CN113481290B - 一种klf4基因在制备检测和/或减少母鼠不良妊娠结局的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域。具体涉及一种KLF4基因在制备检测和/或减少母鼠不良妊娠结局的产品中的应用。本发明通过体内试验发现，KLF4可以作为检测或减少母鼠不良妊娠结局的分子标志物，为检测母鼠不良妊娠结局提供了有力的理论基础和技术支持，克服了传统检测技术的不足和缺点，具有检测更为简便快速，成本更低，准确率、灵敏度和特异性更高等优点，而且为后续研究制备减少母鼠不良妊娠结局产品提供了启示和可能性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种KLF4基因在制备检测和/或减少母鼠不良妊娠结局的产品中的应用。
背景技术
随着妊娠的进行，母体为确保胚胎对养分的大量摄取，母胎间营养素浓度差逐渐增大，母体胰岛素敏感性降低，为了维持正常糖代谢状态，母体胰岛素分泌量就需日渐增加，对于胰岛素分泌受限的母体而言，妊娠中晚期因不能维持这一生理代偿变化即可导致血糖升高，就诱发了妊娠期糖尿病。妊娠期糖尿病与流产、早产、巨大胎儿、胎儿宫内发育异常、新生儿低血糖、新生儿呼吸窘迫综合征及先兆子痫不良结局的发生密切相关，因而增加了围生儿病死率。妊娠糖尿病母体胎盘形态发生变化，主要表现为绒毛不成熟，绒毛和毛细血管表面交换面积的增大以及小毛孔间隙的减少。
KLF4作为转录因子参与了细胞的多种生物学事件，如增殖、分化及迁移、器官形成等过程。有文献指出KLF4可参与血管生成，且主要通过调控内皮细胞受损产生的炎症反应、内皮细胞功能等方式实现的。在过去几年里，人们致力于探究KLF4在修复损伤体外血管中的作用，但迄今为止，未能利用高脂饲喂构建母鼠糖耐受不良体内模型，深入研究KLF4基因对妊娠期糖尿病导致的不良妊娠结局的影响。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种KLF4基因在制备检测和/或减少母鼠不良妊娠结局的产品中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种KLF4基因在制备检测和/或减少母鼠不良妊娠结局的产品中的应用；
所述的母鼠不良妊娠结局与母鼠糖耐受不良相关；
所述的不良妊娠结局包括胚胎吸收率提高、宫胚重下降、胎盘重下降、胎盘总面积下降、胎盘迷宫区面积下降和血窦状面积占比下降中的至少一种；
所述的检测母鼠不良妊娠结局的产品包括：通过以基因组DNA为模板的PCR、RT-PCR、实时定量PCR(qPCR)、DNA测序、免疫检测、蛋白芯片、原位杂交或基因芯片检测母鼠不良妊娠结局的产品；
所述的通过以基因组DNA为模板的PCR检测母鼠不良妊娠结局的产品包括至少一对特异性扩增KLF4基因的引物；
所述的通过RT-PCR检测母鼠不良妊娠结局的产品包括至少一对特异性扩增KLF4基因的引物；
所述的通过实时定量PCR检测母鼠不良妊娠结局的产品包括至少一对特异性扩增KLF4基因的引物；
所述的特异性扩增KLF4基因的引物包含引物KLF4-F和KLF4-R，其核苷酸序列如下所示：
引物KLF4-F：CTATGCAGGCTGTGGCAAAACC；
引物KLF4-R：TTGCGGTAGTGCCTGGTCAGTT；
所述的通过DNA测序检测母鼠不良妊娠结局的产品包括至少一对特异性扩增KLF4基因的引物；
所述的通过免疫检测检测母鼠不良妊娠结局的产品包括：与KLF4基因编码的蛋白特异性结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；
所述的通过蛋白芯片检测母鼠不良妊娠结局的产品包括：与KLF4基因编码的蛋白特异性结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；
所述的通过原位杂交检测母鼠不良妊娠结局的产品包括：与KLF4基因的核酸序列杂交的探针；
所述的通过基因芯片检测母鼠不良妊娠结局的产品包括：与KLF4基因的核酸序列杂交的探针；
本发明的原理：
本发明以C57BL/6J母鼠为研究对象，在妊娠期饲喂高脂日粮发现，高脂饲喂后母鼠葡萄糖耐受量试验下血糖AUC、血糖水平、胰岛素水平、以及HOMA-IR值显著提高，HOMA-IS值显著降低，这标志着母鼠妊娠期糖耐受不良模型建立成功。
在母鼠妊娠期糖耐受不良模型建立的基础上，进一步研究发现：母鼠妊娠期糖耐受不良显著提高了胚胎吸收率、降低了宫胚重、胎盘重、胎盘总面积、胎盘迷宫区面积和血窦状面积占比等，同时降低了胎盘KLF4表达，且KLF4蛋白表达水平与血糖AUC成显著负相关。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过体内试验发现，母鼠妊娠期糖耐受不良的加剧显著提高了胚胎吸收率、降低了宫胚重、胎盘重、胎盘总面积、胎盘迷宫区面积和血窦状面积占比等，同时降低了KLF4表达，且葡萄糖耐受试验下血糖AUC与宫胚重、胎盘KLF4蛋白表达量呈负相关，与吸收胎数、胎鼠重有呈正相关趋势。上述结果表明母鼠糖耐受加剧严重损伤妊娠结局，且胎盘KLF4表达与母体糖耐受量有关。
(2)本发明首次发现KLF4可以作为检测或减少母鼠不良妊娠结局的分子标志物，为检测母鼠不良妊娠结局提供了有力的理论基础和技术支持，克服了传统检测技术的不足和缺点，具有检测更为简便快速，成本更低，准确率、灵敏度和特异性更高等优点。
(3)本发明对制备妊娠期糖尿病的早期检测和治疗相关产品具有重要的指导意义，有望为研制备孕期或孕早期人工干预妊娠期糖尿病、治疗妊娠期糖尿病的营养策略或产品提供理论依据。
附图说明
图1是繁殖日粮饲喂的空怀母鼠、繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠和高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠的糖耐受量差异比较图，其中，a：繁殖日粮饲喂的空怀母鼠和妊娠后期母鼠的葡萄糖耐受量试验结果；b：繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠和高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠的葡萄糖耐受量试验结果，c：繁殖日粮饲喂的空怀母鼠、繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠和高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠相对糖耐受量的差异比较，d：繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠和高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠母鼠血清中葡萄糖浓度和胰岛素浓度；e：繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠和高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠血清胰岛素抵抗指数，HOMA-IR代表母鼠血清“胰岛素抵抗指数”，HOMA-IS代表母鼠血清“胰岛素敏感性指数”。
图2是妊娠后期母鼠糖耐受不良对母鼠胎儿胎盘生长的影响图，其中，a：宫胚重(g)结果分析；b：总胎数结果分析；c：胚胎吸收率(％)结果分析；d：胎鼠重(g)结果分析；e：胎盘重(g)结果分析。
图3是胎儿胎盘指标与对应母鼠的葡萄糖耐受量试验下的血糖AUC的相关性分析图，其中，a：宫胚重与AUC的相关性分析，b：总胎数与AUC的相关性分析，c：吸收胎数与AUC的相关性分析，d：胎鼠重与AUC的相关性分析，e：胎盘重与AUC的相关性分析。
图4是妊娠后期母鼠糖耐受不良对母鼠胎盘形态的影响图，其中，a：母鼠胎盘PAS染色的形态，b：胎盘迷宫区面积(mm2)，c：胎盘连接区面积(mm2)；d：胎盘面积(mm2)，e：胎盘迷宫区占胎盘总面积占比(％)，f：胎盘血窦状形态，g：胎盘迷宫区血窦状面积占比。
图5是妊娠后期母鼠糖耐受不良对母鼠胎盘基因表达的影响图，其中，a：胎盘基因表达，b：KLF4免疫印迹和表达统计，c：胎盘KLF4蛋白表达水平与AUC的相关性分析。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1空怀母鼠、妊娠后期母鼠与高脂饲喂妊娠后期母鼠的糖耐受量差异比较
1、小鼠分组和处理
购买7周龄C57BL/6J母鼠及8周龄C57BL/6J公鼠(购自广东省医学实验动物中心)各40只，以协同医药生物工程公司生产的维持日粮(碳水化合物含量：58％，蛋白含量：18％，脂肪含量：4.5％)预饲1周，小鼠适应环境予以配种。配种前，将母鼠公鼠合笼，母鼠：公鼠＝1：1，第二天早上6:30检查阴道栓，发现有阴栓即为妊娠成功，并确定当天为胚胎孕龄0.5天(E0.5)，挑出妊娠母鼠单笼饲养，连续一周未妊娠的母鼠予以淘汰。按照母鼠妊娠时间，进行后续试验。
2、葡萄糖耐量试验
(1)根据体重一致原则，将空怀母鼠和成功妊娠后的母鼠分为两组，分别为空怀母鼠组(N＝11)、妊娠后期母鼠组(N＝8)；两组均饲喂生长繁殖日粮(碳水化合物含量：58％，蛋白含量：20.8％，脂肪含量：5.6％，购于江苏省协同医药生物工程公司)，饲喂期为妊娠期18天。妊娠期17.5天(E17.5)上午8点对上述两组小鼠进行葡萄糖耐量试验(GTT)试验(GTT试验前一天下午8点禁食12h)，具体方法为：提前配制浓度为0.1g/mL的葡萄糖溶液，放置4℃保存，使用前放置室温混合均匀；用刀片刮下小鼠尾巴末端，轻挤小鼠尾巴，让血液富集成一滴，用血糖仪测定空腹血糖，测定值为0min的血糖值，称重、让小鼠适应30min后，母鼠按照每1g体重腹腔注射1mg葡萄糖溶液的比例注射葡萄糖溶液，在15min、30min、60min、90min及120min采血并测定血糖值。
(2)成功妊娠后的母鼠根据体重一致原则，分为高脂(HF)组(N＝8)和对照组(CON)(N＝10)；其中，高脂组妊娠期间给予高脂日粮(碳水化合物含量：26.3％，蛋白含量：26.2％，脂肪含量：34.9％，购于江苏省协同医药生物公司)，对照组饲喂生长繁殖日粮(碳水化合物含量：58％，蛋白含量：20.8％，脂肪含量：5.6％，购于江苏省协同医药生物工程公司)，饲喂期为妊娠期18天。对上述两组小鼠进行GTT试验，具体方法同步骤(1)；此外，在母鼠妊娠期18.5天，摘眼球后在眼眶处采集血液样品，分离血清，然后通过颈椎脱位处死。
3、母鼠HOMA稳态模型指数测定
(1)将步骤2(2)获得的母鼠血清进行葡萄糖和胰岛素含量检测，具体方法分别按照南京建成生物工程研究所研制的试剂盒、江苏酶免实业有限公司试剂盒操作说明书进行。
(2)稳态模式评估(HOMA)已成为广泛应用于评价血糖的胰岛素敏感性与胰岛素抵抗水平。其中HOMA-IR是用于评价个体的胰岛素抵抗水平的指标。计算方法如下：(空腹血糖水平(mmol/L)×空腹胰岛素水平(mIU/L))/22.5；HOMA-IS是用于评价个体的胰岛素敏感性的指标。计算方法如下：1/(空腹血糖水平(mmol/L)×空腹胰岛素水平(mIU/L))
4、试验结果
试验结果如图1a所示，结果发现：与空怀母鼠组相比，妊娠后期母鼠组葡萄糖耐量试验血糖AUC显著提高，证明妊娠后期母鼠存在糖耐受不良现象。而与繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠(对照组)相比，高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠的葡萄糖耐量试验血糖AUC显著提高，证明高脂下母鼠的糖耐受不良进一步加剧(图1b)。结合上述结果，进一步分析空怀母鼠、繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠和高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠的血糖AUC，可发现空怀母鼠、繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠和高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠糖耐受不良逐渐加剧(图1c)。
另外，高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠血糖、胰岛素及HOMA-IR值显著提高，HOMA-IS显著降低，表明与繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠相比，高脂饲喂下母鼠胰岛素抵抗严重加剧(图1d～e)。
实施例2妊娠后期母鼠糖耐受不良对母鼠胎儿胎盘生长的影响
1、组织样品的采集及数据记录
(1)由实施例1可知：与空怀母鼠相比，繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠和高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠均存在糖耐受不良现象，且高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠的糖耐受不良更为严重，本实施例在实施例1的基础上，进一步研究妊娠后期母鼠糖耐受不良对母鼠胎儿胎盘生长的影响，具体方法为：将实施例1步骤2(2)通过颈椎脱位处死的妊娠后期母鼠进行解剖，得到子宫-胎盘-胎儿复合物；
(2)解剖出子宫-胎盘-胎儿复合物后用滤纸将多余血迹除去后称量得宫胚重(即子宫-胎盘-胎儿复合物)，然后放在培养皿中(放置于冰块中)，用镊子固定子宫一端，用小手术剪沿子宫的系膜侧将子宫从阴道端向卵巢端一次性剪开，然后用小镊子拔出包裹有蜕膜的胚胎，分离胎盘和胎儿，在预冷的PBS溶液中冲洗，用滤纸吸干多余水分，用天平称量胎盘重、胎鼠重，记录胚胎总数。计算每只母鼠的胚胎吸收率，胚胎吸收率＝该母鼠被吸收的胚胎数/总胚胎数。同时，收集胎盘分子样，置于-80℃保存备用；另取胎盘分子样固定在多聚甲醛溶液中，切片染色备用。
(3)将实施例1中E17.5天GTT试验获得的母鼠血糖AUC数据与本实施例得到的其对应E18.5天解剖后的宫胚重、胚胎总数、吸收胎数、胎盘重及胎鼠重数据进行相关性分析。
2、试验结果
宫胚重反映的是母鼠整体胚胎发育程度，胎鼠重反映胚胎生长的变化，胎盘作为连接胎儿与母鼠的唯一器官，胎盘重代表着胎盘的生长发育，可间接反映了胎盘发挥功能的情况。胚胎吸收率则是反映胚胎发育所限，形成吸收胎的程度。试验结果如图2所示：高脂饲喂导致妊娠后期母鼠胚胎吸收率显著提高，胎盘重显著下降，进一步说明了高脂饲喂导致胎儿胎盘生长受限。
在上述结果的基础上，进一步分析GTT试验下的血糖AUC与胎儿胎盘生长的相关性，结果见图3。从图3可知：GTT试验下的血糖AUC与宫胚重呈显著负相关，葡萄糖耐受量试验下的血糖AUC与吸收胎数及胎鼠重有呈正相关的趋势。进一步说明了随着糖耐受不良的逐步加深，母鼠的宫胚重逐渐降低，而吸收胎数量逐渐增加，胎鼠逐渐增大，即母鼠的糖耐受不良与胎儿胎盘生长有相关性，母鼠的糖耐受不良的加剧导致胎儿胎盘生长受限。
综上，妊娠期间糖耐受不良对胎儿胎盘生长发育具有一定的影响，调控母体妊娠期间的糖耐受状态非常必要，可以避免病理性妊娠结局。
实施例3妊娠后期母鼠糖耐受不良对母鼠胎盘形态的影响
1、小鼠胎盘过碘酸希夫染色
将实施例2固定在多聚甲醛溶液中的胚胎分子样切片进行过碘酸希夫染色(PAS)(武汉博尔夫公司)，具体方法为：每组选取8～10个胎盘沿正中矢状面切开封片石蜡包埋胎盘；采用PAS染色区分胎盘连接区(JZ)和迷宫区(LZ)的边界以检测胎盘结构的变化；采用Case Viewer软件统计JZ和LZ面积；采用Image J软件统计迷宫区内血窦状面积占比以检测胎盘迷宫区血流量变化。
2、试验结果
胎盘总面积及迷宫区面积可反映胎盘结构与形态的变化。试验结果如图4所示，高脂饲喂下胎盘总面积及迷宫区面积有降低的趋势。鼠胎盘主要由迷宫区、连接区和脱膜组成，滋养层处于迷宫区域，是母体向胎儿进行营养物质转运的主要部分；同时迷宫区也是血管组成高度发达的组织部分。胎盘总面积及迷宫区面积的降低意味着妊娠后期母鼠糖耐受不良加剧下母鼠胎盘形态受损，间接反映了胎盘功能可能受到损伤。胎盘迷宫区血窦状面积可直接反映胎盘血流量，间接反映母体与胎儿物质的运输效率，结果表明高脂组的血窦状面积占比显著低于对照组，提示了妊娠后期母鼠糖耐受不良加剧下血流量降低，可能导致较低的胎盘营养转运效率。
综上所述，妊娠后期母鼠糖耐受不良加剧可能通过损伤胎盘结构和形态影响着胎盘功能。
实施例4妊娠后期母鼠糖耐受不良对母鼠胎盘基因表达的影响
1、试验材料与方法
(1)取实施例2中收集保存的胎盘分子样，提取RNA并反转录，得到cDNA，然后按照常规方法进行q-PCR试验，检测妊娠后期母鼠糖耐受不良对基因CD34、CD36、SLC38A1、SLC38A4、MCT-1、MCT-4、PDGFA、PDGFRA、IGF-1R及KLF4(其cDNA的序列如下所示)等的表达量的影响，其中，扩增引物用Primer 3进行设计，引物序列见表1，用NCBI中的blast对引物验证，再由生工生物工程股份有限公司广州合成部合成，经普通PCR摸索最佳退火温度并验证产物单一性后再进行荧光定量PCR试验。
KLF4基因cDNA的序列(下横线部分为引物序列)：
AGTTCCCCGGCCAAGAGAGCGAGCGCGGCTCCGGGCGCGCGGGGAGCAGAGGCGGTGGCGGGCGGCGGCGGCACCCGGAGCCGCCGAGTGCCCCTCCCCGCCCCTCCAGCCCCCCACCCAGCAACCCGCCCGTGACCCGCGCCCATGGCCGCGCGCACCCGGCACAGTCCCCAGGACTCCGCACCCCGCGCCACCGCCCAGCTCGCAGTTCCGCGCCACCGCGGCCATTCTCACCTGGCGGCGCCGCCCGCCCACCGCCCGGACCACAGCCCCCGCGCCGCCGACAGCCACAGTGGCCGCGACAACGGTGGGGGACACTGCTGAGTCCAAGAGCGTGCAGCCTGGCCATCGGACCTACTTATCTGCCTTGCTGATTGTCTATTTTTATAAGAGTTTACAACTTTTCTAAGAATTTTTGTATACAAAGGAACTTTTTTAAAGACATCGCCGGTTTATATTGAATCCAAAGAAGAAGGATCTCGGGCAATCTGGGGGTTTTGGTTTGAGGTTTTGTTTCTAAAGTTTTTAATCTTCGTTGACTTTGGGGCTCAGGTACCCCTCTCTCTTCTTCGGACTCCGGAGGACCTTCTGGGCCCCCACATTAATGAGGCAGCCACCTGGCGAGTCTGACATGGCTGTCAGCGACGCTCTGCTCCCGTCCTTCTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGTCCAGCAGGTGCCCCGACTAACCGTTGGCGTGAGGAACTCTCTCACATGAAGCGACTTCCCCCACTTCCCGGCCGCCCCTACGACCTGGCGGCGACGGTGGCCACAGACCTGGAGAGTGGCGGAGCTGGTGCAGCTTGCAGCAGTAACAACCCGGCCCTCCTAGCCCGGAGGGAGACCGAGGAGTTCAACGACCTCCTGGACCTAGACTTTATCCTTTCCAACTCGCTAACCCACCAGGAATCGGTGGCCGCCACCGTGACCACCTCGGCGTCAGCTTCATCCTCGTCTTCCCCGGCGAGCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCAGCTATCCGATCCGGGCCGGGGGTGACCCGGGCGTGGCTGCCAGCAACACAGGTGGAGGGCTCCTCTACAGCCGAGAATCTGCGCCACCTCCCACGGCCCCCTTCAACCTGGCGGACATCAATGACGTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCTGAGCTCCTGCGGCCGGAGTTGGACCCAGTATACATTCCGCCACAGCAGCCTCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTTTGTGCTGAAGGCGTCTCTGACCACCCCTGGCAGCGAGTACAGCAGCCCTTCGGTCATCAGTGTTAGCAAAGGAAGCCCAGACGGCAGCCACCCCGTGGTAGTGGCGCCCTACAGCGGTGGCCCGCCGCGCATGTGCCCCAAGATTAAGCAAGAGGCGGTCCCGTCCTGCACGGTCAGCCGGTCCCTAGAGGCCCATTTGAGCGCTGGACCCCAGCTCAGCAACGGCCACCGGCCCAACACACACGACTTCCCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCACCAGGACTACCCCTACACTGAGTCCCGAGGAACTGCTGAACAGCAGGGACTGTCACCCTGGCCTGCCTCTTCCCCCAGGATTCCATCCCCATCCGGGGCCCAACTACCCTCCTTTCCTGCCAGACCAGATGCAGTCACAAGTCCCCTCTCTCCATTATCAAGAGCTCATGCCACCGGGTTCCTGCCTGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGAAGGTCGTGGCCCCGGAAAAGAACAGCCACCCACACTTGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAAACCTATACCAAGAGTTCTCATCTCAAGGCACACCTGCGAACTCACACAGGCGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTGGGTGGAAATTCGCCCGCTCCGATGAACTGACCAGGCACTACCGCAAACACACAGGGCACCGGCCCTTTCAGTGCCAGAAGTGTGACAGGGCCTTTTCCAGGTCGGACCACCTTGCCTTACACATGAAGAGGCACTTTTAAATCCCACGTAGTGGATGTGACCCACACTGCCAGGAGAGAGAGTTCAGTATTTTTTTTTCTAACCTTTCACACTGTCTTCCCACGAGGGGAGGAGCCCAGCTGGCAAGCGCTACAATCATGGTCAAGTTCCCAGCAAGTCAGCTTGTGAATGGATAATCAGGAGAAAGGAAGAGTTCAAGAGACAAAACAGAAATACTAAAAACAAACAAACAAAAAAACAAACAAAAAAAACAAGAAAAAAAAATCACAGAACAGATGGGGTCTGATACTGGATGGATCTTCTATCATTCCAATACCAAATCCAACTTGAACATGCCCGGACTTACAAAATGCCAAGGGGTGACTGGAAGTTTGTGGATATCAGGGTATACACTAAATCAGTGAGCTTGGGGGGAGGGAAGACCAGGATTCCCTTGAATTGTGTTTCGATGATGCAATACACACGTAAAGATCACCTTGTATGCTCTTTGCCTTCTTAAAAAAAAAAAAAGCCATTATTGTGTCGGAGGAAGAGGAAGCGATTCAGGTACAGAACATGTTCTAACAGCCTAAATGATGGTGCTTGGTGAGTCGTGGTTCTAAAGGTACCAAACGGGGGAGCCAAAGTTCTCCAACTGCTGCATACTTTTGACAAGGAAAATCTAGTTTTGTCTTCCGATCTACATTGATGACCTAAGCCAGGTAAATAAGCCTGGTTTATTTCTGTAACATTTTTATGCAGACAGTCTGTTATGCACTGTGGTTTCAGATGTGCAATAATTTGTACAATGGTTTATTCCCAAGTATGCCTTTAAGCAGAACAAATGTGTTTTTCTATATAGTTCCTTGCCTTAATAAATATGTAATATAAATTTAAGCAAACTTCTATTTTGTATATTTGTAAACTACAAAGTAAAAAAAAATGAACATTTTGTGGAGTTTGTATTTTGCATACTCAAGGTGAGAAATAAGTTTTAAATAAACCTATAATATTTTATCTGAACGACAAAAAAAAAAAAAAA
表1小鼠的基因引物序列
(2)将实施例2中收集保存的胎盘分子样进行Western Blot试验，检测KLF4的蛋白表达水平；其中，一抗为anti-KLF4(兔源)购于美国abcam公司、β-actin(兔源)购于美国Cell Signaling Technology(CST)公司；二抗为rabbit-anti IgG抗体购于美国CST公司。
(3)步骤(2)得到的KLF4蛋白表达水平数据与实施例1中E17.5天GTT试验获得的母鼠血糖AUC数据进行相关性分析。
2、试验结果
与繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠胎盘相比，高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠胎盘KLF4的mRNA和蛋白表达水平显著降低(图5a和图5b)，而胎盘下检测的其他基因的mRNA表达量无显著变化。
将KLF4蛋白表达水平数据与实施例1中E17.5天GTT试验获得的母鼠血糖AUC数据进行相关性分析，发现KLF4蛋白表达水平与AUC成显著负相关(图5c)，说明随着糖耐受不良的加剧，KLF4蛋白表达量逐渐降低。
本发明通过小鼠体内试验发现：与空怀母鼠相比，繁殖日粮饲喂的妊娠后期母鼠和高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠均存在一定程度糖耐受不良现象，且高脂日粮饲喂的妊娠后期母鼠糖耐受不良更为严重，在此基础上，本发明进一步研究了妊娠后期母鼠糖耐受不良的不同程度情况下对母鼠胎儿胎盘生长和形态的影响，并进行了相关性分析，进一步说明了妊娠后期母鼠糖耐受不良会导致胎儿胎盘生长受限，且可能通过损伤胎盘结构和形态影响着胎盘功能。基于妊娠后期母鼠糖耐受不良导致的不良妊娠结局，本发明进一步研究了妊娠后期母鼠糖耐受不良的不同程度情况下胎盘基因的表达，结果发现随着糖耐受不良的加剧，KLF4蛋白表达量逐渐降低。进一步说明了KLF4可以作为检测或减少母鼠不良妊娠结局的分子标志物，为检测母鼠不良妊娠结局提供了有力的理论基础和技术支持，该技术克服了传统检测技术的不足和缺点，具有检测更为简便快速，成本更低，准确率、灵敏度和特异性更高等优点，而且为后续研究制备减少母鼠不良妊娠结局产品提供了启示和可能性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种KLF4基因在制备检测和/或减少母鼠不良妊娠结局的产品中的应用
<130> 1
<160> 23
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3057
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KLF4 基因cDNA的序列
<400> 1
agttccccgg ccaagagagc gagcgcggct ccgggcgcgc ggggagcaga ggcggtggcg 60
ggcggcggcg gcacccggag ccgccgagtg cccctccccg cccctccagc cccccaccca 120
gcaacccgcc cgtgacccgc gcccatggcc gcgcgcaccc ggcacagtcc ccaggactcc 180
gcaccccgcg ccaccgccca gctcgcagtt ccgcgccacc gcggccattc tcacctggcg 240
gcgccgcccg cccaccgccc ggaccacagc ccccgcgccg ccgacagcca cagtggccgc 300
gacaacggtg ggggacactg ctgagtccaa gagcgtgcag cctggccatc ggacctactt 360
atctgccttg ctgattgtct atttttataa gagtttacaa cttttctaag aatttttgta 420
tacaaaggaa cttttttaaa gacatcgccg gtttatattg aatccaaaga agaaggatct 480
cgggcaatct gggggttttg gtttgaggtt ttgtttctaa agtttttaat cttcgttgac 540
tttggggctc aggtacccct ctctcttctt cggactccgg aggaccttct gggcccccac 600
attaatgagg cagccacctg gcgagtctga catggctgtc agcgacgctc tgctcccgtc 660
cttctccacg ttcgcgtccg gcccggcggg aagggagaag acactgcgtc cagcaggtgc 720
cccgactaac cgttggcgtg aggaactctc tcacatgaag cgacttcccc cacttcccgg 780
ccgcccctac gacctggcgg cgacggtggc cacagacctg gagagtggcg gagctggtgc 840
agcttgcagc agtaacaacc cggccctcct agcccggagg gagaccgagg agttcaacga 900
cctcctggac ctagacttta tcctttccaa ctcgctaacc caccaggaat cggtggccgc 960
caccgtgacc acctcggcgt cagcttcatc ctcgtcttcc ccggcgagca gcggccctgc 1020
cagcgcgccc tccacctgca gcttcagcta tccgatccgg gccgggggtg acccgggcgt 1080
ggctgccagc aacacaggtg gagggctcct ctacagccga gaatctgcgc cacctcccac 1140
ggcccccttc aacctggcgg acatcaatga cgtgagcccc tcgggcggct tcgtggctga 1200
gctcctgcgg ccggagttgg acccagtata cattccgcca cagcagcctc agccgccagg 1260
tggcgggctg atgggcaagt ttgtgctgaa ggcgtctctg accacccctg gcagcgagta 1320
cagcagccct tcggtcatca gtgttagcaa aggaagccca gacggcagcc accccgtggt 1380
agtggcgccc tacagcggtg gcccgccgcg catgtgcccc aagattaagc aagaggcggt 1440
cccgtcctgc acggtcagcc ggtccctaga ggcccatttg agcgctggac cccagctcag 1500
caacggccac cggcccaaca cacacgactt ccccctgggg cggcagctcc ccaccaggac 1560
tacccctaca ctgagtcccg aggaactgct gaacagcagg gactgtcacc ctggcctgcc 1620
tcttccccca ggattccatc cccatccggg gcccaactac cctcctttcc tgccagacca 1680
gatgcagtca caagtcccct ctctccatta tcaagagctc atgccaccgg gttcctgcct 1740
gccagaggag cccaagccaa agaggggaag aaggtcgtgg ccccggaaaa gaacagccac 1800
ccacacttgt gactatgcag gctgtggcaa aacctatacc aagagttctc atctcaaggc 1860
acacctgcga actcacacag gcgagaaacc ttaccactgt gactgggacg gctgtgggtg 1920
gaaattcgcc cgctccgatg aactgaccag gcactaccgc aaacacacag ggcaccggcc 1980
ctttcagtgc cagaagtgtg acagggcctt ttccaggtcg gaccaccttg ccttacacat 2040
gaagaggcac ttttaaatcc cacgtagtgg atgtgaccca cactgccagg agagagagtt 2100
cagtattttt ttttctaacc tttcacactg tcttcccacg aggggaggag cccagctggc 2160
aagcgctaca atcatggtca agttcccagc aagtcagctt gtgaatggat aatcaggaga 2220
aaggaagagt tcaagagaca aaacagaaat actaaaaaca aacaaacaaa aaaacaaaca 2280
aaaaaaacaa gaaaaaaaaa tcacagaaca gatggggtct gatactggat ggatcttcta 2340
tcattccaat accaaatcca acttgaacat gcccggactt acaaaatgcc aaggggtgac 2400
tggaagtttg tggatatcag ggtatacact aaatcagtga gcttgggggg agggaagacc 2460
aggattccct tgaattgtgt ttcgatgatg caatacacac gtaaagatca ccttgtatgc 2520
tctttgcctt cttaaaaaaa aaaaaagcca ttattgtgtc ggaggaagag gaagcgattc 2580
aggtacagaa catgttctaa cagcctaaat gatggtgctt ggtgagtcgt ggttctaaag 2640
gtaccaaacg ggggagccaa agttctccaa ctgctgcata cttttgacaa ggaaaatcta 2700
gttttgtctt ccgatctaca ttgatgacct aagccaggta aataagcctg gtttatttct 2760
gtaacatttt tatgcagaca gtctgttatg cactgtggtt tcagatgtgc aataatttgt 2820
acaatggttt attcccaagt atgcctttaa gcagaacaaa tgtgtttttc tatatagttc 2880
cttgccttaa taaatatgta atataaattt aagcaaactt ctattttgta tatttgtaaa 2940
ctacaaagta aaaaaaaatg aacattttgt ggagtttgta ttttgcatac tcaaggtgag 3000
aaataagttt taaataaacc tataatattt tatctgaacg acaaaaaaaa aaaaaaa 3057
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD34-F
<400> 2
aggacagcag taagaccaca cc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD34-R
<400> 3
gtgtggagtt ccagagcctg aa 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> β-actin-F
<400> 4
gtccctcacc ctcccaaaag 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> β-actin-R
<400> 5
gctgcctcaa cacctcaacc c 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MCT-1-F
<400> 6
gaccattgtg gaatgctgcc ct 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MCT-1-R
<400> 7
cgatgatgag gatcacgcca ca 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MCT-4-F
<400> 8
tccatcctgc tggctatgct ct 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MCT-4-R
<400> 9
cagaaggacg cagccaccat tc 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD36-F
<400> 10
ggccaagcta ttgcgacatg 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD36-R
<400> 11
ccgaacacag cgtagataga c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SLC38A1-F
<400> 12
taccagagca caggcgacat tc 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SLC38A1-R
<400> 13
atggcggcac aggtggaact tt 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SLC38A4-F
<400> 14
ctcttcacag caatggcgtg ga 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SLC38A4-R
<400> 15
gacctcaggg tggcagacaa aa 22
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PDGFA-F
<400> 16
gcgactcttg gagatagact ccgta 25
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PDGFA-R
<400> 17
cgtaaatgac cgtcctggtc ttg 23
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PDGFRA-F
<400> 18
gccggtccca acctgtaatg 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PDGFRA-R
<400> 19
aggctcccag caagttcaca a 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IGF-1R-F
<400> 20
cgggatctca tcagcttcac ag 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IGF-1R-R
<400> 21
tccttgttcg gaggcaggtc ta 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KLF4-F
<400> 22
ctatgcaggc tgtggcaaaa cc 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KLF4-R
<400> 23
ttgcggtagt gcctggtcag tt 22
Claims (7)
1.一种检测KLF4基因的试剂在制备检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品包括：通过以基因组DNA为模板的PCR、DNA测序、免疫检测、蛋白芯片、原位杂交或基因芯片检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的通过以基因组DNA为模板的PCR检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品包括至少一对特异性扩增KLF4基因的引物；
所述的通过DNA测序检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品包括至少一对特异性扩增KLF4基因的引物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的通过以基因组DNA为模板的PCR检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品为通过RT-PCR检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品；
所述的通过RT-PCR检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品包括至少一对特异性扩增KLF4基因的引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述的特异性扩增KLF4基因的引物包含引物KLF4-F和KLF4-R，其核苷酸序列如下所示：
KLF4-F：CTATGCAGGCTGTGGCAAAACC；
KLF4-R：TTGCGGTAGTGCCTGGTCAGTT。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的通过免疫检测检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品包括：与KLF4基因编码的蛋白特异性结合的抗体；
所述的通过蛋白芯片检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品包括：与KLF4基因编码的蛋白特异性结合的抗体。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的通过原位杂交检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品包括：与KLF4基因的核酸序列杂交的探针；
所述的通过基因芯片检测与糖耐受不良相关的母鼠不良妊娠结局的产品包括：与KLF4基因的核酸序列杂交的探针。
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| WO2015137885A1 (en) * | 2014-03-11 | 2015-09-17 | Agency For Science, Technology And Research | Method for inducing pluripotency in a hematopoietic cell |
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| Role of Klf4 in the Regulation of Apoptosis and Cell Cycle in Rat Granulosa Cells during the Periovulatory Period.;Choi等;《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》;20190101;第20卷(第1期);参见全文 * |
| 妊娠子宫中CORIN基因表达的转录调控机制研究;王粲;《苏州大学博士学位论文》;20180301;参见全文 * |
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