JP4911950B2 - Mmp−1の部分ペプチドを用いた癌浸潤・転移阻害薬 - Google Patents
Mmp−1の部分ペプチドを用いた癌浸潤・転移阻害薬 Download PDFInfo
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Description
早期診断と外科的手術を含む治療法の進歩によって、癌が原発巣に限局するときの治癒率は高まったものの、転移が起こると現在の治療法では対処しきれないことが多く、大きな問題となっている。転移は主に浸潤性の悪性の癌がリンパ行性あるいは血行性に体内を循環し、他臓器に生着して再び増殖を始めることである。転移には原発巣からの離脱と浸潤、脈管系への侵入、脈管系からの浸出、転移臓器への生着と増殖という多くの過程が含まれる。これらの過程それぞれに多数の分子が関与していることが明らかにされてきている。例えば細胞の浸潤初期には同種細胞の接着機構の喪失が必要とされ、細胞接着因子であるカドヘリンやカドヘリン調節因子であるカテニンの異常が浸潤性胃癌細胞で明らかにされている。また、同種細胞間の接着能を失った細胞が周辺組織を移動するためには、細胞外マトリックスとの接着機構を必要とし、各種インテグリンが細胞外マトリックス構成成分に対する受容体として機能している。それと同時にマトリックスメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼなどの蛋白分解酵素やグリコシダーゼが細胞外マトリックスを分解し、生じた間隙を癌細胞が移動することも明らかになっている。これらの分子以外にも血行性転移ではFibroblast
Growth FactorやVascular Endothelial Growth Factorが血管新生因子として、また、癌細胞と血管内皮細胞との接着にシアリルLexを中心とする細胞表層の糖鎖構造やVCAM-1/VLA-4などが重要な役割を担っていることが知られている。また、癌細胞塊の形成には血小板やフィブリン等が関与すると考えられている。
コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックス(Extracellular Matrix : ECM)構成成分は、細胞間を充填するための基質としてのみならず、細胞に対する様々な生理活性を有し、その生理活性はECM代謝に深く関わっている。このECM代謝が異常をきたすと様々な疾病につながる。とりわけ、癌細胞の浸潤・転移、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周炎、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症、などにおいては、ECMの分解亢進がその病態と密接に関わっており、ECMの分解を担うMMPの重要性が示唆されている。MMPとは、Zn2+イオンを活性中心にもつ一連の金属酵素で現在までにMMPファミリーに属する分子として25種類が知られている(非特許文献2、非特許文献3参照)。これらの多くは分泌型の可溶性酵素であり、サイトカイン、成長因子や発癌プロモーターなどの刺激により不活性型の前駆体(proMMP)として細胞から産生された後、プラスミンや他の活性型MMPにより活性化を受けECMを分解する。MMP産生組織では、同時に組織性MMPインヒビターのTIMP(Tissue Inhibitor of Metallo
Proteinases)も産生され、局所における両者のバランスが組織再生に重要である。さらに、最近では細胞膜結合型MMPやMMPを細胞膜上に捕捉する分子が同定され、細胞―ECMインターフェースにおけるECM分解の重要性が示唆されている。
MMP-1はコラゲナーゼ群に分類されるMMPであり、コラーゲン分子を、その3本鎖へリックス部分のN末端から4分の3の部位で特異的に切断する酵素である。I型、II型、III型、VII型、X型コラーゲン、ゼラチン、アグリカン、エンタクチン、テイネシン、パールカンに対し分解活性を有する。その基質特異性にはヘモペキシン様ドメインが重要な役割を担っていると考えられている(非特許文献4参照)。同じ群に分類されるコラゲナーゼとしては、MMP-8、MMP-13、MMP-18があり、同様の機能を有するが、基質特異性に違いがある。
エンプリンは、当初癌細胞の膜表層に発現し、周辺の正常細胞を刺激してMMPの産生を促進することにより、癌細胞の浸潤・転移能を高める糖蛋白質として発見された。実際非常に多くの上皮系癌細胞がエンプリンを発現していることが判明している。エンプリンは免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、別名CD147またはbasignとも呼ばれる分子量約28kDaの膜貫通ドメインを有する蛋白質である(非特許文献5参照)。その細胞外領域には3本のN型糖鎖を有し、その糖鎖の違いにより43kDa〜66kDaと多様な分子量を示す。また、その糖鎖はエンプリンのMMP産生誘導活性に必須である。エンプリンの細胞外には2個の免疫グロブリン様ループ領域(EC1およびEC2)がある。エンプリンは細胞膜上でEC1を介してホモ二量体を形成し、このホモ二量体形成がMMP産生誘導活性に重要であると考えられている。
さらに本発明者らは、MMP-1のキメラ蛋白を作成し、これらを用いることにより、MMP-1とエンプリンの結合に必須の領域を明らかにすることに成功した。さらにはこの領域のペプチドおよびペプチド誘導体がエンプリンとMMP-1との結合を阻害するとともに、癌細胞の浸潤活性を効率よく阻害することを見出した。これらのペプチドおよびペプチド誘導体は、エンプリンおよびMMP-1を分子標的とする新しいタイプの癌浸潤、転移阻害薬として極めて有用なものである。
(1)配列番号:3に記載のアミノ酸配列をその一部に含む30残基未満のオリゴペプチドまたは1−5のアミノ酸で置換、欠失または挿入されたその誘導体であってMMP-1蛋白質とエンプリン蛋白質の結合を阻害する物質、及び薬学的に許容され得る担体を含んでなる抗癌剤。
(2)配列番号:3に記載のアミノ酸配列をその一部に含む30残基未満のオリゴペプチドが、配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである請求項1に記載の抗癌剤。
(3)癌細胞浸潤、転移阻害薬である請求項1又は2に記載の抗癌剤。
蛋白質およびペプチド
本明細書で使用する用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって共有結合された2つ以上のアミノ酸からなる有機化合物を指す。ペプチドとして、ジペプチド(2つのアミノ酸残基を含むもの)やトリペプチド(3つのアミノ酸)などを挙げることができる。
本発明は、本発明のオリゴペプチドに結合する抗体であって、MMP-1蛋白質とエンプリン蛋白質の結合を阻害する機能を有する抗体を提供することができる。ここで「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントが含まれる。
本発明の「医薬組成物 」とは、前記で定義される本発明の「オリゴペプチド」と、薬学的に許容され得る担体とからなる医薬組成物 である。
組成物 を調製することができる。これらの医薬 組成物 は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
組成物 に含有される活性成分(前記ポリペプチドや抗体など)の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき10μgから1000mg(あるいは10μgから500mg)の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
ヒト子宮頸部がん細胞SKG-IIを播種し、24時間培養した。その後proMMP-1 (mutant)およびproMMP-1 (wild type)を4.8 nMとなるよう添加し、37℃にて6時間反応させた。一方では、あらかじめ抗EMMPRIN抗体を処理後、同様の操作を行った。その後、細胞を4%
(w/v)paraformaldehyde/PBS (-)により固定し、sheep anti-(human
proMMP-1)IgGを一次抗体とし、TRITC-conjugated goat anti-(sheep
IgG)を二次抗体として反応させ、proMMP-1 (mutant)およびproMMP-1 (wild type)の局在を観察した。
その結果を図1に示す。SKG-II細胞膜上に、proMMP-1が結合し、その結合は抗エンプリン抗体により阻害を受けることが確認された。SKG-II細胞表面へのproMMP-1の結合はエンプリンを介していること、さらにはproMMP-1(mutant)とproMMP-1(wild type)は同様にエンプリンに結合することが示された。
ヒト子宮頸部がん細胞SKG-IIを細胞懸濁液とし、これにproMMP-1あるいはAPMAにより活性化させたMMP-1を加え37℃にて30分間反応させた。SKG-II細胞を洗浄後、タイプIコラーゲンをコートしたインサートチャンバーに播種し、72時間培養した。チャンバーの裏側にある細胞数を任意の10視野においてカウントし、統計処理を行った。また、proMMP-1およびMMP-1のSKG-II細胞膜上への局在化を免疫染色法にて確認した。
その結果を図2に示す。活性化させたMMP-1が結合したSKG-II細胞は、proMMP-1が結合したものと比較して、顕著に浸潤活性の上昇が見られた。
ヒト子宮頸部がん細胞SKG-IIを播種し、24時間培養した。その後proMMP-1 (mutant)およびMMP-1キメラタンパク質proMMP-1-1-13, MMP-1-13-1 [MMP-(catalytic domain)-(hinge
domain)-(hemopexin-like domain)]を4.8 nMとなるよう添加し、37℃にて6時間反応させた。その後、細胞を4% (w/v)paraformaldehyde/PBS (-)により固定し、sheep
anti-(human proMMP-1)IgGを一次抗体とし、TRITC-conjugated goat
anti-(sheep IgG)を二次抗体として反応させ、proMMP-1 (mutant)およびキメラタンパク質の局在を観察した。
hinge domain peptideによるproMMP-1(mutant)のSKG-II細胞膜上局在への影響
ヒト子宮頸部がん細胞SKG-IIを播種し、24時間培養した。その後proMMP-1 (mutant)を4.8 nM、およびMMP-1 hinge domain peptideを480 nMとなるよう添加し、37℃にて6時間反応させた。その後、細胞を4% (w/v)paraformaldehyde/PBS (-)により固定し、sheep
anti-(human proMMP-1)IgGを一次抗体とし、TRITC-conjugated goat
anti-(sheep IgG)を二次抗体として反応させ、proMMP-1 (mutant)の局在を観察した
その結果を図4に示す。proMMP-1のSKG-II細胞表面への結合は、MMP-1 hinge domain peptideにより阻害された。すなわち、MMP-1
hinge domain peptideはMMP-1と細胞表面上のエンプリンとの結合を阻害することができた。
ヒト子宮頸部がん細胞SKG-IIを細胞懸濁液とし、proMMP-1、APMAにより活性化させたMMP-1およびMMP-1 hinge domain peptideを添加し、37℃にて30分間反応させた。SKG-II細胞を洗浄後、タイプIコラーゲンをコートしたインサートチャンバーに播種し、72時間培養した。チャンバーの裏側にある細胞数を任意の10視野においてカウントし、統計処理を行った。
その結果を図5に示す。SKG-II細胞に活性化MMP-1が結合することにより浸潤能が増加するが、同時にMMP-1 hinge domain peptideを添加するとその増加が抑制された。この抑制の程度は、proMMP-1を添加した場合と同様であった。すなわちこの結果は、MMP-1 hinge
domain peptideがMMP-1とエンプリンとの結合を阻害することにより、癌細胞浸潤を抑制することができることを示すものである。
Claims (3)
- 配列番号:3に記載のアミノ酸配列をその一部に含む30残基未満のオリゴペプチドまたは1−5のアミノ酸で置換、欠失または挿入されたその誘導体であってMMP-1蛋白質とエンプリン蛋白質の結合を阻害する物質、及び薬学的に許容され得る担体を含んでなる抗癌剤。
- 配列番号:3に記載のアミノ酸配列をその一部に含む30残基未満のオリゴペプチドが、配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである請求項1に記載の抗癌剤。
- 癌細胞浸潤、転移阻害薬である請求項1又は2に記載の抗癌剤。
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