモニター１７に出力さ
れる結果の例を示す図である。図７に示す例では、蛍光
発光を伴う微粒子（ターゲットＤＮＡを保持微粒子）３
１を黒く表示した丸印、蛍光発光を伴わない微粒子（タ
ーゲットＤＮＡを保持しない微粒子）３２を白く表示し
た丸印で示す。黒く表示された３１のところが蛍光が強
く、ＤＮＡがプローブに捕獲されている事が分かる。図
６、図７に示す例では、蛍光体は１種類用いて試料ＤＮ
Ａを標識したが、蛍光体を複数種用いて複数のＤＮＡサ
ンプルを標識して、比較計測しても良い。

【００２９】以上説明したように、粒子に保持したＤＮ
Ａプローブを毛細管の中に保持すると、サンプル供給が
容易で洗浄もやりやすい利点がある他、蛍光計測が簡単
にでき、必要とする好みのプローブアレーを簡単に作る
ことができる。廉い価格でプローブアレーを提供できる
等の利点がある。また、ハイブリダイゼーションに要す
る試料体積も小さくできる。なお、第１の実施例では、
複数のプローブの保持にキャピラリーを用いたが、透明
な平板に設けた溝を用いても良い。粒子を溝に並べる場
合、溝の底部にゲルを保持させておきプローブを保持し
た粒子を溝に配列後に、粒子をゲルに押し付けて固定し
ても良く、この場合、サンプル液を満たす空隙が小さく
なりサンプル消耗を押さえることができる。溝を形成し
た透明な平板によりプローブアレーを構成する場合に
も、図１、図４、図５、図６、図１０（後述する）に示
す検査装置の例が適用でき、プローブの捕捉された試料
を蛍光により容易に検出が可能でることは言うまでもな
い。 （第２の実施例）第１の実施例ではプローブアレーを直
線上に配置したが、第２の実施例では、プローブアレー
を２次元的に配置する例を示す。第２の実施例で用いる
微粒子は第１の実施例と同じ直径０．２ｍｍの粒子であ
るが、直径が０．１ｍｍ、又は０．０５ｍｍの粒子を用
いる時は、以下に述べる溝のピッチ、深さ、プローブア
レーホルダーのサイズ等を変える必要がある。

【００３０】プローブアレーを２次元的に配置する方法
には、プローブアレーを保持したキャピラリー管を並べ
プローブアレーホルダーとするか、平板に複数の溝を形
成し、透明カバーを取り付けプローブアレーホルダーと
して活用する。キャピラリー管を並べプローブアレーホ
ルダーとする場合の作製法は、第１の実施例と同じであ
り、単にキャピラリーを複数並べれば良い。但し、複数
キャピラリーを平行に保持し、サンプルを供給したり、
洗浄液を送り込むためのハウジングはマルチキャピラリ
ーであることに応じてかえる必要がある。また、レーザ
ーを複数キャピラリーに照射する際に、複数キャピラリ
ーの配列される平面に平行な方向からレーザービームを
照射し、各キャピラリー内で発する蛍光を２次元検出器
で検出するか、又は複数キャピラリーの配列される平面
に対して、ビームエクスパンダーにより２次元に広げら
れたレーザーを照射して、各キャピラリー内で発する蛍
光を２次元検出器で検出する構成とする。

【００３１】以下の説明では、平板に複数の溝を形成し
たプローブアレーホルダーについて説明する。２次元プ
ローブアレーホルダー３４は透明な２枚の平板で挟まれ
た間隙０．１ｍｍを持つセルからなっており、下面の平
板には溝が設けられている。溝のピッチは０．３ｍｍ、
溝の幅０．２５ｍｍ、溝の深さは０．１５ｍｍであり、
溝の幅、及び溝の深さは共に２個の粒子が通過するには
小さく、１個の粒子が通過するのに十分である値とす
る。各溝にプローブを固定した微粒子を並べる。微粒子
の直径サイズは０．２ｍｍであり、微粒子は溝から溝へ
移動する事はできない。

【００３２】図８は、（ａ）２次元プローブアレーホル
ダー３４へ微粒子プローブを導入するための２次元プロ
ーブアレーを作製する治具３３の平面図、（ｂ）断面図
である。２次元プローブアレーホルダー３４へ微粒子を
並べるには図８（ａ）、（ｂ）に示す、ガイドのプロー
ブ供給用細溝３６を利用する。溝３６の開口部は透明カ
バー３５で覆われている。図８（ａ）に示すように、溝
３６は末広になっており、溝３６の広がった部分にプロ
ーブ付き微粒子１を、保持したプローブの種類により定
められた順序で並べる。溝３６のアレーに並べられたプ
ローブ付きの微粒子１を溶媒の流れ、又は電界によって
溝３６の狭い部分（粒子保持部３７）へ移動させて２次
元プローブアレーホルダー３４へ移送する。溝３６にま
ばらに配置されていたプローブ付き微粒子は、図８
（ｂ）に示す断面図に見られるように、２次元プローブ
アレーホルダー３４に密集した状態で保持される。プロ
ーブアレーホルダー３４には、図示しない、試料液、又
は洗浄液を導入、及び排出できるように口が設けられて
いる。溝３６にプローブ付きの微粒子を並べるのは第１
の実施例で用いたのと同様に、キャピラリーにまず微粒
子を配列させ、微粒子を溝３６に移送することで行な
う。微粒子は溝３６を超えて隣へ移動できないので、各
列（溝）に属するプローブ粒子はその属するグループ毎
に異なる列（溝）に配置される。各列（溝）のプローブ
の配列は第１の実施例と同様に定めることができる。次
いで、微粒子は溝３６からプローブ付き微粒子配列用細
溝３７に移送される。

【００３３】蛍光を検出する検査装置は図６に示す装置
を一部改良して、２次元プローブアレーホルダー３４に
図６に示すように１次元方向に拡大された線状のレーザ
ー光を照射し、拡大方向と直交する方向に線状のレーザ
ー光をスキャンすることで得られる２次元蛍光イメージ
を、２次元検出器（ＣＣＤ等）を使用して検出する。も
ちろん、点状に絞ったレーザーを２次元方向に走査して
２次元蛍光画像を得ても良い。 （第３の実施例）本発明の方法では微粒子を簡便に並べ
る手法が１つのキーポイントである。第３の実施例では
簡便に微粒子を並べプローブアレーを作製する例を示
す。プローブアレーではプローブを保持した固体（粒
子）を密集して並べることが反応体積を小さくし、計測
を容易にする上で重要である。一方、プローブアレーを
製作する観点からはプローブを保持する部位がまばらな
方が作りやすい。そこで、プローブを固定した部位を移
動可能な構造にし、プローブアレーを作製後に密集構造
とするというのが本発明のポイントである。即ち、本発
明のポイントは、プローブを固定した固体（粒子）を移
動させるにより、プローブを固定した固体（粒子）が密
集したプローブアレーを作製する点にある。

【００３４】プローブを種類毎に固体表面に保持した微
粒子（プローブ粒子）を並べるには、微粒子を１つづつ
ピンセット等によりプローブアレーホルダーの溝に配列
させていく方法がある。この方法は、プローブを連続し
た固体表面に区画して付着させてプローブアレーを製作
する時に用いる方法に類似している。このいわゆるｓｐ
ｏｔｔｉｎｇは、プローブの領域が細かくなるにつれて
困難になってくる。しかし、独立したプローブ付き微粒
子を細かく並べるのは容易に可能である。例えば、プロ
ーブを固定した固体（粒子）が密集したプローブアレー
を作製するには、図２に示す溝１９、図８に示す溝３６
に、プローブ付き粒子をピンセット等を用いてまばらに
まず置いてゆき、液流、又は電場等により粒子を移動さ
せ密集状態にして、プローブアレーホルダー（７、３
４）中に保持すれば良いのである。

【００３５】図９は、微粒子溜からプローブを保持した
微粒子を配列用溝に導入する方法の１例を模式的に示す
図である。図９に示すプローブアレーの作成方法は同一
種類のプローブ付き微粒子を沢山保持した溜から微粒子
を１つづつ配列用の溝に供給する方法である。図９で
は、微粒子１の溜３８から細溝（図１に示す１９）を通
って配列用の溝（図１に示す２０）へ微粒子を１つづつ
溶液流を用いて供給し、微粒子をプローブアレーホルダ
ー７に移送している。同様に、微粒子１の溜３８から配
列用の細溝（図８に示す３６）へ微粒子を１つづつ溶液
流を用いて供給し、微粒子をプローブアレーホルダー３
４に移送することもできる。なお、微粒子の溜３８は溝
１９又は３６が形成される平面に垂直に於いても、平面
内に於いても良いが第３の実施例では平面に垂直とし、
各粒子溜３８が脱着可能である様にすると使い良い。即
ち、目的に応じてプローブの種類をいくらでも変化でき
るからである。 （第４の実施例）第４の実施例はプローブ付きの微粒子
を予め配列させることなく用いる例である。第１から第
３の実施例では、微粒子に保持したプローブの種類を微
粒子の保持されている位置により識別したが、第４の実
施例では、観測している微粒子の位置ではなく、微粒子
それ自体の形状（例えば、粒径）、誘電的性質、又は色
によって識別する方法を開示する。即ち、プローブ上に
捕獲された蛍光標識試料からの信号を得る際に、粒子の
形状、色等を計測し表面のプローブの種類を同時に調べ
る方法である。また、試料を標識した蛍光体と異なる種
類の蛍光体で粒子を標識しても良い。

【００３６】第４の実施例では、試料を長寿命の蛍光
体、又は燐光を出す標識体で標識し、微粒子をそのサイ
ズと微粒子を標識する蛍光体からの蛍光の違いで識別す
る例を示す。各粒子を識別する蛍光体にはＦＩＴＣ、テ
キサスレッド、及びＣｙ−５等の蛍光寿命の比較的短い
蛍光体を用いる。粒子を蛍光寿命の比較的短い蛍光体で
標識するのは、サンプルの標識に用いる蛍光寿命の長い
蛍光体からの蛍光と、粒子を標識する蛍光体からの蛍光
とを識別できるようにするためである。

【００３７】図１０は、２次元配列のプローブアレーを
用いて多色検出により試料を検出する検査（計測）装置
の構成を示す模式図である。図１０では、複数のフィル
ターを用いた例を示した。最初にフラッシュライト４０
により、試料と反応済みのプローブ付き微粒子１が２次
元配置されるプローブアレー３９に光を照射して、プロ
ーブアレー３９の透明な支持台を透過した光を、必要に
応じて光減衰フイルタを通してＣＣＤカメラ１３により
検出された信号をデータ処理装置１５に入力し、プロー
ブアレー３９では、各粒子は重なり合わないことを確認
し、粒子（ビーズ）の形状を計測する。

【００３８】次いで、レーザ光源からのレーザー１１
を、第１の方向にレーザー光の走査を行なう回転するミ
ーラー２８と、第１の方向に直交する第２の方向にレー
ザー光の照射領域を拡大するビームエクスパンダー２９
とにより、プローブアレー３９に照射する。スライド式
又は回転式フィルターホルダー４１に保持される複数の
蛍光波長選別フィルター４２をスライドさせ透過波長を
変化させながら種々の波長の蛍光を選別した後、プロー
ブアレー３９から発する蛍光は、ＣＣＤカメラ１３によ
り検出される。コントローラー１４は、カイテンミラー
の制御、フラッシュライト４０の制御、ＣＣＤカメラ１
３からの信号取り込み制御、データ処理装置１５、及び
モニター１７への信号伝送を制御する。モニター１７、
又は表示装置１６での出力から、試料ＤＮＡ（断片）に
検査目的の塩基配列が存在するか否かが判定できる。

【００３９】第４の実施例では、２種類の蛍光体の混合
比率を変化させて微粒子の表面に固着し、この混合率を
変化させることで、２種類１組の蛍光体毎に微粒子を２
０個まで識別する。例えば、蛍光体Ｆ１、Ｆ２を使用
し、これら蛍光体Ｆ１、Ｆ２の混合率を（ｗ１、ｗ２）
とする時、混合率（ｗ１、ｗ２）を、（ｗ１、ｗ２）＝
（０、０．０５）、（００５、０．９５）、（０．１、
０．９）、（０．１５、０．８５）、（０．２、０．
８）、（０．２５、０．７５）、（０．３、０．７）、
（０．３５、０．６５）、（０．４、０．６）、（０．
４５、０．５５）、（０．５、０．５）、（０．５５、
０．４５）、（０．６、０．４）、（０．６５、０．３
５）、（０．７、０．３）、（０．７５、０．２５）、
（０．８、０．２）、（０．８５、０．１５）、（０．
９、０．１）、（０．９５、０．０５）、（１．０、
０）から２０個選ぶ。一方、１００μｍから７μｍ刻み
で１９８μｍまでの１５種類の粒子のサイズをもつ粒子
群を使用して、各粒子をサイズにより識別する。図１０
に示す計測装置では、微粒子のサイズと蛍光を計測する
が、励起光はパルスで照射され、ＤＮＡを標識する標識
からの寿命の長い燐光と粒子を標識する標識からの蛍光
とは時間分解計測により区別して測定できる。この結
果、合計、２０×１５＝３００種類のＤＮＡプローブ
（粒子）を測時に識別する。計測装置としては、レーザ
ースキャン型蛍光検出装置、又は受光波長選別型の冷却
ＣＣＤ等が用いられる。波長選別器としては回折格子、
波長分散プリズム、又は複数のバンドパスフィルターか
ら構成する分光システムを用いることができる。

【００４０】測定される蛍光の相対強度から粒子の種類
を識別するが、更に励起光（レーザ）の波長を変化させ
ることにより多くの同一粒径の粒子を識別できる。例え
ば、ＹＡＧレーザーで励起できる蛍光体Ｊｏｅ、Ｔａｍ
ｕｒａを用いてこれら蛍光体の混合比を変化させて粒子
を標識すると、これら蛍光体からの蛍光の最適受光チャ
ンネルに合わせた２つのフィルターから得られる信号の
強度比を１０段階に分類して、約１０種の粒子の識別が
可能である。一方、Ｒｏｘを更に使用して粒子を標識す
ると、（Ｊｏｅ、Ｔａｍｕｒａ）の組合わせの混合比の
１０通りに加えて、（Ｊｏｅ、Ｒｏｘ）の組合わせの混
合比の１０通り、（ＴａｍｕｒａとＲｏｘ）の組合わせ
の混合比の１０通りの全部で３０通りの同一粒径の識別
が可能となる。更に、半導体レーザーで励起できる長波
長蛍光体を５種類を用いて試料を標識すると、１５０種
の試料を識別できる。更に、１５種類の粒径の粒子を使
用するサイズ計測を組合せると、２２５０種のＤＮＡプ
ローブを識別できる。各粒子は異なるＤＮＡプローブを
表面に保持しており、２２５０種のＤＮＡを識別検出で
きる。プローブを収納する容器を区分けしたり、上記で
説明した粒子群を保持する部位（区画）を複数持つ保持
チップを用いると、各区分け部分（区画）に異なるＤＮ
Ａプローブ群を保持した粒子を保持できるので、識別検
出できるＤＮＡの種類は１００００種以上に容易にする
ことができる。

【００４１】以上の説明では、蛍光を用いて粒子を標識
したが色素を用いても良い。プローブの種類は目的に応
じて自由に変化させることができるので、種々の目的に
合ったた多プローブセンサー素子を得ることができる。

【００４２】なお、上記のＪｏｅ、Ｔａｍｕｒａ、Ｒｏ
ｘはパーキンエルマーＡＢＤ社の商標、テキサスレッド
はｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社の商標、Ｃｙ−５
はアマシャムフルマシア社の商標である。

【００４３】

【発明の効果】以上、説明したように本発明によれば、
任意のプローブアレーを簡単に、安価に作成することが
できる。また、キャピラリー内にプローブアレーを構築
することにより試薬量を低減し、試薬の注入、洗浄が容
易なプローブを提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施例のＤＮＡプローブアレー
の製作手順、ＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置を
示す図。

【図２】本発明の第１の実施例に於ける微粒子をプロー
ブ固定媒体とするプローブアレー作製治具の（ａ）部品
である細溝を持つプレートの平面図、（ｂ）プローブア
レー作製治具の断面図。

【図３】本発明の第１の実施例に於けるプローブアレー
ホルダーの例を示す図。

【図４】本発明の第１の実施例に於ける、ライン状プロ
ーブアレーと光源とを相対的にスキャンするＤＮＡプロ
ーブアレーを用いる検査装置の例を示す模式図。

【図５】本発明の第１の実施例に於ける、レーザー光を
ライン状に配列した微粒子に沿って照射するＤＮＡプロ
ーブアレーを用いる検査装置の例を示す模式図。

【図６】本発明の第１の実施例に於ける、プローブアレ
ーの存在する領域全体を全面照射するＤＮＡプローブア
レーを用いる検査装置の例を示す模式図。

【図７】本発明の第１の実施例に於ける、微粒子型プロ
ーブアレーを使用する図６に示す構成により得られるモ
ニターに出力される結果例を示す図。

【図８】本発明の第２の実施例に於ける、（ａ）２次元
プローブアレーホルダー３４へ微粒子プローブを導入す
るための治具の平面図、（ｂ）断面図。

【図９】本発明の第３の実施例に於ける、微粒子溜から
プローブを保持した微粒子を配列用溝に導入する方法の
１例を模式的に示す図。

【図１０】本発明の第４の実施例に於ける、２次元配列
のプローブアレーを用いて多色検出により試料を検出す
る検査装置の構成を示す模式図。

【符号の説明】 １…微粒子、２…ＤＮＡプローブ、３…プローブ付き微
粒子、４…プローブアレー、５…試料注入口、５’…ス
トッパーチューブ、５”…試料出口、６…試料の流入方
向、７…プローブアレーホルダー、８…蛍光標識、９…
捕獲された試料ＤＮＡ断片、１０…レンズ、１１…レー
ザー光源、１２…フィルター、１３…ＣＣＤカメラ、１
４…コントローラー、１５…データー処理装置、１６…
表示装置、１７…モニター、１８…微粒子配列用細溝治
具の細溝を持つプレート、１９…微粒子ホールド用細
溝、２０…プローブアレー作製用細溝、２１…送液出口
用の溝、２２…プローブアレーホルダーコネクター、２
３…透明カバー、２４…キャピラリーホルダー用末端ア
ダプター、２５…マイクロレンズアレー（セルホックレ
ンズ）、２６…フィルター、２７…ラインセンサー（Ｃ
ＣＤラインセンサー）、２８…ミラー、２９…ビームエ
クスパンダー、３０…プローブの並ぶ照射領域、３１…
蛍光発光を伴う微粒子（ターゲットＤＮＡを保持微粒
子）、３２…蛍光発光を伴わない微粒子（ターゲットＤ
ＮＡを保持しない微粒子）、３３…２次元プローブアレ
ーを作製する治具、３４…２次元プローブアレーホルダ
ー、３５…透明カバー、３６…プローブ供給用細溝、３
７…プローブ付き微粒子配列用細溝、３８…プローブ付
き微粒子溜、３９…プローブ付き微粒子を２次元配置し
たプローブアレー、４０…ランプ、４１…スライド式フ
ィルターホルダー、４２…蛍光波長選別フィルター、７
０…アビジン、７１…ビオチン。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ // Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G043 AA04 BA16 CA04 DA01 DA05 EA01 EA02 FA01 GA07 GB09 GB12 HA01 HA02 HA15 JA02 JA04 KA02 KA05 KA09 LA03 NA01 2G057 AA04 AB01 AB04 AC01 BA03 CA01 DC07 GA01 GA06 JA02 JA11 4B024 AA11 AA19 CA09 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】複数の粒子の表面にプローブを結合させ、
   前記プローブが固定された複数の前記粒子を前記プロー
   ブの種類ごとに区分けして複数の溝１に保持し、前記溝
   １に保持された前記粒子を溝２に１つづつ導き、前記溝
   ２に導かれた前記粒子を前記溝２の内部での配列順序を
   保ちながら、プローブアレーホルダーへと送って配列さ
   せることを特徴とするプローブアレー製造方法。
2. 【請求項２】前記溝１の設置順序により、前記プローブ
   アレーホルダー内部での前記粒子の前記配列順序が指定
   され、前記プローブアレーホルダー内部での前記粒子に
   固定された前記プローブは、前記配列順序により識別さ
   れることを特徴とする請求項１に記載のプローブアレー
   製造方法。
3. 【請求項３】前記粒子は、前記粒子の形状、前記粒子を
   識別する蛍光体によって識別されることを特徴とする請
   求項１に記載のプローブアレー製造方法。
4. 【請求項４】前記溝２をｎ個設置し、各々に導かれた前
   記粒子を、ｎ個の２次元上に並んだ前記プローブアレー
   ホルダーに各々送って配列させることを特徴とする請求
   項１に記載のプローブアレー製造方法。
5. 【請求項５】前記プローブアレーホルダーとして、容
   器、または毛細管を用い、前記複数の粒子を、前記容
   器、前記毛細管、前記容器が有する平面部に形成された
   溝、または２つの前記平面部の間に形成された溝に収め
   ることを特徴とする請求項１に記載のプローブアレー製
   造方法。
6. 【請求項６】前記粒子の前記溝１から前記溝２への移動
   は、電界印加、もしくは、溶液流によって行われること
   を特徴とする請求項１に記載のプローブアレー製造方
   法。
7. 【請求項７】プローブが表面に固定された複数の粒子を
   前記プローブの種類ごとに区分けして保持する複数の溝
   １と、前記溝１に保持された前記粒子を１つづつ導入さ
   せて配列させて保持し、かつプローブアレーホルダーへ
   連結する溝２と、前記粒子を前記溝１から前記溝２へ、
   および前記溝２から前記プローブアレーホルダーへと移
   動させるための移動手段とを有することを特徴とするプ
   ローブアレー製造装置。