CN1402796A - 分子微阵列及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含地址已知的微粒的微阵列，其中微粒与感兴趣的化学、生物和/或细胞本体偶联。本发明还提供了用于制备微阵列的方法。

Description

分子微阵列及其制备方法和用途

相关申请的相互参考

本专利申请要求的优先权申请是申请日为1999年11月2日、申请号为60/172,243的美国临时专利申请，该申请的公开内容在此作为参考全部并入文本。

技术领域

本发明涉及包括地址已知的化学、生物和/或细胞本体的有序阵列的微阵列。更具体地说，本发明涉及包括地址已知的微粒的微阵列，其中这些微粒偶联到感兴趣的化学、生物和/或细胞本体上。这些微阵列可用于例如基因表达、药物发现及诊断分析方法中。本发明还涉及用于制备微阵列的方法。

背景技术

有几种现存的表面结合的分子微阵列的制造方法。通常，可分为三种方法。第一种是在微阵列上直接合成分子，并且每种分子具有确定的地址(Southern，R.L.等人(1992)，基因组学(Genomics)，13：1008-1017；Matson，R.S.等人(1995)，分析生物化学(Analytical Biochemstry)，224：110-116)。例如，照相平版印刷技术和光敏保护基团业已用于在固相支持体的一个阵列中合成多个不同序列的生物聚合物。参见(US专利号5,445,934，Fodor等人(1995)；US专利号5,510,270.Fodor(1996)；US专利号5,744,101，Fodor等人(1998)；US专利号5,753,788，(1998)#262)。这些方法的局限性之一是在每个偶联循环中由不完全反应产生的截短聚合物(即“破损”序列)发生累积。如此限制了阵列中聚合物可达到的长度和纯度。

第二种方法是将分子传送到固相基片的不连续位点上并通过共价或非共价键进行固定。在一个称作“斑点印迹”的方法中，分子被人为地(诸如利用微量移液管)分配到固相支持体的特定位点上。其后开发的一些方法具有改进的分配效率，例如那些利用真空装置或大头针来分配材料的96孔微滴定板形式的方法。然而，这些方法的实施是费力的且相当不精确，只适合于形成有限量的具有相对大斑点的阵列。

最近，业已开发出若干自动化系统，用以传送许多少量的样品，从而形成阵列。(US专利号5,807,522，Brown 1998)描述了一种通过利用自动化分配装置传送分子而形成大量的微体积阵列的方法，其中该自动化分配装置能够在不渗透的固相表面上沉积选择体积量在0.002至2n1之间的溶液。该方法要求高尖端的机械工程设备，而且还不能解决有关获得可重复的、高度均匀阵列方面的许多困难。例如，利用该方法，难以精确控制每个点上的固定反应，从而难以获得高度重复的阵列。造成该问题的一个原因是，难以获得或制备出在贯穿相对大的表面上都化学均一的基片，从而导致表面的不同区域中的化学性质不一致。另外，因为每个点上所分配的体积相当小，所以难以控制蒸发，从而影响反应物的浓度并进而影响反应速率。而且，部分由于以上提到的化学不一致性，因此还难以在整个表面上保持恒定的温度。这样，在表面的不同区域可发生不同温度对反应速率的影响。

第三种方法，在(US专利号5,605,662，Heller等人，1997)中有所描述，其包括利用具有多个电极的程序装置，每个电极既可带正电荷也可带负电荷，借此集中了带相反电荷的分子而排斥了带相同电荷的分子，从而增大了反应效率和特异性。该装置利用电场将分子传输到所选择的位点上并使反应容易进行，而且将测定和反应设计为自动化运行，而无需人工介入。在该方法中，由醛官能团标记的寡核苷酸被集中在所选择的位点上并且通过与基片上的氨丙基三羟乙基反应而共价结合到基片上。然而，该装置被设计成一次形成一个微阵列，并且更适合于形成具有相对少量位点的微阵列。而且，该方法不能控制交叉污染的程度，从而导致实验结果的背景噪音。上述方法的问题还在于不能提供在基片上获得均一性的方式，从而导致实验结果发生偏差。

US专利号5,900,481涉及包括至少一种与固相支持体共轭结合并且还与至少一种核酸共轭结合的玻珠的组合物。

此处提到的所有出版物和专利公开文本全部并入作为本文的参考文献。

发明的公开内容

本发明的一个目的是提供用于构建微阵列(例如生物、化学和/或细胞本体的微阵列)的方法和组成，该微阵列可大批量生产并且比利用现有方法得到的微阵列具有更均一的性质、更高的纯度和分子完整性。本发明的另一个目的是提供改进的微阵列，该微阵列更易于大批量生产并且其特征在于具有更大的均一性、更高的纯度和分子完整性。

因此，本发明提供了一种微阵列，其包括：(a)一个基片，其中该基片用以下物质衍生化：i)包括第一官能团的第一化合物，以及至少一层包括多个第二官能团的交联化合物，或者ii)包括第一官能团的第一化合物，以及包括多个第二官能团的聚合膜；以及(b)或者i)一个具有至少一种感兴趣本体的群体，其中这个具有至少一种感兴趣本体的群体通过本体与第二官能团的偶联，而与基片上的一个不同地址缔合，或者ii)一个微粒群，其中该微粒群偶联有至少一种感兴趣的本体，并且该微粒群通过第二官能团与微粒的偶联，而与基片上的一个不同地址缔合，从而该至少一种感兴趣的本体占据了基片上的一个不同地址。

本发明的另一方面是，提供了一种微阵列，该微阵列包括：(a)一个基片；以及(b)一个微粒群，其中该微粒群与基片上的一个不同地址缔合，并且该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体，该至少一种感兴趣的本体选自：多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸以及小分子；从而该至少一种感兴趣的本体占据了基片上的一个不同地址。

本发明的又一方面是，提供了一种微阵列，该微阵列包括：(a)一个基片；以及(b)一个微粒群，其中每个微粒的直径都小于1μm，该微粒群与基片上的一个不同地址缔合，并且该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体，从而该至少一种感兴趣的本体占据了基片上的一个不同地址。

本发明的再一方面是，提供了一种由以下方法制备的微阵列：(a)提供一个具有至少一种感兴趣本体的群体，其中这些本体任意偶联到微粒上；(b)提供一个基片，其中该基片用能够偶联到感兴趣的本体或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本体群与基片接触；以及(d)激活基片上所期望的一个或多个位点上的活性化合物，从而使本体群在所期望的位点上被偶联到基片上。

本发明的另一方面是，提供了一种用于构建微阵列的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)提供一个基片，其中该基片用以下物质衍生化：i)包括第一官能团的第一化合物，以及至少一层包括多个第二官能团的交联化合物，或者ii)包括第一官能团的第一化合物，以及包括多个第二官能团的聚合膜；(b)提供或者i)一个具有至少一种感兴趣本体的群体，或者ii)一个微粒群，其中该微粒群偶联有至少一种感兴趣的本体；(c)将本体或微粒群定域在基片上的不同地址处；以及(d)被定域的本体或微粒群通过第二官能团与感兴趣的本体或微粒的偶联，从而与基片上的其不同地址缔合。

本发明的另一方面是，提供了一种用于构建微阵列的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)提供一个具有至少一种感兴趣本体的群体，其中该本体任意偶联到微粒上；(b)提供一个基片，其中该基片用能够偶联到感兴趣本体或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本体群与基片接触；以及(d)激活基片上所期望位点处的活性化合物，从而使本体群在所期望位点处与基片偶联。

本发明的又一方面是，提供了一种制备包括核酸序列的微阵列的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包括以下组分的第一微阵列：(i)第一基片；(ii)具有至少一种核酸序列的第一群体，其中该至少一种核酸序列在其远端包括第一核酸杂交序列，该第一核酸序列任意偶联到微粒上，并且核酸序列群与第一基片上的不同地址缔合；(b)提供包括以下组分的第二微阵列：(i)第二基片；(ii)第二杂交序列群，其中该第二杂交序列与第一杂交序列互补，第二杂交序列群任意偶联到微粒上，并且该杂交序列群与第二基片上的不同地址缔合；(c)在杂交条件下使第一和第二微阵列互相接触，从而使第一和第二杂交序列杂交；(d)使所杂交的第一和第二微阵列暴露于核苷酸聚合的条件下，从而将来自第一微阵列的所述至少一种核酸序列用作制备第二微阵列上的互补核酸序列的模板。

本发明的再一方面是，提供了一种用于在一个基片上制备微阵列的多个拷贝的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供一微粒群，其中该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体；(b)提供一个用于微阵列的多个拷贝的基片；(c)在基片上待制备的每个微阵列的所期望位点处将微粒群定域到基片上；以及(d)在基片上待制备的每个微阵列的所期望位点处使微粒群与基片缔合。

附图描述

图1示出了利用微粒和微流技术合成微阵列的示范装置。

实施本发明的方式

定义

为了达到本发明的目的，术语“基片”、“支持体”和“表面”在本文中可以互换使用，用于表示在其上有阵列构成的材料。

为了达到本发明的目的，“地址”是基片上可与其它独特部位区分开的独特部位。

正如本文中所用的，“微粒群”是指一个或多个微粒。

正如本文中所用的，“具有至少一种感兴趣本体的群体”是指一种或多种感兴趣的本体。

正如本文中所用的，“感兴趣的本体”是指单一种类的分子或细胞群，例如多核苷酸或多肽。可用于本发明的分子种类包括生物或化学化合物，例如简单或复杂的有机和无机分子。大量分子都可以是合成的，例如寡聚体(诸如寡肽和寡核苷酸)以及基于核结构合成的有机化合物。另外，不同的天然源也可以提供用于本发明的分子，例如植物或动物提取物，以及类似物质。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换，是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性的或分支的，它可以包括修饰氨基酸，并且可以装配到多于一个多肽链的复合物中。这些术语还包含业已由天然或人工修饰的氨基酸聚合物；例如通过二硫健形成、糖基化、类脂化、乙酰化、磷酸化或者其它任何操作或修饰作用诸如与标记组分共轭。在该定义内还包括例如含有一个或多个氨基酸(包括诸如非天然的氨基酸等等)类似物的多肽、类似于肽的化合物诸如胨化物，以及本领域内公知的其它修饰物。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”以及“核酸”在本文中可以互换使用，是指任何长度的核苷酸聚合物。它还包括本领域内公知的寡核苷酸类似物和衍生物，例如2’邻-甲基-核糖核苷酸。

术语“聚糖”和“碳水化合物”在本文中可以互换使用。

“A”、“an”和“the”包括复数，除非上下文清楚地表示出其它意思。

化学术语，除非另外定义，否则就象本领域内公知的那样使用。

一般技术

除非另外指出，否则本发明的实施将采用以下这些领域的常规技术：照片平版印刷术bv、微观流体、有机化学、生物化学、寡核苷酸合成与修饰、生物共轭化学、核酸杂交、分子生物学、微生物学、遗传学、重组DNA以及本技术领域内的相关技术。这些技术在本文所提到的参考文献中都有所描述并且在文献中都得到了充分的解释。关于分子生物学和重组DNA技术，参见例如(Maniatis，T.等人(1982)，分子克隆：实验室手册，冷泉港(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor)；Ausubel，F.M.(1987)，分子生物学最新技术(Current Protocols inMolecular Biology)，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience；Ausubel，F.M.(1989)，分子生物学简略方法：分子生物学最新技术中的方法一览表(Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience；Sambrook，J.等人(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港；Innis，M.A.(1990)，PCR方法：方法和应用指南(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)，学术出版社(Academic Press)；Ausubel，F.M.(1992)，分子生物学简略方法：分子生物学最新技术中的方法一览表，Greene Pub.Associates；Ausubel，F.M.(1995)，分子生物学简略方法：分子生物学最新技术中的方法一览表，Greene Pub.Associates；Innis，M.A.等人(1995)，PCR策略(PCRStrategies)，学术出版社；Ausubel，F.M.(1999)，分子生物学简略方法：分子生物学最新技术中的方法一览表，Wiley，以及更新年鉴；Sninsky，J.J.等人(1999)，PCR应用：用于功能基因组学的方法(PCR Applications：Protocols for Functional Genomics)，学术出版社)。关于DNA合成技术以及核酸化学，参见例如(Gait，M.J.(1985)，寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach)，IRL出版社；Gait，M.J.(1990)，寡核苷酸合成：实用方法，IRL出版社；Eckstein，F.(1991)，寡核苷酸及类似物：实用方法(Oligonucleotides andAnalogues：A Practical Approach)，IRL出版社；Adams，R.L.等人(1992)，核酸生物化学(The Biochemistry of the Nucleic Acids)，Chapman和Hall；Shabarova，Z.等人(1994)，核酸的高级有机化学(AdvancedOrganic Chemistry of Nucleic Acids)，Weinheim；Blackburn，G.M.等人(1996)，化学和生物学中的核酸(Nucleic Acids in Chemistry andBiology)，牛津大学出版社(Oxford University Press)；Hermanson，G.T.(1996)，生物连接技术(Bioconjugate Techniques)，学术出版社)。关于微观制造，参见例如(Campbell，S.A.(1996)，微电子制作的科学和工程学(The Science and Engineering of MicroelectronicFabrication)，牛津大学出版社，；Zaut，P.V.(1996)，微型微阵列制作：半导体加工工艺的使用指南(Micromicroarray Fabrication：aPractical Guide to Semiconductor Processing)，SemiconductorServices；Madou，M.J.(1997)，微制作基础(Fundamentals ofMicrofabrication)，CRC出版社；Rai-Choudhury，P.(1997)，微平板印刷术手册，微型机及微制作：微平板印刷术(Handbook ofMicrolithography，Micromachining，& Microfabrication：Microlithography))。

微阵列

本发明提供了微阵列，在该微阵列中，不同的化学、生物和/或细胞本体与基片表面上的特定地址缔合。

因此，本发明提供了一种微阵列，包括：(a)一个基片，其中该基片用以下物质衍生化：i)包括第一官能团的第一化合物，以及至少一层包括多个第二官能团的交联化合物，或者ii)包括第一官能团的第一化合物，以及包括多个第二官能团的聚合膜；以及(b)或者i)一个具有至少一种感兴趣本体的群体，其中这个具有至少一种感兴趣本体的群体通过本体与第二官能团的偶联，而与基片上的一个不同地址缔合，或者ii)一个微粒群，其中该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体，并且该微粒群通过第二官能团与微粒的偶联，而与基片上的一个不同地址缔合，从而该至少一种感兴趣的本体占据了基片上的一个不同地址。

本发明的另一方面是，提供了一种微阵列，该微阵列包括：(a)一个基片；以及(b)一个微粒群，其中该微粒群与基片上的一个不同地址缔合，并且该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体，该至少一种感兴趣的本体选自：多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸以及小分子；从而该至少一种感兴趣的本体占据了基片上的一个不同地址。

本发明的又一方面是，提供了一种微阵列，该微阵列包括：(a)一个基片；以及(b)一个微粒群，其中每个微粒的直径都小于1μm，该微粒群与基片上的一个不同地址缔合，并且该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体，从而该至少一种感兴趣的本体占据了基片上的一个不同地址。

本发明的再一方面是，提供了一种由以下方法制备的微阵列：(a)提供一个具有至少一种感兴趣本体的群体，其中这些本体任意偶联到微粒上；(b)提供一个基片，其中该基片用能够偶联到感兴趣的本体或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本体群与基片接触；以及(d)激活基片上所期望的一个或多个位点上的活性化合物，从而使本体群在所期望的位点处偶联到基片上。

基片

能够用于形成基片的物质包括可共价或非共价结合到微粒上的性质或者能够衍生成具有该性质的任何固体材料。用作基片的材料包括但不局限于：玻璃、硅石、硅、二氧化硅、塑料、金属、陶瓷(诸如瓷)，以及天然或合成聚合物例如纤维素、聚氨基葡糖、葡聚糖、聚苯乙烯和尼龙。在本发明的实践中能够形成固相表面的任何物质都适合用作基片。该基片也可包括不同的材料层。

将基片材料形成为适于阵列的特定制造工艺及应用的尺寸和形状。例如，在分析物和试剂之高消耗为可接受的某些分析类型中，在相对大的基片(例如1cm×1cm或更大)上制备阵列更经济些，因为具有可采用灵敏度更小且更经济的检测系统的辅助优点。然而，在许多情况下，只能得到有限量的分析物和/或试剂，从而需要对这些组分的最小消耗。在这些情况下，较小尺寸的基片和较小的地址是合适的。尤其是，由于地址的尺寸可与单个微粒的尺寸一样小(可以在1-2毫微米这一等级上)，因此在某些情况下可由基片上的地址数来确定最小的基片面积。

在某些实施方案中，一个基片包含高达10⁸个地址，在其它实施方案中可高达10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³或10²个地址。

一个地址可假设成与微粒和地址的缔合相符的任何形状，并且该形状使得每个地址上的本体与所有其它地址上的本体区分开(例如在光学上)。地址的形状可以是例如环形、卵圆形、方形、矩形或者可包括不规则形状。

每个地址的尺寸取决于基片的尺寸、特定基片上的地址数、可得到的分析物和/或试剂的量、微粒的尺寸以及使用阵列的任何方法所需的溶解程度。尺寸可以在例如1-2毫微米至几厘米的范围内，但是与阵列的应用相符的任何尺寸都是可用的。

地址的空间布置和形状被设计成与微阵列的特定应用相符。地址可为密集的，或为广泛分散的，或亚分组为适于特定类型分析所需的模式。

在一个实施方案中，用官能团衍生基片表面，其中所述官能团与微粒或本体上用于阵列特定地址定域的相匹配官能团偶联。一对活性官能团可用来使微粒或感兴趣的本体与基片缔合，其中这对活性官能团的一员与其中的另一员形成共价键。在这种情况下，其中一员固定在基片上，而另一员固定在微粒或感兴趣的本体用于与基片键接。合适的活性官能团对的实例包括但不限于：氨基/N-羟基琥珀酰亚胺酯、巯基/马来酰亚胺基，以及羰基/酰肼。在多种化学目录(诸如Pierce Chemical Co.的目录)中可找到其它实例。另外，在色谱基质的制备中所用的反应基团对，尤其是亲和色谱中所包括的那些反应基团对，以及蛋白质与核酸的修饰中所用到的那些反应基团对都可用于本发明。参见例如(Means等人(1971)，蛋白质的化学修饰(Chemical Modification of Proteins)，Holden-Day；Sundaram，P.V.等人(1978)，亲和技术理论和实践(Theory and Practice in AffinityTechniques)，学术出版社；Wilchek，M.等人(1984)，亲和层析，酶学方法(Affinity Chromatography，Methods in Enzymology)，学术出版社；Hermanson，G.T.等人(1992)，固相化亲和配体技术(ImmobilizedAffinity Ligand Techniques)，学术出版社)。

在一些实施方案中，需要增加基片表面上的官能团数目或可及度，以便使微粒或感兴趣的本体易于缔合并固定到基片上(例如用高密度的官能团将微粒或感兴趣的本体共价固定到基片上，可导致整个键强度能够抵挡住多种测定应用所需的工艺中所施加的机械力)。这一点可通过将含有多个官能团的化合物交联到基片表面的官能团上而达到。具有合适的多个官能团的任何化合物都可用作交联化合物，以便扩大可得到的官能团的总数或者增加官能团的可及度。合适的交联化合物的非限定性实例包括例如聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚氨基葡糖或共聚物(诸如聚丝氨酸-天冬氨酸)等等。在一个实施方案中，该交联化合物是聚赖氨酸。在一个实施方案中，用一个交联周期衍生基片。在一个优选的实施方案中，用两个交联周期衍生基片。在另一优选的实施方案中，用至少三个、至少四个、至少五个交联周期衍生基片。

在一个实施方案中，基片表面可由具有非常高浓度官能团的聚合膜制成或涂覆，从而与微粒或感兴趣的本体具有适当的键合强度。通过聚合官能团(例如环氧、氨或羰基)的纯单体或者聚合不同种单体的混合物，以使官能团的总数较高，而形成这些聚合膜。如果所选择的基片表面具有低密度的反应官能团(例如当基片是诸如金属、玻璃、硅石、陶瓷、聚苯乙烯或聚丙烯时)，用复官能化合物简单处理基片表面一次(诸如通常用聚赖氨酸处理)并附着微粒是不会导致整个键强度足以抵挡住大多数测定应用所需的工艺中所施加的机械力。为了扩大官能团的数目，可应用含有多个官能团的交联化合物并与之反应，重复所需要的次数，直至获得所需密度的反应官能团。含有多个官能团的这些扩增试剂在每个周期内可相同或不同。

当由交联化合物引入的官能团数超过交联反应中所消耗的官能团数时，该过程就扩大了基片表面上的官能团数。如果交联化合物在基片表面与官能团之间提供了更多的空间，那么该过程还能增加官能团的可及度。例如，为了增加基片上的氨基数，可以将合适分子量的聚赖氨酸交联到基片上。可以重复该步骤来交联所需层的聚赖氨酸，这样就扩大了氨基数以及它们与表面的距离。

通过将其它化合物与所需的性质结合可以将其它化学性质赋予基片。例如，利用聚-苯基丙氨酸-赖氨酸比利用聚赖氨酸具有更大的疏水性。关于亲水性，可结合不同分子量大小的聚乙二醇。有多种保护基团和偶联化学方法能够用来以受控方式实现交联。用于此目的的技术和适当的保护基团在肽与寡核苷酸合成领域内是公知的。参见例如(Bodanszky，M.(1993)，肽化学：实践教科书(Peptide Chemistry：A Practical Textbook)，Springer-Verlag；Bodanszky，M.(1993)，肽合成原理(Principles ofPeptide Synthesis)，Springer-Verlag；Bodanszky，M.等人(1994)，肽合成实践(The Practice of Peptide Synthesis)，Springer-Verlag；Fields，G.B.(1997)，固相肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)，学术出版社)。例如，可以用叔丁氧基羰基(t-Boc)来保护聚赖氨酸上的氨基。通过利用碳二亚胺例如N，N’-二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺，并以N-羟基琥珀酰亚胺作为催化剂，可使末端羰基与基片上的原始氨基反应并共价链接(参见(Dierks，T.等人(1992)，生物化学与生物物理学学报(Biochim Biophys Acta)1103(1)：13-24；Sehgal，D.等人(1994)，生物化学年鉴纪事(Anal Biochem)218(1)：87-91))。如果需要的话，通过将保护反应中的少量酐(诸如琥珀酐)与N-(叔丁氧基碳酰氧基)琥珀酰亚胺结合，可将聚赖氨酸上有限数目的氨基转换成羰基，从而使聚赖氨酸上的有限数目的氨基被转换成羰基。由于t-Boc保护的聚赖氨酸上有多于一个的羰基，比较容易将聚合物交联到基片上的氨基上。以类似方式，可使用聚天冬氨酸和含有多个羰基的其它聚合物以引入更多的羰基。可以选择保护和偶联试剂，以便适合特定反应的需求。通过控制反应物的浓度、pH、温度等，可控制该交联反应，以便得到所期望的结果。

微粒

用于形成微粒的物质包括能够被制成粒子的任何固相材料，并且这些材料具有能够与基片以及与微阵列上待显示的特定本体结合的性质或者能够被衍生成具有该性质。微粒可以是衍生化的也可以是非衍生化的。微粒与基片以及与感兴趣本体的结合可以是共价的也可以是非共价的。用于构建微粒的材料包括但不限于：玻璃、硅石、硅、二氧化硅、塑料、金属或陶瓷(诸如瓷)，以及天然和合成聚合物例如纤维素、聚氨基葡糖、葡聚糖、聚苯烯和尼龙。在一个实施方案中，基片被衍生化，而微粒没有衍生化。在另一实施方案中，基片没有衍生化，而微粒被衍生化。在又一实施方案中，基片和微粒都被衍生化。

微粒可通过商业途径购得，例如从Bang Laboratories，Inc.；Seradyn，Inc.；Quantum Dot，Inc.；Biorad和Pharmacia购得，并且可以不同的形状和尺寸获得。与预期使用的阵列相符的任何形状和/或尺寸都是合适的。球形微粒是最常使用的。在一个实施方案中，直径在约1nm和10mm之间的球形微粒是合适的。在另一实施方案中，这些微粒的直径小于1μm。优选的微粒具有均一大小。然而，如果使本领域公知的软件程序用于微粒大小与信号强度关系的均一化，那么对测定应用中产生一致的结果而言，对尺寸的均一性并无严格要求。

在一个实施方案中，表面上带有所需本体的微粒在性质上是离子的或是磁性的，借此使其易于初始定域到特定地址上(参见下文)。通过例如用正或负离子基使微粒衍生化，可将离子性质赋予微粒。这些离子基的实例包括但不限于：羧基(提供负电荷)和氨基(提供正电荷)。另外，用于制备离子交换色谱基质的工艺过程也可用于制备带电微粒。参见例如(Kitchener，J.A.(1961)，离子交换树脂，第一版“小量修改后的再版”(Ion Exchange Resins.lst edition “reprinted with minorammendments”)，Methuen；Placek，C.(1970)，离子交换树脂，Noyes DataCorp.；Wilson，A.等人(1981)，用于水处理中去除特定金属的离子交换树脂的发展和评估(Development and evaluation of ion-exchange resinsfor removal of specific metals in water treatment).Morgantown，Water Research Institute，Center for Extension and ContinuingEcucation，West Virginia University；Kunin，R.(1985)，离子交换树脂，R.E.Krieger Pub.Co.；Kunin，R.(1990)，离子交换树脂，R.E.Krieger Pub.Co.；关于离子交换的国际会议(International Conferenceon Ion Exchange)(1991).离子交换方面的新进展：材料、基础及应用：离子交换的国际会议学报(New Developments in Ion Exchange：Materials，Fundamentals and Applications：Proceedings of the InternationalConference on Ion Exchange)，ICIE’91；Philipp，W.H.等人(1993).离子交换聚合物和成为发明家的方法(Ion Exchange Polymers and Methodfor Making Inventors)，国家航空和空间管理局(National Aeronauticsand Space Administration)；Baumgartner，W.等人(1997)，离子交换树脂，The Freedonia Group Inc.)。在合成某些微粒时，将离子共聚物并入最初的聚合步骤中(例如由Seradyn，Inc.提供的那些步骤)，借此使微粒带电。

在另一实施方案中，借助于偶联分子而赋予微粒离子性质。例如，包含偶联核酸的微粒在中性pH值时具有净负电荷。另外，正如本领域技术人员所公知，某些蛋白质和/或肽可由于它们的氨基酸组成和介质的pH值不同而显示出净的正或负电荷。

通过利用颗粒内部包埋有或其表面附着有顺磁材料的微粒，可获得磁性质。能够被磁化的任何金属或物质都适合使微粒带有磁性质。具有磁性质的微粒可经商业途径购得，例如从Dynal A.S.(Lake Success，纽约和Oslo，挪威)和Seradyn(Indianapolis，IN)购得。

在一个实施方案中，将独特的化学、生物或细胞本体偶联到微粒上。在一实施方案中，化学、生物和/或细胞本体的独特组合物被偶联到微粒上。在另一实施方案中，微阵列具有至少两个微粒或本体群。在另一实施方案中，微阵列具有至少10个、至少100个、至少100个微粒或本体群。以上所描述的使基片官能化，以便结合微粒的方法也可以用于使微粒官能化，以便偶联到基片或所需的本体上，并且为本领域的技术人员所公知的技术。其它实例在下文中有所描述。

感兴趣的本体

能够共价或非共价偶联到微粒或基片上的任何感兴趣的生物、化学和/或细胞本体都可用于形成本发明的微阵列。这些本体包括例如生物聚合物、小分子、激素、氨基酸、类脂、配体、脂肪酸、核苷、核苷酸以及核苷酸类似物(例如cAMP和cAMP衍生物)，并且还包括合成及天然分子。它还包括以上这些物质的衍生物和类似物。在本发明的实践中，细胞或组织样品也可附着到微粒上。这些感兴趣的本体无需来自于生物源；例如在本发明的实践中，组合化学工艺过程的产物可偶联到微粒上。化学、生物和/或细胞本体可通过共价或非共价连接附着到微粒或基片上。在一个实施方案中，具有至少一种感兴趣本体的群体被直接偶联到基片上。在另一实施方案中，一个微粒群被偶联到基片上，其中该微粒群被偶联到至少一种感兴趣的本体上。

生物聚合物包括多糖类、多肽类和多核苷酸类。优选的生物聚合物是多肽类；更优选的是核酸聚合物。核酸聚合物包括但不限于：寡核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸类似物与多核苷酸类似物、嵌合寡核苷酸与嵌合多核苷酸以及修饰核酸。核酸聚合物可以是单链、双链或多链的。

在一个实施方案中，该至少一种感兴趣的本体选自：多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸，以及小分子。在一优选的实施方案中，该至少一种感兴趣的本体是核酸。在若干单独的实施方案中，该至少一种感兴趣的本体是DNA或RNA。在另一优选实施方案中，该至少一种感兴趣的本体是多肽。

在一实施方案中，两种或多种不同类型的化学、生物和/或细胞本体存在于一个微阵列中。例如，许多致癌基因已知可编码转录调节蛋白，后者通常与调节核酸序列和其它调节蛋白质相互作用。因此，包括寡核苷酸、多肽和小分子的阵列可用于例如筛分与致癌基因相互作用的分子，以便鉴定潜在的治疗方案。在另一实施方案中，一个地址可包括至少一种多肽和至少一种核酸。

可利用本领域的技术人员公知的方法在微粒上直接地化学合成分子。例如，以下文献中业已描述了自动化的固相肽合成技术：Stewart，J.M.等人(1984)，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)，PierceChemical Co.；Grant，G.A.(1992)，合成肽：用户指南(SyntheticPeptides：A User’s Guide)，W.H.Freemen；Bodanszky，M.(1993)，肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)，Springer-Verlag；Bodanszky，M.等人(1994)，肽合成的实践(The Practice of PeptideSynthesis)，Springer-Verlag；Fields，G.B.(1997)，固相肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)，学术出版社；Pennington，M.W.等人(1994)，肽合成方法(Peptide Synthesis Protocols)，Humana Press；Fields，G.B.(1997)，固相肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)，学术出版社。用任一通过商业途径购得的DNA合成仪(例如PE Biosystems所提供的DNA合成仪)通过自动化的化学合成工艺，可制备寡核苷酸。用于自动寡核苷酸合成的组合物和方法公开在例如(US专利号4,415,732，Caruthers等人(1983)；US专利号4,500,707和Caruthers(1985)；US专利号4,668,777，Caruthers等人(1987))。

在一个实施方案中，由组合化学工艺过程合成的分子集合(即化合物文库)可以偶联到微粒或基片上，从而形成用于筛分分子的微阵列。

在另一实施方案中，新鲜、冷冻或包埋在石蜡中的组织切片或者从细胞培养物中收集的细胞可偶联到微粒或基片上。用本领域内公知的流化床方法在微粒内部或表面上生长的细胞也是合适的。采用多种细胞源和/或生长条件，可构建代表多种生物状态的微粒集合。例如，采用标准的固定方法、用醇脱水或用交联剂处理，可将细胞固定到微粒上，从而产生具有特定生物状态的固定细胞材料。以下文献中描述了示范性的固定方法：Bancroft，J.D.(1975)，组织化学技术(Histochemical Techniques)，Butterworths；Troyer，H.(1980)，组织化学原理和技术(Principles and Techniques ofHistochemistry)，Little Brown；Bancroft，J.D.等人(1987)，酶组织化学(Enzyme Histochemistry)，牛津大学出版社；Sumner，B.E.H.(1988)，基础组织化学(Basic Histochemistry)，Wiley；Lyon，H.(1991).组织化学中的原理和策略：技术的选择和了解指南(Theory and Strategyin Histochemistry：a Guide to the Selection and Understanding ofTechniques)，Springer-Verlag；Graumenn，W.等人(1992).受体组织化学(Histochemistry of Receptors)，Gustav Fischer Verlag；Noorden，C.J.等人(1992).酶组织化学：最新方法的实验手册(EnzymeHistochemistry：A Laboratory Manual of Current Methods)，牛津大学出版社；Kiernan，J.A.(1999).组织学和组织化学方法：理论和实践(Histological and Histochemical Methods：Theory and Practice)，Butterworth Heinemann)。微粒集合(每个集合含有确定生物状态的固定细胞簇)可以贮藏起来并用于形成如本文所述的微阵列。一个微粒群足以制成大量的微阵列。以这种方式可避免每次测定时对生长细胞的需要，并避免了每次重复细胞生长的精确生长条件的必要性。取而代之的是，含有从同一条件下衍生的细胞中取得的细胞材料的微粒可用于大量不同的阵列中。而且，使用含有细胞的微粒可确保在不同测定中所比较之材料的均一性。

制备微阵列的方法

本发明提供了由所选择的本体阵列构建微阵列的制备方法。在这些和其它方法中，在阵列上待显示的不同化学、生物和/或细胞本体可以首先固定到若干分离开的微粒群体上。然后利用将要描述的几种方法之一，使微粒与基片上的不同特定地址缔合。或者是，将感兴趣的本体直接与基片缔合。

本发明的另一方面是，提供了一种用于构建微阵列的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)提供一个基片，其中该基片用以下物质衍生化：i)包括第一官能团的第一化合物，以及至少一层包括多个第二官能团的交联化合物，或者ii)包括第一官能团的第一化合物，以及包括多个第二官能团的聚合膜；(b)提供或者i)一个具有至少一种感兴趣本体的群体，或者ii)一个微粒群，其中该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体；(c)将本体或微粒群定域在基片上的一个不同地址处；以及(d)定域的本体或微粒群通过第二官能团与感兴趣的本体或微粒的偶联，而与基片上的它们的不同地址缔合。

本发明的另一方面是，提供了一种用于构建微阵列的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)提供一个具有至少一种感兴趣本体的群体，其中该本体任意偶联到微粒上；(b)提供一个基片，其中该基片用能够偶联到感兴趣本体或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本体群与基片接触；以及(d)激活基片上所期望位点处的活性化合物，从而使本体群在所期望的位点处与基片偶联。

本发明的另一方面是，提供了一种制备包括核酸序列的微阵列的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包括以下组分的第一微阵列：(i)第一基片；(ii)具有至少一种核酸序列的第一群体，其中该至少一种核酸序列在其远端包括第一核酸杂交序列，该第一核酸序列群任意偶联到微粒上，并且该核酸序列群与第一基片上的一个不同地址缔合；(b)提供包括以下组分的第二微阵列：(i)第二基片；(ii)一个第二杂交序列群，其中该第二杂交序列与第一杂交序列互补，第二杂交序列群任意偶联到微粒上，并且该杂交序列群与第二基片上的一个不同地址缔合；(c)在杂交条件下使第一和第二微阵列互相接触，从而使第一和第二杂交序列杂交；(d)使所杂交的第一和第二微阵列暴露于核苷酸聚合的条件下，从而将来自第一微阵列的所述至少一种核酸序列用作制备第二微阵列上的互补核酸序列的模板。

本发明的另一方面是，提供了一种用于在一个基片上制备微阵列的多个拷贝的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供一微粒群，其中该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体；(b)提供一个用于微阵列的多个拷贝的基片；(c)在基片上待制备的每个微阵列的所需部位上将微粒群定域到基片上；以及(d)在基片上待制备的每个微阵列的所需部位上使微粒群与基片缔合。

分子或细胞本体与微粒的偶联

阵列上待显示的化学、生物和/或细胞本体首先可共价或非共价偶联到微粒上。偶联可以群体的形式进行，从而每个微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体。有许多方法为利用化学或生物方式将分子或细胞偶联到微粒上(参见上文)。进一步的实例将在下文中描述。

用于将化学或生物本体偶联到微粒上的示范性化学方法包括巯基与巯基、马来酰亚胺或碘乙酸根的偶联；碳二亚胺催化的氨基与琥珀酰亚胺基酯、醛或羧基的偶联；羰基与酰肼基的偶联以及由光活性叠氮化物基团介导的非特异偶联。其它偶联方法为本领域的技术人员公知。可利用本领域内公知的方法使核酸与肽偶联。参见例如(Hermanson，G.T.等人(1992).固定亲和配体技术(Immobilized Affinity Ligand Techniques)，学术出版社；Shabarov8，Z.等人(1994).高级核酸有机化学(Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids)，Weinheim；Hermanson，G.T.(1996).生物连接技术(Bioconjugate Techniques)，学术出版社)。在一个实施方案中，用硅烷处理微粒表面，以便用反应基团涂覆粒子表面(Joos，B.等人(1997).分析生物化学247：96-101)。也可以利用疏水作用和物理截留(例如与膜、聚合物的疏水作用或截留在孔内)。

将分子附着到微粒上的生物方法是基于特定的生物相互作用，这些作用包括但不限于：亲和素-生物素；蛋白质-配体；抗体-抗原；抗体-半抗原、蔗糖-外源凝集素以及互补核酸之间的特异相互作用。通过连接作用和/或核酸聚合技术也可获得分子与微粒的共价或非共价键接。例如，寡核苷酸可连接到微粒上。带有与将要连接到微粒上的分子序列和微粒上的分子序列都互补的序列的接头寡核苷酸及多核苷酸可用来将这两个序列置于并列位置上，然后由连接酶连接。如果优选接头分子的话，则可用来杂交微粒上和待连接的分子上的两个序列，而不是将它们置于并列位置并在两个序列之间留下一个间隙。可用聚合酶填补该间隙，然后用连接酶连接这两条链。示范性连接酶包括E.Coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶和T4 RNA连接酶。示范性核酸聚合酶包括E.Coli DNA聚合酶I(PolI)、Pol I的Klenow片段、Taq聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、E.ColiRNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。其它原核生物与真核生物连接酶、DNA聚合酶及RNA聚合酶都是本领域的技术人员所公知。另外，本领域的技术人员所公知的多种反转录酶可用于本发明的实践中。

对于通过聚合作用而使单链寡核苷酸或多核苷酸与微粒发生的酶偶联，在聚合作用之后必须除去模板。这可通过变性例如用热、高pH值、有机溶剂和/或酶变性而完成。如果需要将双链寡核苷酸或多核苷酸偶联到微粒上，则不必除去模板。利用本领域公知的并在上文中描述的方法可将其任意偶联到微粒上。例如，诸如脂肪族伯氨或者羧基这些官能团可以连接到微粒上，或者可引入3’端核糖基，该3’端核糖基在由高碘酸盐进行氧化时可连接到微粒的氨基上(参见(Hermanson，G.T.等人(1992).固定亲和配体技术(Immobilized Affinity Ligand Techniques)，学术出版社)。

微粒与基片之间的连接

偶联有感兴趣本体的微粒与基片缔合，以便形成一个有序的本体阵列。在一实施方案中，这可通过合成若干个分开的微粒群而获得，并且每个群体具有一个不同的本体或者所选择的本体混合物偶联在该群体中的微粒上。然后每个群体与基片上的独特地址缔合，借此将一个不同的本体或者所选择的本体群放在基片的每个地址上。或者是，包含偶联有不同本体的单一微粒与基片的每个地址缔合。偶联有不同本体的、于不同批中合成的微粒混合物可以与一个地址缔合。

此处所描述的用于将微粒定域并缔合到基片上的方法还可用于将感兴趣的本体偶联到基片上。

含有偶联分子或细胞的微粒可以微粒的液体悬浮液的形式或者作为干粉分送到基片的表面上。一种将微粒定域到地址上的方法利用了地址与微粒之间的离子相互作用。例如，可以将带电微粒定域在基片上，而将程序电极或电场置于该基片上的每个地址处。如果一个特定地址处的电极带正电荷，并且阵列上所有其它地址处的电极都带负电荷，那么带负电荷的微粒(例如偶联有寡核苷酸的微粒)将附着在含有带正电电极的地址处，并且被所有其它地址所排斥。关于将分子定域在阵列上而采用离子性质的其它细节，参见US专利号5,605,662。一旦一个微粒群定域到一个地址上，就可除去多余的微粒并且被定域微粒可与地址缔合(例如通过共价键)；另外，可在不同的地址利用不同微粒群重复该定域过程。因为这些微粒物理占据了地址上的空间，所以一旦定域，它们会阻止其它微粒在该地址处与基片接触。这样，在每个缔合周期内可进行许多次定域循环，从而使该过程更有效。定域和缔合过程的有序重复使得可利用在每个独特地址定域的一个不同微粒样本(借助于其偶联的本体而区分开)构成一个微阵列。

通过利用阵列的磁性质(例如磁场)和微粒的磁性质也可以实现将微粒定域到特定的地址上。例如，微粒可含有铁芯或者另外被衍生化，从而带有磁性质(参见上文)。基片上的每个地址都可单独用所设计的集成电路磁化。例如，每个地址可含有用电线围绕的金属芯；电线中的电流方向将决定地址的磁极性。然后具有特定磁荷的微粒被定域在具有相反磁荷的地址上。

正如本领域所公知的，利用多种类型的微流技术可实现定域。参见例如Service(1998)科学(Science)282：399-401；US专利号5,885,470以及本文提到的参考文献；以及US专利号5,932,315和本文提到的参考文献。利用微流组装微阵列的非限定性实例在下文的实施例2中有所描述。通常，用于本发明的装置可包括多个微粒贮存器10，110等(图1)。每个贮存器含有一个微粒群11，111等，每个微粒带有一个不同的本体或本体组。将微粒从贮存器释放到管道12，112等中，并且沿该管道移动到部位13，113等处。在每个独特微粒群之间(即贮存器10与110之间，管道12与112之间，部位13与113之间)，有一个允许缓冲液通过但将微粒保留在它们各自的贮存器、管道和部位中的隔栅。

微粒单独或者作为一组通过微流从部位13沿第二管道14移动到部位15，并且从那儿，沿管道16移动到部位17。在部位17，一组微粒群(每群带有独特的本体或本体组)被紧密接触地排成行。然后，排成行的微粒沿管道18移动到部位19，排成行的微粒在那儿彼此共价或非共价交联，从而形成微粒链20。同样可形成其它微粒链(120，220等)。适用于微粒交联的活性基团在上文有关微粒与基片的键接以及分子与微粒的偶联的讨论中有所描述。例如，微粒可用生物素在其表面衍生化。在部位19，在缓冲液贮存器2中，含有亲和素或者带有两种或多种亲和素的衍生接头分子的合适缓冲液可用来交联微粒。同样可通过合适缓冲液的使用来启动化学交联，其中所述缓冲液通过影响pH值的改变、影响氧化状态或者提供催化剂来起作用。

然后微粒链20，120等从部位19，119等移动到部位21，121等处。重要的是，以一种能够使链整齐堆积的方式来保持其延伸和取向。这可通过以下方式来获得：即在该区域上设计微型程序电极或磁芯，以便引导微粒串的运动以一种有序的方式排成行并堆积。

最后，微粒链20，120等从部位21，121等移动并沉积在基片50的表面上，从而产生一个地址阵列，其中每个地址包含一个不同的本体或本体组。

该过程可如所期望的那样重复，每次都导致一个新的微粒阵列沉积在基片上。

在一个独立的实施方案中，可以在含有偶联分子的微粒之间散布没有携带欲显示的本体的“空”微粒，借此起到间隔区的作用。这样具有提供一个物理屏障的优点，从而使得地址之间的交叉污染最小化。

用于定域微粒的其它方法包括例如斑点印迹法和自动分配法(如上文所述)，诸如在US专利号5,807,522中有所描述。

微粒在定域到一个特定地址上之后，可通过共价或非共价键与该地址缔合。利用诸如生物素与亲和素、配体与受体、抗原与抗体之间的结合作用或者核酸与互补序列之间的杂交作用可实现非共价键接。利用化学或酶方法可形成共价键接。通过利用特定的活性基团对可在地址与微粒之间形成共价键(如上文所述)，并且这对活性基团中的一员在地址上，而另一员在微粒上。因此活性基团可附着在基片表面和微粒上(如上文所述)。通过采用上述的聚合酶或连接酶的分子生物学技术，能够在基片与微粒之间形成共价或非共价键。利用附着在微粒和基片上的核酸分子的自由端上的互补序列，可通过杂交形成该键接。利用连接或聚合技术可延伸杂交序列，以便加强键合强度。通过利用诸如补骨脂素这些交联两条链的试剂(Kornhauser，A.等人(1982).科学217：733)可以使杂交核酸的非共价键转换成共价键。

在任意次的定域循环之后可实现微粒与基片的缔合。这样，在一个微粒群定域到一个独特地址上之后，再发生缔合，或者在许多不同的微粒群定域之后(每个群体在一个独特的地址上)，再同时缔合所有群体。

在本发明的另一实施方案中，采用一个包括若干孔的掩模和一个活性基团用来将感兴趣的分子或细胞本体(任意偶联到微粒上)连接到基片上，其中所述孔与特定微粒群的预定部位对应。在一个实施方案中，该活性基团包括光活性基团。在另一实施方案中，该活性基团可包括热活性粘合剂。在若干独立的实施方案中，还可用光纤或微镜代替本发明方法中的掩模，以分离用于活化之基片的特定区域。

例如，单独的微粒群可与独特的感兴趣的化学、生物和/或细胞本体偶联(如上文所述)。用高密度的光活性基团使玻璃或硅石板或片衍生化(如上文所述)。例如可在Pierce目录中找到合适的光活性基团。或者是，用聚合膜涂覆板或片，其中所述聚合膜含有高密度的适宜官能团诸如氨基、羧基或环氧基，其可在进一步扩增和衍生化后使用或无需进一步扩增和衍生化而使用。在选择所用的聚合膜时，一个要考虑的因素是，避免使用那些在与光活性基团相同的波长处吸收能量的基团。为赋予其它特性(诸如亲水性、疏水性、正或负电荷)而作的修饰为本领域的技术人员公知，并且在所提到的参考文献中有所描述(参见上文)。

将微粒(或感兴趣的本体)置于适当衍生化的表面上。在板或片的一侧，优选地在没有放置微粒的薄片的那一侧，施加一个掩模，该掩模具有与一个特定微粒群的预定部位对应的若干孔。通过掩模传送适当波长的电磁辐射，来激活光活性基团，由此启动了偶联反应，从而使微粒结合到板上。采用不同掩模和不同微粒群的进一步光活性循环可用来形成偶联到不同地址的不同本体群阵列。

还可以用热活性粘合剂来代替光活性基团。适宜的热活性粘合剂的非限定性实例及其使用方法在诸如以下文献中有所描述：Bonner，R.F.等人(1997)科学，278(5342)：1481-1483页，Emmert-Buck，M.等人(1996)科学，275(5289)：998-1001。例如，单独的微粒群可与如上所述的独特的感兴趣化学、生物和/或细胞本体偶联。利用能够偶联到微粒上的热活性粘合剂可使玻璃或硅石板或片衍生化。然后将微粒放在被适当衍生化的表面上。在板或片的一侧，施加一个掩模，该掩模具有与一个特定微粒群的预定部位对应的若干孔。通过掩膜照射适当波长的光线来激活热活性基团，由此启动偶联反应，从而使微粒结合到板上。采用不同掩模和不同微粒群的进一步粘合循环可用来形成偶联到不同地址的不同本体群阵列。

在这些实例中，微粒群与基片上特定地址的缔合是由掩模上的孔位置决定的。在激活活性基团之前，对微粒群在特定地址的定域几乎没有什么要求。然而，如果需要的话可以采用具有顺磁性质或净电荷的微粒，并且在微粒光活性偶联到板或片上之前施加磁场或电场来增强或控制与板或片缔合的微粒密度。在这种情况下，可在整个板的表面均匀施加磁场或电场，而无需为各个地址提供特性。在缔合步骤之后，可回收没有结合上的微粒。板或片被处理干净并准备用于采用一个不同微粒群和掩模的第二轮反应，其中掩模可指导微粒缔合在第二组位置上。

还可在单个基片上形成包括微粒的多个微阵列。本文所公开的任何方法都可用于本发明的工艺过程中。作为一个非限定性实例，可以构建包括若干孔的一个掩模并使之与基片接触，其中所述孔与单个基片上待制备的每个阵列的预定部位相对应。微粒群与基片接触，并用合适波长的光激活基片上的预定部位，由此将微粒同时偶联到每个阵列的预定部位上。以这种方式，可在板或片上形成大量的阵列并且随后任意地切成单独的微阵列。

包括核酸序列阵列的微阵列可被用作形成其它微阵列的模板，其中新的微阵列包括模板微阵列的互补序列(如下所述)。带有多个不同的单链核酸序列(任意偶联到微粒上)的模板微阵列缔合在不同的地址处。在每个序列的远端(即离基片最远的端部)存在一个短的共同序列。第二阵列构建为含有一个与每个不同地址处的共同序列互补的序列。该共同序列优选为至少5个核苷酸的长度。在另一实施方案中，该共同序列至少为10个核苷酸的长度。

在共同序列与其互补序列之间易于进行杂交的离子和缓冲液条件下，将这两个阵列彼此接触放置。对于每个地址，这些共同序列可相同或不同，只要第二阵列上存在合适的互补序列即可。如果需要的话，可在杂交序列与基片之间插入多种间隔区(诸如核苷酸均聚物和/或聚乙二醇接头)，以利于互补序列间的相互作用。优选的是，各个地址相对离得较远，以便使交叉污染最小。

共同序列与其互补序列杂交之后，这些阵列(仍处于邻近位置)被置于易于进行核苷酸聚合的条件下，例如在适当的pH、离子强度和阳离子浓度的条件下供给DNA聚合酶以及脱氧核苷三磷酸盐基片，这为本领域的技术人员所公知。

聚合作用产生了一个与存在于模板微阵列上的序列相互补之拷贝的有序微阵列。将这两个微阵列上的核酸序列解链，以产生模板微阵列和新的互补微阵列。可以重复这个过程，从而产生特定微阵列的多个拷贝。在一些情况下，以这种方式产生微阵列更经济些。

利用本领域技术人员公知的许多方法中的任一种可以将许多分离的、可区分的不同地址放置在基片上。正如本领域的技术人员所公知的，这些方法包括例如显微机械加工、微平板印刷术、电子束平板印刷术、离子束平板印刷术和分子束外延。

在一些情况下，需要微阵列上包括一个定向标记。这可通过将一个或几个含有易识别信号(诸如发色团或荧光团)的微粒放在基片的一个或多个特定部位上而获得。为了使定向标记与基片上的其它地址区分开，可使其具有例如不同的形状或颜色或者是颜色和/或形状的不同组合。

优点

首先将感兴趣的分子偶联到微粒上、然后用这些微粒形成阵列，这样做有几个显著优点。

第一，本发明的方法包括将分子链接到微粒上的初始步骤。这样做具有获得更加的可重复阵列的优点。由于分子在微粒上的固定是在一个反应容器中进行的，因此所得到的分子与每个微粒的链接与同一容器中分子与任何其它微粒的链接都非常相似。在将这些微粒用于阵列之前可对其进行质量控制测试。反之，当必须对每个独立的地址单独进行分子缔合(固定)时，则难以获得均匀性。相反，微粒与基片的链接可通过多个键形成。所有这些都要求，这些多个键的组合强度在一个阈值之上，该阈值足以通过预定应用所要求的条件保持微粒就位。该键强度可大大过剩且不影响阵列的均匀性，因为均匀性是由本体与微粒偶联的均匀性决定的。与感兴趣的本体直接链接到基片上时的情形相比，各个地址间基片表面差异不再是本发明的关键问题。例如，利用直接键接，偶联到基片上的本体量与每个地址的反应性成比例。任何差异都可影响到地址和微阵列的不一致性。

第二，关于基片的键接性质，某些已有方法受到限制。例如，正如诸如US专利号5,605,662所公开的利用电场对分子进行分布和定域，使分子直接并发共价键接到基片上，这样严重限制了对分子与基片的缔合所进行的化学反应的选择。交联反应必须在电场下进行。该反应必须既不干扰电场，也不被电场干扰，也不能影响到电解或者对电解敏感。还有对反应时间的实际限制。电场的延期应用会导致电解的累积问题，而电解能够损坏包括在阵列中的感兴趣的本体。因为指定要包括在阵列中的分子或细胞本体可具有非常多变的化学性质，所以在整个缔合(固定)过程中保持其化学完整性对于阵列功能来说是非常重要的。例如，寡核苷酸碱基必须能够杂交到分析物上，以用作有效的探针，并且杂交能力取决于碱基上的官能团的保留值。蛋白质甚至比核酸对化学操作更敏感。本发明通过将缔合过程分成两个步骤(首先，将感兴趣的本体链接到微粒上，然后利用微粒形成阵列)，可使微粒与基片的缔合以及分子与微粒的偶联条件的选择范围更宽。交联反应条件的广泛应用使设计更佳的缔合条件并获得预期的最终结果(例如合适的密度、分子化学完整性的保持、所需的链接基团等)变为可能。该方法还克服了有关使用自动化学分配器的限制，从而可以将少量物质分配到每个地址上，这是由于在蒸发强烈改变反应条件之前分配必须在短时间内完成。

第三，通过微粒将本体传送到基片上的方法提供了以下选择，即可利用直接在微粒上衍生的官能团进行微粒与基片的缔合(固定)。用于缔合的官能团不必是在阵列中待显示的本体的一部分。这意味着，生物聚合物例如无需拥有用于同基片缔合的官能团。取而代之的是，这样的本体例如可通过非共价相互作用(诸如疏水作用)固定到微粒上，或者本体被物理截留在微粒中。这又提供了保持待显示的本体化学完整性的较好机会。它还提供了用于微粒与基片缔合的化学类型选择的较大灵活性。例如，用于微粒基质和基片的官能团比可用于感兴趣本体的官能团具有更大的化学活性。它还提供了设计和形成具有更适合于选择应用的化学性质的微粒和基片的机会。

第四，利用所施加的电场使微粒定域到其对应地址处的微粒上的电荷无需施加到在阵列上待显示的本体上(即不必使例如生物聚合物带电)。用适当的电荷使微粒直接衍生化。当构成阵列的本体不带净电荷时这一点尤其重要。

第五，本发明使得在阵列组装过程中由指定给其他地址的本体对微阵列上特定地址的污染问题最小化。当通过将溶液中的分子引入到基片表面来合成阵列时，这是个难以控制的问题，因为分子在有限的可能性下可非特异结合到非指定的地址上。在重复的结合循环之后既使非常低水平的非特异结合都能导致高程度的交叉污染。例如，在200个定域循环之后，每个循环0.5％的非特异结合速率都将导致地址的明显污染。大量污染物在每个部位的存在可引起非特异信号，导致高背景噪音。因为在定域之后微粒样本占据了明确的物理空间，所以本发明使得由于非特异结合而造成的交叉污染问题最小化。一旦一个空间(诸如一个地址)被占据，其他粒子就无法占据同一空间，借此限制了非指定微粒污染特定地址的能力。而且，与分子相比，从基片表面上较容易洗去非特异缔合的微粒。与小分子、甚至与诸如核酸或蛋白质这些大分子相比，微粒的剪切质量更大。粘合这种微粒与粘合小分子或大分子相比，前者要求的基片与微粒之间的结合强度要大得多。因此，非特异结合的问题被最小化了。

第六，不象由被显示的本体直接化学合成到微阵列上而制备的微阵列，指定在阵列上显示的这些分子可被纯化，从而确保它们在偶联到微粒上之前具有适宜的纯度。

应用

本发明的微阵列例如可用于诊断、法医学、药物的发现与开发、分子生物学分析(诸如基于阵列的核苷酸序列分析和基于阵列的基因表达分析)、蛋白质的性质和功能的分析、药物基因组学、蛋白质组学和其他生物与化学分析。

实施例

以下实施例是为了解释本发明，而不是为了限定本发明。

实施例1：利用掩蔽和光活性方法制备微阵列

利用自动固相合成或者通过利用含有伯脂肪氨基的引物对之一进行PCR来制备含有伯脂肪氨基的DNA独立群体。然后用分离合适分子量的Centricon(Amicon)过滤器纯化DNA。利用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺将带有氨基的纯化cDNA链接到羧基化的微粒(诸如由Seradyn或BangLaboratories提供)上。用高密度的光活性基团使玻璃或硅石片衍生化(如下所述)。用3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液处理薄片，可使基片上带有氨基(Joos，B.等人(1997).分析生物化学247：96-101)。通过与修饰的聚赖氨酸进行交联可扩增氨基的数目(如下所述)。首先用有限量的琥珀酐修饰聚赖氨酸，从而将小部分氨基转换成羧基。剩余的大部分氨基通过与N-(叔丁氧基羰基氧)琥珀酰亚胺反应而被保护起来。通过采用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的碳二亚胺化学反应，而将修饰的聚赖氨酸链接到基片上。修饰的聚赖氨酸被链接到基片上之后，用酸除去保护基团，以便暴露氨基。重复该步骤，以便将氨官能团的数目扩增到所需密度(如上文所述)。在所需的密度水平，这些氨基通过与N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺(Pierce Chemical Company)反应而被转化成光活性基团。任何残余的氨基通过与琥珀酐反应而被转化成羧基，从而赋予负电荷，以减少微粒与基片之间的非特异性作用。

将一微粒群放在被适当衍生化的表面上。在与微粒接触的那一侧相反的薄片的那一侧，施加一个掩模，该掩模具有用于微粒群预期位点处若干孔。通过掩模传递适当波长的电磁辐射来激活光活性基团，由此启动了偶联反应，从而将微粒结合到基片上。用不同的掩模重复该过程，从而使其他微粒群与基片上所预期的部位缔合。

实施例2：利用微流方法制备微阵列

本发明的示范性装置(图1)包括多个微粒贮存器10，110等。每个贮存器含有一个微粒群(在其表面用生物素衍生化)11，111等，而每个微粒群带有独一类型的本体。微粒从贮存器中被释放到管道12，112等中，并沿管道移动到部位13，113等。每个独特的微粒群之间(即贮存器10与110之间，管道12与112之间，以及部位13与113之间)是允许缓冲液(例如水)通过但将微粒保留在它们各自的贮存器、管道和部位中的隔栅。

利用微流将一微粒群(单独地或作为一组)从例如部位13沿第二管道14移动到部位15，并且从那儿，沿管道16移动到部位17。在部位17，该微粒群紧密接触排成行。然后排成行的微粒沿管道18移动到部位19，排成行的微粒于此处共价或非共价彼此交联，从而形成微粒链20。同样，其他微粒链120，220等形成并移动到部位119，219等。在部位19，119等，在缓冲液贮存器2内，用含有亲和素的缓冲液交联微粒。

然后微粒链20，120等从部位19，119等迁移到部位21，121等。重要的是，以一种能够使链整齐堆积的方式来保持链的延伸和定向。这可通过以下方式来获得：即在该区域上设计微型程序电极或磁芯，以引导这些微粒链的运动，使它们与其他微粒链以一种有序的方式排列并堆积，从而在部位21，121等形成一个阵列。

最后，微粒链20，120等从部位21，121等移动并沉积到基片50的表面上，从而产生一个地址阵列。其中每个地址都包括一个不同的本体。实施例3：利用一个微阵列作为制备其他微阵列的模板

包括一个核酸序列阵列的微阵列可用作制备其他微阵列的模板(如下所述)。

如下制备模板微阵列：将多个独特的核酸序列结合到微粒上，并将微粒结合到基片上，从而每个独特的核酸序列都占据了基片上的一个独特地址。核酸的3’端被偶联到微粒上，而5’端远离微粒。在每个核酸序列的远端(即距离微粒最远的那一端)存在一个短的共同单链核酸序列，且其5’端远离微粒。

如下制备用于新阵列的基片：与共同序列互补的核酸序列被结合到微粒上，其中所述互补的核酸序列具有偶联到微粒上的5’端，还有3’远端。这些微粒结合到第二基片上的不同地址处。

在共同序列与它们的互补序列之间易于进行杂交的离子和缓冲液条件下，将这两个阵列彼此接触放置。

共同序列与其互补序列间杂交之后，这些阵列(仍处于邻近位置)被置于易于进行核苷酸聚合的条件下，通过在适当的pH、离子强度和阳离子浓度的条件下供给DNA聚合酶以及脱氧核苷三磷酸盐基片，而进行核苷酸的聚合反应(正如本领域的技术人员所公知的)。然后这两个阵列在本领域的技术人员所公知的适当条件下解链，从而将这两个微阵列分开，每个微阵列都含有单链核酸。

基于模板微阵列上的核酸序列通过聚合作用，在第二微阵列上产生了一个有序的新核酸序列阵列。这产生了一个与模板微阵列上的序列互补的核酸序列微阵列，其中新的核酸序列在5’端与共同序列的互补序列相连。

为了清楚地理解本发明的技术方案，业已借助于阐述和实施例更详细地描述了上述发明，但是本领域技术人员应当理解可在不脱离本发明精髓的基础上，进行多种改变和改进。因此上述描述和实施例并不是对本发明范围的限制。

Claims (53)

1、一种微阵列，其包括：

(a)一个基片，其中该基片用以下物质衍生化：

i)包括第一官能团的第一化合物，以及至少一层包括多个第二官能团的交联化合物，或者

ii)包括第一官能团的第一化合物，以及包括多个第二官能团的聚合膜；以及

(b)或者

i)一个具有至少一种感兴趣本体的群体，其中这个具有至少一种感兴趣本体的群体通过本体与第二官能团的偶联，而与基片上的一个不同地址缔合，或者

ii)一个微粒群，其中该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体，并且该微粒群通过第二官能团与微粒的偶联，而与基片上的一个不同地址缔合，从而该至少一种感兴趣的本体占据了基片上的一个不同地址。

2、根据权利要求1所述的微阵列，其中该微阵列包括多个具有至少一种感兴趣本体的群体或者微粒群。

3、根据权利要求1所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体选自于：核酸、多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。

4、根据权利要求3所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是核酸。

5、根据权利要求3所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是多肽。

6、根据权利要求3所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是细胞。

7、根据权利要求1所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是组合化学工艺过程的产物。

8、根据权利要求1所述的微阵列，其中多于一种类型的本体占据了基片上的一个不同的地址。

9、根据权利要求8所述的微阵列，其中每个地址包含至少一种多肽和至少一种核酸。

10、一种微阵列，其包括：

(a)一个基片；以及

(b)一个微粒群，其中该微粒群与基片上的一个不同地址缔合，并且该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体，该至少一种感兴趣的本体选自：多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸以及小分子；

从而该至少一种感兴趣的本体占据了基片上的一个不同地址。

11、根据权利要求10所述的微阵列，其中该微阵列包含多个的微粒群。

12、根据权利要求10所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是多肽。

13、根据权利要求10所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是细胞。

14、根据权利要求10所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是组合化学工艺过程的产物。

15、一种微阵列，其包括：

(a)一个基片；以及

(b)一个微粒群，其中每个微粒的直径都小于1μm，该微粒群与基片上的一个不同地址缔合，并且该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体，

从而该至少一种感兴趣的本体占据了基片上的一个不同地址。

16、根据权利要求15所述的微阵列，其中该微阵列包括多个的微粒群。

17、根据权利要求15所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体选自：核酸、多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。

18、根据权利要求17所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是核酸。

19、根据权利要求17所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是多肽。

20、根据权利要求17所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体是细胞。

21、一种微阵列，由以下方法制备：

(a)提供一个具有至少一种感兴趣本体的群体，其中这些本体任意偶联到微粒上；

(b)提供一个基片，其中该基片用能够偶联到感兴趣的本体或任意微粒上的活性化合物衍生化；

(c)使本体群与基片接触；以及

(d)激活基片上预期位点处的活性化合物，

从而使本体群在预期位点上被偶联到基片上。

22、根据权利要求21所述的微阵列，其中包括多个具有至少一种感兴趣本体的群体。

23、根据权利要求21所述的微阵列，其中该活性化合物由电磁辐射激活。

24、根据权利要求21所述的微阵列，其中预期部位由包括至少一个孔的掩模分离，其中所述孔与用于本体群的预期部位相对应。

25、根据权利要求21所述的微阵列，其中预期部位由光纤束分离。

26、根据权利要求21所述的微阵列，其中预期部位由微镜分离。

27、根据权利要求21所述的微阵列，其中本体与微粒偶联，并且基片用能够与微粒偶联的活性化合物衍生化。

28、根据权利要求21所述的微阵列，其中活性化合物为光活性化合物。

29、根据权利要求21所述的微阵列，其中该活性化合物是热活性粘合剂。

30、根据权利要求21所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体选自：核酸、多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。

31、一种用于构建微阵列的方法，其中该方法包括以下步骤：

(a)提供一个基片，其中该基片用以下物质衍生化：

i)包括第一官能团的第一化合物，以及至少一层包括多个第二官能团的交联化合物，或者

ii)包括第一官能团的第一化合物，以及包括多个第二官能团的聚合膜；

(b)提供或者

i)一个具有至少一种感兴趣本体的群体，或者

ii)提供一个微粒群，其中该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体；

(c)将本体或微粒群定域在基片上的不同地址处；以及

(d)被定域的本体或微粒群通过第二官能团与感兴趣的本体或微粒的偶联，而与基片上的其不同地址缔合。

32、根据权利要求31所述的微阵列，其中该至少一种感兴趣的本体选自：核酸、多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。

33、一种用于构建微阵列的方法，其中该方法包括以下步骤：

(a)提供一个具有至少一种感兴趣本体的群体，其中该本体任意偶联到微粒上；

(b)提供一个基片，其中该基片用能够偶联到感兴趣本体或任意微粒上的活性化合物衍生化；

(c)使本体群与基片接触；以及

(d)激活基片上预期位点处的活性化合物，

从而使本体群在预期位点处与基片偶联。

34、根据权利要求33所述的方法，其包含多于一个的具有至少一种感兴趣本体的群体。

35、根据权利要求33所述的方法，其中活性化合物由电磁辐射激活。

36、根据权利要求33所述的方法，其中预期部位由包括至少一个孔的掩模分离，该孔与用于本体群的预期部位相对应。

37、根据权利要求33所述的方法，其中预期部位由光纤束分离。

38、根据权利要求33所述的方法，其中预期部位由微镜分离。

39、根据权利要求33所述的方法，其中该活性化合物是光活性化合物。

40、根据权利要求33所述的方法，其中该活性化合物是热活性粘合剂。

41、根据权利要求33所述的方法，其中该至少一种感兴趣的本体选自：核酸、多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。

42、一种制备包括核酸序列的微阵列的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供包括以下组分的第一微阵列：

(i)第一基片；

(ii)具有至少一种核酸序列的第一群体，其中该至少一种核酸序列在其远端包括第一核酸杂交序列，该第一核酸序列任意偶联到微粒上，并且核酸序列群与第一基片上的一个不同地址缔合；

(b)提供包括以下组分的第二微阵列：

(i)第二基片；

(ii)第二杂交序列群，其中该第二杂交序列与第一杂交序列互补，第二杂交序列群被任意偶联到微粒上，并且该杂交序列群与第二基片上的一个不同地址缔合；

(c)在杂交条件下使第一和第二微阵列互相接触，从而使第一和第二杂交序列杂交；

(d)使所杂交的第一和第二微阵列暴露于核苷酸聚合的条件下，从而将所述的来自第一微阵列之至少一种核酸序列用作制备第二微阵列上的互补核酸序列的模板。

43、根据权利要求42所述的方法，其中第一和第二杂交序列具有至少5个核苷酸的长度。

44、根据权利要求42所述的方法，其中至少一种核酸序列是DNA序列。

45、根据权利要求42所述的方法，其中至少一种核酸序列是RNA序列。

46、一种用于在一个基片上制备微阵列的多个拷贝的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供一微粒群，其中该微粒群上偶联有至少一种感兴趣的本体；

(b)提供一个用于微阵列的多个拷贝的基片；

(c)在基片上待制备的每个微阵列的所需位点上将微粒群定域到基片上；以及

(d)在基片上待制备的每个微阵列的所需位点上使微粒群与基片缔合。

47、根据权利要求46所述的方法，其中微粒通过光活化与基片缔合。

48、根据权利要求46所述的方法，其中微粒通过热活性粘合剂与基片缔合。

49、根据权利要求46所述的方法，其中微粒通过自动分配定域到预期部位上。

50、根据权利要求46所述的方法，其中微粒通过微流定域到预期部位上。

51、根据权利要求46所述的方法，其中微粒通过电场定域到预期部位上。

52、根据权利要求46所述的方法，其中微粒通过磁场定域到预期部位上。

53、根据权利要求46所述的方法，其中该至少一种感兴趣的本体选自：核酸、多肽、碳水化合物、细胞、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。