CN116635045A - 用于扩增并维持HSCs自我更新能力和分化潜能的培养基组合物及其应用 - Google Patents

用于扩增并维持HSCs自我更新能力和分化潜能的培养基组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

一种用于扩增并维持造血干细胞自我更新能力和分化潜能的培养基组合物、细胞群体及其应用。所述培养基组合物包括造血干细胞培养基和PDGFR靶点的小分子抑制剂。PDGFR的抑制剂能够在体外培养过程中显著扩增HSCs，同时保持HSCs高比例的自我更新能力，可以实现HSCs的体外扩增的同时维持细胞较高比例的干性。

Description

用于扩增并维持HSCs自我更新能力和分化潜能的培养基组合物及其应用 技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种用于扩增并维持HSCs自我更新能力和分化潜能的培养基组合物、包含HSCs的输注液及其应用。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)是血液系统中一群异质原始造血细胞，具有自我更新和多系分化2个重要特征。机体处于健康状态时，体内HSCs长期处于静息状态，当机体发生病变或严重失血状态时，HSCs被激活，进入自我更新、多系分化状态，维持血液系统稳定及机体稳态。HSCs自我更新特性有利于子代HSCs保持干性，而HSCs多系分化特性可使其分化成多种成熟血细胞，如髓系细胞(粒细胞、单核细胞、红细胞及血小板)，淋系细胞(T细胞和B细胞)。正因为HSCs的特性，以及处于血液系统而具有的迁移、归巢能力，有利于HSCs在机体需要时进行分化，以及在机体稳态时归巢至骨髓微环境发挥功能。
HSCs的这些特性，使通过造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)治疗血液系统疾病成为可能。1959年，Thomas等人利用骨髓造血干细胞进行了人类历史上首次造血干细胞移植，在临床治疗白血病，以恢复病人体内正常造血功能。此后几十年，经过科研工作者的不断努力，造血干细胞移植不仅应用于治疗多种血液系统疾病，还被用于治疗免疫缺陷疾病、神经系统退行性疾病等。
目前，HSCs主要有三个来源，骨髓(bone marrow，BM)、动员外周血(mobilized peripheral blood，mPB)、脐带血(umbilical cord blood，CB)。三种来源的HSCs各有利弊，例如采集骨髓来源造血干细胞，创伤性大，采集量不足；人外周血中HSCs所占比例太低(小于0.1％)，采集时需要用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员造血干细胞从骨髓中迁移至外周血中，临床应用中常出现动员效果不佳、所含HSCs数量不足，而多次动员或移植失败；采集脐带血来源的造血干细胞比较方便，对供者无伤害且不存在伦理问 题，所采集的HSCs造血能力强。上述三种来源的HSCs中，骨髓和动员外周血来源的HSCs均需要进行供者和患者之间白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)配型。HLA配型比较困难，一旦发生错配，则会产生移植物抗宿主反应(graft versus host reaction，GVHD)，大量发生GVHD的患者会死于免疫系统紊乱。而脐带血来源的HSCs对HLA配型相合程度要求低，允许HLA部分错配，移植后GVHD发病率低，缓解了传统HSCT配型困难。上述三种方法采集的HSCs面临的共同问题是细胞量少，有时仅能满足儿童或体重较轻的成人移植，不能满足较大体重成人的移植需求。
研究表明，造血干细胞移植的安全性和有效性取决于移植的HSCs含量，当移植HSCs数量不足时，患者中性粒细胞恢复延迟，导致GVHD风险提高。移植的HSCs含量越高，患者中性粒细胞和血小板恢复时间缩短，住院护理时间缩短，大大降低移植失败的风险，并减轻患者负担。
造血干细胞所具有的自我更新和多系分化的特性，导致造血干细胞在体外培养过程中，一旦大量分裂增殖，则分化成各谱系血细胞而失去自我更新特性。因此，研究者们不断努力，尝试探索利用不同方法对造血干细胞在体外进行一定程度扩增，同时最大限度维持造血干细胞自我更新能力。若能实现，则可提高造血干细胞移植的成功率。目前为止，体外培养造血干细胞的其中一种思路是在培养基中添加小分子化合物，靶向调控造血干细胞的分裂增殖信号，通过改变细胞的分裂增殖状态使造血干细胞既能保持一定程度的扩增，又能维持其自我更新能力。
已有研究证明血小板衍生生长因子PDGF(platelet-derived growth factor)及血小板衍生生长因子受体PDGFR(platelet-derived growth factor receptor)与细胞的分裂增殖息息相关。PDGF是从人的血小板中分离出来的促血管生成因子，PDGFR是定位于细胞膜上的酪氨酸蛋白激酶家族成员。研究表明，PDGF必须与PDGFR结合，磷酸化激活PDGFR，启动PDGF/PDGFR信号通路，才能发挥生物学效应，如能刺激停滞于G0/G1期的成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞等多种细胞进入分裂增殖周期。机体受损时，血小板大量释放的PDGF能够刺激邻近的结缔组织细胞增殖，进而重建受损组织、愈合创口。该信号通路也被证实与一系列疾病的发生发展相关。在多种肿瘤中，PDGF和PDGFR的表达与肿瘤的发生发展密切相关，肿瘤细胞通过释放PDGF促进血管生成，诱导肿瘤细胞的增殖和迁移，并抑制其调亡。根据 PDGF/PDGFR作用机制，进行肿瘤的靶向治疗已取得较大进展，目前已有多个针对PDGFR的抑制剂药物获批上市。PDGF/PDGFR信号通路在很多类型的细胞中研究报道较多，但在造血干细胞中报道较少。PDGF/PDGFR信号通路在造血干细胞扩增和保持自我更新能力方面发挥怎样的作用还是一片研究空白。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种用于扩增并维持HSCs自我更新能力和分化潜能的培养基组合物、细胞群体及其应用。
本发明的发明人在体外培养不同来源的HSCs时，持续加入PDGFR的抑制剂，可维持HSCs一定程度的扩增，但与此同时维持HSCs高比例的自我更新能力，这样在细胞培养产物中，能获得大量有移植潜能的LT-HSCs，效果优于已知培养HSCs的化学小分子。这在造血干细胞扩增和自我更新能力研究中尚属首次报道。
本发明具体技术方案如下：
1.一种用于扩增并维持造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)自我更新能力和分化潜能的培养基组合物，其包括造血干细胞培养基和PDGFR靶点的小分子抑制剂。
2.根据项1所述的组合物，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，优选为AG1296。
3.根据项1或2所述的培养基组合物，其中，所述造血干细胞培养基包含：1)基础培养基(优选无血清的基础培养基)；2)生长因子；和/或3)细胞因子。
4.根据项3所述的培养基组合物，其中，所述生长因子或细胞因子选自如下的一种或多种：生长因子Flt-3L、生长因子SCF、生长因子TPO和白细胞介素IL-6。
5.根据项4所述的培养基组合物，其中所述生长因子或细胞因子在所述培养基组合物中的浓度如下所示：
所述生长因子Flt-3L的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述生长因子SCF的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述生长因子TPO的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述白细胞介素IL-6的浓度为1-50ng/ml，优选为1-20ng/ml。
6.根据项1-5中任一项所述的培养基组合物，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂在所述培养基组合物中的浓度为0.1-100μM，优选为0.5-50μM，进一步优选为1-10μM。
7.根据项1-6中任一项所述的培养基组合物，其中，所述HSCs来源于骨髓、动员外周血、脐带血、冻存复苏的HSCs或经过基因编辑改造的HSCs。
8.一种促进HSCs扩增并维持HSCs自我更新能力的方法，包括在含有PDGFR靶点的小分子抑制剂的培养基组合物中体外培养HSCs。
9.根据项8所述的方法，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，优选为AG1296。
10.根据项8或9所述的方法，其中，所述造血干细胞培养基包含：1)基础培养基(优选无血清的基础培养基)；2)生长因子；和/或3)细胞因子。
11.根据项10所述的方法，其中，所述生长因子或细胞因子选自如下的一种或多种：Flt-3L、生长因子SCF、生长因子TPO和白细胞介素IL-6。
12.根据项11所述的方法，其中所述生长因子或细胞因子在所述培养基组合物中的浓度如下所示：
所述生长因子Flt-3L的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述生长因子SCF的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述生长因子TPO的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述白细胞介素IL-6的浓度为1-50ng/ml，优选为1-20ng/ml。
13.根据项8-12任一项所述的方法，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂在所述培养基组合物中的浓度为0.1-100μM，优选为0.5-50μM，进一步优选为1-10μM。
14.根据项8-13中任一项所述的方法，其中，所述HSCs来源于骨髓、动员外周血、脐带血、冻存复苏的HSCs或经过基因修饰改造的HSCs。
15.根据项8-14中任一项所述的方法，其中，体外培养时间为约4-21天，优选为约6-15天，进一步优选为约6-10天，最优选为约6-8天。
16.根据项8-15中任一项所述的方法，其中，体外培养后，CD34+表型 的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为40-85％，优选为60-85％，进一步优选为75-80％。
17.根据项8-16中任一项所述的方法，其中，体外培养后，CD34+CD90+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为6-15％，优选为8-15％，进一步优选为8-12％。
18.根据项8-17中任一项所述的方法，其中，体外培养后，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为2-10％，优选为2-6％，进一步优选为4-5％。
19.根据项8-18中任一项所述的方法，其中，体外培养后，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的细胞数占全部细胞中的比例为2-5％，优选为2.5-4％。
20.一种HSCs输注液，其中，CD34+表型的HSCs细胞数占全部细胞总数的比例为40-85％，优选为60-85％，进一步优选为75-80％。
21.根据项20所述的HSCs输注液，其中，CD34+CD90+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为6-15％，优选为8-15％，进一步优选为8-12％。
22.根据项20或21所述的HSCs输注液，其中，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为2-10％，优选为2-6％，进一步优选为4-5％。
23.根据项20-22任一项所述的HSCs输注液，其中，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的细胞占全部细胞中的比例为2-5％，优选为2.5-4％。
24.根据项20-23任一项所述的HSCs输注液，其通过项8-20任一项的方法获得。
25.一种给有需要的个体补充血细胞的方法，包括将项20-24任一项所述的HSCs输注液输注给所述个体。
26.根据项25的方法，其中所述HSCs输注液输注给所述个体后，所述HSCs在所述个体中定植、分化为血细胞。
27.根据项25或26的方法，其中所述个体为罹患出血、贫血、癌症、白血病、自身免疫病、病毒或细菌感染的个体。
28.PDGFR靶点的小分子抑制剂在促进HSCs扩增并维持HSCs自我更新能力中的用途，优选的，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的 一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，优选为AG1296。
29.一种预防或治疗个体疾病的方法，包括将项20-24中任一项所述的HSCs输注液输注给所述个体。
30.根据项20-24中任一项所述的HSCs输注液在制备预防或治疗疾病的药物中的用途。
31.根据项31所述的用途，其中，所述疾病为需要补充血细胞的疾病。
发明的效果
申请人的研究结果首次证明了PDGFR的抑制剂能够在体外培养过程中显著扩增HSCs，同时保持HSCs高比例的自我更新能力。申请人发现的PDGFR抑制剂扩增LT-HSCs的效果显著优于已报道的化学小分子。这是首次证明并报道了PDGF/PDGFR信号通路在造血干细胞扩增并维持自我更新能力方面发挥重要作用。申请人的研究结果可以实现HSCs的体外扩增的同时维持细胞较高比例的干性，在此基础上进行HSCs移植的临床应用，可广泛治疗一系列血液系统疾病。
附图说明
图1显示了目的细胞群CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-细胞群的逻辑门及门位置的确定。
图2显示了在脐带血来源的CD34+细胞上进行化合物的最佳浓度以及能够维持HSCs干性的筛选，表1中化合物(每个化合物3个测试浓度)诱导6-8天后流式检测LT-HSCs细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达分析图，横坐标代表抑制剂的名称以及使用浓度，纵坐标代表实验组/对照组LT-HSCs比例的扩增倍数。
图3 3A显示了在脐带血来源的CD34+细胞上进行化合物AG1296维持HSCs干性的最佳浓度的筛选，化合物诱导6天后流式检测LT-HSCs细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达分析图，横坐标代表抑制剂的名称以及使用浓度，纵坐标CD34+(％)，CD34+CD90+(％)，CD34+CD90+CD45RA-(％)，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)代表表达不同标志物的细胞占总细胞的比例。
3B显示了在脐带血来源的CD34+细胞上进行小分子化合物AG1296扩增HSCs的最佳浓度筛选，化合物诱导处理6天后进行总细胞数量计数，同时流式检测细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达分析图，并根据细胞计数结果得出CD34+细胞、CD34+CD90+细胞、CD34+CD90+CD45RA-细胞、CD34+CD90+CD45RA-CD38-细胞增殖的绝对数量，其中横坐标代表抑制剂的名称及浓度，纵坐标细胞数量(*e 5)代表细胞的绝对数量(细胞绝对数量＝细胞总数*干性比例，其中，干性比例指的是造血干细胞表面标志分子组合后筛选的细胞比例)。
图4 4A显示了在脐带血来源的CD34+细胞上进行化合物AG1296维持HSCs干性的最佳浓度的筛选，化合物诱导6天后流式检测LT-HSCs细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达分析图，横坐标代表抑制剂的名称以及使用浓度，纵坐标CD34+(％)，CD34+CD90+(％)，CD34+CD90+CD45RA-(％)，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)代表表达不同标志物的细胞占总细胞的比例。
4B显示了在脐带血来源的CD34+细胞上进行小分子化合物AG1296扩增HSCs的最佳浓度筛选，化合物诱导处理6天后进行总细胞数量计数，同时流式检测细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达分析图，并根据细胞计数结果得出CD34+细胞、CD34+CD90+细胞、CD34+CD90+CD45RA-细胞、CD34+CD90+CD45RA-CD38-细胞增殖的绝对数量，其中横坐标代表抑制剂的名称及浓度，纵坐标细胞数量(*e 5)代表细胞的绝对数量(细胞绝对数量＝细胞总数*干性比例，其中，干性比例指的是造血干细胞表面标志分子组合后筛选的细胞比例)。
图5 5A显示了在动员外周血来源的CD34+细胞上进行化合物AG1296与已知文献报道的抑制剂SR1和UM171在维持HSCs干性方面的比较。化合物诱导8天后流式检测LT-HSCs细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达分析图，横坐标代表抑制剂的名称以及使用浓度，纵坐标CD34+(％)，CD34+CD90+(％)，CD34+CD90+CD45RA-(％)，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)代表表达不同标志物的细胞占总细胞的比例。
5B显示了在动员外周血来源的CD34+细胞上进行化合物AG1296与已知文献报道的抑制剂SR1和UM171在细胞扩增方面的比较。化合物诱导处理8 天后流式检测细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达分析图，并根据计数结果得出CD34+细胞、CD34+CD90+细胞、CD34+CD90+CD45RA-细胞、CD34+CD90+CD45RA-CD38-细胞增殖的绝对数量，其中，横坐标代表抑制剂的名称，纵坐标细胞数量(*e 5)代表细胞的绝对数量(细胞绝对数量＝细胞总数*干性比例，其中，干性比例指的是造血干细胞表面标志分子组合后筛选的细胞比例)。
图6显示了在脐带血来源的CD34+细胞上进行AG1296不同浓度的体外克隆形成能力的分析图。BFU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM代表红系、髓系、淋巴系等血液系统不同谱系的克隆。其中，横坐标代表抑制剂名称以及使用浓度，纵坐标克隆数目代表总克隆数，GEMM克隆数目代表CFU-GEMM克隆数量。
图7显示了目的细胞群hCD45+、hCD19+、hCD33+、hCD3+和hCD56+细胞群的逻辑门及门位置的确定。
图8 8A显示了化合物AG1296与已知文献报道的抑制剂SR1，体外培养动员外周血来源的CD34+细胞并进行免疫缺陷型小鼠的体内移植效果的比较。动员外周血来源的CD34+细胞用小分子抑制剂体外培养6天后，移植免疫缺陷型小鼠，移植后18周检测小鼠骨髓细胞中人CD45+细胞比例。横坐标代表抑制剂的名称，纵坐标代表小鼠骨髓细胞中人CD45+细胞比例。
8B显示了化合物AG1296与已知文献报道的抑制剂SR1，体外培养动员外周血来源的CD34+细胞并进行免疫缺陷型小鼠的体内移植后各谱系细胞形成能力的比较。动员外周血来源的CD34+细胞用小分子抑制剂体外培养6天后，移植免疫缺陷型小鼠，移植后18周检测小鼠骨髓细胞中人CD19+(代表B细胞)、人CD33+(代表Myeloid细胞)、人CD3+(代表T细胞)、人CD56+(代表NK细胞)细胞比例。横坐标代表抑制剂的名称，纵坐标代表小鼠骨髓细胞中人谱系细胞比例。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本 发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供了一种用于扩增并维持HSCs自我更新能力和分化潜能的培养基组合物，其包括PDGFR靶点的小分子抑制剂。
所述HSCs自我更新能力指的是能产生具有干性的HSCs而不分化的能力。
所述小分子抑制剂指的是这样的分子实体(通常为有机或有机金属的)，其不是聚合物，具有医药活性，并且具有小于约2kDa、小于约1kDa、小于约900Da、小于约800Da或小于约700Da的分子量，小分子抑制剂可以是合成的，半合成的(即从天然存在的前体合成)或通过生物学方式获得的。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib；优选为AG1296。
所述AG1296是人工合成的喹啉类化合物，其是一种酶抑制剂，可以与ATP竞争性抑制PDFGR。
所述PDGFR inhibitor 1是人工合成的一种酶抑制剂，可抑制PDGFR靶点。
所述Imatinib是人工合成的多靶点酪氨酸激酶抑制剂，可抑制PDGFR靶点。
所述PP121是人工合成的多靶点抑制剂，可抑制PDGFR靶点。
所述Ponatinib是人工合成的多靶点抑制剂，可抑制PDGFR靶点。
所述Axitinib是人工合成的多靶点抑制剂，可抑制PDGFR靶点。
所述Trapidil是人工合成的PDGF的拮抗剂，可破坏PDGF和PDGFR的自分泌环。
所述Erdafitinib是人工合成的FGFR抑制剂，也可抑制PDGFR靶点。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述组合物还包括造血干细胞培养基，优选的，所述造血干细胞培养基包含：1)基础培养基(优选无血清的基础培养基)；2)生长因子；和/或3)细胞因子；
所述生长因子或细胞因子选自如下的一种或多种：生长因子Flt-3L、生长因子SCF、生长因子TPO和白细胞介素IL-6；
优选的，所述生长因子Flt-3L的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述生长因子SCF的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述生长因子TPO的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述白细胞介素IL-6的浓度为1-50ng/ml，优选为1-20ng/ml。
所述基础培养基指的是能够提供细胞增殖所需的基础营养物质，所有的基础培养基都包含氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子等物质，所述的基础培养基可以是自制的(即需要使用粉体自制成液体)，也可以是商购的(即为液体)，所述的基础培养基包括含血清的基础培养基和无血清的基础培养基。
所述的含血清的基础培养基中血清可以为胎牛血清或小牛血清等；
所述的无血清的基础培养基例如可以为如StemCell公司的SFEM、SFEM II、 H3000、StemSpan TMACF；ThermoFisher公司的StemPro-34；Sigma公司的Stemline II；R&D公司的StemXVivo；Lonza公司的X-VIVO 15；CellGenix公司的SCGM等。
所述生长因子Flt-3L指的是人FMS相关酪氨酸激酶3配体，可刺激造血干细胞的增殖。
所述生长因子SCF指的是人干细胞因子，可刺激造血干细胞的增殖。
所述生长因子TPO指的是人促血小板生成素，可刺激造血干性的增殖。
所述白细胞介素IL-6指的是人白介素-6，可促进造血干细胞增殖。
其中，所述SFEM II培养基指的是StemCell公司的一款培养造血干细胞的无血清基础培养基，适用于培养造血干细胞。
例如，所述生长因子Flt-3L的浓度可以为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml等；
所述生长因子SCF的浓度可以为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、等；
所述生长因子TPO的浓度可以为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml等；
所述白细胞介素IL-6的浓度可以为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml等。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述造血干细胞培养基例如包括无血清的基础培养、生长因子Flt-3L、生长因子SCF、生长因子TPO和白细胞介素IL-6或者所述造血干细胞培养基可以包括无血清的基础培养基、生长因子Flt-3L、生长因子SCF和生长因子TPO。
所述的造血干细胞培养基指的是培养造血干细胞的培养基。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂在所述培养基组合物中的浓度为0.1-100μM，优选为0.5-50μM，进一步优选为1-10μM。
例如，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂在所述培养基组合物中的浓度可以为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM等。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述HSCs来源于骨髓、动员外周血、脐带血、冻存复苏的HSCs或经过基因编辑改造的HSCs。
本发明提提供了一种HSCs输注液，其中，CD34+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为40-85％，优选为60-85％，进一步优选为75-80％。
例如，CD34+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例可以为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％等。
所述全部细胞指的是指最初的CD34+细胞经过培养之后的所有子代细胞。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，CD34+CD90+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为6-15％，优选为8-15％，进一步优选为8-12％。
例如，CD34+CD90+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例可以为6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，CD34+CD90+CD45RA- 表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为2-10％，优选为2-6％，进一步优选为4-5％。
例如，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例可以为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的细胞数占全部细胞中的比例为2-5％，优选为2.5-4％。
例如，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的细胞数占全部细胞中的比例可以为2％、3％、4％、5％等。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述HSCs来源于骨髓、动员外周血、脐带血、冻存复苏的HSCs或经过基因编辑改造的HSCs。
本发明提供了一种给有需要的个体补充血细胞的方法，包括将上述所述的HSCs输注液输注给所述个体。
在本发明优选的一些实施方式中，其中，将所述HSCs输注液输注给所述个体后，检测所述HSCs在所述个体中的定植和分化。在本申请给有需要的个体补充血细胞的方法中，将所述HSCs输注液输注给所述个体后，所述HSCs在所述个体中定植、分化成血细胞。将所述HSCs输注液输注给所述个体后，所述HSCs是否能在所述个体中定植、分化可通过本领域常规的检测HSCs定植、分化的方法检测。例如将动员外周血造血干细胞移植后，中性粒细胞上升会有2个峰值，第一个峰值在移植后平均11天左右，外周血中性粒细胞达到0.5×10 9个/L，随后呈现下降趋势，在移植后3～4周再次出现第二次峰值，随后恢复正常。因此，可通过检测外周血中性粒细胞的数量判断HSCs输注液输注后HSCs是否成功定植、分化。也可以通过检测外周血血小板的数量判断HSCs输注液输注后HSCs是否成功定植、分化。例如在输注后平均时间为13天左右检测外周血血小板是否达到50×10 9个/L。在脐带血造血干细胞移植后，通过平均22～24天左右检测外周血中性粒细胞是否达到5×10 9个/L进行判断；或者平均48～54天，检测外周血血小板是否达到5×10 9个/L。或者，持续监测所述个体外周血，连续3天中性粒细胞绝对计数≥0.5×10 9个/L；或血小板计数＞20×10 9个/L。另外，还有一些指标，如性染色体转变、血型转变、短片段串联重复(short tandem repeat，STR)转为供者型也可以作为植入成功标志。
本发明提供了一种促进HSCs扩增并维持HSCs自我更新能力的方法，包括在含有PDGFR靶点的小分子抑制剂的培养基组合物中体外培养HSCs。
本发明通过将含有PDGFR靶点的小分子抑制剂的培养基组合物中体外培养HSCs，能够促进HSCs扩增并维持HSCs自我更新的能力，此外，扩增所得到的细胞植入体内后，能够分化成不同谱系的细胞。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib；优选为AG1296。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述培养基组合物包含造血干细胞培养基，优选的，所述造血干细胞培养基包含1)基础培养基(优选无血清的基础培养基)；2)生长因子；和/或3)细胞因子。
所述生长因子或细胞因子选自如下的一种或多种：Flt-3L、生长因子SCF、生长因子TPO和白细胞介素IL-6；
优选的，所述生长因子Flt-3L的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述生长因子SCF的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述生长因子TPO的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述白细胞介素IL-6的浓度为1-50ng/ml，优选为1-20ng/ml。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂在所述培养基组合物中的浓度为0.1-100μM，优选为0.5-50μM，进一步优选为1-10μM。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，体外接触的时间为约4-21天，优选为约6-15天，进一步优选为约6-10天，最优选为约6-8天。
例如，体外接触的时间可以为约4-21天、约4-20天、约4-19天、约4-18天、约5-21天、约5-20天、约5-19天、约5-18天、约6-18天、约6-17天、约6-16天、约6-15天、约6-14天、约6-13天、约6-12天、约6-11天、约6-10天、约6-9天、约6-8天等。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，体外接触上述时间后，CD34+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为40-85％，优选为60-85％，进一步优选为75-80％。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，CD34+CD90+表型的HSCs 细胞数占全部细胞中的比例为6-15％，优选为8-15％，进一步优选为8-12％。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，体外接触上述时间后，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为2-10％，优选为2-6％，进一步优选为4-5％。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，体外接触上述时间后，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的细胞数占全部细胞中的比例为2-5％，优选为2.5-4％。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述HSCs来源于骨髓、动员外周血、脐带血、冻存复苏的HSCs或经过基因编辑改造的HSCs。
本发明使用PDGFR靶点的小分子抑制剂体外扩增HSCs细胞，能扩增不同来源的细胞，如上述所述的来源于骨髓、动员外周血或脐带血的HSCs细胞以及冻存复苏的HSCs或经过基因编辑改造的HSCs。
本发明提供了一种细胞群体，其中，CD34+细胞数占细胞群体的比例为40-85％。
所述的细胞群体指的离体细胞产物，指的是将HSCs体外接触含有PDGFR靶点的小分子抑制剂的培养基组合物得到的细胞群体。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，CD34+细胞数占细胞群体的比例为60-85％，优选为75-80％。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述细胞群体通过含有PDGFR靶点的小分子抑制剂的培养基组合物中体外培养HSCs得到。
所述的细胞群体能够维持干性，并且在植入体内后，能够分化成不同谱系的细胞，以用于治疗不同的疾病。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib；优选为AG1296。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述培养基组合物包含造血干细胞培养基，优选的，所述造血干细胞培养基包含：1)基础培养基(优选无血清的基础培养基)；2)生长因子；和/或3)细胞因子；
所述生长因子或细胞因子选自如下的一种或多种：Flt-3L、生长因子SCF、生长因子TPO和白细胞介素IL-6；
优选的，所述生长因子Flt-3L的浓度为10-110ng/ml，优选为 50-100ng/ml；
所述生长因子SCF的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述生长因子TPO的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述白细胞介素IL-6的浓度为1-50ng/ml，优选为1-20ng/ml。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂在所述培养基组合物中的浓度为0.1-100μM，优选为0.5-50μM，进一步优选为1-10μM。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述HSCs来源于骨髓、动员外周血、脐带血、冻存复苏的HSCs或经过基因编辑改造的HSCs。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述细胞群体植入体内后分化为不同谱系的血细胞。例如可以分化为B细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞或红细胞。
本发明提供了一种预防或治疗个体疾病的方法，包括将上述所述的HSCs输注液或者上述所述的细胞群体输注给所述个体。
本发明提供了PDGFR靶点的小分子抑制剂在促进HSCs扩增并维持HSCs自我更新能力中的用途，优选的，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib；优选为AG1296。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述HSCs来源于骨髓、动员外周血、脐带血、冻存复苏的HSCs或经过基因编辑改造的HSCs。
本发明提供了上述所述的HSCs输注液或者上述所述的细胞群体在制备预防或治疗疾病的药物中的用途。
优选的，所述疾病为需要补充血细胞的疾病。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，当血细胞为红细胞时，可以治疗贫血等；
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，当血细胞为白细胞时，可以治疗白细胞减少症、粒细胞缺乏症、嗜酸性粒细胞增多症、急性白血病、慢性白血病、骨髓增生异常综合症、恶性淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、传染性单核细胞增多症、恶性组织细胞病、多发性骨髓瘤等；
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，当血细胞为血小板时，可以治疗再生障碍性贫血、急性白血病、急性放射病等；
本发明所述的PDGFR的抑制剂能够在体外培养过程中显著扩增HSCs，同时保持HSCs高比例的自我更新能力。并且所述的PDGFR的抑制剂能够体外扩增不同来源的细胞，所扩增得到的细胞植入体内后，能够分化成不同谱系的细胞，可广泛治疗一系列血液系统疾病。
在本申请中，术语LT-HSCs是 Long Term Hemopoietic Stem Cells的简写，是指处于静息状态且能够自我更新的一类具有高分化潜能的干细胞，能够支持长期造血系统的重建，例如能在二次移植中重建受体造血系统。
造血干细胞(Hemopoietic Stem Cells，HSCs)的自我更新能力和分化潜能可以称之为造血干细胞的“干性”。本申请发现，在CD34+的造血干细胞中，LT-HSCs是造血干细胞中最具自我更新能力和分化潜能的一群细胞，能够支持长期造血系统的重建。
实施例
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，所用到的化学材料中％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1脐带血/动员外周血分选CD34+HSCs用于后续小分子筛选
准备试剂H-lyse Buffer(1×)溶液和Wash Buffer(1×)溶液:取5ml H-lyse Buffer 10×储存液(R&D，货号：WL1000)，加45ml去离子水(EdiGene，0.22μm滤膜过滤)，混匀，配制成H-lyse Buffer(1×)溶液；
取5ml Wash Buffer 10×储存液(R&D，货号：WL1000)，加45ml去离子水，混匀，配制成Wash Buffer(1×)溶液。
向10ml脐带血/动员外周血(EdiGene)中加注生理盐水至终体积为30ml，向该稀释血液中加入人淋巴细胞分离液(达科为，货号：DKW-KLSH-0100)，之后400g离心30min(设置升速3，降速0)，吸取白膜层，500g离心10min。将细胞沉淀集中至一个50ml离心管中，加入H-lyse Buffer(1×)10ml，常温裂解红细胞10min，然后加入10ml Wash Buffer(1×)终止裂解反应，补加生理盐水至终体积为50ml。将上述50ml离心管转移至高速离心机中，500g离心10min，弃上清，用50ml生理盐水(1％HSA)重悬细胞，混匀，取20μL细胞悬液至细胞计数仪(Nexcelom，型号：Cellometer K2)中计数，将该离心管转 移至高速离心机中，500g离心10min。弃上清，根据计数结果加入相应体积的磁珠(100μL FcR/1*10^8 cells和100μL CD34 MicroBeads/1*10^8 cells)，其操作如下：首先加入FcR Blocking Reagent(Miltenyi Biotec，货号：130-100-453，试剂用量根据细胞计数结果决定)重悬细胞，再加入预混匀的CD34 MicroBeads(CD34 MicroBead Kit UltraPure，human：MiltenyiBiotec，货号：130-100-453)，混匀，4℃冰箱中孵育30min。往离心管中加生理盐水(1％HSA)至终体积为50ml，转移至高速离心机中，500g离心10min。准备磁力分离器(MiltenyiBiotec，型号：130-042-102)和一个磁力架(MiltenyiBiotec，型号：130-042-303)，将磁力分离器调整至合适高度，放入MS Column(MiltenyiBiotec，货号：130-042-201)或LS Column(MiltenyiBiotec，货号：130-042-401)(根据细胞量决定选用柱子的类型，具体参考产品相关说明书)，下方放置15ml离心管(Corning，货号：430791)收集非目标细胞悬液，用1ml(MS柱)或者3ml(LS柱)生理盐水(1％HSA)润洗MS Column或LS Column。在上述高速离心机(Thermo，型号：ST40)中的离心管离心后，弃上清，用1ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理盐水(1％HSA)重悬细胞，往每个分选柱(分选柱的用量根据脐带血/动员外周血的份数以及细胞量决定)中加入细胞悬液。再用1ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理盐水(1％HSA)洗涤离心管，洗涤液加入柱中。
用1ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理盐水(1％HSA)洗涤MS Column或LS Column。重复3次。将分选柱转移至新的15ml离心管上方，加入2ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理盐水(1％HSA)洗脱目标细胞，再加入1ml(MS柱)或2ml(LS柱)生理盐水(1％HSA)重复洗脱目标细胞一次。取20μL细胞悬液至细胞计数仪(Nexcelom，型号：Cellometer K2)中计数，剩余细胞悬液400g离心5min。不完全弃上清，留1ml上清，重悬细胞。取一个新的MS Column，加入1ml生理盐水(1％HSA)润洗，将上述经重悬的细胞的细胞悬液转移至该MS Column中，重复上述洗涤和洗脱步骤，获得3ml目标细胞悬液。取20μL细胞悬液至细胞计数仪(Nexcelom，型号：Cellometer K2)中计数，根据细胞密度和细胞悬液体积，计算总细胞数，剩余细胞悬液400g离心5min，弃上清备用。
实施例2小分子抑制剂浓度测试以及筛选
根据小分子抑制剂的说明书标明的溶解度以及所需溶剂(小分子抑制剂货号参见表1)，进行小分子抑制剂储存液的配置。接着进行造血干细胞培养基的配制：SFEM II培养基(stem cell，货号：09655)+50ng/ml生长因子Flt-3L(PeProtech，货号：300-100UG)+50ng/ml生长因子SCF(PeProtech，货号：300-07-100UG)+50ng/ml生长因子TPO(PeProtech，货号：300-18-100UG)+10ng/ml白细胞介素IL-6(PeProtech，货号：200-06-20UG)+1％双抗(HyClone，货号：sv30010)。根据设置的小分子抑制剂浓度梯度，利用储存液和基础培养基，配制含有不同浓度小分子抑制剂的培养基。
首先，将准备好的培养基加入到24孔板(Corning，货号：3473)中，每孔950μl，放置在二氧化碳培养箱(Thermo，型号：3111)中预热；将实施例1中备用的脐带血来源的HSCs用SFEM II+50ng/ml Flt-3L+50ng/ml SCF+50ng/ml TPO+10ng/ml IL-6+1％双抗重悬，按照每孔50μl细胞悬液，每孔细胞密度为2*10^5/ml计算所加的培养基体积。例如每孔细胞培养液终体积为1ml，根据每孔细胞密度计算每孔细胞总量为2*10^5个细胞，每孔补加的50μl细胞悬液密度则为4*10^6/ml，将实施例1中备用的HSCs密度调整为计算所得的细胞悬液密度，进行添加；从培养箱中拿出预热好的培养基，每孔中加入50μl细胞悬液，混匀后，显微镜(OLYMPUS，型号：CKX53)下观察细胞状态，然后放入培养箱中培养。
表1：小分子抑制剂
实施例3流式检测HSCs干性以及CD34+的维持
本实施例中所使用的抗体及其来源参见表2。
表2：抗体
抗体名称 厂家 货号
APC/Cy7 anti-human CD45 Biolegend 304014
APC anti-human CD38 Biolegend 356606
Brilliant Violet 510&#8482；anti-human CD34 Biolegend 343528
PE anti-human CD90(Thy1) Biolegend 328110
FITC anti-human CD45RA Biolegend 304106
APC Mouse IgG2a,κIsotype Ctrl Biolegend 400220
APC/Cyanine7Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Biolegend 400128
PE Mouse IgG2a,κIsotype Ctrl Biolegend 400212
FITC Mouse IgG2b,κIsotype Ctrl Biolegend 402208
Brilliant Violet 510&#8482；Mouse IgG2a,κIsotype Ctrl Biolegend 400268
将上述实施例2中培养至6-8天(D6-D8)的细胞取样20μL计数，根据计数结果取出2*10^5个细胞的悬液至1.5ml离心管中；400g，5min离心，弃上清。取含1％HSA(人血清白蛋白，广东双林，货号：S10970069)的PBS(磷酸缓冲盐溶液，HyClone，货号：SH30256.01)100μL，重悬细胞，涡旋混匀，备用。然后，收集对照细胞样本。细胞数量及收集方法同待测样本细胞操作。对照分别设定为NC组、ISO组，细胞选择为本批次实验中待检样本的任一样本或混合细胞，视细胞数量而定。同批次实验中各对照组不设重复检测。组别设置参见表3。
表3：
按照上表3，向上述待检测细胞样本及对照细胞样本的细胞悬液中，按组别对应加入抗体。涡旋混匀，室温避光孵育15min。15min孵育结束后，在每个实验样本中加入含1％HSA的PBS 1ml，混匀，400g，5min室温离心。离心结束后，弃上清，每个实验样本用100μL含1％HSA的PBS重悬细胞。上机检测前样本室温避光保存。使用流式细胞仪检测。
检测结果按如下方法分析：1)目的细胞群为CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-细胞群；2)逻辑门及门位置的确定参见 图1所示：首先圈定细胞群，P1门；来源于P1门的细胞群去除粘连细胞，为P2门；来源于P2门的细胞群用NC或ISO圈定CD34，CD45，CD45RA阴性细胞群，为Q3-LL门(CD34-CD45-)，Q5-UL+Q5-LL门(CD45RA-)；FMO90圈定CD90阴性细胞群，为Q5-LL+Q5-LR门；FMO38圈定CD38阴性细胞群，为Q6-LR门；应用NC，ISO，FMO划定的门，确定Q3-UR—Q5-UL—Q6-LR门圈定的细胞为CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-目的细胞。
实施例4小分子抑制剂初步筛选
在实施例1中分选出来的脐带血来源的CD34+细胞上，以实施例2相同的方法进行小分子抑制剂的最佳浓度以及能够维持HSCs干性的筛选，小分子诱导6-8天后，用与实施例3相同的方法流式细胞仪检测LT-HSCs细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达。
在本实施例中共进行了29个小分子的筛选(见表1)，每个抑制剂测试3个浓度。
图2结果表明，虚线以上的点所代表的抑制剂能够很好的维持HSCs的干性，是阴性对照组Mock的3倍以上。虚线以上三个不同的三角形代表不同浓度的AG1296，使用浓度已标明。
综上所述：在本实施例中，筛选出1个能够维持LT-HSCs干性的小分子，是以PDGFR为靶点的抑制剂AG1296。
实施例5：已筛PDGFR抑制剂AG1296最佳使用浓度的筛选
在实施例1中分选出来的脐带血来源的CD34+细胞上，以实施例2相同的方法对已筛抑制剂AG1296进行最佳使用浓度的筛选。不同浓度的小分子抑制剂AG1296诱导6天后，用与实施例3相同的方法用流式细胞仪检测LT-HSCs细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达。在培养6天时取20μL细胞悬液至细胞计数仪(Nexcelom，型号：Cellometer K2)中计数，并计算第6天最终的CD34+细胞以及LT-HSCs的绝对数量(细胞绝对数量＝细胞总数*干性比例)，其结果分别如图3A-3B以及如图4A-4B所示。
图3A的结果表明，在维持CD3+、CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA- 细胞比例方面，AG1296在1μM、5μM和10μM浓度下均优于Mock组。
图3B的结果表明，在总细胞数量中，AG1296(1μM)的细胞数量较高，高于浓度为5μM和10μM，在维持CD34+细胞绝对数量方面，AG1296在1μM、5μM和10μM的浓度下低于mock组，证明AG1296在1μM、5μM和10μM浓度下对细胞增殖略有抑制，但在维持CD34+CD90+CD45RA-细胞绝对数量方面，AG1296(1μM、5μM和10μM)明显优于Mock组，在增殖LT-HSCs绝对数量方面，AG1296(1μM、5μM和10μM)的效果较好。
图4A结果表明，在维持CD34+、CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA-细胞比例方面，AG1296在1μM浓度优于Mock组和100nM、500nM使用浓度，具有显著差异。在提高LT-HSC比例方面，AG1296(1μM)是Mock组、AG1296(100nM)组的3倍左右，是AG1296(500nM)的2倍左右，显著提高LT-HSC的比例。
图4B结果表明，在维持CD34+细胞绝对数量方面，AG1296(1μM)没有明显优于其它组别，证明AG1296在1μM浓度下对细胞增殖略有抑制，但在维持CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA-细胞绝对数量方面，AG1296(1μM)明显优于其它组别。增殖LT-HSCs绝对数量方面，AG1296(1μM)的效果是其它组别的1～2倍。
综上所述，在脐带血来源的HSCs上，维持LT-HSCs干性和细胞绝对数量方面，AG1296在浓度为1μM、5μM和10μM下效果较好。
实施例6：已筛PDGFR抑制剂AG1296和文献报道抑制剂UM171，SR1使用的比较
在实施例1中分选出来的动员外周血来源的CD34+细胞上，以实施例2相同的方法对已筛抑制剂AG1296与文献(Fares I,et al.Science.2014；Boitano A E，et al.Science.2010；)报道抑制剂UM171，SR1进行比较。小分子抑制剂诱导8天后，用与实施例3相同的方法流式细胞仪检测LT-HSCs细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达。在培养8天时取20μL细胞悬液至细胞计数仪(Nexcelom，型号：Cellometer K2)中计数，并计算第6天最终的CD34+细胞以及LT-HSCs的绝对数量(细胞绝对数量＝细胞总数*干性比例)，其结果如图5所示。
图5A结果表明，在维持CD34+、CD34+CD90+、 CD34+CD90+CD45RA-细胞比例方面，AG1296(1μM)效果明显优于Mock组、UM171组、AG1296(500nM)组和AG1296(700nM)组，但不如SR1组。在提高LT-HSCs比例方面，AG1296(1μM)是Mock组、UM171组2倍左右，是AG1296(500nM)组和AG1296(700nM)组的1倍左右，显著提高LT-HSC的比例，但效果不如SR1组。
图5B结果表明，在维持CD34+细胞绝对数量方面，AG1296(1μM)没有明显优于其它组别，证明AG1296在1μM浓度下对细胞增殖有抑制，UM171组效果最好。但在维持CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA-细胞绝对数量方面，AG1296(1μM)表现出优势。
实施例7：CD34+造血干细胞集落形成培养
本实施例通过集落形成单位(Colony-Forming Unit，CFU)检测脐血来源的造血干细胞经过小分子抑制剂诱导后的体外功能进行定性和定量检测，验证其体外分化潜能。
首先，分装100mL培养基MethoCult TMH4034Optimum(Stem Cell,货号：04034)，在2-8℃过夜解冻。剧烈摇晃1-2min后静置10min，待气泡浮升至液面。将50mL注射器针头紧套在5mL一次性注射器后，吸取培养基至1mL，全部推出注射器以排尽注射器内气体，重新吸取3mL分装至每个15mL离心管(Corning，货号：430791)。2-8℃保存1个月，-20℃长期保存，切勿反复冻融。
准备3mL培养基MethoCult TMH4034Optimum，在室温(15-25℃)或2-8℃过夜解冻。
进行细胞接种：取小分子抑制剂诱导后扩增培养7天后的细胞(脐血来源的经小分子抑制剂诱导后的CD34+造血干细胞)悬液细胞计数，根据计数结果吸取100倍接种密度的细胞悬液(例如，接种密度100cells/孔/3ml，应收集10000cells)，加入到1ml的2％FBS(Gibco，货号：16000-044)-IMDM(Gibco，货号：12440-053)培养基中，混匀备用。将上述细胞混匀后吸取50μL细胞悬液加入到0.5mL IMDM(2％FBS)重悬细胞(相当于将细胞悬液稀释10倍)，混匀后，取出100μL细胞悬液(100个细胞)加入到3mL MethoCult TMH4034Optimum中。涡旋至少4s后静置10min，待气泡浮升至液面。3cc Syringes(Stem cell,货号：28240)与Blunt-End Needles 16Gauge(Stemcell，货号：28110)配合使用，吸取所得细胞悬液至1mL，全部推出注射器以排尽注射器内气体，重新吸取所得全部细胞悬液，向SmsrtDishTM-6(stem cell，货号：27370，6孔板)一个孔注入3mL，缓慢倾斜6孔板使细胞悬液均匀铺满孔底部。按上述接种完所有细胞后，将6孔板各孔间隙内补加无菌PBS 3ml，防止培养基干涸。将6孔板盖好盖子后放入二氧化碳培养箱(Thermo，型号：3111)，37℃，5％CO2，95％相对湿度，培养14天。
于培养第7,14天进行观察集落，培养14天后用STEMgridTM-6计数网格(stem cell，货号：27000)进行克隆计数。集落的判定标准如下(不同分类的集落可反应出HSCs集落形成能力，维持干性的能力)：
CFU-GEMM(CFU-G、CFU-E、CFU-MM)：粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位。一个集落内包含红细胞和20个或更多个非红细胞(粒细胞、巨噬细胞和/或巨核细胞)，通常集落中心有红细胞，周围有非红细胞，非红细胞也可以集中在红细胞的一侧。CFU-GEMM的集落通常比CFU-GM或BFU-E的集落大。在大多数细胞样本中比较少见(通常占集落总数的10％)。
CFU-GM：含有超过20个以上粒细胞(CFU-G)和/或巨噬细胞(CFU-M)的集落。不显现红色或棕色，集落内个体细胞通常可以区分，特别是在集落边缘，大的集落可能有一个或多个密集的暗核。该集落生长及分化不需要促红细胞生成素(EPO)。
BFU-E：爆发红细胞集落形成单位，形成单个或多个细胞簇组成的集落，每个集落包含>200个成熟红细胞。当细胞被血红蛋白化时呈现红色或棕色，难以区分每簇内的单个细胞，BFU-E是更加不成熟的祖细胞，它的生长需要红细胞生成素(EPO)和其他细胞因子，尤其是白介素3(IL-3)和干细胞因子(SCF)，以促进其集落的最佳生长。
CFU-E：红细胞集落形成单位，可形成1-2个包含有8-200个红细胞的细胞簇，当细胞被血红蛋白化时呈现红色或棕色，在集落内难区分单个细胞。CFU-E是成熟的红细胞系的祖细胞，需要促红细胞生成素(EPO)促进其分化。
实施例8：已筛PDGFR抑制剂AG1296对HSC体外克隆形成能力的比 较
在实施例1中分选出来的脐带血来源的CD34+细胞上进行已筛PDGFR抑制剂AG1296不同使用浓度的体外克隆形成能力的比较。用不同浓度的AG1296处理细胞，8天后，以实施例7相同的方法进行体外克隆(CFU)形成检测，接种细胞14天后统计克隆数目，并对CFU-GEMM进行分析，其结果如图6所示，其中，BFU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM代表红系、髓系、淋巴系等血液系统不同谱系的克隆。
图6结果表明，在总克隆数量方面，各个组别差别不大。在由LT-HSCs分化形成的GEMM克隆数目方面，AG1296(1μM)显著优于其它组别。GEMM克隆代表造血干细胞分化形成其它谱系细胞的能力。GEMM克隆数量越多，代表造血干细胞自我更新能力、移植重建能力越强。综上所述，AG1296在HSCs体外扩增过程中，能很好的维持LT-HSC的自我更新能力和细胞绝对数量。
实施例9：已筛PDGFR抑制剂AG1296和文献报道抑制剂SR1对造血干细胞体内移植效果的比较
在实施例1中分选出来的脐带血来源的CD34+细胞上，对已筛选小分子抑制剂AG1296，与文献报道抑制剂SR1的体内造血系统重建能力进行比较。本实施例中所使用的小分子抑制剂浓度及分组见表4。
表4小分子抑制剂浓度
组别 小分子抑制剂使用浓度
Mock NA
SR1 5μM
AG1296 1μM
配制细胞培养基：SFEM II+100ng/ml Flt-3L+100ng/ml SCF+100ng/ml TPO+20ng/ml IL-6+1％双抗，所用培养基、生长因子、双抗等货号与实施例2中所述一致，根据表4中设置的组别，加入不同的小分子抑制剂。
将配制好的细胞培养基加入到24孔板中，每孔950μl，放置在二氧化碳培养箱中预热；将实施例1中备用的脐带血来源的HSCs用SFEMII+100ng/ml Flt-3L+100ng/ml SCF+100ng/ml TPO+20ng/ml IL-6+1％双抗重悬，重悬细胞所需培养基体积，按照每孔加入50μl细胞悬液，每孔细胞密度为0.28*10^5/ml进行计算；从培养箱中拿出预热的培养基，向每孔中加入50μl 重悬的细胞悬液，混匀后，显微镜下观察细胞状态，然后放入培养箱中培养。每只小鼠移植的起始培养细胞量为0.28*10^5/只，即24孔板中每个孔所扩增的细胞可移植一只小鼠。细胞培养过程中隔天计数，计数方法及所用细胞计数仪与实施例1一致，保证细胞密度不超过8*10^5/ml，如细胞过密，则及时分孔，并添加新鲜培养基。
小分子抑制剂处理细胞7天后，用与实施例3相同的方法用流式细胞仪检测LT-HSCs细胞表面标志物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表达。
准备小鼠，每个组别设置8只小鼠。小鼠购自北京维通达生物技术有限公司，品系为NPG(NOD-Prkdc scidll2rg null/Vst)，6周龄，雌鼠，小鼠之间体重克差控制在3g内。小鼠进行细胞移植之前经过半致死剂量辐照，辐照剂量为1.6Gy。
收集培养的细胞悬液(起始培养细胞量为0.28*10^5/ml/孔)，室温离心，400g离心5min，弃上清，细胞沉淀用100μl生理盐水(含1％HSA)重悬混匀，尾静脉注射一只经辐照的NPG小鼠，不同组别小鼠做好标记。
细胞移植小鼠后，第18周处死小鼠，收集小鼠骨髓细胞，流式检测human CD45、human CD19、human CD3、human CD33和human CD56比例。本实施例中所用抗体、7-AAD染料及来源参见表5。
表5：抗体及7-AAD染料
抗体名称 厂家 货号
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
APC/Cy7 anti-human CD45 Biolegend 304014
Brilliant Violet 510 TManti-human CD3 Biolegend 300448
PE anti-human CD19 Biolegend 363004
Brilliant Violet 421 TManti-human CD33 Biolegend 303416
APC anti-human CD56 Biolegend 304610
7-AAD Viability Staining Solution Biolegend 420404
流式检测小鼠骨髓细胞中human CD45、human CD19、human CD3、human CD33和human CD56比例，设置的细胞检测组别参见表6。
表6：
断颈处死小鼠，取小鼠一侧后腿的胫骨和股骨。用眼科剪和眼科镊操作，分别剪断胫骨和股骨两端，露出骨髓腔。用1ml注射器吸取预冷的PBS(含1％HSA)，将针头刺入骨髓腔的一端，用力推注PBS，将骨髓细胞从骨髓腔另一端冲出。胫骨和股骨骨髓腔分别用2ml PBS冲洗。用移液器反复吹吸骨髓细胞悬液，用40um细胞筛网(BD，货号：352340)过滤细胞悬液，室温离心，400g，5min。离心结束后，弃上清，骨髓细胞备用。
向备用的骨髓细胞中加入1ml红细胞裂解液，涡旋混匀，室温裂解15min，期间每隔3min上下颠倒混匀样本。裂解结束后，向每个样本中加入4ml PBS(含1％HSA)，室温离心，400g，5min。离心结束后，弃上清，向每个样本中加入1ml PBS(含1％HSA)，涡旋混匀。从每个样本中各取100μl细胞悬液，按照表6的组别加入抗体，涡旋混匀，室温避光孵育15min。孵育结束后，向每个样本组中加入5μl 7-AAD染料，涡旋混匀，室温避光孵育5min。孵育结束后，向NC和每个样本组中加入1ml PBS(含1％HSA)，混匀，室温离心，400g，5min。离心结束后，弃上清，向每个实验样本中加入100μl PBS(含1％HSA)重悬细胞，使用流式细胞仪检测。
检测结果按如下方法分析：1)目的细胞群为human CD45+细胞群，human CD19+细胞群，human CD3+细胞群，human CD33+细胞群，以及human CD56+细胞群；2)逻辑门及门位置的确定参见图7所示：首先圈定细胞群，P1门；来源于P1门的细胞群去除粘连细胞，为P2门；来源于P2门的细胞群用7-AAD阴性细胞圈定活细胞群，为P3门；来源于P3门的细胞群用NC圈定mouse CD45+(P4门)和human CD45+细胞群(P5门)；来源于P5门的细胞群用NC圈定human CD33+(P11门)和human CD56+细胞群(P13门)；来源于P5门的细胞群用NC圈定human CD19+(10门)和human CD3+细胞群(P12门)。人造血干细胞移植效率用human CD45细胞比例表示，计算方法为human CD45％/(human CD45％+mouse CD45％)。人造血干细胞在小鼠体内分化为各谱系血细胞的效率用human CD19％(代表B细胞)，human CD3％(代表T细胞)，human CD33％(代表髓系细胞)，human CD56％(代表NK细胞)表示，其结果如图8A和图8B所示。
图8A结果表明，在小鼠移植的起始培养细胞量一致的情况下，AG1296 处理的造血干细胞第18周的骨髓移植效率，明显高于Mock组和SR1组。图8B结果表明，AG1296处理的造血干细胞分化形成的各谱系细胞比例与Mock组和SR1组无明显差别，AG1296处理的造血干细胞分化形成各谱系细胞能力正常。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (31)

  1. 一种用于扩增并维持造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)自我更新能力和分化潜能的培养基组合物，其包括造血干细胞培养基和PDGFR靶点的小分子抑制剂。
  2. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，优选为AG1296。
  3. 根据权利要求1或2所述的培养基组合物，其中，所述造血干细胞培养基包含：1)基础培养基(优选无血清的基础培养基)；2)生长因子；和/或3)细胞因子。
  4. 根据权利要求3所述的培养基组合物，其中，所述生长因子或细胞因子选自如下的一种或多种：生长因子Flt-3L、生长因子SCF、生长因子TPO和白细胞介素IL-6。
  5. 根据权利要求4所述的培养基组合物，其中所述生长因子或细胞因子在所述培养基组合物中的浓度如下所示：
    所述生长因子Flt-3L的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
    所述生长因子SCF的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
    所述生长因子TPO的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
    所述白细胞介素IL-6的浓度为1-50ng/ml，优选为1-20ng/ml。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的培养基组合物，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂在所述培养基组合物中的浓度为0.1-100μM，优选为0.5-50μM，进一步优选为1-10μM。
  7. 根据权利要求1-6中任一项所述的培养基组合物，其中，所述HSCs来源于骨髓、动员外周血、脐带血、冻存复苏的HSCs或经过基因编辑改造的HSCs。
  8. 一种促进HSCs扩增并维持HSCs自我更新能力的方法，包括在含有PDGFR靶点的小分子抑制剂的培养基组合物中体外培养HSCs。
  9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、 Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，优选为AG1296。
  10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述造血干细胞培养基包含：1)基础培养基(优选无血清的基础培养基)；2)生长因子；和/或3)细胞因子。
  11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述生长因子或细胞因子选自如下的一种或多种：Flt-3L、生长因子SCF、生长因子TPO和白细胞介素IL-6。
  12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述生长因子或细胞因子在所述培养基组合物中的浓度如下所示：
    所述生长因子Flt-3L的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
    所述生长因子SCF的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
    所述生长因子TPO的浓度为10-110ng/ml，优选为50-100ng/ml；
    所述白细胞介素IL-6的浓度为1-50ng/ml，优选为1-20ng/ml。
  13. 根据权利要求8-12任一项所述的方法，其中，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂在所述培养基组合物中的浓度为0.1-100μM，优选为0.5-50μM，进一步优选为1-10μM。
  14. 根据权利要求8-13中任一项所述的方法，其中，所述HSCs来源于骨髓、动员外周血、脐带血、冻存复苏的HSCs或经过基因编辑改造的HSCs。
  15. 根据权利要求8-14中任一项所述的方法，其中，体外培养时间为约4-21天，优选为约6-15天，进一步优选为约6-10天，最优选为约6-8天。
  16. 根据权利要求8-15中任一项所述的方法，其中，体外培养后，CD34+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为40-85％，优选为60-85％，进一步优选为75-80％。
  17. 根据权利要求8-16中任一项所述的方法，其中，体外培养后，CD34+CD90+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为6-15％，优选为8-15％，进一步优选为8-12％。
  18. 根据权利要求8-17中任一项所述的方法，其中，体外培养后，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为2-10％，优选为2-6％，进一步优选为4-5％。
  19. 根据权利要求8-18中任一项所述的方法，其中，体外培养后，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的细胞数占全部细胞中的 比例为2-5％，优选为2.5-4％。
  20. 一种HSCs输注液，其中，CD34+表型的HSCs细胞数占全部细胞总数的比例为40-85％，优选为60-85％，进一步优选为75-80％。
  21. 根据权利要求20所述的HSCs输注液，其中，CD34+CD90+表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为6-15％，优选为8-15％，进一步优选为8-12％。
  22. 根据权利要求20或21所述的HSCs输注液，其中，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs细胞数占全部细胞中的比例为2-10％，优选为2-6％，进一步优选为4-5％。
  23. 根据权利要求20-22任一项所述的HSCs输注液，其中，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的细胞占全部细胞中的比例为2-5％，优选为2.5-4％。
  24. 根据权利要求20-23任一项所述的HSCs输注液，其通过权利要求8-19任一项的方法获得。
  25. 一种给有需要的个体补充血细胞的方法，包括将权利要求20-24任一项所述的HSCs输注液输注给所述个体。
  26. 根据权利要求25的方法，其中所述HSCs输注液输注给所述个体后，所述HSCs在所述个体中定植、分化为血细胞。
  27. 根据权利要求25或26的方法，其中所述个体为罹患出血、贫血、癌症、白血病、自身免疫病、病毒或细菌感染的个体。
  28. PDGFR靶点的小分子抑制剂在促进HSCs扩增并维持HSCs自我更新能力中的用途，优选的，所述PDGFR靶点的小分子抑制剂选自下述中的一种或多种：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，优选为AG1296。
  29. 一种预防或治疗个体疾病的方法，包括将权利要求20-24任一项所述的HSCs输注液输注给所述个体。
  30. 根据权利要求20-24任一项所述的HSCs输注液在制备预防或治疗疾病的药物中的用途。
  31. 根据权利要求30所述的用途，其中，所述疾病为需要补充血细胞的疾病。
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