WO2012095614A1 - Nouvelles surfaces adhésives pour l'immobilisation de ligands - Google Patents

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WO2012095614A1
WO2012095614A1 PCT/FR2012/050085 FR2012050085W WO2012095614A1 WO 2012095614 A1 WO2012095614 A1 WO 2012095614A1 FR 2012050085 W FR2012050085 W FR 2012050085W WO 2012095614 A1 WO2012095614 A1 WO 2012095614A1
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ligand
adhesive
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complex
support
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PCT/FR2012/050085
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Benjamin CORGIER
Gaëlle Legoff
Céline MANDON
Loïc BLUM
Christophe Marquette
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Centre National De La Recherche Scientifique
Universite Claude Bernard
Institut National Des Sciences Appliquees De Lyon
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    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention may be subject to a further com plete comprising at least one ligand immobilized on an adhesive coated on one of the faces of the support.
  • ligands immobilized on a support is common, particularly in the field of diagnostic tests or in the field of biotechnology. These systems allow the use of a large number of molecules, as in the case of chips used for DNA or RNA analysis.
  • Immobilization of ligands on a support has been widely described (Sambrook et al., 1989). Immobilization methods can be difficult, expensive, time consuming and partially effective. They are based on adsorption, ionic or covalent bonds or the trapping of ligands in a gel or polymer type matrix.
  • patent application WO 2005/1 14417 describes the use of a layer of globular proteins applied to an adhesive support, a crosslinking agent then being applied to the layer of globular proteins, the protein catalysts being immobilized on the surface by reaction with the crosslinking agent.
  • WO 03/072752 discloses protein chips made on a rigid substrate on which there is a hydrophobic and polymeric layer of polyvinylidene difluoride (PVDF) allowing the immobilization of proteins in the dry state, a high density of spots and having a high signal-to-noise ratio.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the present invention makes it possible to overcome the disadvantages described above by using a complex comprising a support having at least two faces, one of which is provided with a coating of an adhesive and at least one a ligand immobilized on said adhesive surface.
  • the ligand deposited on the adhesive surface may be of protein nature: protein, oligopeptide, polypeptide, antibody, of nucleic nature: DNA, RNA, oligonucleotide (ie pri me), it can be ag it also includes des olers (oligosaccharides or polysaccharides) or small, possibly synthetic molecules such as toxins, pesticides, hormones, herbicides, fungicides, or neurotransmitters.
  • des olers oligosaccharides or polysaccharides
  • small, possibly synthetic molecules such as toxins, pesticides, hormones, herbicides, fungicides, or neurotransmitters.
  • the support used may consist of a plate of glass, plastic, a polyester film or any other material that may be coated with an adhesive.
  • the support is provided with a coating of an adhesive on two of its faces ( Figure 1).
  • the adhesive is a common adhesive polymer that can have an activated surface.
  • non-reactive adhesives such as styrene-butadiene copolymers, nitrile gums, polyvinyl acetate and its polymers, polyvinyl acetals, pressure-sensitive adhesives such as polyacrylates and silicone gums.
  • poly (vinyl ether) or reactive adhesives as two-component polyurethane adhesives, epoxy adhesives, anaerobic acrylics, or cyanoacrylates.
  • Ligands are selected to specifically interact with defined anti-ligands. Depending on the nature of the substrate and the immobilization strategy (by affinity, covalent, etc.), the ligands can be functionalized in order to obtain better immobilization.
  • Different ligands can be dyed simultaneously on the same support and the design of the matrix can also include several replicas of the same probe ( Figure 1).
  • Figure 1 For protein ligands, no pretreatment of the surface of the adhesive is necessary, and the ligands can be deposited (spotting step) directly onto the surface.
  • a surface pretreatment step using a multifunctional crosslinking agent can be implemented to improve the activity of the immobilized ligands.
  • a multifunctional crosslinking agent preferably glutaraldehyde
  • the subject of the invention is a complex comprising a support, one of whose faces is provided with a coating of an adhesive, said adhesive surface being functionalized, for example by the action of an agent. crosslinking.
  • the ligand is also functionalized.
  • the present invention also relates to a process for preparing the complexes described above.
  • the ligands are diluted in a buffer, for example, a saline buffer (selected according to the nature of the biomolecules used as ligands) and deposited on the surface of the coated support using, for example a non-contact type piezoelectric spotter or by immersing the coated support in a solution comprising the ligands.
  • a buffer for example, a saline buffer (selected according to the nature of the biomolecules used as ligands) and deposited on the surface of the coated support using, for example a non-contact type piezoelectric spotter or by immersing the coated support in a solution comprising the ligands.
  • the size of the drops deposited and therefore the size of the spots formed on the surface 50-1000 ⁇
  • the density of the spots (1 -25 per mm 2 ) and the The size of the matrix can be modified according to the desired field of application and the nature of the biomolecules.
  • a functionalization step of the support may be implemented before the deposition of the ligands, such as, for example, the treatment of the adhesive surface with a crosslinking agent such as glutaraldehyde.
  • a post-treatment step may be implemented after the ligand deposition steps and optionally drying at room temperature.
  • This post-treatment step may consist of heating (for example at 1 63 ° C. for one minute), washing (saline buffers, etc.) and / or saturating (to reduce the background noise) the complex.
  • the complexes according to the invention can be used for the preparation of devices including analysis.
  • Such devices comprise a substantially rigid support comprising at least one well delimiting an internal cavity comprising at least two openings, at least one of which is sealed by the complex according to the invention.
  • Such devices may take the form of 12, 24 or 96 well plates or microfluidic networks commonly used in the field of diagnostic tests or in the field of biotechnology.
  • the method for preparing such devices consists of sealing the complex according to the invention to the support so as to close at least one of said openings of the cavity, the adhesive surface comprising the ligands being oriented towards the inside of the cavity.
  • the ligand-modified adhesive surface can be easily assembled with various types of materials in order to generate ready-to-use analytical tools ( Figures 2 and 3).
  • the adhesive backing may be assembled with a bottomless 96-well plate to generate a solid-bottomed plate conventionally used for analytical purposes.
  • the adhesive support can also be interfaced with various microfluidic networks, composed of channels, flow cells or mixers.
  • the assembled microfluidic part can be made of any material available for this kind of application (glass, silicon, plastics, and other polymeric materials).
  • the present invention also relates to a method for detecting and / or quantifying an anti-ligand comprising the implementation of a device or a complex as described above. Said complex or device is brought into contact with a sample that may contain an anti-ligand under conditions allowing the interaction between the ligand and the anti-ligand, optionally a labeled detection molecule is added and finally the signals generated by the interaction between the ligand and the anti-ligand are detected and / or quantified.
  • the anti-ligand can come from a biological sample such as serum, blood, or plasma, an environmental sample such as a sample of water, gas, air, soil or a sample from of the agri-food industry as food.
  • a biological sample such as serum, blood, or plasma
  • an environmental sample such as a sample of water, gas, air, soil or a sample from of the agri-food industry as food.
  • one or more steps may be added according to the imperatives inherent in the tagging and detection strategies of the interaction ( Figure 4).
  • an additional labeling step eg interaction between the biotin moiety of a cell and a streptavidin molecule
  • two strategies can be used:
  • Alkaline phosphatase with chemiluminescent substrate Alkaline phosphatase with chemiluminescent substrate.
  • Radiogra phy or radioactivity detection and / or quantification can also be used.
  • Figure 1 schematic representation of the complex according to the invention, having (A) the support (S), a surface is coated with adhesive (ad) on which are immobilized ligands (L); (B) the support (S), two faces of which are coated with adhesive (ad), the ligands (L) being immobilized on one of the two faces.
  • Figuet 2 schematic representation of the assembly of devices according to the invention
  • A a microfluidic network
  • B a 96-well plate
  • Figu re 3 schematic representation of the assembly of a microfluidic network according to the invention.
  • Figure 4 schematic representation of the method of detecting an anti-ligand in a sample.
  • Figure 5 Curve showing the correlation between the intensity of the detected signal and the concentration of oligonucleotide (anti-ligand) in the sample.
  • Figure 6 Curve showing the correlation between the intensity of the detected signal and the concentration of CRP (anti-ligand) in the sample.
  • Figure 7 Curve showing the correlation between the intensity of the detected signal and the concentration of CRP (anti-ligand) in the sample.
  • the ligands were spotted on the surface of the adhesive support and hybridized with an oligonucleotide of complementary sequence (anti-ligand).
  • anti-ligand an oligonucleotide of complementary sequence
  • a biotin - streptavidin phosphatase alkaline revealing system was used for the colorimetric revelation of the signal.
  • a correlation between the intensity of the measured signal and the anti-ligand concentration has been demonstrated ( Figure 5).
  • a 3M 7966WDL support was pretreated with 1% glutaraldehyde solution in 0.1 M pH 5 phosphate buffer for 1 hour at room temperature. 37 ° C. The supports were then washed with distilled water in order to be ready for use for the immobilization of the probes.
  • This solution was spotted on the surface of a 3M 7966WDL adhesive using a piezoelectric spotter (BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer). substrate was dried in the open air and at room temperature. The spots produced have a diameter of about 100 ⁇ and the density of spots varies from 1 to 25 spots per mm 2 .
  • the spotted adhesives are then assembled with a bottomless 96-well plate to generate a solid bottom plate of conventional use.
  • the adhesive properties of the support are here essential in order to allow easy assembly achieved by exerting a low pressure on the two parts affixed against each other ( Figure 2). ⁇ Trial
  • Solutions of anti-ligands (SEQ ID No. 2) at different concentrations mixed with the alkaline phosphatase-streptavidin conjugate ( 1 ⁇ g.mL- 1 ) were prepared in PBSTA buffer. 200 ⁇ l of the resulting solution were deposited in each well. then the whole was incubated on the spotted surface for 30 minutes at 37 ° C. Media Adhesives were then washed at room temperature with 1 ml of PBS.
  • the present invention allows the implementation of q uantitative serological tests, which can be used for point-of-care diagnostic applications.
  • Anti-CRP antibodies were immobilized on the support in order to serve as probes for the detection of CRP using biotinylated antibodies. corresponding targets.
  • a biotin-streptavidin phosphatase Alcal ine-type revealing system was used for the colorimetric revelation of the signal.
  • a correlation between the intensity of the measured signal and the concentration of target antibody (anti-ligand) has been demonstrated ( Figure 6). ⁇ Spotting ligands
  • a solution of anti-CRP antibody at a concentration of 500 g.mL -1 in an acetate buffer (0.1M acetate, 0.1M KCl, bromophenol blue 0.25mg / m L pH 5.5) was spotted on the surface of a 3M 7966WDL adhesive using a piezoelectric spotter (BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer). No pretreatment of the surface is required. The surface was dried for 30 minutes at room temperature. The spots produced have a diameter of the order of 100 ⁇ in diameter and the density of spots may vary from 1 to 25 per mm 2 .
  • the spotted adhesives are then assembled with a bottomless 96-well plate to generate a solid bottom plate of conventional use.
  • the adhesive properties of the support are here essential in order to allow easy assembly achieved by exerting a low pressure on the two parts affixed against each other ( Figure 2).
  • the post-treatment is carried out as follows: the supports are heated at + 163 ° C. for 1 minute, then washed by addition of PBS buffer and then incubated at 37 ° C. for 15 minutes with PBSTA buffer (0.1M phosphate, 0.5M NaCl, pH 7.4, Tween20 0.1% v / v, BSA 1% w / v) to saturate the surface.
  • PBSTA buffer 0.1M phosphate, 0.5M NaCl, pH 7.4, Tween20 0.1% v / v, BSA 1% w / v
  • the adhesive support of matrix proteins was assembled with a precursor microfluidic system consisting of micro-channels made of PVC / 3M 7966WD L or bi in half cracks of glass obtained by etching.
  • the adhesive properties of the support are essential here to allow easy assembly achieved by exerting a low pressure on the two parts affixed against each other (Figure 3).
  • Oligonucleotide matrix on microtitration adhesive plates for the quantitative detection of anti-ligand
  • the present invention can be applied to the analysis and quantitative detection of oligonucleotide sequences (see Example 1).
  • the ligands were spotted on the surface of the adhesive support and hybridized with an oligonucleotide of complementary sequence (anti-ligand).
  • anti-ligand an oligonucleotide of complementary sequence
  • a biotin - streptavidin phosphatase alkaline revealing system was used for the colorimetric revelation of the signal.
  • a 3M 7966WDL carrier was pretreated with 1% glutaraldehyde solution in 0.1 M pH 5 phosphate buffer for 1 hour at 37 ° C. The supports were then washed with distilled water in order to be ready for use for the immobilization of the probes.
  • This solution was spotted on the surface of a 3M 7966WDL adhesive using a piezoelectric spotter (BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer). substrate was dried in the open air and at room temperature. The spots produced have a diameter of about 100 ⁇ and the density of spots varies from 1 to 25 spots per mm 2 .
  • Solutions of anti-ligands (SEQ ID No. 2) at different concentrations mixed with the alkaline phosphatase-streptavidin conjugate ( 1 ⁇ g.mL- 1 ) were prepared in PBSTA buffer. 200 ⁇ l of the resulting solution were deposited in each well. then the whole was incubated on the spotted surface for 30 minutes at 37 ° C. The adhesive supports were then washed at room temperature with 1 mL of PBS solution.

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Abstract

La présente invention a pour objet un complexe comprenant: un support pourvu d'au moins deux faces dont l'une est pourvu d'une enduction d'un adhésif,au moins un ligand ledit ligand étant immobilisé sur la surface adhésive. Le ligand mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est choisi parmi les protéines, peptides, anticorps, acides nucléiques, sucres ou oligosaccharides, les toxines, pesticides, hormones, herbicides, fongicides, neurotransmetteurs.

Description

Nouvelles surfaces adhésives pour l'immobilisation de ligands
La présente invention a pou r objet u n nouveau com pl exe comprenant au moins un ligand immobilisé sur un adhésif enduit sur l'une des faces du support.
L'utilisation de ligands immobilisés sur un support est courante, notamment dans le domaine des tests diagnostiques ou dans le domaine des biotechnologies. Ces systèmes permettent l'utilisation d'un grand nombre de molécules, comme dans le cas des puces utilisées pour l'analyse ADN ou ARN.
L'immobilisation de ligands sur un support a été largement décrite (Sambrook et al. 1989). Les méthodes d'immobilisation peuvent s'avérer difficiles, coûteuses, longues et partiellement efficaces. Elles reposent sur l'adsorption, les liaisons ioniques ou covalentes ou encore le piégeage des ligands dans une matrice de type gel ou polymère.
Des méthodes ont été développées, ainsi la demande de brevet WO 2005/1 14417 décrit l'utilisation d'une couche de protéines globulaires appliquées sur un support adhésif, un agent réticulant étant ensuite appliqué su r la couche de protéines globulaires, les catalyseurs protéiques étant immobilisés en surface par réaction avec l'agent de réticulation.
Le document WO 03/072752 décrit des puces de protéines réalisées sur un substrat rigide sur lequel se trouve une couche hydrophobe et polymérique de polyvinylidene difluoride (PVDF) permettant l'immobilisation des protéines à l'état sec, une haute densité de spots et ayant un ratio signal sur bruit élevé.
La présente invention permet de palier les inconvénients décrits ci- dessus grâce à l'utilisation d'un complexe comprenant un support disposant d'au moins deux faces dont l'une est pourvue d'une enduction d'un adhésif et d'au moins un ligand immobilisé sur ladite surface adhésive.
Dans le cadre de la présente invention, le ligand déposé sur la surface adhésive peut être de nature protéique : protéine, oligopeptide, polypeptide, anticorps, de nature nucléique : ADN, ARN, oligonucléotide (i.e. pri m er) , i l peu t s' ag it ég a l em e nt d e s u cres (ol igosa cch a rid es ou polysaccharides) ou encore de petites molécules, éventuellement de synthèse comme des toxines, des pesticides, des hormones, des herbicides, des fongicides, ou des neurotransmetteurs. Ainsi lorsque le ligand est de type protéique, aucun prétraitement de la surface adhésive n'est nécessaire.
Le support utilisé peut être constitué par une plaque de verre, de plastique, un film de polyester ou tout autre matériau pouvant être enduit d'un adhésif.
Dans une mise en œuvre particulière de l'invention, le support est pourvu d'une enduction d'un adhésif sur deux de ses faces (Figure 1 ).
L'adhésif est un polymère adhésif commun pouvant présenter une surface activée. On citera à titre d'exemple les adhésifs non réactifs comme les copolymères styrène-butadiene, les gommes nitriles, le poly(vinyl acétate) et ses polymères, les polyvinyl acetals, les adhésifs sensibles à la pression comme les polyacrylates, les gommes silicone, les poly(vinyl ether) ou encore les adhésifs réactifs comme adhésifs polyurethane à deux composants, les adhésifs epoxy, les acryliques anaérobies, ou encore les cyanoacrylates.
Par exemple, les matériaux suivant ont été utilisés :
- 3M 7966WDL (adhésif 3M™ 200MP),
- 5 Stars Double Sided Display Tape Polypropylene,
3M™ Optically Clear Overlaminating Film 76991 ,
Ultra Clear Removable Overlaminating Film 76991 .
Les ligands sont choisis afin d'interagir spécifiquement avec des anti ligands définis. Suivant la nature du substrat et la stratégie d'immobilisation (par affinité, covalente...), les ligands peuvent être fonctionnalisés afin d'obtenir une meilleure immobilisation.
Différents ligands peuvent être matricés simultanément sur un même support et la conception de la matrice peut de plus inclure plusieurs réplicas d'une même sonde (Figure 1 ). Pour les ligands protéiques, aucun prétraitement de la surface de l'adhésif n'est nécessaire, et les ligands peuvent être déposés (étape de spotting) directement sur la surface.
Pour les ligands oligonucléotidiques, une étape de prétraitement de surface à l'aide d'un agent de réticulation multifonctionnel (le glutaraldéhyde de préférence) peut être mise en œuvre afin d'améliorer l'activité des ligands immobilisés. Ainsi selon un autre aspect, l'invention a pour objet un complexe comprenant un support dont l'une des faces est pourvue d'une enduction d'un adhésif, ladite surface adhésive étant fonctionnalisée, par exemple par l'action d'un agent de réticulation. Dans une mise en œuvre particulière, le ligand est également fonctionnalisé.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des complexes décrits ci-dessus.
Dans une mise en œuvre particulière de l'invention, les ligands sont dilués dans un tampon, par exemple, un tampon salin (sélectionné suivant la nature des biomolécules utilisées en tant que ligands) et déposés à la surface du support enduit en utilisant par exemple un spotter piézoélectrique de type non-contact ou par immersion du support enduit dans une solution comprenant les ligands.
Lorsque les ligands en solution sont déposés sous la forme de gouttes, la taille des gouttes déposées et par conséquent la taille des spots formés sur la surface (50-1000 μιτι), la densité des spots (1 -25 par mm2) et le format de la matrice peuvent être modifiés en fonction du champ d'application recherché et de la nature des biomolécules.
Une étape de fonctionnalisation du support peut être mise en œuvre avant le dépôt des ligands, comme par exemple le traitement de la surface adhésive par un agent de réticulation comme le glutaraldéhyde.
Selon le champ d'appl ication considéré, une étape de posttraitement peut être mise en œuvre après les étapes de dépôt du ligand et éventuellement de séchage à température ambiante. Cette étape de post traitement peut consister à chauffer (par exemple à 1 63°C pendant une minute), laver (tampons salins...) et/ou saturer (pour diminuer le bruit de fond) le complexe.
Les complexes selon l'invention peuvent être util isés pour la préparation de dispositifs notamment d'analyse.
De tels dispositifs comprennent un support substantiellement rigide comprenant au moins un puits délimitant une cavité interne comprenant au moins deux ouvertures, l'une d'entre elles au moins étant scellée par le complexe selon l'invention. De tels dispositifs peuvent prendre la forme de plaques de 12, 24 ou 96 puits ou encore de réseaux microfluidiques couramment utilisés dans le domaine des tests diagnostiques ou dans le domaine des biotechnologies.
Le procédé de préparation de tels dispositifs consiste à sceller le complexe selon l'invention au support de façon à fermer au moins une desdites ouvertures de la cavité, la surface adhésive comportant les ligands étant orientée vers l'intérieur de la cavité.
La surface adhésive modifiée avec les ligands peut être facilement assemblée avec des matériaux de types variés dans le but de générer des outils analytiques prêts à l'usage (Figures 2 et 3).
Par exemple, le support adhésif peut être assemblé avec une plaque 96-puits sans fond afin de générer une plaque à fond solide classiquement utilisée à des fins analytiques.
Le support adhésif peut également être interfacé avec divers réseaux microfluidiques, composés de canaux, cellules de flux ou mixeurs. La partie microfluidique assemblée peut être constituée de n'importe quel matériau disponible pour ce genre d'application (verre, silicium, plastiques, et autres matériaux polymériques). La présente invention a encore pour objet, un procédé de détection et/ou de quantification d'un anti ligand comprenant la mise en œuvre d'un dispositif ou d'un complexe tels que décrits ci-dessus. Ledit complexe ou dispositif est mis en contact avec un échantillon susceptible de contenir un anti ligand dans des conditions permettant l'interaction entre le ligand et l'anti ligand, optionnellement une molécule de détection marquée est ajoutée et enfin les signaux générés par l'interaction entre le ligand et l'anti ligand sont détectés et/ou quantifiés.
Dans un tel procédé l'anti ligand qui peut provenir d'un échantillon biologique tel du sérum, du sang, ou du plasma, un échantillon environnemental comme un prélèvement d'eau, de gaz, d'air, de sol ou un échantillon provenant de l'industrie agroalimentaire comme de la nourriture.
En supplément de l'étape critique que constitue l'interaction ligand/anti ligand, une ou plusieurs étapes peuvent être ajoutées selon les impératifs inhérents aux stratégies de marquage et de détection de l'interaction (Figure 4). Dans ce cas, e.g. si une étape supplémentaire de marquage est requ ise (e.g. interaction entre le g roupement biotine d'u ne ci bl e et u ne molécule de streptavidine), deux stratégies peuvent être utilisées :
- un protocole en deux étapes :
1 ) Incubation de la solution d'anti ligand (interaction ligand/anti ligand).
2) Incubation d'une solution de molécules marquées (e.g. conjugué streptavidine).
- un protocole une étape :
1 ) I ncu bation d 'une sol ution un ique pré-mélangée contenant à la fois les anti ligands et les molécules marquées.
En fonction de l'application et des exigences, différentes méthodes de détection peuvent être mises en œuvre, par exemple :
- La colorimétrie en utilisant un marqueur comme par exemple :
- Système indicateur avec Phosphatase alcaline / BCIP ;
- Système indicateur avec Peroxydase du raifort - ABTS ;
- Particules d'or...
- La chimiluminescence en utilisant un marqueur comme suit :
- Peroxyd ase d u ra ifort - système avec su bstrat chimiluminescent.
Phosphatase alcal ine - systèm e avec s u bstrat chimiluminescent.
La rad iog raph ie ou la détection et/ou quantification de radioactivité peuvent également être utilisés.
Description des figures
Figure 1 : représentation schématique du complexe selon l'invention, présentant (A) le support (S) dont une surface est enduite d'adhésif (ad) sur lequel sont immobilisés des ligands (L) ; (B) le support (S) dont deux faces sont enduites d'adhésif (ad) les ligands (L) étant immobil isés sur l'une des deux faces.
F i g u re 2 : représentation schématique de l'assemblage de dispositifs selon l'invention (A) : un réseau microfluidique, (B) une plaque 96- puits. Figu re 3 : représentation schématique de l'assemblage d'un réseau microfluidique selon l'invention.
Figure 4 : représentation schématique du procédé de détection d'un anti ligand dans un échantillon.
Figure 5 : Courbe présentant la corrélation entre l'intensité du signal détecté et la concentration en ol igonucléotide (anti l igand) dans l'échantillon.
Figure 6 : Courbe présentant la corrélation entre l'intensité du signal détecté et la concentration en CRP (anti ligand) dans l'échantillon.
Figure 7 : Courbe présentant la corrélation entre l'intensité du signal détecté et la concentration en CRP (anti ligand) dans l'échantillon.
Exemples
Exemple 1.
Matrice d'oligonucléotides sur plaques adhésives de microtitration (pour la détection quantitative d'anti ligand) En util isant u n cou ple d 'ol igon ucléotides synthétiq ues de séquences complémentaires en tant que ligand et anti ligand, il a été montré que la présente invention peut être appliquée à l'analyse et à la détection quantitative de séquences d'oligonucléotides.
Les ligands ont été spottés sur la surface du support adhésif et hybridés avec un oligonucléotide de séquence complémentaire (anti ligand). Un système révélateur de type biotine - streptavidine Phosphatase Alcaline a été utilisé pour la révélation colorimétrique du signal . Une corrélation entre l'intensité du signal mesuré et la concentration en anti ligand a été démontrée (Figure 5).
• Spotting des sondes Prétraitement
Un support 3M 7966WDL a été pré-traité à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde 1 % dans un tampon phosphate 0,1 M pH 5 pendant 1 heure à 37°C. Les supports ont alors été lavés avec de l'eau distillée afin d'être prêts à l'emploi pour l'immobilisation des sondes.
Spotting
Les ligands (oligonucléotides synthétiques (SEQ ID No. 1, modification amino en 5') ont été dilués dans du tampon acétate salin (acétate 0,1 M, KCI 0,1 M, bleu de bromophénol 0,25mg/mL pH=5,5) afin d'atteindre une concentration finale de 50 mol.L"1. Cette solution a été spottée à la surface d'un adhésif 3M 7966WDL à l'aide d'un spotter piézoélectrique (BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer). Le substrat a été séché à l'air libre et à température ambiante. Les spots produits ont un diamètre d'environ 100 μιτι et la densité de spots varie de 1 à 25 spots par mm2.
Post-traitement
Après le matriçage des ligands et le séchage du support à température ambiante, le post-traitement a été effectué comme suit : les supports sont chauffés à 163°C durant 1 minute, puis lavés par addition de tampon PBS et ensuite incubés à 37°C pendant 15 minutes avec du tampon PBSTA (phosphate 0,1 M, NaCI 0,5M, pH=7,4, Tween200,1 \% v/v, BSA 1\% w/v) afin de saturer la surface.
• Assemblage
Les adhésifs spottés sont ensuite assemblés avec une plaque 96- puits sans fond afin de générer une plaque à fond solide d'utilisation classique. Les propriétés adhésives du support sont ici essentielles afin de permettre un assemblage facile réalisé en exerçant une faible pression sur les deux parties apposées l'une contre l'autre (Figure 2). · Essai
Des solutions d'anti ligands (SEQ ID No. 2) à différentes concentrations mélangées avec le conjugué Phosphatase Alcaline - Streptavidine (1pg.mL~1) ont été préparées dans un tampon PBSTA.200μΙ de la solution résultante ont été déposés dans chaque puits, puis l'ensemble a été incubé sur la surface spottée pendant 30 minutes à 37°C. Les supports adhésifs ont alors été lavés à température ambiante avec 1 ml_ de solution PBS.
• Révélation
1 00 μ Ι_ d ' u n e sol ution d e BC I P/N BT (4-bromo-5-chloroindolyl phosphate/ nitro-blue tetrazolium) ont été ajoutés dans les puits de la plaque et incubés à 37°C afin de révéler le signal (environ 30 minutes). Les puits ont ensuite été lavés avec 1 ml_ de PBS.
Une fois les fonds de pu its secs, l'acqu isition d'une image a été effectuée à l'aide d'un scanner horizontal de bureau (HP). Une corrélation entre l'intensité du signal mesuré et la concentration d'anti l igand a été démontré (Figure 5). Exemple 2. Matrice de protéines sur plaque adhésive pour immunoessai de type sandwich appliqué au diagnostic point-of-care
Dans le cas où les supports adhésifs sont fonctionnalisés avec des microarrays de protéines (ligands), la présente invention permet la mise en œuvre de tests sérolog iques q uantitatifs, pouvant être util isés pou r des applications de type diagnostic point-of-care.
Afin d'évaluer la fiabil ité d'un tel essai q uantitatif, le système suivant fut utilisé : des anticorps anti-CRP ont été immobilisés sur le support dans le but de servir de sondes pour la détection de CRP en util isant les anticorps biotinylés ciblés correspondants. Un système révélateur de type biotine - streptavidine Phosphatase Alcal ine a été utilisé pour la révélation colorimétrique du signal. Une corrélation entre l'intensité du signal mesuré et la concentration en anticorps cible (anti ligand) a été démontrée (Figure 6). · Spotting des ligands
Spotting
Une solution d'anticorps anti-CRP à une concentration de 500 g.mL"1 dans un tampon acétate (acétate 0,1 M, KCI 0,1 M, bleu bromophenol 0,25 mg/m L pH=5,5) a été spottée sur la surface d'un adhésif de type 3M 7966WDL à l'aide d'un spotter piézoélectrique (BioChip Arrayer BCA1 , PerkinElmer). Aucun prétraitement de la surface n'est requis. La surface a été séchée pendant 30 minutes à température ambiante. Les spots produits ont un diamètre de l'ordre de 100 μιτι de diamètre et la densité de spots peut varier de 1 à 25 par mm2.
Post-traitement
Suite au matriçage du microarray et au séchage à température ambiante, le post-traitement s'effectue comme suit : les supports sont chauffés à +163°C durant 1 minute, puis lavés par addition de tampon PBS et ensuite incubés à 37°C pendant 15 minutes avec du tampon PBSTA (phosphate 0,1 M, NaCI 0,5M , pH=7,4, Tween20 0, 1 \% v/v, BSA 1 \% w/v) afin de satu rer la surface.
• Assemblage
Les adhésifs spottés sont ensuite assemblés avec une plaque 96- puits sans fond afin de générer une plaque à fond solide d'utilisation classique. Les propriétés adhésives du support sont ici essentielles afin de permettre un assemblage facile réalisé en exerçant une faible pression sur les deux parties apposées l'une contre l'autre (Figure 2).
• Essai
Des solutions mélangées de protéine cible (CRP), de conjugué biotine-anticorps (pl usieurs concentrations) et de conjugué Phosphatase Alcaline- Streptavidine (1 g.mL"1) ont été préparées dans du tampon PBSTA. 200 i l de la sol ution résultante ont été déposés dans chaque pu its, puis l'ensemble a été incubé 30 minutes à 37°C. Les supports adhésifs ont ensuite été lavés à température ambiante avec 1 mL de solution PBS.
• Révélation
1 00 μ ί d ' u n e sol ution d e BC I P/N BT (4-bromo-5-chloroindolyl phosphate/ nitro-blue tetrazolium) ont été ajoutés dans les puits de la plaque et incubés à 37°C afin de révéler le signal (environ 30 minutes). Les pu its ont ensuite été lavés avec 1 mL de PBS. Une fois les fonds de pu its secs, l'acqu isition d'une image a été effectuée à l'aide d'un scanner horizontal de bureau (H P). Des exemples d'images résultantes sont présentés à la Figure 6. Exemple 3. Matrice de protéines sur support adhésif pour immunoessai de type sandwich appliqué au diagnostic point-of-care dans un système microfluidique assemblé
• Spotting des ligands
Spotting
Une solution d'anticorps anti-CRP à u ne concentration de 500 g.mL"1 dans un tampon acétate (acétate 0,1 M, KCI 0,1 M, bleu bromophenol 0,25 mg/mL pH 5,5) a été spottée sur la surface d'un adhésif de type 3M 7966WDL à l 'a ide d 'un spotter piézoélectriq ue (BioCh ip Arrayer BCA1 , PerkinElmer). Aucun prétraitement de la surface n'est requis. La surface a été séchée pendant 30 minutes à température ambiante. Les spots produits ont un diamètre de l'ordre de 100 μιτι de diamètre et la densité de spots peut varier de 1 à 25 par mm2.
Post-traitement
Su ite au matriçage du microarray et au séchage à température ambiante, le post-traitement s'effectue comme suit : les supports sont chauffés à +163°C durant 1 minute, puis lavés par addition de tampon PBS et ensuite incubés à 37°C pendant 15 minutes avec du tampon PBSTA (phosphate 0,1 M, NaCI 0,5 M, p H 7,4, Tween20 0,1 \% v/v, BSA 1 \% w/v) afin de saturer la surface.
• Assemblage
Le support adhésif de protéines matricées a été assemblé avec un système m icroflu id ique préconçu constitué de m icro-canaux en PVC/3M 7966WD L ou b i en d e m i cro-canaux de verre obtenus par etching. Les propriétés adhésives du support sont ici essentielles afin de permettre un assemblage facile réalisé en exerçant une faible pression sur les deux parties apposées l'une contre l'autre (Figure 3). • Essai
Des solutions mélangées de protéine cible (CRP, anti ligand), de conjugué biotine-anticorps (plusieurs concentrations) et de conjugué streptavidine - Phosphatase alcaline (1 g.mL"1) ont été préparées dans du tampon PBSTA.50 μΙ_ de la solution résultante ont été injectés dans le réseau microfluidique (Figure 7), puis l'ensemble a été incubé une heure à 37°C. Le système microfluidique assemblé a ensuite été lavé avec 200 μΙ_ de tampon PBS.
• Révélation
50 μΙ_ d'une solution de BCIP/NBT (4-bromo-5-chloroindolyl phosphate/ nitro-blue tetrazolium) ont été injectés dans le système microfluidique assemblé et incubés à 37°C afin de révéler le signal (environ 30 minutes). Les canaux ont ensuite été lavés avec 1 mL de PBS. Une fois l'ensemble séché, l'acquisition d'une image du système microfluidique assemblé a été effectuée à l'aide d'un scanner horizontal de bureau (HP). Une corrélation entre l'intensité du signal mesuré et la concentration d'anti ligand a été démontrée (Figure 7).
Exemple 4.
Matrice d'oligonucléotides sur plaques adhésives de microtitration (pour la détection quantitative d'anti ligand)
La présente invention peut être appliquée à l'analyse et à la détection quantitative de séquences d'oligonucléotides (cf. exemple 1).
Dans le présent exemple, les ligands ont été spottés sur la surface du support adhésif et hybridés avec un oligonucléotide de séquence complémentaire (anti ligand). Un système révélateur de type biotine - streptavidine Phosphatase Alcaline a été utilisé pour la révélation colorimétrique du signal.
• Spotting des sondes Prétraitement
Un support 3M 7966WDL a été pré-traité à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde 1% dans un tampon phosphate 0,1 M pH 5 pendant 1 heure à 37°C. Les supports ont alors été lavés avec de l'eau distillée afin d'être prêts à l'emploi pour l'immobilisation des sondes.
Spotting
Les ligands (oligonucléotides synthétiques (SEQ ID No. 1, modification amino en 5') ont été dilués dans du tampon acétate salin (acétate 0,1 M, KCI 0,1 M, bleu de bromophénol 0,25mg/mL pH=5,5) afin d'atteindre une concentration finale de 50 mol.L"1. Cette solution a été spottée à la surface d'un adhésif 3M 7966WDL à l'aide d'un spotter piézoélectrique (BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer). Le substrat a été séché à l'air libre et à température ambiante. Les spots produits ont un diamètre d'environ 100 μιτι et la densité de spots varie de 1 à 25 spots par mm2.
• Assemblage
Les adhésifs spottés sont ensuite assemblés avec une plaque 96- puits sans fond afin de générer une plaque à fond solide d'utilisation classique. Les propriétés adhésives du support sont ici essentielles afin de permettre un assemblage facile réalisé en exerçant une faible pression sur les deux parties apposées l'une contre l'autre (Figure 2). «Essai
Des solutions d'anti ligands (SEQ ID No. 2) à différentes concentrations mélangées avec le conjugué Phosphatase Alcaline - Streptavidine (1pg.mL~1) ont été préparées dans un tampon PBSTA.200μΙ de la solution résultante ont été déposés dans chaque puits, puis l'ensemble a été incubé sur la surface spottée pendant 30 minutes à 37°C. Les supports adhésifs ont alors été lavés à température ambiante avec 1 mL de solution PBS.
• Révélation 1 00 μ Ι_ d 'u ne sol ution de BC I P/N BT (4-bromo-5-chloroindolyl phosphate/ nitro-blue tetrazolium) ont été ajoutés dans les puits de la plaque et incubés à 37°C afin de révéler le signal (environ 30 minutes). Les puits ont ensuite été lavés avec 1 ml_ de PBS.
Une fois les fonds de puits secs, l'acquisition d'une image a été effectuée à l'aide d'un scanner horizontal de bureau (HP). Une corrélation entre l'intensité du signal mesuré et la concentration d'anti ligand a été démontré (Figure 8).

Claims

REVENDICATIONS
Complexe comprenant :
- un support pourvu d'au moins deux faces dont l'une est pourvue d'une enduction d'un adhésif,
- au moins un ligand
ledit ligand étant immobilisé sur la surface adhésive et caractérisé en ce que l'adhésif est choisi parmi les adhésifs sensibles à la pression comme les polyacrylates, les gommes silicone, les polyvinyl ethers, ou les adhésifs non réactifs comme les copolymères styrène-butadiene, les gommes nitriles, le poly(vinyl acétate) et ses polymères, les polyvinyl acetals, ou les adhésifs réactifs comme adhésifs polyurethane à deux composants, les adhésifs epoxy, les acryliques anaérobies, ou encore les cyanoacrylates.
Complexe selon la revendication 1 caractérisé en ce que le ligand est choisi parmi les protéines, peptides, anticorps, acides nucléiques, sucres ou oligosaccharides, les toxines, pesticides, hormones, herbicides, fongicides, neurotransmetteurs.
Complexe selon l'une des revendications précédentes, ladite surface adhésive étant fonctionnalisée, par exemple par l'action d'un agent de réticulation
Complexe selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel le ligand est fonctionnalisé.
Complexe selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'un adhésif est également enduit sur une autre face du support.
Dispositif d'analyse comprenant un support rigide comprenant au moins un puits délimitant une cavité interne comprenant au moins deux ouvertures, au moins une desdites ouvertures de la cavité étant scellée par le complexe selon l'une des revendications 1 à 5.
Dispositif selon la revendication 6 choisi parmi les plaques d'analyse, par exemple des plaques 12, 24 ou 96-puits ou des réseaux microfluidiques.
Utilisation d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 5 pour la préparation d'un dispositif d'analyse selon l'une des revendications 6 ou 7.
Procédé de préparation d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 5 comprenant les étapes suivantes :
a) Dilution du ligand dans une solution adaptée par exemple un tampon salin ;
b) Dépôt du ligand en solution à la surface de l'adhésif.
10. Procédé de préparation selon la revendication 9 comprenant une étape de prétraitement de la surface adhésive, par exemple par un agent de réticulation comme le glutaraldéhyde.
11. Procédé de préparation d'un complexe selon la revendication 9 ou 11 comprenant une étape supplémentaire c) de séchage du liquide ainsi déposé par exemple à température ambiante.
12. Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 11 comprenant une étape supplémentaire (d) de chauffage, lavage et/ou de saturation. 13. Procédé de préparation d'un dispositif selon la revendication 6 ou 7 comprenant l'étape consistant à sceller le complexe selon l'une des revendications 1 à 5 au support de façon à fermer au moins une desdites ouvertures de la cavité, la surface adhésive comportant le ligand étant orientée vers l'intérieur de la cavité. Procédé de détection et/ou de quantification d'un anti ligand comprenant les étapes : a) Disposer d'un dispositif selon la revendication 6 ou 7 ou d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 5, b) Mettre en contact le dispositif ou le complexe avec un échantillon susceptible de contenir un anti ligand dans des conditions permettant l'interaction entre le ligand et l'anti ligand,
c) Optionnellement ajouter une molécule de détection marquée,
d) Détection et/ou quantification des signaux générés par l'interaction entre le ligand et l'anti ligand. 15. Procédé de détection et/ou de quantification d'un anti ligand selon la revendication 4§ 14 dans lequel l'anti ligand provient d'un échantillon biologique tel du sérum, du sang, ou du plasma, un échantillon environnemental comme un prélèvement d'eau, de gaz, d'air, de sol ou un échantillon provena nt d e l ' i nd ustrie ag roal imenta i re com me de la nourriture.
16. Procédé de détection et/ou de quantification d'un anti ligand selon l'un des revend ications 1 4 ou 1 5 par colorimétrie, fluorescence, chimiluminescence, radiographie ou détection de radioactivité.
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