CN1960753A - 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子拮抗剂在治疗过度血管发生相关疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

一种用细胞外基质金属蛋白酶诱导因子拮抗剂，通过特异性的防止或抑制新组织形成血管供给的能力，治疗伴有增生性疾病的病理进程例如癌症的方法。本发明尤其是关于通过使用EMMPRIN拮抗剂如直接针对EMMPRIN的抗体，包括特异部分或变体，特异性针对至少一种EMMPRIN蛋白或其片段，以抑制血管发生的有效剂量来治疗这种疾病的方法。

Description

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子拮抗剂在治疗过度 血管发生相关疾病中的用途

发明领域

本发明涉及使用EMMPRIN(细胞外基质金属蛋白酶诱导因子)拮抗剂，通过特异性的防止或抑制增生组织形成血管供给的能力，来治疗伴有增生性疾病的病理进程例如癌症的方法。本发明尤其涉及通过使用EMMPRIN拮抗剂如直接针对EMMPRIN的抗体，包括特异部分或变体，特异性针对至少一种蛋白或其片段，以抑制血管发生的有效剂量来治疗这种疾病的方法。

发明背景

EMMPRIN

血管发生是新血管形成的过程。在成人中，生理条件下如创伤愈合、月经期及妊娠期的血管发生仅出现于局部且仅持续片刻。相反，过度血管发生出现于超过70种疾病条件中，如癌症、动脉粥样硬化、糖尿病性失明、老年黄斑病变、类风湿性关节炎和银屑病。另一方面，在如冠状动脉疾病、中风和伤口愈合延迟的疾病中，血管发生不足。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一个超过20种内肽酶的家族，能剪切全部细胞外基质成分，在血管发生中发挥关键作用[Klagsbrun and Moses 1999]。毛细管内皮细胞被来自肿瘤、炎症位点或经受其他病理学条件的组织的血管发生刺激物激活，分解血管基膜，血管发生随之开始。活化的内皮细胞的MMP表达提高，并依次使散布的内皮细胞迁移，远离亲本血管。细胞只有逃逸后，才应答不同的生长因子以增殖，并最终经过一个复杂的分化过程形成新生血管。除尽MMP如MMP-2或MMP-9导致肿瘤血管发生的显著抑制，证明MMP在此过程中的关键作用[Bergers et al.2000；Fang et al.2000]。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)(也被称作CD147)是一个58kDa的糖蛋白，最初纯化自癌症细胞的质膜并因为能刺激肿瘤基质成纤维细胞合成胶原酶-1(MMP-1)而被指定为肿瘤胶原酶刺激因子(TCSF)[Biswas et al.1995；Ellis et al.1989]。已经证明它与M6抗原或人Basigen是完全相同的(Biswas et al，CancerRes.55：434，1995)。随后的研究进一步证明EMMPRIN也诱导成纤维细胞合成MMP-2、MMP-3以及功能为MMP-2内源活化剂的膜型1MMP(MT1-MMP)和MT2-MMP[Guo et al.1997；Kataoka et al.1993；Sameshima et al.2000b]。一些临床研究已经证明EMMPRIN的表达水平在肿瘤组织中明显高于癌旁基质组织。这些肿瘤包括肺[Polette etal.1997]、胸[Polette et al.1997]、膀胱[Javadpour and Guirguis 1992；Muraoka et al.1993]及神经胶质瘤[Sameshima et al.2000a]。用各种方法包括Northern杂交、原位杂交和免疫染色检查EMMPRIN在这些临床样本中的表达情况，揭示出EMMPRIN是由肿瘤细胞而不是毗邻的基质细胞所表达。另一方面，MMP是由癌旁基质细胞表达。用EMMPRIN-过表达的人乳癌细胞直接说明EMMPRIN在肿瘤生长和转移上的作用。当MDA MB 436细胞被植入裸小鼠中时，这些细胞正常的缓慢生长。不过，当这些细胞被EMMPRIN转染，它们则采用一种更强劲的生长模式，生长速率加快且出现转移表现型[Zuckeret al.2001]。

伴随不适当血管发生的病症

血管发生是产生新毛细血管的过程，起因于内皮细胞的活化增殖。新生血管形成被高度调节，仅在胚胎发育、组织重塑、创伤愈合及黄体发育的周期循环期间出现(Folkman及Cotran，血管增生与肿瘤生长的关系(Relation of vascular proliferation to tumor growth)，Int.Rev.Exp.Pathol.′16，207-248(1976))。

内皮细胞比机体内其他类型细胞的正常增殖要缓慢的多。不过，如果这些细胞的增殖速率变得不受调节，可导致病理上的血管发生。病理上的血管发生与许多疾病有关。例如，心血管疾病如血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形、动脉粥样硬化、虹膜粘连和特发性硬化(edemic sclerosis)、眼科(opthalmological)疾病如角膜移植后的新生血管生成、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、血管生成性角膜病、黄斑变性、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维组织增生症及粒性结膜炎，与血管发生有关。慢性炎性疾病如关节炎，皮肤病如银屑病、毛细血管扩张病、脓性肉芽肿、脂溢性皮炎、静脉曲张性溃疡、痤疮、红斑痤疮(酒糟鼻或全身性红斑狼疮)、疣(肉赘)、湿疹、血管瘤、淋巴管新生也依赖血管发生。

因为玻璃体被毛细管血浸润的各种眼睛疾病，可导致视力受损或失去。糖尿病性视网膜病可是两种形式-非增殖性或增殖性的一种。增殖性视网膜病的特征是异常的新血管形成(新生血管形成)，血管生长在玻璃体表面或伸展至玻璃体腔。新生血管膜可出现在晚期疾病中，导致牵引视网膜脱离。新生血管化可导致玻璃体出血。视觉症状改变。突然的严重视力丧失可出现在玻璃体内出血时。如果伴随严重的视网膜缺血、广泛的新生血管形成或广泛的纤维组织形成，则增殖性视网膜病的视力预后更谨慎。黄斑变性同样也有两种型，干型和湿型。在较不常见的渗出性黄斑变性中(湿型)，脉络膜新生血管化的视网膜下网状结构常伴随视网膜内出血、视网膜下液、色素上皮细胞脱离和色素沉着。最终该复合体收缩并在后极留下独特的隆起伤疤。与年龄相关的黄斑变性的两种型都常发生在两侧并位于黄斑区的脉络膜小疣前。与血管生成性病因的视力丧失有关的另一个原因是虹膜的损伤。最常见的导致虹膜被牵引到角的两种情况是膜的收缩如在患有糖尿病或视网膜中央静脉闭塞的病人的新生血管性青光眼中或在伴有眼色素层炎的炎性沉淀的病人中，虹膜被拉到角内(Ch.99.The Merck Manual 17th Ed.1999)。

类风湿性关节炎是一种炎性疾病，也导致不适当的血管发生。滑液腔内血管内皮细胞的生长被炎性细胞因子激活并导致软骨的破坏及在关节处被血管翳取代(Koch AK，Polverini PJ and Leibovich SJ，Arth；15 Rhenium，29，47l-479(1986)；Stupack DG，Storgard CM andCheresh DA，Braz.J.Med.Biol.Res.，32，578-581(1999)；Koch AK，Arthritis Rheum，4l，951 962(1998))。

银屑病是由不受控制的皮肤细胞增殖所引起。快速生长的细胞需要足够的血液供应，异常的血管发生在银屑病中被诱导(Folkman J.，J.Invest.Dermatol.，59，40-48(1972))。

现在有大量证据表明肿瘤生长及癌的发展需要血管发生，新血管的形成是为了给肿瘤组织提供营养和氧、除去废物并充当将肿瘤细胞转移至远处的管道(Folkman，et al.N Engl J Med 285：1181-1186，1971 and Folkman，et al.N Engl J Med 333：1757-1763，1995)。

许多因子与导致血管发生的进程和事件有关：细胞黏附分子、整合素、血管内皮生长因子(VEGF)、TNFα、bFGF及包括IL-6和IL-12的细胞因子。例如，密切相关但不同的整合素αVβ3和αVβ5已经被证明其介导血管生成性过程中的独立途径。抗αVβ3的抗体阻碍碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)所诱导的血管发生，而特异性针对αVβ5的抗体抑制血管内皮生长因子(VEGF)所诱导的血管发生(Eliceiri，et al.，J.Clin，lnvest.103：1227-1230(1999)；Friedlander et al.，Science 270：1500-1502(1995))。IL-6在有血管发生的组织中增加并可在A431细胞、人表皮样癌细胞系中诱导VEGF(Cohen，et al.J.Biol.Chem.271：736-741，1996)。

因此，血管发生是已知的许多病理条件中的起作用因子，包括肿瘤生长及转移的能力、包括视网膜病的眼睛病症和包括卡波济肉瘤的皮肤病症。虽然已经有许多因子显示与这些病变有关，但迄今还未证明EMMPRIN直接刺激VEGF生成、刺激除了局部成纤维细胞外的内皮细胞表达MMP从而促进肿瘤的血管发生、生长、侵入和转移。

发明概述

本发明涉及用EMMPRIN的拮抗剂包括直接针对EMMPRIN的抗体、及特异针对至少一种EMMPRIN蛋白或其片段的特异部分或变体，抑制伴有异常血管发生的疾病条件下的血管发生的方法。这种EMMPRIN拮抗剂如抗体可通过其以剂量依赖方式阻止EMMPRIN刺激微血管内皮细胞(血管发生的相关细胞)表达MMP的能力来发挥作用。其次，这种拮抗剂或抗体可通过局部环境中限制EMMPRIN对VEGF的诱导从而减少组织血管发生的可能性来发挥作用。通过妨碍血管发生，这种拮抗剂可预防伴随癌组织起始或进展的事件包括与血管发生和癌的转移扩散有关的事件。基于本发明EMMPRIN拮抗剂的上述作用，这些拮抗剂最好被描述为抗血管形成EMMPRIN拮抗剂。

因此，根据本发明，我们已首次证明EMMPRIN可以剂量依赖方式直接刺激微血管内皮细胞(血管发生的相关细胞)的MMP-1的表达。这种刺激尤其被封闭功能的抗EMMPRIN单克隆抗体所抑制。既然MMP是血管发生所必需的，这种EMMPRIN拮抗剂可被用作癌症、糖尿病性失明、与年龄相关的黄斑退行性改变、类风湿性关节炎和银屑病等疾病的治疗药。

在一个实施方案中，EMMPRIN拮抗剂能防止细胞产生EMMPRIN，该拮抗剂如siRNA或shRNA分子。

在一个详细的实施方案中，EMMPRIN拮抗剂是一种特异性结合EMMPRIN的抗体。这种抗体的特别优点在于其结合EMMPRIN的方式能全身性的阻止其作用。因此本发明的方法使用有所需中和性质的抗体，使其能理想的在人或非人病患中适合治疗及预防处理伴有不同型癌症的转移性疾病状态。相应的，本发明涉及病人体内血管发生依赖型疾病或状态的治疗方法，包含给予病人一定量的中和EMMPRIN抗体以抑制血管发生。

在一个特别优选的本发明EMMPRIN拮抗剂抗体的实施方案中，抗体被称作CNT0146，是鼠抗人EMMPRIN的IgG Ik类，能显著抑制EMMPRIN诱导的MMP的产生，包括抑制成纤维细胞中由重组EMMPRIN刺激的MMP-1的生成，也抑制联合培养的肿瘤细胞和成纤维细胞的MMP生成。

附图简述

图1，有异常血管发生的疾病中EMMPRIN重要作用的概图。

图2，重组EMMPRIN对HMVEC-L细胞产生MMP-1的剂量依赖性刺激。

图3，中和抗EMMPRIN单克隆抗体在HMVEC-L细胞中对EMMPRIN诱导产生的MMP-1的抑制。

图4，(A)是一组显示由诱导的相对内皮细胞迁移的柱状图。图5是一组显示最终肿瘤重量平均数的柱状图，肿瘤由经操控比正常细胞(WT)表达较多或较少量EMMPRIN的MDA MB231人乳腺肿瘤细胞所产生，(B)所示为在抗VEGF抗体浓度渐增的情况下WT细胞诱导的内皮细胞迁移相对减少的柱状图。

图5A是显示最终肿瘤重量平均数的柱状图，肿瘤由经操控比正常细胞(WT)或载体对照细胞表达较多(S1-3)或较少(AS1-5和AS2-5)量EMMPRIN的MDA MB231人乳腺肿瘤细胞所产生。5B的显微照片显示用WT与S1-3细胞移植小鼠引起的肿瘤之间血管生成结构的不同。5C是一组柱状图，显示由MDA MB231人乳腺肿瘤细胞产生的肿瘤中人VEGF(左栏)和小鼠VEGF(右栏)的量。

图6A是柱状图，显示异种移植肿瘤的组织抽提物中人EMMPRIN的量，肿瘤来自WT、载体对照、S1-3或AS EMMPRIN人基因工程肿瘤细胞。B是酶谱法凝胶的照片，显示来自同样肿瘤的组织抽提物中MMP的表达情况，每个泳道都加入10μg总蛋白以测定其含量。C是柱状图，显示异种移植的肿瘤中人和小鼠MMP-9的定量测定的水平。D是一对柱状图，显示异种移植的肿瘤中人(左栏)和小鼠(右栏)MMP-9的定量测定的水平。

图7的照片显示大量新的毛细血管来自表达EMMPRIN的有义细胞的肿瘤而不是来自WT或AS细胞的肿瘤，由此证明增加的血管发生。

图8显示对肿瘤免疫组织化学分析MMP、VEGF、EMMPRIN后的照片：A，MDA-MB-231异种移植肿瘤的H&E染色；B，小鼠MMP-9染色；C，小鼠EMMPRIN染色；D，血管用抗CD31抗体染色。左栏-载体对照肿瘤，右栏-S1-3肿瘤。

发明详述

患病组织中细胞表达的EMMPRIN直接刺激毗邻的内皮细胞，导致MMP即MMP-1表达的增加(见图1)。这些MMP依次介导存在的血管基膜的分解、促进内皮细胞迁移离开亲本血管、刺激血管生成生长因子的表达和释放、使内皮细胞应答血管发生刺激因子导致细胞增殖及促进细胞外基质的重塑以利于内皮细胞分化和新血管的装配。所有这些变化都导致血管发生的增加并进一步促成整体的疾病进程。

本发明的抗血管形成EMMPRIN拮抗剂能用于抑制和防止血管发生，原因在于其阻断EMMPRIN对内皮细胞的刺激效应、减少内皮细胞的VEGF表达、减少内皮细胞的分裂、减少内皮细胞的迁移并使内皮组织分泌的蛋白水解酶活性受损。许多病变包括各型实体原发性肿瘤和转移灶、眼睛损伤和皮肤病症，通过用本发明方法中的EMMPRIN拮抗剂处理而得到改善。

癌症

良性和恶性肿瘤，其中包括各种癌症如颈、直肠和口腔癌、胃、结肠、膀胱、直肠、肝、胰脏、肺、乳腺、子宫颈、子宫体、卵巢、前列腺、睾丸、肾脏、脑/中枢神经系统(如神经胶质瘤)、头和颈、眼或眼睛、咽喉、皮肤黑素瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、基底细胞癌和鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、肾母细胞瘤、成神经细胞瘤、口/咽、食管、喉头、肾和淋巴瘤，可用本发明的抗EMMPRIN抗体来治疗。此外，其中有多发性神经纤维瘤、结节性硬化症(各情形产生皮肤良性肿瘤)、血管瘤和淋巴瘤等病症，可用EMMPRIN拮抗剂依据本发明进行有效的治疗。

继发性瘤、转移灶是一种发源自机体别处的最初位点，而此刻已扩散到远距离器官的肿瘤。转移灶的通常路径是直接生长到邻近结构中、通过血管或淋巴系统及跟随如腹水或脑髓液的组织位面和体腔而扩散。继发的肝脏肿瘤是癌症病人最常见的死因之一并且是到目前为止肝癌的最常见型。虽然事实上许多恶性肿瘤可转移至肝脏，但是最可能扩散到肝脏的肿瘤包括：胃、结肠和胰腺癌；黑素瘤；肺、口咽和膀胱癌；何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤；乳腺、卵巢和前列腺癌。继发的肺、脑和骨肿瘤通常是乳腺、前列腺和肺癌的晚期。任何癌症都可以转移至骨，但最常见的转移灶具体说是来自出现于胸腺、肺、前列腺、肾和甲状腺的癌。肺癌通常伴有血原性的转移扩散至肝、脑、肾上腺和骨，可能出现在早期，导致那些位点的症状在明显的肺症状前。肺的转移灶通常来自乳腺、结肠、前列腺、肾、甲状腺、胃、子宫颈、直肠、睾丸和骨的原发性癌及黑色素瘤。上述提及的每一种继发性肿瘤都可用本发明的抗体治疗。

除了肿瘤外，很多其他非致瘤性的血管发生依赖型疾病具有血管异常生长的特征的，也可用本发明抗血管形成EMMPRIN拮抗剂进行治疗。

这种非致瘤性血管发生依赖型疾病的典型例子包括角膜新生血管形成、肥大性瘢和瘢痕瘤、增殖型糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、动静脉畸形(上述)、动脉粥样硬化斑块、创伤愈合延迟、血友病性关节、骨折不结合、Osier-Weber综合症、银屑病、脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼、月经过多(上述)和脉管粘连。

眼血管形成的条件

正常的角膜组织缺乏血管。不过在特定的病理学条件下，毛细血管可从边缘角膜周的血管丛进入角膜。当角膜形成血管化，其也变得有暗影，导致病人视力下降。如果角膜完全不透明，则视力可变得完全丧失。

血管可以多种模式和深度进入角膜，依赖其刺激新生血管形成的过程。这些模式已经在传统上被眼科学家确定为以下类型：沙眼血管翳、麻风血管翳、pannus phylctenulosus、变性血管翳及血糖血管翳。角膜基质也可被前方的睫动脉分支侵入(称作间质血管化)，引起若干不同的临床损害：末梢环影(terminal loops)、″毛刷″型、伞形花序型、格栅型、间质弓形组织(来自巩膜上的血管)及迷行不规则血管。

角膜新生血管形成可起因于角膜溃疡。大量的多种病因可产生角膜溃疡包括如角膜感染(沙眼、单纯疱疹性角膜炎、利什曼病和盘尾丝虫病)、免疫过程(移植排斥和斯-约二氏综合征)、碱烧伤、创伤、(任何原因的)炎症、毒素和维生素A或蛋白缺乏状态，以及佩戴隐形眼镜的并发症。

虽然角膜新生血管形成的原因可不同，但角膜对损伤和后继的血管向内生长的应答是相似的而不管原因。若干血管生成因子可能与该过程有关，其中许多是炎症应答的产物。角膜新生血管形成看来的确只与炎性细胞浸润联合出现，并且血管发生的程度与炎性反应的程度成比例。角膜水肿通过松弛毛细血管生长穿过的角膜基质骨架进一步促进血管向内生长。

用EMMPRIN抗体的局部治疗也可用来对已知具有高概率诱导血管生成应答的角膜病损(如化学灼伤)进行预防。在这些例子中，可立刻开始治疗(可能联合有类固醇)以帮助阻止继发的并发症。

这种方法也可用于相似的类型以预防毛细管侵入移植的角膜。也要考虑与类固醇的联合使用。

新生血管性青光眼是一种病理状态，其中新生的毛细血管在眼虹膜中发育。血管发生常常自位于瞳孔缘的血管开始，经过虹膜底部前进并进入小梁网内。成纤维细胞和其他连接的组织成分伴有毛细管生长，纤维血管膜穿过虹膜前表面扩散发育最终致成瘢痕。瘢痕形成阻止水状体的适当引流导致眼内压升高，最终可致盲。

新生血管性青光眼普遍作为以视网膜缺血为主的疾病的并发症出现。尤其是大约三分之一患有此病症的病人有糖尿病性视网膜病。其他的原因包括慢性视网膜脱离、末期青光眼、颈动脉梗阻病、晶状体后纤维组织增生症、镰状细胞性贫血、眼内瘤和慢性海绵状瘘。

皮肤血管形成的条件

本发明其他方面中，提供治疗肥大性瘢和瘢痕瘤的方法，包含将一种上述抗血管形成组合物给予肥大性瘢或瘢痕瘤的步骤。

创伤愈合和瘢痕形成出现于三个时期：炎症、增殖和化脓。第一个时期，炎症出现于对损伤的应答，损伤足够严重以引起组织损伤和血管渗漏。此阶段期间(维持3到4天)，血液和组织液形成粘连的凝块和含纤维的网状结构，用于将伤口表面束缚在一起。随后的增殖期是毛细血管和伤口边缘结缔组织的向内生长和缺损皮肤的闭合。最后，一旦毛细血管和成纤维细胞增殖停止，化脓过程就开始，其中瘢痕收缩并且网格变少、血管变少及出现扁平和白色。此末期可在6到12个月间进行。

伤口位置结缔组织的超量产生持续的引起微孔并可能发红及形成隆起的瘢痕。如果瘢痕残留在最初伤口的界面，则被称为肥大性瘢；但如果扩散超过了最初的瘢痕并进入外围组织，则损伤被称为瘢痕瘤。肥大性瘢和瘢痕瘤是在瘢痕形成的第二和第三时期产生的。若干创伤是特别易于产生过度内皮和成纤维细胞的增殖，包括烧伤、开放性创伤和感染性创伤。随肥大性瘢出现某种程度的化脓并出现逐渐的改善。不过至于瘢痕瘤，当其变得相当大时产生真正的肿瘤。这种情况下自发的改善很少出现。给予本发明的抗EMMPRIN抗体以抑制这种情况下的血管发生可因此而抑制这种瘢痕瘤的形成。

与EMMPRIN拮抗剂联用的抗血管形成组合

血管发生的特征是平滑肌和内皮细胞的侵入、迁移和增殖。已知αvβ3整合素(也被称作玻璃粘附蛋白受体)在不同条件或疾病状态下发挥作用，包括瘤转移、实体瘤生长(瘤形成)、骨质疏松症、佩吉特氏病、恶性肿瘤的体液性高钙血症、血管发生(包括肿瘤血管发生)、视网膜病(包括黄斑变性)、关节炎(包括类风湿性关节炎)、牙周病、银屑病和平滑肌细胞迁移(如再狭窄)。

粘着受体整合素αvβ3结合玻璃体结合蛋白、纤维蛋白素原、vonWillebrand因子、层粘连蛋白、凝血酶敏感素和其他类似配体。它已经鉴定作为小鸡和人中血管生成性血管的标记物，并在血管发生或新生血管形成中发挥关键作用。αvβ3的拮抗剂通过有选择的促进新血管系统的细胞凋亡来抑制该过程。因此αvβ3拮抗剂可用作治疗这种伴有新生血管形成情形的治疗靶标(Brooks et al.，Science，Vol.264，(1994)，569-571)。另外，肿瘤细胞的侵入经由一个三步过程出现：1)肿瘤细胞附着于细胞外基质上；2)基质的蛋白水解溶出；和3)细胞穿过溶解的屏障移动。该过程可重复出现并可导致远离最初肿瘤位点的转移灶。αvβ3整合素已经显示出在肿瘤细胞侵入以及血管发生中发挥作用。

尽管αvβ3拮抗剂和中和的抗EMMPRIN抗体都以新血管系统为靶标，但是通过不同机制而作用，联用抗整合素抗体和抗EMMPRIN抗体可导致独特效力并且有很少的正常组织毒性的有效联合治疗。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了伴有血管发生的疾病或状态的治疗方法，包括整合素拮抗剂和抗EMMPRIN抗体的合并给药以抑制需要这种治疗的病人的血管发生。其他有选择的结合整合素或整合素亚基的抗体，尤其是那些结合αV亚基的抗体，在美国专利5,985,278和6,160,099中被公开。US 5,766,591和WO0078815公开的Mab，抑制αvβ3结合到其天然的含有精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽的配体。

首选的抗体的合并给药是在申请人的共同待审批的美国专利申请09/092,026中所描述的抗αvβ3和抗αvβ5的Mab与这里所公开的抗EMMPRIN抗体的联用。上述两个申请都通过引用结合至本申请，并成为本公开的一部分。根据本发明，其他已知的抗血管发生的药物如沙立度胺也可与抗EMMPRIN抗体合并使用。

抗血管形成活性的评估方法

广泛接受的血管发生的功能测定及由此的抗血管形成剂是小鸡绒毛膜尿囊膜测定(CAM)和新生血管化的角膜微囊测定。

对CAM测定来说，受精的鸡胚在第三天(或第四天)时从壳中被移出并在培养皿中于高湿度和5％CO2下培养。第6天时，含有测试物质的甲基纤维素盘(10毫升)被移植到绒毛膜尿囊膜上。48小时后检验胚胎，如果环绕甲基纤维素盘出现一个清楚的无血管区带，则测量该区带的直径。区带越大抗体越有效。黑墨汁可恰好在甲醛固定前被注入到一些胚胎的心中使组织切片中靠近无血管区边缘的血管可见。检测绒毛膜尿囊的组织横切片以确定测试物质是否阻止毛细血管的正常发育。该方法被描述于美国专利No.5,001,116中(也通过引用被特地结合至此)，显示该测试在选择抗血管形成化合物或化合物组合上是有用的。

新生血管化的角膜微囊测定可用大鼠或兔的角膜来实践。该体内模型作为临床效应的普遍前兆而被广泛接受，如在许多综述和文件例如O′Reilly等在Cell 79：315-328中所描述的。

简短的说，含有重组bFGF的栓或丸(日本武田制药，TakedaPharmaceuticals-Japan)被植入麻醉的雌性纽西兰白兔各眼的角膜微囊中，随后在角膜表面从边缘的2mm起局部应用红霉素软膏。动物被给予测试化合物并由角膜专家每隔一日用裂隙灯检测。各种数学模型被用来确定血管化角膜的量，并发现该公式提供向该丸生长的新生血管形成带区域最精确的近似值。

该方法也可用大鼠来实践。

本发明中，角膜微囊的测定可用来证明抗EMMPRIN抗体的抗血管形成效应。这是由血管发生的显著减少证明的，如持续观察并且优选标记的角膜内血管数量显著减少所代表。

内皮和非内皮细胞增殖

重要的是确立哪种细胞类型与肿瘤血管化特异的血管形成过程有关。肿瘤血管通常是初级的即仅含有内皮细胞。发现于更成熟血管的其他细胞类型包括：平滑肌细胞、视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞，以及肿瘤细胞如血管内皮瘤细胞或癌瘤细胞。血管生成抑制剂的一个实例是特异性抑制内皮细胞增殖的血管他丁(ANGIOSTATIN)蛋白(O′Reilly et al.，1994 supra)。

各种代表性的细胞系可用于测试。牛主动脉平滑肌(SMC)、牛视网膜色素上皮(RPE)、水貂肺上皮(MLE)、路易士肺癌(LLC)和EOMA血管内皮瘤细胞及3T3成纤维细胞。为增殖测定，用PBS洗涤细胞并分散于0.05％胰蛋白酶溶液。对各个不同细胞类型的细胞增殖测定的最适条件已被确立。一般，细胞被胰蛋白酶作用并被再培养于存在和缺乏EMMPRIN及抗EMMORIN的中和Mab的生长培养基中。约72小时后，细胞数量的变化通过用如四氮唑染料活体染色或者通过LDH释放(Promega，Madison W1)或通过单个细胞计数来评价。

EMMPRIN拮抗剂

如这里所用的，术语“EMMPRIN拮抗剂”指的是抑制或中和EMMPRIN的血管形成活性的物质。这种拮抗剂以多种方式完成其作用。一类EMMPRIN拮抗剂可以足够的亲和力结合EMMPRIN蛋白，并特异的中和EMMPRIN的血管形成作用。被包括于此类分子的是抗体和抗体片段(例如F(ab)或F(ab′)2分子)。另一类EMMPRIN拮抗剂是可结合EMMPRIN或EMMPRIN结合伴侣的EMMPRIN蛋白、突变体蛋白的片段或有机小分子即拟肽，从而抑制EMMPRIN的血管形成活性。EMMPRIN拮抗剂可以是这类物质中的任何一种，只要其可抑制EMMPRIN血管生成活性。EMMPRIN拮抗剂包括EMMPRIN抗体、EMMPRIN受体抗体、经修饰的EMMPRIN、反义EMMPRIN和EMMPRIN或EMMPRINR的部分肽。

抗EMMPRIN抗体

抗介导炎症和肿瘤增殖的可溶性因子如TNFα的中和抗体已经证明在治疗上高度有效。Centocor(Malvern，PA)销售的REMICADE(infliximab)(一种抗TNFαMab)，是RA和局限性回肠炎的处方药，Genentech(San Bruno，CA)销售的RITUXAN(rituximab)是一种抗CD20Mab，用来治疗B细胞淋巴瘤。“中和”Mab不仅结合其靶标还抑制靶标的生物活性，通常是通过阻止与其同源的细胞表面受体的相互作用来完成抑制。在特定情况下，靶蛋白可包含一个以上的活性区域，并由于结合一种以上配体或受体而显示多种作用。EMMPRIN是这种分子，在分子的细胞外部分显示两个免疫球蛋白样结构域，basigin异型2(NCBI检索号#NP_940991)区22-103位氨基酸的Ig样C2型结构域和相同异型105-199位氨基酸的Ig样V型结构域(Biswas，Zhang，DeCastro，Guo，Nakamura，Kataoka andNabeshima，(1995)，Cancer Res 55：434-9)。抗来自癌细胞的EMMPRIN的单克隆抗体能抑制成纤维细胞中EMMPRIN诱导的MMP的产生，标志着中和活性(Ellis，Nabeshima and Biswas，(1989)，Cancer Res 49：3385-91)。这些抗体随后显示出与EMMPRIN在位于C2型结构域内34-99区域结合。相反，鼠IgM CBL1、抗人淋巴母细胞单克隆抗体是在用T细胞急性成淋巴细胞性白血病细胞系(T-ALL)CEM免疫的Balb/c小鼠中产生。后者Mab已用于移植物抗宿主病患者的临床试验(Heslop，H.et al.(1995)Lancet 346：805-806)。WO9945031说明与CBL1有相似活性的抗体共享一段共有结合序列，更多位于C端而不是V型结构域，即RVSR(NP_940991的201-204残基)，并且所制的EMMPRIN胞外域的一组Mab中只有一个，指定为M-6/6，能抑制OKT3诱导的T细胞激活作用及与C2型区域的结构域结合(Koch，C.et al.(1999)Internat.Immunol.11：777-786；Staffler，G.et al.(2003)J.Immunol.171：1707-1714)。因此，选择独特的抗血管形成抗EMMPRIN的Mab可通过用一组特异的离体分析作为筛选工具来完成。

本领域已知的任何抗EMMPRIN抗体是抗血管形成的EMMPRIN拮抗剂的，都可用于本发明的方法。已知抗EMMPRIN的鼠单克隆抗体在如上述1989 Ellis等、1999 Koch等(Internat.Immunol.11(5)：777-786)。

相应的这里所用的“EMMPRIN抗体”、“抗EMMPRIN抗体”、“抗EMMPRIN的抗体部分”或“抗EMMPRIN的抗体片段”和/或“抗EMMPRIN的抗体变体”等，包括任何至少包含免疫球蛋白分子一部分的蛋白或多肽分子，例如但不限于重链或轻链的一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任一部分、或者至少EMMPRIN结合蛋白(来自EMMPRIN蛋白或肽)的一部分，可被掺入抗体用于本发明。任选这种抗体对特异配体的进一步影响，例如但不限于在体外、原位和/或体内此抗体调整、减少、增加、拮抗、激动、减轻、缓和、封阻、抑制、废除和/或干扰EMMPRIN血管形成的活性。作为非限制性实例，本发明的合适的抗EMMPRIN抗体、特定部分或变体可结合至少一种EMMPRIN蛋白或肽、特定部分或变体或其区域。合适的抗EMMPRIN抗体、特定部分或变体以多种方式影响EMMPRIN的血管形成功能，例如但不限于RNA、DNA或蛋白的合成、EMMPRIN释放、EMMPRIN受体信号转导、EMMPRIN受体结合、EMMPRIN的产生和/或合成。术语“抗体”进一步用来包含抗体、消化片段、特定部分及其变体，包括拟抗体或包含模拟抗体或特定片段或其部分的结构和/或功能的抗体部分(包括单链抗体及其片段)。功能片段包括结合哺乳动物EMMPRIN的抗原结合片段。例如能结合EMMPRIN或其部分的抗体片段，包括但不限于Fab(如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab’(如通过胃蛋白酶消化或不完全降解)和F(ab′)2(如通过胃蛋白酶消化)、facb(如通过纤维蛋白溶酶消化)、pFc′(如通过胃蛋白酶或纤维蛋白溶酶消化)、Fd(如通过胃蛋白酶消化、不完全降解及重聚合)、Fv或scFv片段(如通过分子生物学技术)，都被包括于本发明(参见前述Colligan，Immunology)。

通过如本领域已知的和/或这里所述的酶法分析产物、合成或重组技术可产生这种片段。抗体也可用抗体基因以多种截短型而产生，其中一个或多个终止密码子被引入到其天然终止位点的上游。例如，可设计编码F(ab′)2重链部分的组合基因使其包括编码CH1区和/或重链的铰链区的DNA序列。抗体的各部分可通过常规技术以化学方法连接到一起，或可用遗传工程技术制备为邻接的蛋白。

抗EMMPRIN抗体可以是灵长类、啮齿类或人类抗体或嵌合的或者人源化的抗体。如这里使用的术语“人抗体”指的是蛋白的每个主要部分(如CDR、框架、CL1 CH区(如CH1、CH2、CH3、CH4)、铰链区、(VL、VH))在人体内实质上都是非免疫原的抗体，只有较少的序列改变或变异。同样，所称灵长类(猴、狒狒、猩猩等)、啮齿类(小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等)的抗体及其他哺乳动物是指该种、亚属、属、亚科、科的特异性抗体。此外，本发明的嵌合抗体可包含以上的任何组合。相对未经修饰的抗体，这种改变或变异任选并优选保留或减少在人体或其他物种内的免疫原性。因此，人抗体与嵌合体或人源化抗体不同。要指出的是人抗体可通过非人类的动物或能在功能上表达重排人免疫球蛋白基因(如重链和/或轻链)的原核或真核细胞所产生。此外，当人抗体为单链抗体时，其可包含在天然人抗体中未发现的接头肽。例如，Fv可包含一段接头肽，如2到约8个甘氨酸或其他氨基酸残基，连接重链可变区和轻链可变区。这种接头肽被考虑为人源。

双特异、异种特异、异种缀合或相似的单克隆抗体也可被使用，其至少对两种不同抗原具有结合特异性，优选人或人源化的抗体。

在本例中，结合特异性的一种是针对至少一个EMMPRIN蛋白，另一种是针对任一其他抗原。制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组产物是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链有不同的特异性(Milstein andCuello，Nature 305：537(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，这些杂交瘤(四分之一杂交瘤(quadromas))产生可能的10个不同抗体分子的混合物，其中只有一个具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常是通过亲和色谱步骤完成，相当麻烦，产品收率低。类似的操作在如WO 93/08829、美国专利6210668、6193967、6132992、6106833、6060285、6037453、6010902、5989530、5959084、5959083、5932448、5833985、5821333、5807706、5643759、5601819、5582996、5496549、4676980、WO91/00360、WO92/00373、EP03089、Traunecker等EMBO J.10：3655(1991)、Suresh等酶学方法(Methodsin Enzymology)121：210(1986)中被公开，每个都通过引用被完整结合至本文。

用于本发明方法和组合物的抗EMMPRIN抗体，可任选与EMMPRIN具有高亲和力为特征并且任选及优选具低毒性。尤其是，任选并优选各个成分如可变区、恒定区和框架分别和/或全体具有低免疫原性的本发明抗体、特定片段或变体，用于本发明中。用于本发明的抗体可任选具有能治疗病人扩散期的特征，可检测到症状减轻和低和/或可接受的毒性。低或可接受的免疫原性和/或高亲和力以及其他的合适性质，可促进治疗结果的完成。“低免疫原性”这里被定义为在经治疗的病人中少于约75％、优选少于50％引起显著的HAHA、HACA或HAMA应答和/或在经治疗的病人体内引起低滴定度(用双抗原酶免疫测定所测量的少于约300，优选少于约100)(Elliott et al.，Lancet 344：1125-1127(1994)，通过引用被完整结合至本文)。

适合的抗体包括那些与市售人单克隆抗体CD147-RDI/克隆UM-8D6竞争结合人EMMPRIN(Research Diagnostics，Inc.，Flanders，NJ)的抗体。

组合物及其使用

根据本发明，所述中和抗EMMPRIN单克隆抗体可用来抑制血管发生并因此预防或使肿瘤生长受损以及阻止或抑制转移。此外，这种单克隆抗体可用于抑制血管生成性炎性疾病，可用于这种治疗的疾病包括但不限于类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、银屑病和黄斑变性。被治疗的个体可以是任何哺乳动物，优选灵长类、哺乳动物类宠物并且最优选病人。给予的单克隆抗体的量可根据使用目的和给药方法而不同。

抗血管形成的抗EMMPRIN抗体可通过许多方法被给予到需要预防或阻止血管发生的组织内发挥效果。另外，抗抗血管形成的抗EMMPRIN抗体不需要局部递送来传递抗血管形成的效果，因此可给予任何可完成进入含有EMMPRIN体腔或体液的部位来给药。至于对发炎的、恶性或其他缺乏免疫力的组织，这些方法可包括直接应用含有抗体的制剂。这种方法包括液体组合物的静脉给药、液体或固体制剂的经皮肤给药、口服、外用或组织间或相互协同给药。给药可被植入的装置所影响，装置的主功能可能不是作为给药载体，例如血管支架。

特别是本发明的一个方面中提供的治疗角膜新生血管形成的方法，包含以治疗上的有效剂量直接给予本发明的抗血管形成的EMMPRIN抗体到病人角膜或全身的步骤，使得血管的形成被抑制。

本发明的另一个方面中提供治疗新生血管性青光眼的方法，包含以治疗上的有效剂量直接给予本发明的抗血管形成的EMMPRIN抗体到病人眼睛或全身的步骤，使得血管的形成被抑制。

在本发明的另外一个实施方案中，要么仅本发明的抗血管形成的EMMPRIN抗体要么并用其他抗血管形成的药物，直接注入肥大性瘢或瘢痕瘤以阻止这些损伤的进行。该治疗在已知的导致肥大性瘢或瘢痕瘤如灼伤发展条件的预防疗法上有特殊的价值。当已经有时间发展的增殖期后(I相损伤后约14天)而肥大性瘢或瘢痕瘤发展前时，开始治疗可能是有效的。

给药也可以通过口服或通过局部注射到肿瘤或组织内，不过通常单克隆抗体是由静脉内给药。一般剂量范围是从约0.05mg/kg到约12.0mg/kg。其可以是静脉推注，或者由受控的微处理器和程序控制的泵装置所控制的缓慢或连续的输注。

或者，优选编码所述单克隆抗体片段的DNA，可分离自杂交瘤细胞并被给予给哺乳动物。DNA可以裸DNA形式给予或以使DNA在病人的细胞中表达并递送抗体的方式被插入到重组载体(如痘苗病毒)中。

用于本发明方法的单克隆抗体可通过任一确立的药物组合物的配制方法进行配制，如在Remington的药物科学(1985)中所述的。为便于给药，典型的是将单克隆抗体与药物可接受的载体结合。这种载体包括水、生理盐水或油脂。

适合肠胃外投药的制剂包括水相和非水相的无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、制菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；及水和非水无菌混悬剂，其可包括悬浮剂和增稠剂。除了与活性成分及其预期用途不相容的任何常规培养基外，其用于任何组合物中的用途都要考虑到。

该制剂可出现于单位剂量或多剂量器皿内，例如密封的安瓿和管形瓶，也可被保藏于只需在临使用前添加无菌的液体载体，如注射用水的冷冻干燥(低压冻干的)条件下。

缩写

Abs抗体，多克隆或单克隆

aV整合素亚基αV

b3整合素亚基β3

bFGF碱性成纤维细胞生长因子

IFN干扰素

Ig免疫球蛋白

IgG免疫球蛋白G

IL白细胞介素

MMP-1

EMMPRIN细胞外基质金属蛋白酶诱导因子

EMMPRINR受体

SEMMPRINR可溶性EMMPRIN受体

Mab单克隆抗体

VEGF血管内皮生长因子

MMP基质金属蛋白酶

虽然已经总体上描述了本发明，本发明的实施方案将在以下实施例中被进一步公开。

                     实施例1

重组EMMPRIN刺激来自人肺的微血管内皮细胞(HMVEC-L)产生

                     MMP-1

用微血管内皮细胞研究EMMPRIN对内皮细胞的影响，该细胞在体内与血管发生过程直接相关。

HMVEC-L细胞得自马里兰的Clonetics，Walkersville(Cat# CC-2527，Lot# 8F1528)。在由供应商推荐的条件下培养HMVEC-L细胞。简单来说，37℃ 5％ CO2下，细胞被培养在内皮细胞生长培养基MV(EGM-2MV，Clonetics，Cat#CC-3202)中，含有人上皮细胞生长因子(hEGF)、皮质醇、人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF-B)、血管内皮生长因子(VEGF)、人胰岛素样生长激素-1(hlGF-1)、抗坏血酸、庆大霉素、5％FBS。

早期传代细胞(传代小于3)受胰蛋白酶作用并用RPMI-1640培养液清洗一次。细胞被重悬于稀释培养基(DM-成纤维细胞基础培养基+2％FBS)中，浓度为5×100000细胞/毫升。将含有50000细胞的100μl细胞悬液加入96孔细胞培养板的各孔中。这些孔中预装入终浓度为20μg/ml、6.67μg/ml、2.22μg/ml、0.74μg/ml、0.25μg/ml、0.08μg/ml和0μg/ml的可溶的重组人EMMPRIN。细胞在5％CO2的增湿保温箱中37℃温育1天和3天。从各孔收集条件培养基并经MMP-1活性测定。

用人MMP-1活性试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)(Cat#F1 M00)完成条件培养基中MMP-1活性的定量检测。简单的说，通过固定在各孔底部的抗MMP-1抗体捕获150μl标样或样本中的MMP-1。捕获的MMP-1随后被4-氨基苯基乙酸汞(4-aminophenylmercuric acetate)(APMA)激活。加入各孔中的MMP底物被活化的MMP-1剪切，产生的荧光用SpectraFluor Plus PlateReader(TECAN，Zurich，Switzerland)(Cat^* F129005，Ser# 94747)进行确定，参数如下：激发波长320nm，发射波长405nm。

用不同浓度的重组EMMPRIN攻击HMVEC-L细胞，以刺激MMP-1的产生。如图2所示，EMMPRIN刺激内皮细胞中MMP-1的产生是剂量依赖的。当用20μg/ml EMMPRIN处理HMVEC-L细胞时，其产生约40ng/ml MMP-1。HMVEC-L对EMMPRIN刺激的这种应答甚至比NHLF细胞更强烈，NHLF细胞对同样处理的应答只产生一半量的MMP-1。刺激MMP-1的产生首先是在攻击一天后被观察到并至少持续3天。

图2所示结果，首次证明EMMPRIN能以剂量依赖方式直接刺激微血管内皮细胞(细胞与血管发生直接相关)的MMP-1的表达。

                    实施例2

通过HMVEC-L细胞中的抗EMMPRIN mAb抑制EMMPRIN诱

                导的MMP-1的产生

为进一步证实EMMPRIN诱导的MMP-1产生的特异性，在用EMMPRIN刺激细胞15分钟后，加入抗人EMMPRIN的单克隆抗体。在10μg/ml时CD147-RDI/克隆UM-8D6(Research Diagnostics，Inc.，Flanders，NJ)显著抑制EMMPRIN(5μg/ml)诱导的成纤维细胞MMP-1的产生(图3)。不过，其他抗EMMPRIN mAb(小鼠抗人CD147/EMMPRIN，克隆HIM6，BD Pharmingen，San Diego，CA)不能抑制EMMPRIN诱导的MMP-1的产生。

我们的结果证明在HMVEC-L细胞中EMMPRIN刺激的MMP-1的产生是通过唯一的抗原表位明确介导的，EMMPRIN上的该表位由UM-8D6而不是HIM6识别。

                   实施例3

         EMMPRIN对人内皮细胞迁移的影响

血管发生中EMMPRIN的作用也可用体外细胞迁移和侵入测定进行直接研究。来自初生组织(脐带)HUVEC细胞的人内皮细胞被用于体外系统，其中内皮细胞被培育于非接触培养转孔系统(transwell system)的上层孔中，细胞培养基包含1％FBS。底层孔中含有10％FBS的培养基将作为趋化剂的来源以诱导细胞迁移或侵入。上层和底层孔通过孔隙直径为8μm的膜隔开。膜为非包被或分别包被有不同细胞外基质蛋白，即胶原蛋白、纤维结合蛋白、玻璃体结合蛋白或基质胶，以确定细胞迁移或侵入。

材料与方法

MDA-MB-231人乳腺癌细胞购自ATCC(Manassas，VA)。前面已经描述了转染和确立稳定表达不同水平的EMMPRIN的方法(Tang，Y.et al.(2004)MoI.Cancer Res.2：73-80)。细胞用pcDNA3.1 TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染，其上有对应于人EMMPRIN开放阅读框有义(MDA MB231 S1-3)或同样ORF的反义链(MDA MB231AS1-5和MDA MB231 AS2-5)的cDNA。空载体转染的细胞被用作第二对照(载体)。

用QCM^TM-胶原I细胞迁移定量测定试剂盒评价内皮细胞(Chemicon，Temecula，CA)(HUVEC)的迁移。HUVEC细胞(100μl无血清培养基中100000个细胞)被加到上层。以MDA MB231细胞：WT、载体、S1-3、AS1-5或AS2-5为条件的无血清培养基在小室底层，被用作化学吸引剂来源。在第二次的实验中，抗VEGF mAb(R&DSystems，Minneapolis，MN)以不同浓度被加到底层，以中和VEGF的生物活性。细胞迁移实验在37℃下进行6小时。固定插入的滤膜，留在上层的细胞被移除。滤膜用龙胆紫染色，用显微镜显像系统(Pro-Plus 3D Imaging System)确定迁移细胞的数量。

图4A显示来自不同MDA-MB-231细胞构建体的条件培养基所诱导的HUVEC细胞迁移的相对水平。WT细胞诱导的迁移被定为100％。误差柱代表一式三份数据点的标准差。与WT细胞诱导的内皮细胞迁移相比，T检验的显著差异(*)的值在p＜0.01。图4B显示，受以MDA-MB-231 EMMPRIN S1-3肿瘤细胞为条件的无血清培养基刺激的内皮细胞，被VEGF的中和抗体以剂量依赖方式抑制其迁移，并被定为100％。误差柱代表一式三份数据点的标准差。与缺乏抗VEGFmAb的内皮细胞迁移相比，^*p＜0.01。

这些数据证明在EMMPRIN诱导的内皮细胞迁移涉及VEGF。

                    实施例4

        EMMPRIN对HMVEC-L细胞管形成的影响

EMMPRIN在血管发生中的作用可被显示于体外管形成实验。当在基质胶上培育时，HMVEC细胞开始一个自发的分化过程以形成类毛细管的结构。此体外分化模拟体内的体外血管发生过程并常被用于研究血管发生。

我们预测，EMMPRIN通过刺激MMP的表达改变内皮细胞的性质，并因此而刺激细胞的迁移和侵入。当用EMMPRIN刺激这些细胞时，会出现管形成的提高。

EMMPRIN在管形成上的特异性将用抗人EMMPRIN的单克隆抗体来研究。

                 实施例5

  EMMPRIN对体内血管发生的影响-基质胶塞实验

EMMPRIN在血管发生上的作用可用基质胶塞实验直接在体内进行研究。基质胶是一种溶解的基底膜，从Engel-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取制备，该肿瘤富含细胞外基质蛋白。主要成分是层粘连蛋白，而基质胶也包含痕量的成纤维细胞生长因子、TGF-β、组织纤维蛋白溶酶原激活物及其他在EHS肿瘤中自然出现的生长因子。基质胶是若干肿瘤细胞类型侵入实验的基底，并提供必要的血管发生研究的底物。当基质胶被皮下注射到小鼠或大鼠中时形成一块柔软的凝胶塞并在补充血管形成因子时支持强烈的血管应答。

基质胶塞包含亚适量的血管形成生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(FGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)，可被植入小鼠中以诱导体内的血管发生。这些塞的一部分补充各种剂量的重组EMMPRIN。既然EMMPRIN诱导内皮细胞迁移及内皮细胞的MMP的产生，所以我们期望观察到由于细胞迁移和穿过基质胶的侵入的提高而增加的血管发生。

EMMPRIN的这些影响，如在基质胶塞血管发生实验中已实验的，可用来证明EMMPRIN拮抗剂如siRNA或抗EMMPRIN抗体在预防血管发生上的活性。

                   实施例6

  EMMPRIN对体内血管发生的影响-角膜囊(pocket)实验

类似的，EMMPRIN在血管发生上的作用可用角膜囊实验进行直接的体内研究。

包含血管形成生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(FGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)的聚合物盘可被植入角膜囊中，以引起血管从位于脉管系统缘周围向外生长。我们也并用亚适量的血管形成生长因子，补充不同剂量的重组EMMPRIN。既然EMMPRIN会诱导内皮细胞的MMP的产生，所以我们期望观察到由于细胞迁移和侵入的提高而增加的血管发生。

EMMPRIN在角膜囊血管发生实验中的特异性将用EMMPRIN拮抗剂如siRNA或抗EMMPRIN抗体进行研究。

                    实施例7

EMMPRIN对血管发生的影响-刺激MMP介导的VEGF产生和释

                      放

EMMPRIN也刺激膜型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)的表达[Sameshima et al.2000b]是已被报道的。MT1-MMP依次刺激VEGF一最有效的血管形成生长因子之一的表达，导致血管发生提高[Deryugina et al.2002；Sounni et al.2002]。不过，EMMPRIN和VEGF表达及血管发生之间的直接联系仍需被确立。

EMMPRINN和VEGF之间的联系可用重组EMMPRIN或表达不同水平EMMPRIN的肿瘤细胞既在体外又在体内设置上被证明。除了EMMPRIN诱导的内皮细胞迁移和侵入之外，由于VEGF水平的增加促进血管发生，也是证明对肿瘤侵袭力和生长率的所得影响。

材料与方法

MDA-MB-231人乳腺癌细胞购自ATCC(Manassas，VA)。转染和确立MDA-MB-231细胞稳定表达不同水平EMMPRIN的方法已有前述(Tang，Y.et al.(2004)MoI.Cancer Res.2：73-80)。细胞用pcDNA3.1 TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染，其上有对应于人EMMPRIN开放阅读框有义(MDA MB231 S1-3)或同样ORF的反义链(MDA MB231 AS1-5和MDA MB231 AS2-5)的cDNA。

正常人肺或皮肤成纤维细胞(NHLF或NHDF)和来自肺的人微血管内皮细胞(HMVEC-L)或人脐带脉静脉内皮细胞(HUVEC)得自(Clonetics，Walkersville，MD)并分别在成纤维细胞生长培养基或内皮生长培养基-2(EGM-2)中培养。

对肿瘤和成纤维细胞的联合培养，100000个肿瘤细胞(MDIMB231 WT、S1-3、AS1-5或AS2-5)与200000个NHDF细胞一起被培养在六孔培养板的完全DMEM中。24小时后，培养基用无血清DMEM代替，继续培养2天。用新鲜的无血清DMEM替换培养基并再培养3天，此时收集并分析培养基。用加了1％NP40的Tris缓冲盐水溶解细胞以确定细胞伴随的EMMPRIN。

通过用扫描密度法的Western杂交分析、如所述(Tang et al.2004)的用抗EMMPRIN抗体(RDI-147，Research diagnostics)的定量ELISA和通过荧光激活细胞分析(FAC分析)细胞表面来确定10μg总细胞蛋白中表达的EMMPRIN的相对量。FAC分析确认转染了反义构建体的细胞缺乏细胞表面EMMPRIN(数据未显示)。通过用10μg总蛋白的底物SDS-PAGE酶谱法确定无血清培养基或肿瘤提取物中MMP-2和MMP-9的存在。凝胶上蛋白水解活性作为未消化染色凝胶上蓝色背景上的澄清带而被检测到。用R&D系统的定量ELISA试剂盒，依照厂商的技术说明完成对人或小鼠MMP-2、MMP-9和VEGF浓度的ELISA测量。每个样本都被分析三次。简单的说，通过被固定在测定孔底部的抗MMP-2、抗MMP-9或抗VEGF抗体捕获100μl标样或样本(相当于50μg总蛋白)包含的MMP-2、MMP-9或VEGF。洗涤后，MMP或VEGF特异性抗体被用来测定存在的量。

结果

在细胞培养条件下生长时，经转染的细胞已改变总EMMPRIN的水平(表1)。S1-3细胞大约是WT细胞的两倍水平，是AS细胞的4倍。

                    表1

细胞	表达(相对量)	检测到的MMP	VEGF(pg/ml)
				WT	100％	无	208.1
载体	ND		175.5
				S1-3	190％	MMP-2(弱)	310.1
AS1-5	47％		64.6
				AS2-5	62％		108.7

细胞	检测到的MMP	VEGF(pg/ml)
			WT	MMP-2MMP-9	306.3
WT+1.10PA	ND	240
			WT+抗-CD147	ND	220
无(仅NHDF)	MMP-2	19.5
			S1-3	MMP-2MMP-9	416.1
AS1-5	无	134.7
			AS2-5	无	154.3

                    表2

这些数据显示肿瘤细胞表达的EMMPRIN、MMP表达和单独的工程肿瘤细胞中VEGF水平之间的联系。共培养的数据(表2)显示，当NHDF与WT人乳腺肿瘤细胞或过表达EMMPRIN的细胞(S1-3)存在时，产生超出相加量的VEGF。

                   实施例8

        通过EMMPRIN刺激体内肿瘤的血管发生

肿瘤细胞来源的EMMPRIN对血管发生、新血管形成上的刺激影响，在体内被直接评价。人乳腺癌细胞MDA MB 231经设计以用重组DNA技术来表达不同水平的EMMPRIN蛋白。被制造的有义EMMPRIN细胞代表一个细胞群，该群得自用编码全长人EMMPRIN的哺乳动物表达载体稳定转染的单细胞克隆。通过用以反义方向编码全长人EMMPRIN的哺乳动物表达载体转染MDA MB 231细胞产生反义细胞。有义细胞组成型表达水平提高的EMMPRIN，反义细胞由于通过反义RNA抑制蛋白翻译而表达水平降低的EMMPRIN(见实施例7)。这些细胞，与野生型细胞一起被植入裸鼠皮下。在由这些细胞得来的肿瘤中评价肿瘤血管发生。

所有涉及动物及其照料的程序的进行都与该公司ICAUC指导方针一致，符合NIH标准。四周龄雌性CD1 Nu/Nu小鼠得自CharlesRiver实验室，并在实验前适应10-14天。

与得自野生型肿瘤或载体对照肿瘤细胞比较，发现EMMPRIN过表达细胞产生的S1-3肿瘤中最终肿瘤重量增加了5倍(图5A)。在相同时间段，与未改变的对照细胞、WT或用空载体、载体转染的那些细胞相比，AS1-5和AS2-5细胞产生明显较小的规模(分别是p＝0.0242和0.0439)(图5A)。

如图5B所示，增加的血管发生由肿瘤中大量新毛细血管而证明，肿瘤得自有义细胞而不是得自野生型和反义细胞。

由S1-3细胞产生的异种移植组织(235.3pg/μg总蛋白)的人VEGF水平比WT(92.4)和载体对照细胞(86.0pg/μg总蛋白)(有义相对野生型p＝0.0043)中高2.6倍(图5C)。EMMPRIN水平被抑制的AS细胞得来的肿瘤组织，其人VEGF减少40.4％或为55pg/mg总蛋白(相比WTp＝0.0177)。

更重要的是，肿瘤细胞表面EMMPRIN水平的提高对肿瘤组织VEGF表达的影响超出了肿瘤细胞的范围。伴随肿瘤VEGF产生的刺激，小鼠基质VEGF产生在有S1-3肿瘤的小鼠中也提高。宿主来源的VEGF水平提高2.1倍，在野生型和载体对照肿瘤中从23和24pg/mg总蛋白到有义肿瘤中48pg/μg总蛋白(p＝0.00009有义相对WT)(图5C)。从给予AS细胞的小鼠组织VEGF，VEGF减少56.6％或为10pg/mg总蛋白(相比WTp＝0.00013)。

因此，肿瘤和宿主细胞来源的VEGF水平都随EMMPRIN修饰细胞来源的肿瘤中的EMMPRIN水平和其趋势而动。这些观测结果支持一个新的范例，其中肿瘤EMMPRIN介导肿瘤和基质层之间有效的相互作用以刺激VEGF的产生及随后体内肿瘤的血管发生和生长。

                  实施例9

肿瘤EMMPRIN对与MMP和VEGF有关的肿瘤组织环境的影响

描述于实施例3中的人乳腺癌细胞，被用来评价EMMPRIN增加或降低对体内肿瘤组织和肿瘤基质(成纤维细胞、内皮细胞和其他辅助细胞)的影响。

第0天，大约6周龄的小鼠被分为5组，每组包括8只小鼠。动物在右胁腹部位被皮下注射有10⁷细胞的0.1mL细胞悬液。每周通过测径器测量来监测肿瘤生长，按照公式(长度×宽度×宽度)/2来计算肿瘤体积(mm³)。在实验的最后，所有的动物都经由CO₂窒息被安乐死。原发性肿瘤被切离、秤量、在冰冷的PBS中清洗和加工以备组织学/显微镜检用。组织样本和切片也在液氮中速冻以备蛋白提取和生化分析用。

人EMMPRIN水平用ELISA分析进行定量评价，证明与野生型肿瘤中59.0pg/μg总蛋白相比，有义肿瘤中获得相当高水平的EMMPRIN(109.8pg/μg总蛋白)，而相反，反义肿瘤中的水平被高度抑制(26.0pg/μg总蛋白)(有义和反义肿瘤相比野生型分别为p＝0.000048和0.000077)(图6A)。EMMPRIN表达对转染的肿瘤细胞的稳定影响随后被转变为体内对MMP表达的影响。正如所期望的，肿瘤组织抽提物的底物酶谱法分析显示在EMMPRIN有义肿瘤中MMP-2和MMP-9的活性水平增加，当EMMPRIN表达被抑制时则水平降低(图6B)。肿瘤和宿主层的MMP水平都通过生物化学分析来定量。当EMMPRIN在肿瘤细胞中过表达时，在所得异种移植肿瘤中的人MMP-2和人MMP-9表达水平都被提高约2.5倍(分别与野生型肿瘤相比p＝0.0068和0.0056)(图6C)。相反，当EMMRPIN在反义肿瘤中被抑制时，这两种MMP的表达被观察到降低2倍(分别与野生型肿瘤相比p＝0.0026和0.0035)(图6C)。肿瘤EMMPRIN表达对伴有基质细胞的宿主MMP-9活性的影响甚至大于对肿瘤MMP。

因此，肿瘤细胞表面EMMPRIN的变化能诱导小鼠MMP-9的表达分别在有义或反义肿瘤结节中提高3.3倍或降低59.3％(分别与野生型肿瘤相比p＝0.00013和0.0047)(图6D)。

体内肿瘤EMMPRIN-MMP系统的可视化

肿瘤

在过表达EMMPRIN的细胞和WT或低表达细胞AS产生的肿瘤之间，血管形成活性的不同清晰可见(图7)。

肿瘤EMMPRIN表达对宿主EMMPRIN-MMP系统的影响，在异种移植肿瘤的免疫组织化学分析中被进一步研究。过表达EMMPRIN的肿瘤细胞(MDA MB231 S1-3)产生的肿瘤中，小鼠MMP-9和EMMPRIN的增量调节均在基质细胞中被检测到。这两种蛋白的表达被限制于小鼠细胞中，而不会在异种移植的人肿瘤细胞中被检测到(图8)。有趣的是，除了在肿瘤周围包膜或浸润入肿瘤组织的基质层中的成纤维细胞里有染色之外，血管样结构周围的小鼠EMMPRIN和MMP-9均被高度正调节(图8)。通过重叠分布的小鼠MMP-9、EMMPRIN和CD31的血管标记进一步证明MMP-9和EMMPRIN的共定位在血管形成性血管周围(图8)。相反，在载体对照肿瘤细胞产生的肿瘤中只有最低水平的MMP-9和EMMPRIN的表达。在这些肿瘤中，MMP-9主要在巨噬细胞样细胞中被检测到，EMMPRIN以极低的水平在一些成纤维细胞中被检测到(图8)。

                   实施例10

  抗血管形成的抗EMMPRIN单克隆抗体的产生和特征

抗血管形成的抗EMMPRIN抗体可用标准程序进行制备并用这里描述的抗血管生成的抗EMMPRIN拮抗剂之性质进行筛选。

材料与方法

三个12-14周龄的Balb/c小鼠得自Charles River实验室。两只小鼠的每一个都接受组合的皮内和腹腔内注射25μg rHuEMMPRIN(R&D系统)(12.5μg/位点)，第0天在75μL PBS中与相等量的弗氏完全佐剂乳化，第14、28、51天含25μg rHuEMMPRIN的75μLPBS与相等量的弗氏不完全佐剂乳化。第三只小鼠最初经尾根部皮下注射给予100μL PBS，其中含25μg rHuEMMPRIN+0.33×10⁵U鼠IFNα+0.33×10⁵U鼠IFNβ(Biosource)。在第2和第3天，小鼠再次经尾根部皮下注射给予100μLPBS，其中含0.33×10⁵U鼠IFNα+0.33×10⁵U鼠IFNβ(Biosource)。数周后，小鼠再追加尾根部皮下注射给药，其中含25μgEMMPRIN+100μg抗鼠CD40激动剂Mab(R&D Systems)。

在免疫过程自始至终的各个时间点将小鼠放血。通过后框穿刺完成血液的收集，并且通过固相EIA测定收集到的血清的滴定度。一旦得到平稳的滴定度，就施以小鼠最后的加强剂量，静脉(IV)给予含25μg EMMPRIN的PBS。三天后，小鼠经由CO₂窒息安乐死，脾脏被无菌移除并浸入含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B的10mL冰冷PBS中(PBS/PSA)。无菌细胞流过浸入冰冷(PBS/PSA)的金属筛，收集淋巴细胞。细胞在冰冷PSA/PBS中洗涤一次，用台盼蓝染色排除法进行计数并重悬于10mL PBS中。

抗人EMMPRIN抗体的特征

酶免疫测定(EIAs)用来检测杂交瘤细胞上清液以确定人抗EMMPRIN Mabs的存在。简短的说，用1μg/mL人EMMPRIN的PBS包被板子(Nunc-Maxisorp)过夜。在含有0.02％(w/v)Tween 20的0.15M盐水中洗涤后，用1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS封阻各孔，37℃封阻1小时。未稀释的杂交瘤上清液在包被板上37℃温育1小时。洗涤板并随后与1∶10000稀释于1％BSA/PBS的HRP标记的羊抗鼠IgG、特异的Fc(Sigma)37℃温育30分钟。再洗板，随后与100μL/孔的柠檬酸-磷酸底物溶液(0.1M柠檬酸和0.2M磷酸钠、0.01％H₂O₂和1mg/mL邻苯二胺二盐酸盐)RT下温育15分钟。通过添加25μL/孔的4N硫酸停止底物显影，经酶标仪自动板分光光度计检测490nm的吸光度。所有活性的杂交细胞系通过有限稀释被亚克隆两次至1细胞/孔的克隆板里。同种细胞系被冷冻保存在冷冻培养基(90％FBS，10％DMSO)里并被储存在液氮中。

为鉴定同种型的鼠抗人EMMPRIN抗体，按照厂商说明使用单克隆抗体同种型试剂盒-IsoStrip浸渍片形式(Roche)。简短的说，培养物上清以1∶10稀释于PBS中并被加入显影管。浸渍片被加入到显影管，RT下温育约10分钟。温育后通过视觉评价来确定同种型。18个不同杂交瘤克隆的一栏示于表3，分泌特异性结合人EMMPRIN的鼠IgG Mab。

用作抗原蛋白的重组EMMPRIN的生物活性，通过其刺激成纤维细胞中由EMMPRIN受激的MMP-1的产生的能力而被测定，如所述进行(Guo，Zucker，Gordon，Toole and Biswas，(1997)，J Biol Chem272：24-7)(24))，用传代小于三次的高度同源的原代人纤维母细胞修饰及经修饰的刺激条件。只有高纯度的、被确定为细胞角蛋白18、细胞角蛋白19、因子VII相关抗原和α肌动蛋白阴性的成纤维蛋白被用于本实验中。对EMMPRIN刺激的应答强度依赖于成纤维细胞的传代。初期的传代细胞应答更有力，与已经被培养超过三代的细胞相比，产生MMP的量增加。此外，一种新的细胞攻击方法被使用。我们将重组EMMPRIN预装入测试孔中而不是添加重组EMMPRIN到粘附细胞中。悬浮的细胞随后被加入到这些孔里并被直接暴露给重组EMMPRIN。由于细胞表面受体可能被表达于基底侧表面并不能与粘附细胞接近，所以此新攻击操作确保细胞表面受体对EMMPRIN的最大暴露以优化测定灵敏度。

在NSO细胞中产生(R&D Systems，Minneapolis，MN)相应于人EMMMPRIN蛋白的胞外区域的重组EMMPRIN。无血清培养基(用不同量的重组EMMPRIN蛋白处理的成纤维细胞调整)中的MMP-1活性的定量是用MMP-1活性测定试剂盒按照产品手册进行(R&DSystems，Minneapolis，MN)。简短的说，包含于150μL标样或样本的MMP-1被固定在测定孔底部的抗MMP-1抗体捕获。捕获到的MMP-1随后被4-氨基苯基乙酸汞(APMA)激活。加入到每个孔中的MMP底物被活化的MMP-1分解，产生的荧光用Spectra Fluor Plus PlateReader(TECAN，Research Triangle Park，NC)进行确定，参数如下：激发波长320nm，发射波长405nm。为确定抗EMMPRIN抗体的抑制活性，在细胞被重组EMMPRIN刺激15分钟后，抗体被加入到细胞培养物中。

除了同种型之外，该组单克隆抗体都进行这两种活性的筛选(表3)。表3

CNTO#	同种型	MMP-1	共培养
				1111	IgG2bk	N	P
2169	IgG1k	N	N
				120	IgG1k	N	N
5125	IgG1k	N	N
				627	IgG1k	N/A	N/A
828	IgG2bk	N	N
				146	IgG1k	P	P
314	IgG1k	N	P
				1310	IgG1k	N	N
1412	IgG2bk	N	N/A
				1513	IgG1k	N	N

1611	IgG1k	N*	N
				610	IgG1k	N	N/A
1134	IgG1k	N	N/A
				4153	IgG1k	N	N/A
3632	IgG1k	N	N/A
				1193	IgG1k	N	N/A
4161	IgG1k	N	N/A
				N/A(抗CD147)	IgG1k	P	P

称为CNTO146的抗体符合抗血管形成的抗EMMPRIN Mab的起始选择标准。

在肿瘤细胞和成纤维细胞的共培养中抑制MMP-2的产生

如前所述用正常人皮肤成纤维细胞和人黑素瘤细胞(G361)进行共培养实验，市售抗体RDI CD147或CNTO 146被加入培养物中。最后更换无血清培养基后三天，测定MMP-2的量。数据显示在这些共培养物中与市售抗体一样，CNTO146能抑制MMP-2的产生。

Claims (18)

1.一种治疗哺乳动物的血管发生依赖型疾病方法，所述方法包括给予需要该疗法的哺乳动物有效剂量的EMMPRIN拮抗剂以抑制所述哺乳动物的血管发生。

2.权利要求1的方法，其中EMMPRIN拮抗剂是EMMPRIN的单克隆抗体或其片段。

3.权利要求2的方法，其中抗体片段是Fab、Fab′或F(ab′)2片段或其衍生物。

4.权利要求2的方法，其中单克隆抗体是由静脉内给予。

5.权利要求2的方法，其中单克隆抗体的给药剂量为0.05mg/kg-12.0mg/kg体重。

6.权利要求2的方法，其中单克隆抗体是以静脉推注给药，随后输注所述抗体。

7.权利要求1的方法，其中哺乳动物为病人。

8.权利要求1的方法，其中血管发生依赖型疾病为癌症。

9.权利要求1的方法，其中血管发生依赖型疾病选自血管瘤、血管纤维瘤、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼、血管发生诱导的角膜病、退化性黄斑、黄斑变性、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维组织增生症、粒性结膜炎、银屑病、毛细血管扩张、脓性肉芽肿、脂溢性皮炎、痤疮和关节炎。

10.权利要求1的方法，其中所述血管发生依赖型疾病是炎性疾病，选自类风湿性关节炎、黄斑变性、银屑病、糖尿病性视网膜病。

11.权利要求1的方法，其中所述血管发生依赖型疾病是血管发生性的皮肤病症，选自银屑病、静脉曲张性溃疡、痤疮、红斑痤疮、疣、湿疹、血管瘤和淋巴管新生。

12.权利要求1的方法，其中所述血管发生依赖型疾病是涉及角膜或视网膜新生血管化的病症。

13.一种抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予需要该疗法的哺乳动物有效剂量的EMMPRIN拮抗剂，以抑制支持所述肿瘤生长的脉管系统的血管发生。

14.一种防止哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予需要该疗法的哺乳动物有效剂量的EMMPRIN单克隆抗体或其片段，以有效抑制支持所述肿瘤生长的脉管系统的血管发生。

15.一种防止哺乳动物中肿瘤转移的方法，所述方法包括给予需要该疗法的哺乳动物有效剂量的EMMPRIN拮抗剂，以预防所述哺乳动物中的肿瘤转移。

16.权利要求1、2、13、14或15中任一项的方法，其中EMMPRIN拮抗剂与第二种抗血管发生的药物合并给药。

17.权利要求16的方法，其中第二种抗血管发生的药物是能特异性结合含有αV的粘着分子的Mab。

18.权利要求2的方法，其中单克隆抗体与单克隆抗体CD147-RDI/克隆UM-8D6竞争结合人EMMPRIN。

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