CN103597350A - 用于固定配体的新型粘合表面 - Google Patents

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CN103597350A CN201280005398.7A CN201280005398A CN103597350A CN 103597350 A CN103597350 A CN 103597350A CN 201280005398 A CN201280005398 A CN 201280005398A CN 103597350 A CN103597350 A CN 103597350A
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本杰明·科尔吉耶
加埃利·莱戈夫
席琳·曼东
洛奇·布卢姆
克利斯朵夫·马奎特
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French National Academy Of Applied Sciences
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
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French National Academy Of Applied Sciences
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
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Abstract

本发明的主题是一种复合物，包含：具有至少两个表面的载体，其中之一具有粘合剂涂层，至少一种固定在该粘合剂表面上的配体。在本发明框架内实现的配体选自蛋白质、肽、抗体、核酸、糖或寡糖、毒素、杀虫剂、激素、除草剂、杀真菌剂和神经递质。

Description

用于固定配体的新型粘合表面
技术领域
本发明涉及包含固定在涂布于载体表面之一（enduit sur l’une des facesdu support）的粘合剂上的至少一种配体的新型复合物(complexe)。
背景技术
使用固定在载体上的配体是常见的，尤其在诊断试验领域和在生物工艺学领域。这些系统允许使用大量的分子，如在用于DNA或RNA分析的芯片的情况下。
已经广泛描述了配体在载体上的固定（Sambrook等人，1989）。该固定方法被证实是困难、昂贵、漫长和部分有效的。它们基于吸附、离子或共价键合、或在凝胶或聚合物类型的基质中捕集配体。
已经开发了方法，由此专利申请WO 2005/114417描述了使用施加到粘性载体上的球状蛋白层，随后向球状蛋白的层上施加交联剂，该蛋白质催化剂通过与交联剂的反应固定在该表面上。
文献WO 03/072  752描述了能够以干燥形式、高点密度固定蛋白质并具有高信噪比的在带有聚偏二氟乙烯（PVDF）的疏水性和聚合层的刚性基底上制得的蛋白质芯片。
发明内容
本发明能够通过使用包含具有至少两个表面且其中一个表面具有粘合剂和固定在所述粘合表面上的至少一种配体的涂层的复合物克服了上述缺陷。
在本发明的上下文中，沉积在该粘合表面上的配体可以具有蛋白质性质：蛋白质、寡肽、多肽、抗体，具有核酸性质：DNA、RNA、寡核苷酸（即引物），其还有可能是糖（寡糖或多糖）或小分子，其任选是合成的，如毒素、杀虫剂、激素、除草剂、杀真菌剂或神经递质。
由此，当配体为蛋白质类型时，无需对粘合表面进行预处理。
所用载体可以由玻璃或塑料板、聚酯膜或可以用粘合剂涂布的任何其它材料组成。
在本发明的特定实施方案中，该载体在其两个表面上都具有粘合剂涂层（图1）。
粘合剂是普通粘性聚合物，其可以具有活化表面。可以提及的实例包括非反应性粘合剂，如苯乙烯-丁二烯共聚物、丁腈橡胶、聚(乙酸乙烯酯)及其聚合物、聚乙烯醇缩乙醛，压敏粘合剂如聚丙烯酸酯、硅橡胶、聚(乙烯醚)，或者反应性粘合剂如双组分聚氨酯粘合剂、环氧粘合剂、厌氧性丙烯酸类或氰基丙烯酸酯。
例如，已经使用下列材料：
-3M 7966WDL（粘合剂3MTM 200MP）
-5 Stars Double Sided Display Tape Polypropylene，
3MTMOptically Clear Overlaminating Film 76991，
Ultra Clear Removable Overlaminating Film 76991。
选择该配体以使得与规定的抗配体(antiligand)特异性相互作用。取决于基底的性质和固定方式（通过亲合力、共价等等）。可以将该配体官能化以获得更好的固定。
各种配体可以同时基质化（matrixed）到同一载体上并且该基质的设计可以进一步包括相同探针的若干复制品（图1）。
对于蛋白质配体，无需对粘合剂表面进行预处理，配体可以直接沉积（点样步骤（étape de spotting））到该表面上。
对于寡核苷酸配体（ligands oligonucléotidiques），可以进行使用多官能交联剂（优选戊二醛）的表面预处理步骤以改善固定的配体的活性。
由此，根据另一方面，本发明的主题是包含载体的复合物，所述载体的表面之一上具有粘合剂涂层，所述粘合表面例如通过交联剂的作用被官能化。在一种特定实施方案中，该配体也被官能化。
本发明的主题还是制备上述复合物的方法。
在本发明的特定实施方案中，配体在缓冲液，例如盐水缓冲液（根据用作配体的生物分子的性质选择）中稀释并使用例如非接触型压电点样仪或通过将涂布的载体浸渍在包含该配体的溶液中来沉积在涂布的载体的表面上。
当配体溶液（ligand en solution）以液滴形式沉积时，沉积液滴的尺寸以及由此在表面上形成的斑点的尺寸（50-1000微米）、斑点密度（每平方毫米1-25个）以及基质的格式可以随着期望的应用领域和生物分子的性质而改变。
官能化载体的步骤可以在配体沉积前进行，例如用交联剂如戊二醛处理该粘合表面。
取决于所述应用领域，可以在沉积该配体和任选在室温下干燥的步骤后进行后处理步骤。该后处理步骤可以由加热（例如在163℃下1分钟）、洗涤（盐水缓冲液等等）和/或饱和（以减少背景噪音）该复合物组成。
本发明的复合物可用于制备尤其用于分析的设备。
此类设备包含基本刚性的载体（support substantiellement rigide），所述载体包含至少一个限定（délimitant）包含至少两个孔口（ouvertures）的内部腔室的孔，所述孔口的至少一个被本发明的复合物密封。
此类设备可以取通常用于诊断试验或生物工艺学领域的12-、24-或96-孔板形式或微流体网络形式。
制备此类设备的方法包括将本发明的复合物密封到载体上以便封闭该腔室的至少一个所述孔口，该粘合表面包含朝向该腔室内部取向的配体。
用配体改性的该粘合表面可以容易地与用于产生准备使用的分析工具的各种类型材料组装（图2和3）。
例如，粘性载体可以与无底96孔板组装以产生常规用于分析目的的固体有底板。
该粘性载体也可以与各种微流体网络连接，所述微流体网络由通道、流动池或混合器组成。组装的微流体部件可以由任何可用于此类应用的材料组成（玻璃、硅、塑料和其它聚合物材料）。
本发明的主题还是检测和/或定量抗配体的方法，包括使用如上所述的设备或复合物。在使得配体与抗配体之间相互作用的条件下放置所述复合物或设备以便与可能含有抗配体的样品接触，任选加入标记的检测分子，并最后检测和/或定量由配体与抗配体之间相互作用产生的信号。
在此类方法中，抗配体可以源自于生物样品如血清、血液或血浆，环境样品如水、气体、空气或土壤的样品，或者来自于农产品行业的样品如食品。
除了由配体/抗配体相互作用组成的关键步骤之外，可以根据用于标记和检测该相互作用的策略本身的要求增加一个或多个步骤（图4）。
在这种情况下，例如，如果需要附加的标记步骤（例如，在生物素组靶与抗生蛋白链菌素分子之间的相互作用），可以采用两种策略：
-两步骤方案：
1）培育抗配体溶液（配体/抗配体相互作用）；
2）培育标记的分子的溶液（例如共轭的抗生蛋白链菌素）；
-一步骤方案：
1）培育含有抗配体与标记的分子的单一预混合溶液。
根据应用和要求，可以使用各种检测方法，例如：
-使用标记的比色法，例如：
-采用碱性磷酸酶/BCIP的指示剂体系；
-采用辣根过氧化酶-ABTS的指示剂体系；
-金粒子，等等；
-使用如下的标记的化学发光法：
-辣根过氧化酶–具有化学发光底物的体系；
-碱性磷酸酶–具有化学发光底物的体系。
也可以使用放射线照相术或放射性的检测和/或定量。
附图描述
图1：本发明的复合物的示意图，显示了（A）载体（S），其一个表面涂有粘合剂（ad），配体（L）固定在粘合剂上；（B）载体（S），其两个表面涂有粘合剂（ad），配体（L）固定在两个表面之一上。
图2：本发明的设备的组件的示意图（A）微流体网络，（B）96-孔板。
图3：本发明的微流体网络的组件的示意图。
图4：检测样品中抗配体的过程的示意图。
图5：表示检测信号的强度与样品中寡核苷酸（抗配体）浓度之间相互关系的曲线。
图6：表示检测信号的强度与样品中CRP（抗配体）浓度之间相互关系的曲线。
图7：表示检测信号的强度与样品中CRP（抗配体）浓度之间相互关系的曲线。
实施例
实施例1
在粘性微量滴定板上的寡核苷酸的基质（用于定量检测抗配体）
使用一对互补序列的合成寡核苷酸作为配体与抗配体，其显示本发明可用于分析和用于定量检测寡核苷酸序列。
将配体点样到粘性载体表面上并用互补序列的寡核苷酸（抗配体）杂交。生物素-抗生蛋白链菌素碱性磷酸酶类型的显色体系用于信号的比色显色。展示了测得信号的强度与抗配体浓度之间的相互关系（图5）。
·探针的点样
预处理
载体3M 7966WDL用在0.1M的pH5磷酸盐缓冲液中的1%戊二醛溶液在37℃下预处理1小时。载体随后用蒸馏水洗涤以准备用于固定该探针。
点样
该配体（合成寡核苷酸(序列表编号1，5’-氨基酸改性)）在盐水乙酸盐缓冲液（0.1M乙酸盐，0.1M KCl，0.25毫克/毫升溴酚蓝，pH=5.5）中稀释已达到50微摩尔/升的最终浓度。使用压电点样仪（BioChip Arrayer BCA1，PerkinElmer）将该溶液点样到粘性3M 7966WDL的表面上。基底在开放空气中在室温下干燥。制得的斑点具有大约100微米的直径和每平方毫米1至25个点的斑点密度。
后处理
在基质化配体和在室温下干燥载体后，如下进行后处理：载体在163℃下加热1分钟，随后通过添加PBS缓冲液进行洗涤并随后在37℃下用PBSTA缓冲液（0.1M磷酸盐，0.5M NaCl，pH=7.4，0.1%v/v Tween20，1%w/v BSA）培育15分钟以饱和该表面。
·组装
点样的粘合剂随后与无底96-孔板组装以制造标准用途的固体有底板。该载体的粘性在此是能够通过在一个挨一个放置的两个部件上施加温和压力而进行简单组装所必需的（图2）。
·测试
在PBSTA缓冲液中制备与碱性磷酸酶-抗生蛋白链菌素共轭物（1微克/毫升）混合的不同浓度的抗配体（序列表编号2）溶液。在各孔中放置200微升所得溶液，该组件随后在点样表面上在37℃下培育30分钟。随后在室温下用1毫升PBS溶液洗涤该粘性载体。
·显色(révélation)
100微升BCIP/NBT（4-溴-5-氯代吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑）溶液加入到该板的孔中并在37℃下培育以显色该信号（大约30分钟）。该孔随后用1毫升PBS洗涤。
一旦孔底部干燥，使用水平办公扫描仪（HP）进行图像采集。展示了测得信号的强度与抗配体浓度之间的相互关系（图5）。
实施例2应用于救护地点诊断的夹层型免疫试验法用粘性板上的蛋白质基质
在其中用蛋白质（配体）微阵列I官能化该粘性载体的情况下，本发明可以达到定量血清学试验的性能，所述定量血清学试验用于救护地点诊断类型的应用。
为了评价此类定量试验的可靠性，使用下列体系：为了使用相应靶向生物素标记抗体充当用于检测CRP的探针，在载体上固定抗-CRP抗体。生物素-抗生蛋白链菌素碱性磷酸酶型显色体系用于信号的比色显色。展示了测得信号的强度与靶抗体（抗配体）浓度之间的相互关系（图6）。
·配体的点样
点样
使用压电点样仪（BioChip Arrayer BCA1，PerkinElmer）将浓度为500微克/毫升的抗-CRP抗体在乙酸盐缓冲液（0.1M乙酸盐，0.1M KCl，0.25毫克/毫升溴酚蓝，pH=5.5）中的溶液点样到3M 7966WDL型的粘合剂表面上。不需要对该表面进行预处理。该表面在室温下干燥30分钟。制得的斑点具有大约100微米的直径和每平方毫米1至25个点的斑点密度。
后处理
在微阵列的基质化和在室温下干燥载体后，如下进行后处理：载体在+163℃下加热1分钟，随后通过添加PBS缓冲液进行洗涤并随后在37℃下用PBSTA缓冲液（0.1M磷酸盐，0.5M NaCl，pH=7.4，0.1%v/v Tween20，1%w/v BSA）培育15分钟以饱和该表面。
·组装
点样的粘合剂随后与无底96-孔板组装以制造标准用途的固体有底板。该载体的粘性在此是能够通过在一个挨一个放置的两个部件上施加温和压力而进行简单组装所必需的（图2）。
·测试
在PBSTA缓冲液中制备靶蛋白质（CRP）、生物素-抗体共轭物（几种浓度）与碱性磷酸酶-抗生蛋白链菌素共轭物（1微克/毫升）的混合溶液。在各孔中沉积200微升所得溶液，该整体随后在37℃下培育30分钟。随后在室温下用1毫升PBS溶液洗涤该粘性载体。
·显色
100微升BCIP/NBT（4-溴-5-氯代吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑）溶液加入到该板的孔中并在37℃下培育以显色该信号（大约30分钟）。该孔随后用1毫升PBS洗涤。
一旦孔底部干燥，使用水平办公扫描仪（HP）进行图像采集。在图6中给出了所得图像的实例。
实施例3在组装的微流体系统中在应用于救护地点诊断的夹层型免疫试验法用粘性载体上的蛋白质基质
·配体的点样
点样
使用压电点样仪（BioChip Arrayer BCA1，PerkinElmer）将浓度为500微克/毫升的抗-CRP抗体在乙酸盐缓冲液（0.1M乙酸盐，0.1M KCl，0.25毫克/毫升溴酚蓝，pH=5.5）中的溶液点样到3M 7966WDL型的粘合剂表面上。不需要对该表面进行预处理。该表面在室温下干燥30分钟。制得的斑点具有大约100微米的直径和每平方毫米1至25个点的斑点密度。
后处理
在微阵列的基质化和在室温下干燥载体后，如下进行后处理：载体在+163℃下加热1分钟，随后通过添加PBS缓冲液进行洗涤并随后在37℃下用PBSTA缓冲液（0.1M磷酸盐，0.5M NaCl，pH=7.4，0.1%v/v Tween20，1%w/v BSA）培育15分钟以饱和该表面。
·组装
基质化蛋白质的粘性载体随后与预先制造的由PVC/3M 7966WDL微通道或由蚀刻获得的玻璃微通道所组成的微流体系统组装。该载体的粘性在此是能够通过在一个挨一个放置的两个部件上施加温和压力而进行简单组装所必需的（图3）。
·测试
在PBSTA缓冲液中制备靶蛋白质（CRP，抗配体）、生物素-抗体共轭物（几种浓度）与碱性磷酸酶-抗生蛋白链菌素共轭物（1微克/毫升）的混合溶液。将50微升所得溶液注入该微流体网络中（图7），该组件随后在37℃下培育1小时。组装的微流体系统随后用200毫升PBS缓冲液洗涤。
·显色
将50微升BCIP/NBT（4-溴-5-氯代吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑）溶液注入到该组装的微流体系统中并在37℃下培育以显色该信号（大约30分钟）。该通道随后用1毫升PBS洗涤。一旦该组件干燥，使用水平办公扫描仪（HP）进行组装的微流体系统的图像采集。在图7中给出了测得信号与抗配体浓度之间的相互关系。
实施例4
在粘性微量滴定板上的寡核苷酸基质（用于定量测定抗配体）
本发明可以用于分析和定量检测寡核苷酸序列（参见实施例1）。
在本实施例中，将配体点样到粘性载体的表面上并用互补序列的寡核苷酸（抗配体）杂交。生物素-抗生蛋白链菌素碱性磷酸酶类型的显色体系用于信号的比色显色（colorimetric revelation）
·探针的点样
预处理
3M 7966WDL载体用在0.1M的pH5磷酸盐缓冲液中的1%戊二醛溶液在37℃下预处理1小时。载体随后用蒸馏水洗涤以准备用于固定该探针。
点样
该配体（合成寡核苷酸(序列表编号1，5’-氨基酸改性)）在盐水乙酸盐缓冲液（0.1M乙酸盐，0.1M KCl，0.25毫克/毫升溴酚蓝，pH=5.5）中稀释已达到50微摩尔/升的最终浓度。使用压电点样仪（BioChip Arrayer BCA1，PerkinElmer）将该溶液点样到3M 7966WDL粘合剂的表面上。基底在开放空气中在室温下干燥。制得的斑点具有大约100微米的直径和每平方毫米1至25个点的斑点密度。
·组装
点样的粘合剂随后与无底96-孔板组装以制造标准用途的固体有底板。该载体的粘性在此是能够通过在一个挨一个放置的两个部件上施加温和压力而进行简单组装所必需的（图2）。
·测试
在PBSTA缓冲液中制备与碱性磷酸酶-抗生蛋白链菌素共轭物（1微克/毫升）混合的不同浓度的抗配体（序列表编号2）溶液。在各孔中沉积200微升所得溶液，该整体随后在点样表面上在37℃下培育30分钟。随后在室温下用1毫升PBS溶液洗涤该粘性载体。
·显色
100微升BCIP/NBT（4-溴-5-氯代吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑）溶液加入到该板的孔中并在37℃下培育以显色该信号（大约30分钟）。该孔随后用1毫升PBS洗涤。
一旦孔底部干燥，使用水平办公扫描仪（HP）进行图像采集。展示了测得信号的强度与抗配体浓度之间的相互关系（图8）。
Figure IDA00003510235100011

Claims (16)

1.复合物，包含：
-具有两个表面的载体，其中一个表面具有粘合剂涂层，
-至少一种配体，
所述固体固定在该粘合表面上，其特征在于粘合剂选自压敏粘合剂如聚丙烯酸酯、硅橡胶、聚乙烯醚，或非反应性粘合剂如苯乙烯-丁二烯共聚物、丁腈橡胶、聚(乙酸乙烯酯)及其聚合物、聚乙烯醇缩乙醛，或反应性粘合剂如双组分聚氨酯粘合剂、环氧粘合剂、厌氧性丙烯酸类或氰基丙烯酸酯。
2.如权利要求1所要求保护的复合物，其特征在于该配体选自蛋白质、肽、抗体、核酸、糖或寡糖、毒素、杀虫剂、激素、除草剂、杀真菌剂和神经递质。
3.如前述权利要求之一所要求保护的复合物，所述粘合表面被官能化，例如通过交联剂的作用。
4.如权利要求1至3之一所要求保护的复合物，其中该配体被官能化。
5.如前述权利要求之一所要求保护的复合物，其特征在于粘合剂还涂布在该载体的另一表面上。
6.包含刚性载体的分析设备，所述载体包含至少一个限定包含至少两个孔口的内部腔室的孔，该腔室的所述孔口的至少一个被如权利要求1至5任一项所要求保护的复合物密封。
7.如权利要求6所要求保护的设备，选自分析板，例如12-、24-或96-孔板或微流体网络。
8.如权利要求1至5所要求保护的复合物的用途，用于制备如权利要求6和7之一所要求保护的分析设备。
9.制备如权利要求1至5之一所要求保护的复合物的方法，包括下列步骤：
a）将该配体稀释在合适的溶液中，例如盐水缓冲液；
b）将配体溶液沉积到该粘合剂的表面上。
10.如权利要求9所要求保护的制备方法，包括预处理该粘合表面的步骤，例如用交联剂预处理该粘合表面，该交联剂如戊二醛。
11.制备如权利要求9或11所要求保护的复合物的方法，包括，例如于室温，干燥由此沉积的液体的附加步骤c）。
12.如权利要求9至11任一项所要求保护的制备方法，包括加热、洗涤和/或饱和的附加步骤d）。
13.制备如权利要求6或7所要求保护的设备的方法，包括将如权利要求1至5之一所要求保护的复合物与该载体密封以便封闭该腔室的至少一个所述孔口，该粘合表面包含朝向该腔室内部取向的配体。
14.检测和/或定量抗配体的方法，包括下列步骤：
a）具有如权利要求6或7所要求保护的设备或如权利要求1至5之一所要求保护的复合物，
b）在使得配体与抗配体之间相互作用的条件下放置该设备或该复合物以便与可能含有抗配体的样品接触，和
c）任选加入标记的检测分子，
d）检测和/或定量由配体与抗配体之间相互作用产生的信号。
15.如权利要求14所要求保护的检测和/或定量抗配体的方法，其中该抗配体来自于生物样品如血清、血液或血浆，环境样品如水、气体、空气或土壤的样品，或者来自于农产品行业的样品如食品。
16.如权利要求14和15之一所要求保护的检测和/或定量抗配体的方法，通过比色法、荧光、化学发光、放射线照相术或放射性的检测。
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