JP2001178458A - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固相担体表面に、予め別に調製したＤＮＡ断
片を迅速な反応によって結合させることが可能で、か
つ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固
定方法を開発し、ブロッキング工程が不要なＤＮＡチッ
プを得ること。 【解決手段】 表面にホスト基もしくはゲスト基が導入
された固相担体と、一方の末端部にゲスト基もしくはホ
スト基を有するＤＮＡ断片とを、液相にて接触させるこ
とにより、それぞれのゲスト基とホスト基との間で結合
を起こさせることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表
面への固定方法、この方法により得られたＤＮＡチッ
プ、そしてそのＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ上の
ＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片を検出する
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる導電性基を持つ
インターカレータを利用する方法などが知られている。

【０００３】ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。

【０００４】ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。

【０００５】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。

【０００６】しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。

【０００７】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。

【０００８】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。

【０００９】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。

【００１０】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によっ
て結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に
結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工
程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の
検出方法を提供することを、その課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記の課題は下記の本発
明によって解決された。 （１）表面にホスト基もしくはゲスト基が導入された固
相担体と、一方の末端部にゲスト基もしくはホスト基を
有するＤＮＡ断片とを、液相にて接触させることによ
り、それぞれのゲスト基とホスト基との間で結合を起こ
させることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への
固定方法。

【００１３】（２）上記の方法によって得られたＤＮＡ
チップ。

【００１４】（３）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （４）上記のＤＮＡチップの表面に、導電性基を有する
インターカレータと核酸断片試料とを含む水性液を付与
する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と
相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーション
によってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡ
チップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成されたハ
イブリッド構造内に取り込まれたインターカレータの導
電性基を介して流れる電流を電気化学的に検出する工程
からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性
を有する核酸断片の検出方法。

【００１５】本発明は、一般にホストゲスト相互作用と
して知られる、特定の一対一での非共有結合性分子間相
互作用を行うホストおよびとゲストをそれぞれ固相担体
とＤＮＡ断片に固定することにより、きわめて効率よく
固相担体に該ＤＮＡ断片が固定される発見に基づいてい
る。このような特定な一対一の非共有結合性分子間相互
作用を利用することにより、きわめて効率的に、また、
煩雑な操作を用いることなく固相担体にＤＮＡ断片に固
定されることことはこれまで知られていなかった。さら
に、この手法によりＤＮＡ断片はその末端で固相担体に
固定される為、ハイブリダイゼーションの効率が向上す
ることはこれまで知られていなかった。

【００１６】本発明は次のようにして具体化することが
可能である。ＤＮＡ断片の固相担体への固定は、ＤＮＡ
断片および固相担体に固定されたホストおよびゲストを
介した、特定の一対一での非共有結合性分子間相互作用
（以下、ホストゲスト相互作用という）によって行われ
る。従って、本発明では、分子の一方の末端にホストま
たはゲスト分子を結合した鎖状分子を用い、該鎖状分子
の他方の末端にＤＮＡ断片を結合する工程、固相担体表
面にＤＮＡ断片に結合されたホストまたはゲスト分子と
の間にホストゲスト相互作用を有する分子を結合する工
程、ホストまたはゲスト分子を結合したＤＮＡ断片を含
む水性液体を点着する工程から構成される。種々のＤＮ
Ａ断片について上記の点着操作を繰り返すことによっ
て、本発明のＤＮＡチップは作製される。このような本
発明の方法を採用することによって、特別な工程を施す
ことなく点着部分のみでホストゲスト相互作用によりＤ
ＮＡ断片が固定され、結果として煩雑なブロッキング工
程を不要化することもできる。

【００１７】本発明のＤＮＡ断片の固相単体表面への固
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）ホストゲスト相互作用を形成するためのホストま
たはゲスト分子を、固相担体表面に結合させる。 （２）ＤＮＡ断片として、固相担体表面とホストゲスト
相互作用を形成するための分子を末端に有し、その塩基
配列が既知であるものを用いる。 （３）（１）で作成した固相担体表面に、（２）で作成
したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着する。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明の固定方法において用いら
れる、特定の一対一での非共有結合性分子間相互作用
（ホストゲスト相互作用）を形成するための分子、およ
びその組み合わせについて述べる。

【００１９】本発明において用いられるホストおよびゲ
ストとしては、ホストゲスト相互作用を形成して強固な
結合を形成するものであれば、どのようなものでも使用
することができる。

【００２０】本発明の固定方法においては、水が存在し
ない反応系を使用することもできるが、ＤＮＡ断片を溶
解または分散する上で有利なことから、水中での会合定
数（Ka）の値は大きければ大きいほど好ましいが、該値
が10²以上を示すホストおよびゲストの組み合わせが好
ましく用いられ、10³以上を示すものがより好ましく用
いられる。

【００２１】このようなホストゲスト相互作用を示す組
み合わせとしては、多くの成書が知られており、それら
を参考にすることができるが、例えば、竹本喜一、宮田
幹二、木村恵一著「包接化合物 基礎から未来技術へ」
東京化学同人（１９８９年）、Ｊ．M．Ｌｅｈｎ著、竹
内敬人訳「レーン超分子化学」（株）化学同人（１９９
７年）、妹尾学、荒本孝二、大月譲著、「超分子化学」
東京化学同人（１９９８年）、上野昭著「超分子の科学
極微の世界が未来を拓く」産業図書株式会社（１９９
３年）、日本化学会編「超分子をめざす化学」季刊化学
総説、No31（１９９７年）、Ｌ． Ｅｃｈｅｇｏｙｅ
ｎ、Ａ．Ｅ．Ｋａｉｔｅｒ「Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｕｐ
ｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｋｌｕ
ｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１
９９６年）に記載の方法やこれらに記載の引用文献等を
参考にすることができる。

【００２２】本発明で好ましく用いられる、ホストゲス
ト相互作用を担うホスト分子の例を挙げると、包接化合
物（以下、ホスト化合物という）としては、例えば、ポ
タンド、クラウンエーテル、アザクラウンエーテル、コ
ロナンド、トランド、包接キレート化合物、配位包接化
合物、クリプタンド、スペレアンド、スフェランド、キ
ャビタンド、カーセランド、カリックスアレーン、シク
ロファン、アザシクロファン、クリプトファン、シクロ
デキストリンがあげられる。なかでも、クラウンエーテ
ル、アザクラウンエーテル、カリックスアレーン、シク
ロデキストリンが好ましい。クラウンエーテルとして
は、ベンゾクラウンエーテル、ジベンゾクラウンエーテ
ル等、公知のクラウンエーテルのいずれも用いることが
できるが、なかでも１８−クラウン−６、１５−クラウ
ン−５、１２−クラウン−４、およびこれと同等の系サ
イズをもつ化合物が好ましい。アザクラウンエーテルに
ついても、公知のアザクラウンエーテルのいずれも用い
ることができ、前述のクラウンエーテルと同等の径サイ
ズを有するものが特に好ましい。カリックスアレーンと
してはカリックス［４］アレーン、カリックス［６］ア
レーン、カリックス［８］アレーン類が好ましい。シク
ロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β
−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンのいず
れも好ましく用いることができる。また、クラウンエー
テル、アザクラウンエーテル、カリックスアレーン、シ
クロデキストリンのうち、最も好ましいのは、カリック
スアレーンあるいはシクロデキストリンである。

【００２３】また、本発明で好ましく用いられる、ホス
ト化合物に包接されることによってホストゲスト相互作
用を行う部分構造（以下、ゲスト分子という。）として
は、例えば、フェロセン基、ベンゼン基、ナフタレン
基、アントラセン基、ピレン基、アダマンタン基、1級
アンモニウム基、２級アンモニウム基、 グアニジニウ
ム基、芳香族ジアゾニウム基、アニリン基、フェノール
基、カルボキシル基、リン酸基が挙げられる。なかで
も、フェロセン基、アダマンタン基、1級アンモニウム
基が好ましい。

【００２４】次に、本発明でホストゲスト相互作用を形
成するために好ましく用いられるホストおよびゲスト分
子の組み合わせについて述べる。本発明で用いられるホ
ストおよびゲスト分子の組み合わせについては、ホスト
ゲスト相互作用を行う公知の組み合わせであれば、いず
れも用いることができる。これらの組み合わせについて
は、例えば、前述した成書に詳しく記載されており、そ
れらの引用文献とともに使用することができる。ホスト
およびゲスト分子は前述した様にＤＮＡ断片に一方を、
固相担体には他方を結合して用いる。ホストまたはゲス
ト分子のＤＮＡ断片への結合箇所はＤＮＡ断片の末端が
好ましい。

【００２５】また、本発明でホストゲスト相互作用を形
成するために特に好ましく用いられるホストおよびゲス
ト分子の組み合わせについて以下に述べる。クラウンエ
ーテル：1級アンモニウム基、２級アンモニウム基、グ
アニジウム基、芳香族ジアゾニウム基、アニリン基、フ
ェノール基、カルボキシル基；アザクラウンエーテル：
1級アンモニウム基、２級アンモニウム基、グアニジウ
ム基、芳香族ジアゾニウム基、アニリン基、フェノール
基、カルボキシル基、リン酸基；カリックスアレーン：
芳香族ジアゾニウム基、ベンゼン基、ナフタレン基、ア
ントラセン基、ピレン基、アダマンタン基；あるいは、
シクロデキストリン：フェロセン基、ベンゼン基、ナフ
タレン基、アントラセン基、ピレン基、アダマンタン基
である。

【００２６】本発明において最も好ましい組み合わせ
は、クラウンエーテル：1級アンモニウム基、グアニジ
ウム基；アザクラウンエーテル：1級アンモニウム基、
グアニジウム基；カリックスアレーン：ベンゼン基、ナ
フタレン基、アダマンタン基；あるいは、シクロデキス
トリン：フェロセン基、アダマンタン基である。

【００２７】固相担体としては、疎水性、あるいは親水
性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が
凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用い
ることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミ
ックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾
紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金
などの導電性材料などを拳げることができる。多孔質物
質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にある
ことが好ましく、２乃至５００n mの範囲にあることが
特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリ
コンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容
易さや電気化学的方法による解析の容易さによるもので
ある。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範
囲にあることが好ましい。

【００２８】固相担体の表面は、ホストまたはゲスト分
子を固相担体表面への導入するための置換基を有する連
結試薬（シランカップリング剤など）によって接触処理
されていることが好ましい。固相担体表面への導入置換
基としては、共有結合を形成できる反応性の官能基であ
れば特に限定されないが、なかでもアミノ基、カルボン
酸基、水酸基、チオール基、アルデヒド基、エポキシ
基、アルキルハライド、シリルハライド等がが好まし
い。

【００２９】固相担体表面に導入するホスト（Ｈ）また
はゲスト化合物（Ｇ）には、固相担体表面の導入置換基
と結合を形成するための反応活性基が存在する。反応活
性基は、先に示した固相担体状の反応性官能基と化学結
合を形成する官能基であれば特に種類は問わないが、ア
ミノ基、カルボン酸基、水酸基、チオール基、アルデヒ
ド基、エポキシ基、アルキルハライド、シリルハライド
等の中から固相担体状の反応性官能基に応じて適宜選択
するのが好ましい。生じた化学結合の種類としては、ア
ミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル
結合、チオエーテル結合、アルキルアミノ結合、イミノ
結合、シリルエーテル結合等が好ましいが、特にアミド
結合、チオエーテル結合が好ましい。また、該化学結合
を形成する為の反応試薬は、その結合に応じて適宜選択
することができる。

【００３０】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。

【００３１】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。

【００３２】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１0³乃至１０⁶の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ
目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、
９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環
境に置くことも好ましい。

【００３３】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。

【００３４】ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対
して、１０²乃至１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０¹⁵モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。

【００３５】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。

【００３６】標織方法としては、大別してＲＩ法と非Ｒ
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅ^TMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ²−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。

【００３７】なお、上記の標識を利用する以外にも、導
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。

【００３８】試料として用いる核酸断片としては、その
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片
は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライ
マーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰ
ＣＲを行なって得ることが好ましい。

【００３９】ハイブリダイゼーションは、９６穴もしく
は３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標
識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液
を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによ
つて実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１０
０ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼー
ションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至
２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダ
イゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液
を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去する
ことが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液と
しては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができ
るが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。

【００４０】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。

【００４１】

【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成
及びＤＮＡ断片の固定量の測定 （１）ホスト化合物が導入されたスライド（Ｃ）の作成 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅ
ｔｙ，ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎ，２，９２
１頁（１９８５年）に記載の方法で合成した６−o−
（２−ナフチルスルホニル）−γ−シクロデキストリン
と、１０倍量の１，６−ヘキサンジアミン（和光純薬社
製）をジメチルホルムアミド溶媒中で８０℃に加熱処理
することによって、側鎖末端にアミノ基の導入されたシ
クロデキストリン化合物を合成した。

【００４２】一方、２質量％アミノプロピルエトキシシ
ラン（信越化学工業（株）製）のエタノール溶液に、ス
ライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した
後取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間
乾燥して、シラン化合物被覆スライド（Ａ）を作成し
た。次いで、このシラン化合物被覆スライド（Ａ）を、
４質量％無水コハク酸の１−メチル−２−ピロリドン
（５０ｍＬ）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニ
トリルで洗浄し、１時間減圧下乾燥した。乾燥後の、末
端にカルボン酸基が導入されたスライド（Ｂ）を、４質
量％の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩（東京化成社製）および１０
質量％の前述のアミノ基の導入されたシクロデキストリ
ン化合物のアセトニトリル（５０ｍＬ）溶液に２時間浸
し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下に乾燥し、
ホスト分子としてγ−シクロデキストリン基が導入され
たスライド（Ｃ）を作成した。

【００４３】（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３'末端および５'末端がそれぞれアミノ基、蛍光標織試
薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤ
ＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を１−アダ
マンチルカルボン酸（東京化成工業（株）製）および１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩（いずれも東京化成工業（株）製）で処
理し、３'末端に１−アダマンチルカルボンアミド基が
導入されたＤＮＡ断片を作成した。このＤＮＡ断片を
０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に分散してなる水性
液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）を、上記（１）で得たスラ
イド（Ｃ）に点着した。直ちに、点着後のスライドを４
０℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このスライド
を０．１質量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２
×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した
溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との混合溶液
で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次
いで、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライ
ド（Ｄ１）を得た。このスライド（Ｄ１）表面の蛍光強
度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、１５００
であった。本発明の固定化方法により、ＤＮＡ断片が効
率よくスライドガラスに固定されたことが分かる。

【００４４】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 ５'末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライド（Ｄ２）を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０質量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に点着し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１質量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１質量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、５１４であった。本発明の固定化方法によ
って作成されたＤＮＡチップを用いることによって、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る試料ＤＮＡ断片を検出できることがわかる。

【００４５】

【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。ＤＮＡ断
片の安定かつ簡便な固定は、遺伝子解析等に有効に利用
することができる高い検出限界を有するＤＮＡチップの
作製が可能となる。その一つの例として、本発明によっ
て作製されたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片との
ハイブリダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチッ
プに固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核
酸断片を感度よく検出することができる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/547 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＺ (72)発明者 中村 剛希 神奈川県南足柄市中沼210番地 富士写真 フイルム株式会社内 (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 2G054 AA02 AA06 AB07 BB02 CA22 CE01 CE02 EA03 EA10 FB01 4B033 NA02 NA45 NB04 NB15 NB25 NB63 NB68 NC03 NC12 ND05 ND12 4B063 QA01 QA08 QA12 QA17 QA18 QQ02 QQ42 QQ53 QR32 QR56 QR82 QS03 QS25 QS34 QX02

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面にホスト基もしくはゲスト基が導入
   された固相担体と、一方の末端部にゲスト基もしくはホ
   スト基を有するＤＮＡ断片とを、液相にて接触させるこ
   とにより、それぞれのゲスト基とホスト基との間で結合
   を起こさせることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表
   面への固定方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法によって得られた
   ＤＮＡチップ。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡチップの表面
   に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試
   料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
   れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
   イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
   る工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断
   片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程か
   らなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を
   有する核酸断片の検出方法。
4. 【請求項４】 請求項２に記載のＤＮＡチップの表面
   に、導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料
   とを含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
   れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
   イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
   る工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試
   料とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれた
   インターカレータの導電性基を介して流れる電流を電気
   化学的に検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮ
   Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。