CN116716396A - microRNAs作为神经管畸形的无创产前筛查分子标志物及其应用 - Google Patents
microRNAs作为神经管畸形的无创产前筛查分子标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116716396A CN116716396A CN202310763600.2A CN202310763600A CN116716396A CN 116716396 A CN116716396 A CN 116716396A CN 202310763600 A CN202310763600 A CN 202310763600A CN 116716396 A CN116716396 A CN 116716396A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hsa
- mir
- ntds
- mirnas
- diagnosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000009609 prenatal screening Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 title abstract description 25
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 title abstract description 15
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 40
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 108091067635 Homo sapiens miR-187 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 108091069527 Homo sapiens miR-223 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 108091070512 Homo sapiens let-7d stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 201000010193 neural tube defect Diseases 0.000 claims description 44
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 20
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 claims description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 abstract description 15
- 206010061619 Deformity Diseases 0.000 abstract description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000008925 shengjing Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091062140 Mir-223 Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036830 Normal foetus Diseases 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 238000010806 PrimeScriptTM RT Reagent kit Methods 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091033753 let-7d stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 208000035581 susceptibility to neural tube defects Diseases 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了microRNAs作为神经管畸形的无创产前筛查分子标志物及其应用，属于医药生物技术领域。提供用于NTDs胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用，所述分子标志物由hsa‑miR‑223、hsa‑miR‑187和hsa‑let‑7d一种或多种的miRNAs组成，可用于神经管畸形产前筛查，为神经管畸形治疗提供新的靶点，具有重大的临床意义。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及microRNAs作为神经管畸形的无创产前筛查分子标志物及其应用。
背景技术
神经管畸形(neural tube defects，NTDs)作为我国常见的重大出生缺陷疾病，是胚胎发育过程中神经管闭合不全所致的先天性畸形，其致死率和致残率极高，主要包括无脑儿、脑膨出和脊柱裂等。虽然随着孕期保健和叶酸补充的普及以及产前畸形矫正与修补手术的进步，NTDs的发生率有所降低，但一系列术后并发症依旧对其个人、家庭和整个社会构成多方面的负担。因此，探寻神经管畸形早期无创诊断方法，使胎儿在出现严重结构异常或不可逆损伤之前获得有效诊断，进而采取早期干预措施，对于减少畸形的致残率、提高人口素质具有极其重要意义。
目前，临床上对于NTDs产前诊断主要依赖于妊娠中期的胎儿超声检查并结合母体血清甲胎蛋白水平。然而，超声检查手段对NTDs的发现只能在缺陷形成后，并且其诊断准确性高度依赖于操作人员的经验和设备的质量，而母体甲胎蛋白易受其他疾病和因素影响。因此，探讨客观的、准确的早期NTDs诊断方法具有极其重要的意义，也为其早期咨询及治疗提供依据。母体血清学检查是一种无创性产前诊断方法,孕妇易接受，适用于大范围产前筛查。因此，国内外许多学者都在致力于发现新的诊断特异性标志物的研究，但目前为止，尚无在临床获得应用的孕早期神经管畸形的诊断分子标志物。
近年来随着各种组学技术突飞猛进的发展，一系列新技术融入到高通量的组学研究中，组学技术通过检测从单个亚细胞组分到大规模生物网络的多个系统的动态分子变化，在先天性畸形生物标志物的发现中发挥了重要作用。microRNA（miRNA)转录组是细胞在特定生理或发育阶段的总miRNA的总和，母体血循环中的miRNA为早期诊断妊娠相关疾病提供可能。利用高通量的组学技术可以充分考虑母体与胎儿两方面因素，从众多复杂的基因中筛选出改变明显的关键性分子，综合分析其变化规律，将有利于确定疾病早期诊断和预后判定的分子标志物，也是未来将复杂的分子标志物转化为临床应用的趋势所在。
发明内容
针对上述问题，发明的目的在于提供用于NTDs胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用，所述分子标志物为hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d三种miRNAs组成，可用于神经管畸形产前筛查，为神经管畸形治疗提供新的靶点。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种检测分子标志物含量的试剂在制备用于NTDs胎儿产前筛查、预警、诊断的产品中的应用，其特征在于，所述分子标志物由hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中一种或者多种miRNAs组成。
进一步地，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸，高通量测序平台，聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或芯片检测相关方法。
进一步地，所述产品检测样品为孕妇血液样本。
进一步地，所述检测hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中一种或者多种含量的试剂为特异性识别或扩增hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中一种或者多种的试剂。
进一步地，所述检测hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中一种或者多种的试剂为hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中一种或者多种的特异性探针或引物。
本发明还提供了一种用于NTDs胎儿产前筛查、预警和诊断的工具，所述工具能够检测上述miRNAs的表达量。
进一步地，所述工具包括能够定量NTDs胎儿产前无创诊断分子标志物hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中一种或者多种miRNAs组成。
进一步地，所述用于NTDs胎儿产前筛查、预警和诊断的工具包括芯片、试剂盒、试纸和高通量测序平台等。
本发明还提供了一种神经管畸形产前筛查、预警和诊断的方法，所述方法包括如下步骤。
(1）本发明获取受试者的血清样品，从母体血清中分离的总RNA 被去磷酸化并与pCp-Cy3连接。根据Sanger miRBase release 14.0，纯化标记RNA并将其杂交成含有887个人类成熟miRNA探针的miRNA阵列。使用Agilent微阵列扫描仪清洗和扫描阵列，提取评估各混合化信号的强度。初步筛选出患有NTD胎儿的孕妇血清中的miRNAs分子标志物特征。
(2)本发明进一步扩大样本验证，即利用实时定量PCR 验证三个hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d在母体血清中的表达。
(3)本发明利用ROC曲线分析评估其诊断胎儿NTDs的临床应用价值，制备用于神经管畸形胎儿产前筛查、预警、临床诊断的工具。
本发明中所述PCR方法为已知方法，利用RT-PCR(逆转录酶-PCR)法，原位RT-PCR法来检测。
本发明中引物和探针通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。
本发明所述的样品来自受试孕妇血液。
本发明提供了一种用于NTDs胎儿产前筛查、预警和诊断的工具，所述工具能够检测上述miRNAs的表达量。
本发明中的高通量测序平台是一种特殊工具，通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，分析与疾病相关的异常基因。因此，从高通量测序中获知上述与NTDs相关的差异表达分子属于使用了本发明的新用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明中NTDs胎儿产前筛查、预警和诊断包括判断受试者胎儿是否出现NTDs表型，判断受试者胎儿是否存在患有NTDs的风险。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明首次发现并证实在孕妇血中hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d的表达异常与NTDs胎儿的发生具有密切相关性，验证的样本量较多，结果准确。
本发明提供的用于NTDs胎儿产前无创诊断相关的miRNAs标志物，提供miRNAs胎儿产前诊断或风险监控的服务，协作或独立地向医院和诊所销售诊断和预后的咨询服务。
本发明提供的用于miRNAs胎儿产前无创诊断相关的miRNA标志物为NTDs胎儿产前筛查、预警和诊断提供了新的途径。
附图说明
图1 差异倍数大于1.5倍的差异表达的miRNAs的聚类分析和KEGG分析。（A）NTDs组和对照组差异表达的miRNAs聚类分析热图。(B) NTDs组和对照组差异表达miRNAs的KEGG功能富集分析气泡图。
图2 hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d在孕有NTDs胎儿和正常胎儿的孕妇血清中的表达。
图3 hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d的ROC曲线分析结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用孕妇外周血标本来源于盛京出生队列样本库，并获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准（批准号：2017PS264K）。
实施例1应用miRNA芯片技术在NTDs孕妇外周血中筛选差异表达miRNAs及生物信息学分析。
1、分离血清。
采集全血样品，于促凝管中，轻柔颠倒混匀后，使用4℃低温离心机，1600×g离心10min，离心后收集上清（血清）至新的EP管中，16000×g离心10min去除细胞碎片，将血清分装到多个离心管中，于-80℃低温冰箱中冻存。
2、miRNA芯片检测和生物信息学分析。
纳入孕妇年龄和孕周相匹配的3名孕有NTDs胎儿的孕妇和3名孕有健康胎儿的孕妇，其临床特征见表1。分离提取血清，从母体血清中分离的总RNA 被去磷酸化并与pCp-Cy3连接。根据Sanger miRBase release 14.0，纯化标记RNA并将其杂交成含有887个人类成熟miRNA探针的miRNA阵列。使用Agilent微阵列扫描仪清洗和扫描阵列，提取评估各混合化信号的强度。并进行深入的生物信息学分析筛选出患有NTD胎儿的孕妇血清中产前诊断的miRNA分子标志物。
3、miRNA芯片筛选的差异miRNA。
在887个人类成熟miRNA探针的miRNA阵列中，NTDs和对照组血清中分别探测到104个和156个miRNA。按照差异表达倍数变化1.5倍以上且p<0.05的标准筛选差异表达miRNA，其中21个miRNA在NTDs中表达下调，7个miRNA在NTDs中表达上调。
4、差异表达的miRNAs进行聚类分析。
本项目采用层次聚类算法对miRNA芯片结果中1.5倍差异变化倍数的28个miRNA分别进行聚类分析，并以热图形式进行数据展示，揭示了NTDs组与对照组之间的显著不同表达模式（图1A）。
5、差异表达的miRNA靶基因功能富集分析。
经过KEGG通路分析发现，差异表达miRNA的靶基因主要参与了Pathways ofneurodegeneration和Transcriptional misregulatio等可能与神经系统疾病相关的重要生物学过程（图1B）。
实施例2在验证集中验证hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d作为分子标志物的诊断效能。
1、纳入研究样本。
验证集中共纳入孕有健康胎儿的孕妇和孕有NTDs胎儿的孕妇各30例，其临床特征见表1。按实施例1方法分离血清。
表1. 用于miRNA芯片和qRT-PCR检测的孕妇临床特征
。
2、miRNA引物设计合成以及实时定量PCR的方法检测miRNA（miR-223,miRNA-187和let-7d）的表达。
根据目的基因的序列，miRNA引物由上海生工生物工程有限公司合成。管家基因选择U6。用mirVana PARIS (Ambion）试剂盒提取RNA，并用PrimeScript RT reagent kit(Takara）反转录 RNA。以 U6 为内参，用 SYBR Premix Ex Taq (Takara)试剂盒进行实时荧光定量 PCR，对hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d的表达情况在30名孕有NTDs孕妇和名健康对照孕妇血清中进行检测。引物序列如下：hsa-miR-223 F链为GTCAGTTTGTCAAATACCCC，R链为GCTGTCAACGATACGCTACG；hsa-miR-187 F 链为GCTACAACACAGGACCCGGGC ，R链为GCTGTCAACGATACGCTACG；hsa-let-7d F 链为GCAGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT，R链为GCTGTCAACGATACGCTACG。检测结果显示，hsa-miR-223在NTDs胎儿母亲血清的表达量明显降低，hsa-miR-187和hsa-let-7d在NTDs胎儿母亲血清的表达量明显升高，与正常孕妇组相比存在统计学差异（图2）。
3、绘制ROC曲线。
ROC曲线分析hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d诊断NTDs的ROC曲线下面积分别为0.708、0.688、0.728（p<0.05）。三种miRNA联合诊断NTDs的ROC曲线下面积分别为0.834，p＜0.01。结果表明，hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d可作为NTDs胎儿产前诊断的分子标志物（图3，表2）。
表2. 孕妇血清中miRNAs对NTDs和对照组胎儿的诊断能力的ROC分析
AUC：ROC曲线下面积曲线下面积；CI：置信区间。
综上所述，本发明提供用于NTDs胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用，可用于神经管畸形产前筛查，为神经管畸形治疗提供新的靶点，具有重大的临床意义。
Claims (8)
1.一种检测分子标志物含量的试剂在制备用于NTDs胎儿产前筛查、预警、诊断的产品中的应用，其特征在于，所述分子标志物由hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中的一种或者多种miRNAs组成。
2.如权利要求1所述的额应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸，高通量测序平台，聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或芯片检测相关方法。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品检测样品为孕妇血液样本。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中的一种或者多种含量的试剂为特异性识别或扩增hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中的一种或者多种的试剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中的一种或者多种的试剂为hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中的一种或者多种的特异性探针或引物。
6.一种用于NTDs胎儿产前筛查、预警和诊断的工具，所述工具能够检测上述miRNAs的表达量。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够定量NTDs胎儿产前无创诊断分子标志物hsa-miR-223、hsa-miR-187和hsa-let-7d中的一种或者多种miRNAs组成。
8.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述用于NTDs胎儿产前筛查、预警和诊断的工具包括芯片、试剂盒、试纸和高通量测序平台等。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310763600.2A CN116716396A (zh) | 2023-06-27 | 2023-06-27 | microRNAs作为神经管畸形的无创产前筛查分子标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310763600.2A CN116716396A (zh) | 2023-06-27 | 2023-06-27 | microRNAs作为神经管畸形的无创产前筛查分子标志物及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116716396A true CN116716396A (zh) | 2023-09-08 |
Family
ID=87871334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310763600.2A Pending CN116716396A (zh) | 2023-06-27 | 2023-06-27 | microRNAs作为神经管畸形的无创产前筛查分子标志物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116716396A (zh) |
-
2023
- 2023-06-27 CN CN202310763600.2A patent/CN116716396A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20190136330A1 (en) | Method for screening cancer | |
| TW201833329A (zh) | 腫瘤檢測之方法及系統 | |
| JP2018533953A (ja) | 胎児と妊娠女性との間において差次的にメチル化されるｄｎａ領域を用いる胎児染色体異数性の検出 | |
| JP7306723B2 (ja) | 遺伝子のｃｐｇメチル化変化を用いた肝癌の予後または危険度を評価する方法 | |
| CN106574296A (zh) | 用于测定dna的组织或细胞来源的方法和试剂盒 | |
| CN106661609B (zh) | 用于预测先天性心脏缺陷的方法 | |
| EP3249051B1 (en) | Use of methylation sites in y chromosome as prostate cancer diagnosis marker | |
| US20210254179A1 (en) | Set of genes for molecular classifying of medulloblastoma and use thereof | |
| US20150031574A1 (en) | Method for classification of test body fluid sample | |
| CN107988366B (zh) | 一种用于诊断评估乳腺癌的试剂盒、甲基化hoxa4/dpp6基因的检测及其应用 | |
| CN104087672A (zh) | 一种多重实时荧光定量pcr技术快速检测人21号染色体数目的试剂盒 | |
| US20150038358A1 (en) | Methods for detecting trisomy 21 | |
| US11821036B2 (en) | Methods for identifying and monitoring pregnant women at risk of preeclampsia | |
| CN111944893B (zh) | 与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用 | |
| CN111944894B (zh) | 用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用 | |
| CN116716396A (zh) | microRNAs作为神经管畸形的无创产前筛查分子标志物及其应用 | |
| CN112760365B (zh) | 一种适用于产前无创的poag基因检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN112410414B (zh) | 孕妇血清外泌体miRNA标志物在制备胎儿先心病早期诊断产品中的应用及试剂盒 | |
| CN104087671A (zh) | 一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒 | |
| CN114941025A (zh) | 用于诊断子痫前期的miRNA及其应用 | |
| CN109423514A (zh) | 反复自然流产相关微小rna及其应用 | |
| CN109628594B (zh) | 一种与肝癌相关的长链非编码rna及其应用 | |
| CN112899358A (zh) | 一种无创产前胎儿染色体非整倍体的检测方法及其试剂盒 | |
| CN105316420A (zh) | 一种单管四色双重相对荧光定量pcr技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒 | |
| CN114032297B (zh) | 一种与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体miRNA标志物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |