JP4175074B2 - Ｄｎａプローブアレー製造方法、製造装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検出対象をＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質として種々の検査項目を１度に検査するプローブアレーに関し、特に、最近注目を集めているプローブアレーの製造方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この遺伝子の発現状況を調べる有力な方法として、固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレー、又はＤＮＡチップが用いられ始めている。このチップを作るには、光化学反応と半導体工業で広く使用されるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに、設計された配列のオリゴマーを１塩基づつ合成して行く方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１、７６７−７７３（１９９１））、又はＤＮＡプローブを各区画に１つ１つ植え込んでいく方法等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術では、ＤＮＡプローブアレー、又はＤＮＡチップの作成の何れの方法も制作に手間と時間がかかり、製作費が高価になる難点がある。特に、プローブアレー（プローブの配列）が高密度であり微細な部分からできていると製作は一層手間と時間のかかるという難点がある。また、使用者が簡単に作れない不便さもある。プローブアレーが粗に配列する場合には、製作する上では楽になるが、全体として検出反応に要する体積、従ってサンプル量が多くなり、計測の面でも時間がかかったり、高感度が得られない等の問題がある。
【０００４】
本発明は上記の難点を解決するためになされたもので、本発明の目的は、簡単に望むＤＮＡプローブアレー（ＤＮＡプローブの配列）を密集した状態で作ることができ、製造コストも安価な方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために本発明では、各プローブを保持した固体を移動できる様に微粒子で構成し、微粒子をまばらに配列させた後に移動させ、密集構造のプローブアレーを作製する。まず、種々のＤＮＡプローブを合成して用意する。これらのＤＮＡプローブをプローブの種類毎に微粒子の表面に結合させる。固体表面へのＤＮＡプローブの固定は、ビオチンとアビジンの結合を利用する方法、Ａｕ（金）表面にＳＨ基を介して固定する方法（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ７１、１０７９−１０８６（１９９６）、ガラス表面に固定する方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７、９６−１０１（１９９７））、ガラス表面に塗布したアクリルアミドゲルのエレメントマトリックスに固定する方法（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３、４９１３−４９１８（１９９６））等を利用して、簡単に固体表面に多量のＤＮＡプローブを固定できる。
【０００６】
ＤＮＡプローブを表面にそれぞれ保持した種々の微粒子を、検査用のホルダーにＤＮＡプローブの種類毎に決められた順序で入れ、又は固体表面に種類毎に一定の順序で配列させて固定してプローブアレーを構成する。微粒子は球状でありサイズは用途にもよるが、直径数μｍから１ｍｍである。微粒子は、用途によっては、角形、円盤形等を使用しても良い。通常の検査には直径０．１―０．２ｍｍの球形の微粒子が使いやすい。
【０００７】
溶媒と共にプローブを保持した微粒子（以下、プローブ微粒子とも言う）は１つづつプローブアレー作成用の溝に供給される。検査用途に応じて、必要な種類のプローブを簡単に溝の中に並べることができる。各プローブを固定した微粒子の作製は安価にできるので、プローブアレー自身も安価に作ることができる。溝に並べられたプローブ付きの微粒子は検査用の毛細管、又は細い隙間のセルに入れられ、使用される。毛細管をプローブアレーホルダーに使用したときには、検査しようとする試料ＤＮＡの量を少なくすることができる利点がある。また、溶液導入系との結合も簡単にできる利点がある。
【０００８】
以下に本発明の構成の特徴の詳細を説明する。本発明の多項目検査を行なうプローブアレーの特徴は、
（１）異なる検査対象（ＤＮＡ又は蛋白等）とそれぞれ結合可能なプローブを固定した粒子を複数並べたこと、（１）に於いて、
（２）各プローブを保持した粒子が予め決められた順序でライン状に並べられ、この順序又は並べられた位置と粒子に固定されたプローブの種類が対応づけられていること、
（３）各プローブを保持した粒子は、粒子の持つ特徴とプローブの種類が対応づけられていることに特徴があり、（１）又は（３）に於いて、
（４）各プローブを保持した粒子のサイズ又は形状と、粒子の表面に固定されたプローブの種類が対応対応づけられていること、
（５）各プローブを保持した粒子は、保持したプローブの種類に応じて異なる色素又は蛍光体で標識されていること、（３）から（５）の何れかに於いて、
（６）プローブを２次元平面上に１層に並べたこと、
（７）プローブを１次元に並べたこと、
（８）プローブを透明な窓を持つ容器内に保持したこと、（１）から（５）の何れかに於いて、
（９）プローブを保持した粒子を、毛細管内に保持したこと、
（１０）プローブを保持した粒子を、固体平面に形成された溝又は２枚の平面の間に形成された溝に保持されること、
（１１）プローブを保持した粒子を複数の毛細管内に保持した複数の毛細管を複数個並べるか、又はプローブを保持した粒子を平面に設けた溝に保持して、プローブを保持した粒子を２次元に配列したこと、
（１２）（１）から（７）の何れかに於いて、プローブを保持した粒子を、アガロース等のゲル状物質の中に保持したこと、等に特徴がある。
【０００９】
本発明の多項目検査を行なうプローブアレーの製造方法の特徴は、
（１３）粒子の表面にプローブを固定する工程と、プローブが固定された複数の粒子を配列する工程とを有すること、
（１４）粒子の表面にプローブを固定する工程と、プローブが固定された複数の粒子を混合して平面上に配列する工程とを有し、粒子に固定されたプローブの種類を粒子の形状、サイズ、又は粒子を標識する蛍光体により識別すること、
（１５）（１２）に於いて、粒子に固定されたプローブの種類により、予め定められた順序で粒子を直線上に並べること、
（１６）（１４）に於いて、プローブを固定した粒子を、プローブの種類毎に異なる粒子溜に保持し、毛細管又は溝を通じて粒子を配列するための溝に１つづつ供給して配列させ、該配列を保持してプローブアレーホルダーに移送してプローブアレーを作成すること、（１６）において、
粒子溜から粒子を配列するための溝、又はプローブアレーホルダーへの移送を電気的な力により行なうこと、
（１８）粒子溜から粒子を配列するための溝、又はプローブアレーホルダーへの移送を溶液の流れを用いて行なうこと、
（１９）（１４）から（１７）の何れかに於いて、プローブを固定した粒子を移送するための毛細管又は溝を複数個用いて、異なるプローブがそれぞれ固定された複数の粒子を同時に粒子を配列するための溝又はプルーブアレーホルダーに移送すること、に特徴がある。
【００１０】
粒子の表面に保持されたプローブに結合する検査対象を検出する本発明の方法の特徴は、
（２０）検査対象を蛍光体又は燐光物質で標識する工程と、粒子に光（レーザー）を照射して発する蛍光又は燐光を光学的に検出する工程とを有すること、（２０）に於いて、
（２１）粒子が配列した直線に沿って、光（レーザー）を発する光源とアレーセンサーをスキャンして、粒子が配列する位置毎に蛍光又は燐光を検出すること、
（２２）粒子が配列した直線に沿って、光（レーザー）を照射して、粒子が配列する位置毎に蛍光又は燐光を検出し、各プローブに結合した検査対象の量を求めること、
（２３）光の照射により得られる各粒子による光の散乱画像と、粒子に固定されたプローブに結合した検査対象から発する蛍光とを検出し、粒子の形状又は粒子を標識する蛍光体から発する蛍光と、検査対象から発する蛍光又は燐光の強度の関係を検出し、各プローブに結合した検査対象の量を求めること、
（２４）粒子をフローさせながら検出すること、
（２５）粒子に固定されたプローブに結合した検査対象を蛍光画像として計測すること、
（２６）粒子を粒子画像として計測すること、等に特徴がある。
【００１１】
本発明のプローブアレーの製造方法は、
（２７）粒子の表面にプローブを固定する第１の工程と、プローブが固定された複数の粒子を郡に分けて固体表面の各区画に配列する第２の工程と、各位区画に於いて粒子に固定されたプローブと検査対象とを反応させる第３の工程と有し、第３の工程が行なわれる各区画での粒子の分布状態と、第１の工程での粒子の分布状態が異なることに特徴がある。
【００１２】
本発明の代表例を要約すると以下の通りである。本発明の代表例では、種々のプローブを固定した粒子（プローブ粒子）を一定の順序でホルダーに整列させたプローブアレーを用いる。各プローブ粒子を充填した細管又は溝を複数本並列に並べ、各細管又は溝から各々粒子の１個ずつを、他の細管又は溝に注入して、種々のプローブ粒子を常に一定の順序で整列させたプローブアレーを作成する。粒径の異なる粒子に多種のプローブを結合して、多種類の蛍光標識ＤＮＡを同時計測する。本発明では、多種類のＤＮＡプローブを固定したプローブアレーが簡単に調製でき、任意のＤＮＡプローブを多種類固定した多種類のＤＮＡ検出用のプローブアレーを提供する。
【００１３】
本発明のほかに以下の構成の特徴を有する。本発明の多項目検査を行なうプローブアレーの特徴は、（１）複数の粒子の表面にプローブを結合させ、前記プローブが固定された複数の前記粒子を前記プローブの種類ごとに区分けして複数の溝１に保持し、前記溝１に保持された前記粒子を溝２に１つづつ導き、前記溝２に導かれた前記粒子を前記溝２の内部での配列順序を保ちながら、プローブアレーホルダーへと送って配列させること、（２）プローブが表面に固定された複数の粒子を前記プローブの種類ごとに区分けして保持する複数の溝１と、前記溝１に保持された前記粒子を１つづつ導入させて配列させて保持し、かつプローブアレーホルダーへ連結する溝２と、前記粒子を前記溝１から前記溝２へ、および前記溝２から前記プローブアレーホルダーへと移動させるための移動手段とを有すること、等がある。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を図を参照して詳細に説明する。
（第１の実施例）
図１は、本発明の第１の実施例のＤＮＡプローブアレーの製作手順、ＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置を示す図である。アビジン７０を表面に保持した球形のプラスチック粒子１（直径０．２ｍｍ）を用意する。微粒子１の直径の精度は５％である。ビオチン付きのプライマーを用いてＰＣＲ増幅して得たＤＮＡプローブを１本鎖とし、ビオチン７１が結合されたＤＮＡプローブ２と、アビジンを保持した微粒子（プローブ粒子）とを結合させる。このようにしてＤＮＡプローブを種類毎に微粒子に捕獲し、複数のプローブが捕捉された微粒子３の群ができる。もちろんＤＮＡプローブとして合成ＤＮＡ鎖を用いても良く、この場合、ビオチンーアビジン結合でなく固体（微粒子）表面に直接ＤＮＡプローブを結合させる事もできる。固体表面にＤＮＡプローブを結合させる方法は、例えば、上記した文献（（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ７１、１０７９−１０８６ （１９９６）やＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７、９６−１０１（１９９７））に記載がある。また、固体（微粒子）表面に全て同じ特定の配列、例えばＴＴＴＴＴ………ＴＴ等を固定しておき、ポリＡ鎖を持ったＤＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせ、相補鎖合成により、ＤＮＡオリゴマーを上記の特定の配列と結合させ固体（微粒子）表面に導入しても良い。
【００１５】
このようにして作成したプローブが捕捉された微粒子を１つづつ透明なキャピラリー管（プローブアレーホルダー７）の中に並べてプローブアレー４とする。キャピラリー管（プローブアレーホルダー７）の中に並べる順番から、並べられた何番目の微粒子がいかなる種類のプローブを表面に持つかを知ることができるので、ＤＮＡプローブ２と蛍光標識８が結合された試料ＤＮＡとをハイブリダイズした（９は相補鎖結合により微粒子１に捕捉された試料ＤＮＡ断片である）後、光を照射して発する蛍光から検査体中のＤＮＡの種類を知ることができる。
【００１６】
プローブ１、２、…、ｎからなるプローブアレー４を持つキャピラリー管（プローブアレーホルダー７）の試料注入口５の試料流入方向６から蛍光標識８が結合された試料ＤＮＡを注入してＤＮＡプローブ２と蛍光標識８が結合された試料ＤＮＡとをハイブリダイズさせた後、プローブアレーホルダー７を検査装置の移動台（図示せず）にセットして、レーザー光源１１からのレーザーをレンズ１２で集光して移動するプローブアレーホルダー７に照射する。５”は、試料出口である。レーザーが照射された部位に存在する微粒子１に捕捉された蛍光標識８が結合された試料ＤＮＡから発する蛍光はフイルター１２により波長選択され、ＣＣＤカメラ１３等の光検出器により、レーザーの照射方向とほぼ直交する方向から検出される。検出された蛍光信号はモニター１７にリアルタイムで表示されると共に、データ処理装置１５に入力され所定の信号処理（蛍光強度の変化曲線の平滑化、ピークの位置及び強度の検出等）が施され結果が表示装置１６に出力される。モニター１７に表示される出力図形の横軸は、キャピラリー管（プローブアレーホルダー７）の中に並べられた微粒子１の位置、従ってプローブの種類に対応し、縦軸は各プローブと相補鎖結合した試料ＤＮＡ断片の存在を示す蛍光強度である。なお、コントローラー１４は、上記の移動台の移動制御、ＣＣＤカメラ１３からの信号取り込み制御、データ処理装置１５、及びモニター１７への信号伝送を制御する。モニター１７、又は表示装置１６での出力から、試料ＤＮＡ（断片）に検査目的の塩基配列が存在するか否かが判定できる。
【００１７】
なお、上記の説明では、蛍光標識を試料ＤＮＡ（断片）に結合したが、プローブ１、２、…、ｎのそれぞれ異なる蛍光標識を結合しておき、試料ＤＮＡ（断片）に蛍光標識を結合しない構成としても良く、この場合フイルター１２は、複数の波長帯域を選択できる多色フイルタの構成とするか、フイルター１２の代わりに、分光結晶、回折格子等を使用して蛍光の分光を行なう構成とする。
【００１８】
次に、第１の実施例に於ける、微粒子をプローブ固定媒体とするプローブアレーの作製方法について説明する。
【００１９】
図２は、（ａ）微粒子をプローブ固定媒体とするプローブアレー作製治具の部品である細溝を持つプレートの平面図、（ｂ）プローブアレー作製治具の断面図である。プローブ付き微粒子１は細溝を用いた微粒子配列用の治具により並べることができる。図２（ａ）の平面図に示す、微粒子配列用細溝治具の細溝を持つプレート１８に、図２（ｂ）の断面図に示す透明カバー２３をつけて使用する。プレート１８には、異なる種類のプローブを保持する微粒子をそれぞれ異なる溝に並べる複数の溝１９と、溝１９に交叉（直交）し、プローブを保持した種々の微粒子を配列するための溝（プローブアレー作製用細溝）２０と、送液を排泄する送液出口用の溝２１とが形成されている。溝１９、２０の溝幅方向及び溝深さの最大値は２つの微粒子が同じに入れない寸法（即ち、微粒子の直径をＲとする時最大値を２Ｒ未満とする条件１を満たす）とし、溝２１の溝幅方向及び溝深さの最大値は微粒子が通過できない寸法（即ち、微粒子の直径をＲとする時最大値をＲ未満とする条件２を満たす）とする。即ち、プレート１８に形成される細溝１９、２０と透明カバー２３により形成される細管の内部を微粒子１は通過できる。なお、溝１９、２０、２１の断面形状、寸法は、上記条件１、２を満たすものであれば、溝の断面形状は任意である。
【００２０】
細溝１９の１つの溝には同一種類のプローブを保持する微粒子が、ランダムな間隔で並んでいる。細溝１９の各細溝毎に異なるプローブを保持する微粒子が区分けして保持される。例えば、細溝１９の第１の溝１９−１にはプローブ１を保持する微粒子が、第２の溝１９−２にはプローブ２を保持する微粒子が、…、第ｎの溝１９−ｎにはプローブｎを保持する微粒子が、それぞれ並べられる。複数の溝１９に直交して設けられた溝２０にはプローブを保持した種々の微粒子が配列される。プローブ付き微粒子１は溶液の流れ、又は電界により配列用の溝２０に導かれる。溝１９には横方向には２つの微粒子はサイズの関係で入れないので、各種プローブを保持した微粒子（プローブ粒子）が１つづつ複数の細溝１９のアレーとプローブ配列用溝２０との交点に並ぶ。この交点から先の溝２１は細くなり粒子は先へ進めないようになっている。粒子の間隔はこの時点でまばら（ランダム）である。溝２０に並んだ微粒子は、溝１９と直行する方向、即ち配列用の溝２０に沿って溶液流、又は電界によりプローブアレー保持キャピラリー（プローブアレーホルダー７）（内径０．３ｍｍ）に送り込まれ隙間無く配列する。２２は、微粒子配列用の治具（２３、２０）とプローブアレーホルダー７とを結合するプローブアレーホルダーコネクターであり、５’はストッパーチューブである。細溝１９の各溝に通じる粒子溜（図９の３８参照）には、用いようとするＤＮＡプローブを固定した粒子を供給しておく。このプローブを固定した粒子を保持する粒子溜の配列順序が、溝２０、プローブアレー保持キャピラリーに於けるプローブの配列順序となる。プローブを固定する粒子の間にマーカーとなる粒子を入れて順序をわかりやすくすることもできる。
【００２１】
次に、第１の実施例に於ける、キャピラリー管中にプローブを保持するプローブアレーホルダー７の例について説明する。
【００２２】
図３は、第１の実施例に於けるプローブアレーホルダーの例を示す図である。プローブ付き微粒子は試料注入口、及び排出口のついたプローブアレーホルダー７（キャピラリー）に保持されている。プローブアレーホルダー７の両端には、微粒子１が流出しないようにストッパーチューブ５’、及びプローブアレーホルダーコネクター２２を介してキャピラリーホルダー用末端アダプター２４が取り付けられている。もちろんアダプター２４は微粒子をキャピラリー（プローブアレーホルダー７）に導入してから取り付ける。
【００２３】
検査しようとするＤＮＡ試料を蛍光標識（ここでは、Ｃｙ−５（発光極大波長６５０ｎｍ）を用いた）し、溶媒と共にプローブアレーを保持するキャピラリー（プローブアレーホルダー７）中に導入し、ハイブリダイゼーションをＤＮＡ試料とプローブとの間で起こす。ハイブリダイゼーションにより目的ＤＮＡをプローブに結合した後、余剰のＤＮＡサンプルを洗浄除去して蛍光検出をするが、ライン状のプローブアレーでは、プローブアレーを保持するプローブアレーホルダー７の機械的な走査が容易であり、試料の消耗が少ない利点がある。なお、標識蛍光体としてはテキサスレッド（発光極大波長：６１５ｎｍ）、フルオレセインイソチオシアネート（発光波長：５２０ｎｍ）等があり、これら標識蛍光体に加えて燐光を発する標識体を用いても良い。未反応のＤＮＡを洗浄除去し、計測装置に挿入する。計測装置は励起用レーザー、及び蛍光検出器からなっている。キャピラリー管（プローブアレーホルダー）に沿ってレーザーをスキャンしたり、キャピラリー管の内側を管に沿ってレーザーを照射し多数の微粒子を同時に光照射し得られる蛍光画像を検出したりする。また、キャピラリー管を動かし微粒子を順次照射部へ送り込んでも良い。
【００２４】
次に、ＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置の例について説明する。
【００２５】
図４は、ライン状プローブアレーと光源とを相対的にスキャンするＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置の例を示す模式図である。図４では、図１に示す構成と同様とし、レーザー照射位置と検出器１３を相対的に固定し、レーザー照射位置と検出器１３とを固定してプローブを保持したプローブアレーホルダー７を相対的に移動させて照射するか、又はプローブアレーホルダー７を固定してレーザー照射位置と検出器１３を相対的に移動させて照射する方式とする。検出器１３には光電子増倍管やレンズ付き冷却ＣＣＤカメラが用いられ、蛍光はレーザの照射方向とほぼ直交する方向から検出される。
【００２６】
図５は、レーザー光をライン状に配列した微粒子に沿って照射するＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置の例を示す模式図である。図５では、レーザー光源１１からのレーザーをプローブアレーホルダー７の軸に沿って同軸方向に照射する例である。標識蛍光体から発する蛍光を、レーザーの照射方向と交叉する方向からマイクロレンズアレー（セルホックレンズ）２５で集光し、フイルター２６を介してラインセンサー２７に結像させる。図５に示すその他の構成要素は、図１に示す構成と同様である。図５に示す構成は、効率の良い方法であるが微粒子が透明な場合に限られる。
【００２７】
図６は、プローブアレーの存在する領域（プローブの並ぶ照射領域）３０の全体を全面照射するＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置の例を示す模式図である。図６に示す構成では、プローブアレーは１次元に配列しているが２次元に配列した場合にも適用できるように、冷却ＣＣＤエリアセンサー等を蛍光の検出に用いる。レーザー光源１１からのレーザー光はミラー２８で進行方向を変えてビームエクスパンダー２９によりレーザー光の照射領域を１次元方向に拡大して、プローブアレーホルダー７のうちプローブが並ぶ照射領域３０の全体を全面照射する。ＣＣＤエリアセンサー等の２次元光検出器を使用する場合には、蛍光の２次元像が得られ、発光点の位置からプローブの種類がわかる。図６に示すその他の構成は基本的に図１と同様である。また、図６に於いて、更に、コンフォーカル顕微鏡、及び類似技術を用いても良い。例えば、ビームエクスパンダー２９を使用せず、ミラー２８を回転させてレーザーの進行方向を変えてレーザースキャンを行ない、レーザーが照射されるプローブアレーホルダー７の部位に存在する標識蛍光体から発する蛍光を検出する構成とする。
【００２８】
図７は、微粒子型プローブアレーを使用する図６に示す構成により得られるモニター１７に出力される結果の例を示す図である。図７に示す例では、蛍光発光を伴う微粒子（ターゲットＤＮＡを保持微粒子）３１を黒く表示した丸印、
蛍光発光を伴わない微粒子（ターゲットＤＮＡを保持しない微粒子）３２を白く表示した丸印で示す。黒く表示された３１のところが蛍光が強く、ＤＮＡがプローブに捕獲されている事が分かる。図６、図７に示す例では、蛍光体は１種類用いて試料ＤＮＡを標識したが、蛍光体を複数種用いて複数のＤＮＡサンプルを標識して、比較計測しても良い。
【００２９】
以上説明したように、粒子に保持したＤＮＡプローブを毛細管の中に保持すると、サンプル供給が容易で洗浄もやりやすい利点がある他、蛍光計測が簡単にでき、必要とする好みのプローブアレーを簡単に作ることができる。廉い価格でプローブアレーを提供できる等の利点がある。また、ハイブリダイゼーションに要する試料体積も小さくできる。なお、第１の実施例では、複数のプローブの保持にキャピラリーを用いたが、透明な平板に設けた溝を用いても良い。粒子を溝に並べる場合、溝の底部にゲルを保持させておきプローブを保持した粒子を溝に配列後に、粒子をゲルに押し付けて固定しても良く、この場合、サンプル液を満たす空隙が小さくなりサンプル消耗を押さえることができる。溝を形成した透明な平板によりプローブアレーを構成する場合にも、図１、図４、図５、図６、図１０（後述する）に示す検査装置の例が適用でき、プローブの捕捉された試料を蛍光により容易に検出が可能でることは言うまでもない。
（第２の実施例）
第１の実施例ではプローブアレーを直線上に配置したが、第２の実施例では、プローブアレーを２次元的に配置する例を示す。第２の実施例で用いる微粒子は第１の実施例と同じ直径０．２ｍｍの粒子であるが、直径が０．１ｍｍ、又は０．０５ｍｍの粒子を用いる時は、以下に述べる溝のピッチ、深さ、プローブアレーホルダーのサイズ等を変える必要がある。
【００３０】
プローブアレーを２次元的に配置する方法には、プローブアレーを保持したキャピラリー管を並べプローブアレーホルダーとするか、平板に複数の溝を形成し、透明カバーを取り付けプローブアレーホルダーとして活用する。キャピラリー管を並べプローブアレーホルダーとする場合の作製法は、第１の実施例と同じであり、単にキャピラリーを複数並べれば良い。但し、複数キャピラリーを平行に保持し、サンプルを供給したり、洗浄液を送り込むためのハウジングはマルチキャピラリーであることに応じてかえる必要がある。また、レーザーを複数キャピラリーに照射する際に、複数キャピラリーの配列される平面に平行な方向からレーザービームを照射し、各キャピラリー内で発する蛍光を２次元検出器で検出するか、又は複数キャピラリーの配列される平面に対して、ビームエクスパンダーにより２次元に広げられたレーザーを照射して、各キャピラリー内で発する蛍光を２次元検出器で検出する構成とする。
【００３１】
以下の説明では、平板に複数の溝を形成したプローブアレーホルダーについて説明する。２次元プローブアレーホルダー３４は透明な２枚の平板で挟まれた間隙０．１ｍｍを持つセルからなっており、下面の平板には溝が設けられている。溝のピッチは０．３ｍｍ、溝の幅０．２５ｍｍ、溝の深さは０．１５ｍｍであり、溝の幅、及び溝の深さは共に２個の粒子が通過するには小さく、１個の粒子が通過するのに十分である値とする。各溝にプローブを固定した微粒子を並べる。微粒子の直径サイズは０．２ｍｍであり、微粒子は溝から溝へ移動する事はできない。
【００３２】
図８は、（ａ）２次元プローブアレーホルダー３４へ微粒子プローブを導入するための２次元プローブアレーを作製する治具３３の平面図、（ｂ）断面図である。２次元プローブアレーホルダー３４へ微粒子を並べるには図８（ａ）、（ｂ）に示す、ガイドのプローブ供給用細溝３６を利用する。溝３６の開口部は透明カバー３５で覆われている。図８（ａ）に示すように、溝３６は末広になっており、溝３６の広がった部分にプローブ付き微粒子１を、保持したプローブの種類により定められた順序で並べる。溝３６のアレーに並べられたプローブ付きの微粒子１を溶媒の流れ、又は電界によって溝３６の狭い部分（粒子保持部３７）へ移動させて２次元プローブアレーホルダー３４へ移送する。溝３６にまばらに配置されていたプローブ付き微粒子は、図８（ｂ）に示す断面図に見られるように、２次元プローブアレーホルダー３４に密集した状態で保持される。プローブアレーホルダー３４には、図示しない、試料液、又は洗浄液を導入、及び排出できるように口が設けられている。溝３６にプローブ付きの微粒子を並べるのは第１の実施例で用いたのと同様に、キャピラリーにまず微粒子を配列させ、微粒子を溝３６に移送することで行なう。微粒子は溝３６を超えて隣へ移動できないので、各列（溝）に属するプローブ粒子はその属するグループ毎に異なる列（溝）に配置される。各列（溝）のプローブの配列は第１の実施例と同様に定めることができる。次いで、微粒子は溝３６からプローブ付き微粒子配列用細溝３７に移送される。
【００３３】
蛍光を検出する検査装置は図６に示す装置を一部改良して、２次元プローブアレーホルダー３４に図６に示すように１次元方向に拡大された線状のレーザー光を照射し、拡大方向と直交する方向に線状のレーザー光をスキャンすることで得られる２次元蛍光イメージを、２次元検出器（ＣＣＤ等）を使用して検出する。もちろん、点状に絞ったレーザーを２次元方向に走査して２次元蛍光画像を得ても良い。
（第３の実施例）
本発明の方法では微粒子を簡便に並べる手法が１つのキーポイントである。第３の実施例では簡便に微粒子を並べプローブアレーを作製する例を示す。プローブアレーではプローブを保持した固体（粒子）を密集して並べることが反応体積を小さくし、計測を容易にする上で重要である。一方、プローブアレーを製作する観点からはプローブを保持する部位がまばらな方が作りやすい。そこで、プローブを固定した部位を移動可能な構造にし、プローブアレーを作製後に密集構造とするというのが本発明のポイントである。即ち、本発明のポイントは、プローブを固定した固体（粒子）を移動させるにより、プローブを固定した固体（粒子）が密集したプローブアレーを作製する点にある。
【００３４】
プローブを種類毎に固体表面に保持した微粒子（プローブ粒子）を並べるには、微粒子を１つづつピンセット等によりプローブアレーホルダーの溝に配列させていく方法がある。この方法は、プローブを連続した固体表面に区画して付着させてプローブアレーを製作する時に用いる方法に類似している。このいわゆるｓｐｏｔｔｉｎｇは、プローブの領域が細かくなるにつれて困難になってくる。しかし、独立したプローブ付き微粒子を細かく並べるのは容易に可能である。例えば、プローブを固定した固体（粒子）が密集したプローブアレーを作製するには、
図２に示す溝１９、図８に示す溝３６に、プローブ付き粒子をピンセット等を用いてまばらにまず置いてゆき、液流、又は電場等により粒子を移動させ密集状態にして、プローブアレーホルダー（７、３４）中に保持すれば良いのである。
【００３５】
図９は、微粒子溜からプローブを保持した微粒子を配列用溝に導入する方法の１例を模式的に示す図である。図９に示すプローブアレーの作成方法は同一種類のプローブ付き微粒子を沢山保持した溜から微粒子を１つづつ配列用の溝に供給する方法である。図９では、微粒子１の溜３８から細溝（図１に示す１９）を通って配列用の溝（図１に示す２０）へ微粒子を１つづつ溶液流を用いて供給し、微粒子をプローブアレーホルダー７に移送している。同様に、微粒子１の溜３８から配列用の細溝（図８に示す３６）へ微粒子を１つづつ溶液流を用いて供給し、微粒子をプローブアレーホルダー３４に移送することもできる。なお、微粒子の溜３８は溝１９又は３６が形成される平面に垂直に於いても、平面内に於いても良いが第３の実施例では平面に垂直とし、各粒子溜３８が脱着可能である様にすると使い良い。即ち、目的に応じてプローブの種類をいくらでも変化できるからである。
（第４の実施例）
第４の実施例はプローブ付きの微粒子を予め配列させることなく用いる例である。第１から第３の実施例では、微粒子に保持したプローブの種類を微粒子の保持されている位置により識別したが、第４の実施例では、観測している微粒子の位置ではなく、微粒子それ自体の形状（例えば、粒径）、誘電的性質、又は色によって識別する方法を開示する。即ち、プローブ上に捕獲された蛍光標識試料からの信号を得る際に、粒子の形状、色等を計測し表面のプローブの種類を同時に調べる方法である。また、試料を標識した蛍光体と異なる種類の蛍光体で粒子を標識しても良い。
【００３６】
第４の実施例では、試料を長寿命の蛍光体、又は燐光を出す標識体で標識し、微粒子をそのサイズと微粒子を標識する蛍光体からの蛍光の違いで識別する例を示す。各粒子を識別する蛍光体にはＦＩＴＣ、テキサスレッド、及びＣｙ−５等の蛍光寿命の比較的短い蛍光体を用いる。粒子を蛍光寿命の比較的短い蛍光体で標識するのは、サンプルの標識に用いる蛍光寿命の長い蛍光体からの蛍光と、粒子を標識する蛍光体からの蛍光とを識別できるようにするためである。
【００３７】
図１０は、２次元配列のプローブアレーを用いて多色検出により試料を検出する検査（計測）装置の構成を示す模式図である。図１０では、複数のフィルターを用いた例を示した。最初にフラッシュライト４０により、試料と反応済みのプローブ付き微粒子１が２次元配置されるプローブアレー３９に光を照射して、プローブアレー３９の透明な支持台を透過した光を、必要に応じて光減衰フイルタを通してＣＣＤカメラ１３により検出された信号をデータ処理装置１５に入力し、プローブアレー３９では、各粒子は重なり合わないことを確認し、粒子（ビーズ）の形状を計測する。
【００３８】
次いで、レーザ光源からのレーザー１１を、第１の方向にレーザー光の走査を行なう回転するミーラー２８と、第１の方向に直交する第２の方向にレーザー光の照射領域を拡大するビームエクスパンダー２９とにより、プローブアレー３９に照射する。スライド式又は回転式フィルターホルダー４１に保持される複数の蛍光波長選別フィルター４２をスライドさせ透過波長を変化させながら種々の波長の蛍光を選別した後、プローブアレー３９から発する蛍光は、ＣＣＤカメラ１３により検出される。コントローラー１４は、カイテンミラーの制御、フラッシュライト４０の制御、ＣＣＤカメラ１３からの信号取り込み制御、データ処理装置１５、及びモニター１７への信号伝送を制御する。モニター１７、又は表示装置１６での出力から、試料ＤＮＡ（断片）に検査目的の塩基配列が存在するか否かが判定できる。
【００３９】
第４の実施例では、２種類の蛍光体の混合比率を変化させて微粒子の表面に固着し、この混合率を変化させることで、２種類１組の蛍光体毎に微粒子を２０個まで識別する。例えば、蛍光体Ｆ１、Ｆ２を使用し、これら蛍光体Ｆ１、Ｆ２の混合率を（ｗ１、ｗ２）とする時、混合率（ｗ１、ｗ２）を、（ｗ１、ｗ２）＝（０、０．０５）、（００５、０．９５）、（０．１、０．９）、（０．１５、０．８５）、（０．２、０．８）、（０．２５、０．７５）、（０．３、０．７）、（０．３５、０．６５）、（０．４、０．６）、（０．４５、０．５５）、（０．５、０．５）、（０．５５、０．４５）、（０．６、０．４）、（０．６５、０．３５）、（０．７、０．３）、（０．７５、０．２５）、（０．８、０．２）、（０．８５、０．１５）、（０．９、０．１）、（０．９５、０．０５）、（１．０、０）から２０個選ぶ。一方、１００μｍから７μｍ刻みで１９８μｍまでの１５種類の粒子のサイズをもつ粒子群を使用して、各粒子をサイズにより識別する。図１０に示す計測装置では、微粒子のサイズと蛍光を計測するが、励起光はパルスで照射され、ＤＮＡを標識する標識からの寿命の長い燐光と粒子を標識する標識からの蛍光とは時間分解計測により区別して測定できる。この結果、合計、２０×１５＝３００種類のＤＮＡプローブ（粒子）を測時に識別する。計測装置としては、レーザースキャン型蛍光検出装置、又は受光波長選別型の冷却ＣＣＤ等が用いられる。波長選別器としては回折格子、波長分散プリズム、又は複数のバンドパスフィルターから構成する分光システムを用いることができる。
【００４０】
測定される蛍光の相対強度から粒子の種類を識別するが、更に励起光（レーザ）の波長を変化させることにより多くの同一粒径の粒子を識別できる。例えば、ＹＡＧレーザーで励起できる蛍光体Ｊｏｅ、Ｔａｍｕｒａを用いてこれら蛍光体の混合比を変化させて粒子を標識すると、これら蛍光体からの蛍光の最適受光チャンネルに合わせた２つのフィルターから得られる信号の強度比を１０段階に分類して、約１０種の粒子の識別が可能である。一方、Ｒｏｘを更に使用して粒子を標識すると、（Ｊｏｅ、Ｔａｍｕｒａ）の組合わせの混合比の１０通りに加えて、（Ｊｏｅ、Ｒｏｘ）の組合わせの混合比の１０通り、（ＴａｍｕｒａとＲｏｘ）の組合わせの混合比の１０通りの全部で３０通りの同一粒径の識別が可能となる。更に、半導体レーザーで励起できる長波長蛍光体を５種類を用いて試料を標識すると、１５０種の試料を識別できる。更に、１５種類の粒径の粒子を使用するサイズ計測を組合せると、２２５０種のＤＮＡプローブを識別できる。各粒子は異なるＤＮＡプローブを表面に保持しており、２２５０種のＤＮＡを識別検出できる。プローブを収納する容器を区分けしたり、上記で説明した粒子群を保持する部位（区画）を複数持つ保持チップを用いると、各区分け部分（区画）に異なるＤＮＡプローブ群を保持した粒子を保持できるので、識別検出できるＤＮＡの種類は１００００種以上に容易にすることができる。
【００４１】
以上の説明では、蛍光を用いて粒子を標識したが色素を用いても良い。プローブの種類は目的に応じて自由に変化させることができるので、種々の目的に合ったた多プローブセンサー素子を得ることができる。
【００４２】
なお、上記のＪｏｅ、Ｔａｍｕｒａ、ＲｏｘはパーキンエルマーＡＢＤ社の商標、テキサスレッドはｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社の商標、Ｃｙ−５はアマシャムフルマシア社の商標である。
【００４３】
【発明の効果】
以上、説明したように本発明によれば、任意のプローブアレーを簡単に、安価に作成することができる。また、キャピラリー内にプローブアレーを構築することにより試薬量を低減し、試薬の注入、洗浄が容易なプローブを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施例のＤＮＡプローブアレーの製作手順、ＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置を示す図。
【図２】本発明の第１の実施例に於ける微粒子をプローブ固定媒体とするプローブアレー作製治具の（ａ）部品である細溝を持つプレートの平面図、（ｂ）プローブアレー作製治具の断面図。
【図３】本発明の第１の実施例に於けるプローブアレーホルダーの例を示す図。
【図４】本発明の第１の実施例に於ける、ライン状プローブアレーと光源とを相対的にスキャンするＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置の例を示す模式図。
【図５】本発明の第１の実施例に於ける、レーザー光をライン状に配列した微粒子に沿って照射するＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置の例を示す模式図。
【図６】本発明の第１の実施例に於ける、プローブアレーの存在する領域全体を全面照射するＤＮＡプローブアレーを用いる検査装置の例を示す模式図。
【図７】本発明の第１の実施例に於ける、微粒子型プローブアレーを使用する図６に示す構成により得られるモニターに出力される結果例を示す図。
【図８】本発明の第２の実施例に於ける、（ａ）２次元プローブアレーホルダー３４へ微粒子プローブを導入するための治具の平面図、（ｂ）断面図。
【図９】本発明の第３の実施例に於ける、微粒子溜からプローブを保持した微粒子を配列用溝に導入する方法の１例を模式的に示す図。
【図１０】本発明の第４の実施例に於ける、２次元配列のプローブアレーを用いて多色検出により試料を検出する検査装置の構成を示す模式図。
【符号の説明】
１…微粒子、２…ＤＮＡプローブ、３…プローブ付き微粒子、４…プローブアレー、５…試料注入口、５’…ストッパーチューブ、５”…試料出口、６…試料の流入方向、７…プローブアレーホルダー、８…蛍光標識、９…捕獲された試料ＤＮＡ断片、１０…レンズ、１１…レーザー光源、１２…フィルター、１３…ＣＣＤカメラ、１４…コントローラー、１５…データー処理装置、１６…表示装置、１７…モニター、１８…微粒子配列用細溝治具の細溝を持つプレート、１９…微粒子ホールド用細溝、２０…プローブアレー作製用細溝、２１…送液出口用の溝、２２…プローブアレーホルダーコネクター、２３…透明カバー、２４…キャピラリーホルダー用末端アダプター、２５…マイクロレンズアレー（セルホックレンズ）、２６…フィルター、２７…ラインセンサー（ＣＣＤラインセンサー）、２８…ミラー、２９…ビームエクスパンダー、３０…プローブの並ぶ照射領域、３１…蛍光発光を伴う微粒子（ターゲットＤＮＡを保持微粒子）、３２…蛍光発光を伴わない微粒子（ターゲットＤＮＡを保持しない微粒子）、３３…２次元プローブアレーを作製する治具、３４…２次元プローブアレーホルダー、３５…透明カバー、３６…プローブ供給用細溝、３７…プローブ付き微粒子配列用細溝、３８…プローブ付き微粒子溜、３９…プローブ付き微粒子を２次元配置したプローブアレー、４０…ランプ、４１…スライド式フィルターホルダー、４２…蛍光波長選別フィルター、７０…アビジン、７１…ビオチン。

Claims (9)

1. 粒子を収める複数の容器を供給する工程と、
   各々の前記粒子を前記複数の容器からホルダーへ所定の順で供給する工程とを有し、
   １の前記容器に収められた前記粒子は１種類のプローブが固定され、前記ホルダーの幅は２個の前記粒子が通過するには小さくかつ１個の前記粒子が通過するのに十分であり、前記粒子と前記ホルダーとの間の少なくとも一部に隙間を有することを特徴とするプローブアレイ製造方法。
2. 粒子を収める複数の容器を供給する工程と、
   各々の前記粒子を前記複数の容器からホルダーへ所定の順で供給する工程とを有し、
   １の前記容器に収められた前記粒子に固定するプローブの種類は複数であり、前記ホルダーの幅は２個の前記粒子が通過するには小さくかつ１個の前記粒子が通過するのに十分であり、前記粒子と前記ホルダーとの間の少なくとも一部に隙間を有することを特徴とするプローブアレイ製造方法。
3. 前記粒子は液流で前記ホルダーへ供給されることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載のプローブアレイ製造方法。
4. 前記粒子は電場によって前記ホルダーへ供給されることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載のプローブアレイ製造方法。
5. 前記粒子は配列用溝を通じて前記ホルダーに供給されることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載のプローブアレイ製造方法。
6. 前記配列用溝は前記複数の容器の配列方向と実質的に直交することを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載のプローブアレイ製造方法。
7. 前記ホルダーは、キャピラリー管であることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載のプローブアレイ製造方法。
8. 前記ホルダーは、板状部材に形成された溝を有することを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載のプローブアレイ製造方法。
9. 前記複数の容器の配列順序が前記ホルダーでの前記プローブの配列順序となることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載のプローブアレイ製造方法。

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