WO1998021313A1 - Procede pour la mise en culture de cellules souches hematopoïetiques - Google Patents

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WO1998021313A1
WO1998021313A1 PCT/JP1997/003797 JP9703797W WO9821313A1 WO 1998021313 A1 WO1998021313 A1 WO 1998021313A1 JP 9703797 W JP9703797 W JP 9703797W WO 9821313 A1 WO9821313 A1 WO 9821313A1
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WO
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hematopoietic stem
stem cells
kit
cells
culture
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PCT/JP1997/003797
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Shinji Sogo
Kazuya Yamanishi
Masakazu Adachi
Susumu Ikehara
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Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
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    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere

Definitions

  • B represents CD34 + c-kit cells (R 2), CD34 + c-kit '° w cells (R 3) and CD 34 + c-kit h — i 8 h cells (R 4) were suspended in medium only and cultured for 24 hours on a cell-adherent plate. Then, FITC-labeled anti-CD34 class III antibody and PE FIG. 4 shows the results of examining the expression state of CD34 and c-kit molecules in cultured cells using a FACS can, stained with a labeled anti-c-kit antibody.
  • A. C of each cell before sorting after FACS tar sorting The expression patterns of D34 and c_kit are shown.
  • ACD-A solution sodium citrate 2.20 w / v %, Citric acid 0.80 w / v%, glucose
  • CBNC Nuclear Cells
  • CBMNC Cored Blood Mononuclear Cells
  • CD34 Manorechi sort kit (CD34 raultisort kit: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) and the Minimax (MiniMACS: Miltenyi Biotec,
  • CD34 + cells were isolated.
  • the CD34 + cells were transformed into FITC (fluorescein
  • Double staining was performed using Merseile, France) and then sorted using FACStar (Becton Dickenson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA).
  • each of the cells set above is sorted, and the separated fractions are similarly set on a FACS can (Bee ton Dickinson Immunotome try Systems: SanJose, CA, As a result of re-analyzed using the USA), CD 3 4 + c- kit fraction, CD 3 4 + c - the kit l QW fractionation and CD 3 4 + c- kit hish fractionation, the cells set Teitori It was confirmed that it was obtained.
  • Table 1 shows that the higher the expression of the c-kit antigen, the higher the colony-forming ability. On the other hand, it was shown that the fraction in which the expression of the C-kit antigen was negative, that is, the CD34 + c-kit fraction had almost no colony-forming ability.
  • CD34 c-kit fraction, CD34 + c-kit [ ow fraction] and CD34 + C-kit hi irh fraction were each subjected to 10% heat inactivation FBS (Stemcell Technology). Inc., Vancouver, BC Canada) and 10% heat-inactivated sera (HOS: Stem cell Technology Inc., Vancouver, BC, Canada) ⁇ : Including, drowning in a-MEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) The cells were seeded on a cell-adherent 24 2 plate (Cat. No. 76-063-05, Flow Laboratories Inc., McLean, USA).
  • recombinant FL human FL recombinant human f 11-31 igand, rhFL: Cat. No. 80-3692-01, Genzyme, Cambrige, MA, USA
  • Recombinant human IL-6 rH-6, rhIL-6: Cat. No. 1131567, Boehlinger Mannheim Biomedica, Germany
  • recombinant human IL-7 recombinant human IL-7, rhIL-7 : Cat. No. Fl-1587-1, Genzyme, Cambrige, MA, USA.
  • An anti-CD34 class III antibody (Cat. No. 550018, Beet on Dickinson Immunochemistry Systems, San Jose, Calif., USA) was added to PBS (concentration: 10 ⁇ g / ml). The mixture was diluted with-), and added to a 240 ⁇ l plate at a rate of 300 ⁇ l.
  • each plate was washed three times with PBS (containing 0.1% FBS) to prepare a culture plate on which the anti-CD34 antibody was immobilized.
  • PBS containing 0.1% FBS
  • CD34xL was applied to the CD34-positive cells.
  • the cells are collected from the 24-well plate by pipetting after liquid culture, and a portion is suspended in a complete methylcellulose medium (Methocult GF H4434V, Steracell technoloies "Inc., Vancouver, BC, Canada). Pollution 1 2 ⁇ 0. 8 ml Dzu' by U Enorepure Bok (Cat. No. 76- 063- 05, Flow Laboratories Inc., McLean, USA) were seeded in 3 7 ° C 5% C 0 2 conditions in, C 0 2 Lee incubator (Tabai,
  • the remaining cells were stained with FITC-labeled anti-CD34 class III antibody and PE-labeled anti-c-kit antibody, and the expression levels of CD34 antigen and c-kit antigen were measured by FACS can.
  • the light intensity (mean fluorescense intesity) was expressed by the channel of the detector.
  • CD 3 4 + c- kit cell fraction (R 2), CD 3 4 + c- kit l ° w cell fraction (R 3) and CD 3 4 + c- kit h ' 2h cells fraction ( R 4) was suspended in —MEM (containing 10% FBS + 10% HoS) and cultured in a cell-adhesive 24 ⁇ l plate for 24 hours.
  • R2, R3 and R4 cells before and after culture for 24 hours were stained with FITC-labeled anti-CD34 class III antibody and PE-labeled anti-c-kit antibody, respectively.
  • the expression status of c-kit antigen molecule in CD34 + cells was examined using FACS can.
  • Figure 2 shows the expression patterns (A in Fig. 2) of each fraction (R2, R3 and R4) after sorting, and the fractions (A) in the culture after 24 hours.
  • R2, R3 and R4) expression patterns (Indicated by B in Fig. 2).
  • a cytodynamic antibody such as FL, IL-6 and immobilized anti-CD34 antibody were used as hematopoietic stem cell growth factors.
  • the CD34 + c-kit-cells were seeded at 70000 cells each on 24 ⁇ l plates, and a predetermined amount of each of the above additives was added (with no addition as a control). After culturing for 3 days, the cultured cells are collected by pipetting, the number of cells is counted, and the cells are then treated with FITC-labeled anti-CD34 class III antibody and PE-labeled anti-c-kit antibody. Then, the expression state of the c-kit molecule in CD34 + cells was examined using FACS can.
  • Figure 3 shows the results.
  • (A) shows the result of the control (medium only) without addition
  • (B) shows the result of addition of FL (100 ng / ml)
  • (C) shows the result of IL-6 (10 ng / ml).
  • (D) shows the results of CD34 x L using the immobilized anti-CD34 antibody
  • (E) shows the results of FL (100 ng / ml) + IL-6 (/ ml).
  • (F) shows the result of addition of FL (100 ng / ml)-IL-6 (10 ng / ml) + IL-7 (10 ng / ml).
  • (G) show the results of the addition of FL (100 ng / ml) + IL-6 (10 ng / ml) + IL-7 (10 ng / ml) + CD34 ⁇ L, respectively.
  • CD34 + c-kit cells were stimulated and cultured with FL + IL-6 + IL-7 + CD34 x L on cell-adherent plates.
  • the induced CD34 + c-kit law cells and CD34 + c-kit h1 cells have a higher colony forming ability than the CD34 + c-kit cells before induction.
  • CD34 + C-kit single cell were seeded respectively in Po Li pro pin les down tubes which plates and cells for small suspension cultures of cell adhesion hardly adhere, 5% C 0 2, 3 7 ° C The culture was performed for 24 hours below.
  • FIG. 4 A shows the results of CD34 + c-kit—cells suspended in ⁇ -MEM (containing 10% FBS + 10% HoS) alone and cultured in a suspension cell culture plate.
  • CD34 + C-kit cells were used as source cells, and stimulated with FL + IL-6 + IL-7 + CD34 x L by liquid culture.
  • a cell-adhering incubator may be essential. Indicated.

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Description

明 細 書
造血幹細胞の培養方法 技 術 分 野
本発明は、 ヒ ト造血幹細胞の新 しい培養方法に関する。 背 景 技 術
造血幹細胞とは、 自己複製能及び全ての成熟血球に分 化する能力を持っ た細胞と定義される。 その大部分は、 造血支持能を有する骨髄ス ト 口一マ細胞に接着 した態様 で、 骨髄に存在している ものと考え られる。 そ して僅か ではある力 造血幹細胞は定常状態において末梢血中に も存在しており、 化学療法後の骨髄回復期や造血刺激因 子 C S F ( colony— stimulating factor) の投与後に（ま、 末梢血中の造血幹細胞が著増する こ とが知 られている。
また、 造血幹細胞は臍帯血中に も存在してお り、 この 臍帯血幹細胞は、 骨髄に存在する造血幹細胞に比して高 ぃコ ロニー形成能を有する こ とが知られている。
近年、 このよ う な造血幹細胞を、 抗体によ って同定さ れる特異的なェピ ト一プ部位と関連するマーカー 〔例え ば、 C D 3 3、 C D 3 8、 C D 1 1 7 ( c-kit) 、 H L A 一 D R等のマーカ一〕 の存在の有無を指標と して、 特定 しょ う と試み られている。 かかる方法によ って、 現在、 ヒ ト の造血幹細胞に関 しては、 表現型と して C D 3 4 + C D 3 3 —、 C D 3 4 + C D 3 8 —と示される分画等が、 造血 幹細胞に該当するのではないかと考え られている。
また最近、 stem cell factor ( S C F ) の レセプ夕一 である C D 1 1 7 ( c-kit) をメ ルク マールとする特定法 を用いた、 羊に対する in vivo実験において、 C D 3 4 十 c-kit 1 ow 細胞が、 移植可能な造血幹細胞である と報告さ れている。
一方、 骨髄ス ト ロ ーマ細胞を用いた in viiro長期培養 系において、 C D 3 4 +c- kit' °w 細胞よ り も C D 3 4 + c-kit" 細胞の方が、 よ り長期に培養可能である との報告 もあ り、 その結論が待たれる所である。
近年、 白血病等の疾患に対して、 骨髄移植が活発に行 なわれている。 しかしながら、 骨髄移植は ドナ一に対す る負担が大きい等の種々 の短所があ り、 これに対して、 末梢血幹細胞または臍帯血幹細胞の移植は、 次に述べる よ う な利点がある。
即ち、 末梢血幹細胞の移植は、 （i)ァフ ェ レ一シス によ つ て 自 己幹細胞を採取するため、 骨髄移植の場合のよ う な麻酔をする必要がな く、 全身状態や臓器機能の悪い患 者において も施術可能である こ と、 （ii)ま た、 移植術後 の造血回復速度も速 く、 H L Aがー致する正常 ドナーか らの血小板採取回数も低減でき、 患者と移植チームに対 する負担が大幅に軽減する こ と等の利点を有する。
また、 臍帯血幹細胞の移植は、 （i)該細胞が通常廃棄さ れる臍帯から採取される ものであるため、 ドナー（donor) への負担が全 く ないこ と、 （ii)また、 新生児血液である こ とか ら採取時にウィルス等の感染の危険性もほとんど な くヽ 移植後の G V H D ( graft - versus - host disease) も起こ り に く いこ と等の利点がある。
こ の よ う に、 末梢血幹細胞移植及び臍帯血幹細胞移植 は、 白血病等の腫瘍性疾患並びに重症再生不良性貧血等 の非腫瘍性疾患に対する根治療法と して、 重要な位置を 占める よ う にな っ てきている。
かかる造血幹細胞移植の臨床展開と並行 して、 造血幹 細胞の ex 増殖法の開発の重要性が指摘されてお り
(小澤敬也 ： 臨床科学 30巻 3号、 p 315〜 320 ( 1994 ） 、 活発な研究が行なわれている。 しか しながら、 現在でも なお、 造血幹細胞を、 液体培養によ って、 その 自己複製 能及び全成熟血球への分化能を維持したま まで増殖させ る技術は、 開発されるに至っていない。
僅かにス ト ロ一マ細胞を用いた系が知られてはいる力、'、 これは以下の如き欠点があ り、 実用面からは適さないと 考え られる。
即ち、 第 1 に造血幹細胞にはス ト ローマ細胞に接着す る性質があるため、 ス ト ローマ細胞と分離して造血幹細 胞を回収する こ とが困難である こ と、 第 2 にス ト ローマ 細胞は正と負の両方の増殖調節因子を産生する こ とによ り 巧妙に造血を制御 しているため、 造血幹細胞の 自 己複 製刺激作用を選択的に強化する こ とは、 細胞 レベルでは 困難である こ と等が挙げられる。
また、 造血幹細胞の培養技術は、 上述 した幹細胞移植 術の面からのみな らず、 遺伝子治療の面から もその確立 が急務と されている。
事実、 遺伝子治療は、 現在効果的な治療法のない致死 的な遺伝性疾患、 ある種の悪性腫瘍、 及びエイ ズのよ う に既存の治療法の成績が極めて悪い疾患に対 して、 治療 効果が期待できる こ と、 他の疾患について も既存の治療 法よ り 優れた治療法となる こ と等から、 新 しい治療法と して急速に広がり を見せている。
かかる遺伝子治療のための標的細胞と して造血幹細胞 が選択され、 該細胞に遺伝子が導入された場合には、 造 血幹細胞本来の自 己複製能によ って遺伝子の発現が永続 し、 遺伝子による効果も持続するだろ う と期待される。 このため、 遺伝子導入操作を行な う 原料となる造血幹細 胞を大量に得るべ く、 ex 増殖法の確立が斯界で望ま れている。
本発明は、 従来、 効果的な培養技術が確立されていな かっ た造血幹細胞の ex yi O増殖法の提供、 具体的には、 移植及び遺伝子療法において有用な造血幹細胞を有意に 増殖産生でき る新しい液体培養技術を提供する こ とを目 的とする ものであ る。 発 明 の 開 示
本発明者らは、 造血幹細胞と して表現型が C D 3 4 +及 び c-kit—と して特徴づけ られる細胞を選択 し、 これを造 血幹細胞増殖因子の存在下で付着性培養器を用いて液体 培養する こ とによ って得られる培養細胞が、 あ らゆる成 熟血球に分化する能力を保持 している こ とを見出 し、 こ れによ り、 上記目的に合致する造血幹細胞の培養方法が 確立でき る こ とを確認して、 本発明を完成する に至っ た。
すなわち、 本発明は、 造血幹細胞増殖因子の存在下に、 表現型が C D 3 4 +及び C- kit—と して特徴づけ られる ヒ ト 造血幹細胞を、 付着性培養器を用いて液体培養する こ と を特徴とする造血幹細胞の培養方法である。
また、 本発明は、 かかる培養方法によ っ て増殖取得さ れる造血幹細胞、 特に表現型が C D 3 4 +及び c- kit+と し て特徴づけ られる造血幹細胞である。 図面の簡単な説明
図 1 は、 ヒ ト臍帯血から、 C D 3 4 マルチソー トキ ッ トを用いた免疫ビーズ法において陽性選択 （positive selection) して得られた、 C D 3 4 +細胞分画を、 F I T C標識抗 C D 3 4 ク ラ ス III抗体及び P E標識抗 c- kit 抗体によ り 二重染色したパタ ー ン （図 1 中、 C ) 、 アイ ソタイ プ適合コ ン ト ロールである F I T C標識マウス I g G 1 及び P E標識マウス I g G 1 で二重染色したパタ — ン （図 1 中、 B ：) 、 及び前方散乱 （ F S C ) 及び側方 散乱 （ S S C ) のパター ン （図 1 中、 A ) を示す図であ る （実施例 1 参照） 。
図 2 において、 B は、 実施例 1 において、 F A C S t a r でソ一ティ ングした C D 3 4 +c- kit 細胞 （ R 2 ) 、 C D 3 4 +c- kit'°w細胞（R 3 ) 及び C D 3 4 +c- kith—i 8 h 細胞 （ R 4 ) を培地のみに懸濁させ、 細胞付着性プレー ト上で 2 4 時間培養 した後、 F I T C標識抗 C D 3 4 ク ラス III抗体及び P E標識抗 c- kit抗体で染色 し、 F A C S c a nを用いて培養後の細胞における C D 3 4 及び c - kit分子の発現状態を調べた結果を示す図である。 Aは. F A C S t a r でのソーティ ング後培養前の各細胞の C D 3 4 と c_ kitの発現パタ ー ンを示す。
図 3 は、 実施例 1 において、 C D 3 4 +C- kit—細胞を、 各添加物の存在下で培養 して、 培養後の細胞における c - kit分子の発現状態を調べた結果を示す図である。 図 3 中 （ A ) は無添加対照、 （ B ) は F L添加、 （ C ) は I L - 6 添加、 （ D ) は固相化抗 C D 3 4 抗体を用いた C D
3 4 分子の架橋 ( C D 3 4 X L ： CD34 cross- 1 inking) 、 ( E ) は F L + I L - 6 添加、 （ F ) は F L + I L - 6 + I L - 7 添加、 （ G ) は F L + I L - 6 + I L - 7 + C D 3 4 x L添加の結果をそれぞれ示す。
図 4 は、 実施例 1 において、 細胞非付着性培養器中で C D 3 4 +c- kit—細胞を培養した場合における c-kit分子 の発現状態を調べた結果を示す図である。 図中 Aは、 C D 3 4 +c- kit—細胞を浮遊細胞培養用プレー ト 中で培地の みを用いて培養 した結果を、 B は同プレー ト 中で F L存 在下で培養した結果を示す。 図中 C は C D 3 4 +c- ki— t一細 胞をプロ ピレ ン製チューブ中で F L存在下で培養 した結 果を示す。 発明の実施するための最良の形態
本発明においては、 起源細胞と して、 表現型が C D 3
4 +及び c- kit—と して特徴づけ られる ヒ ト造血幹細胞を用 いる こ とを必須とする。
かかる起源細胞は、 常法に従っ て、 各種造血幹細胞よ り調製、 単離 （純化） する こ とができ る。 原料とする造 血幹細胞は、 末梢血幹細胞、 骨髄幹細胞及び臍帯血幹細 胞のいずれでもよい。 またその調製、 単離 （純化） は、 目的とする造血幹細胞のマ一力一を指標と して通常の方 法によ り行な う こ とができ る。 その詳細については、 後 述する実施例に例示される。
本発明において、 造血幹細胞の培養及び増殖に用い ら れる造血幹細胞増殖因子と しては、 特に制限される こ と な く、 従来からよ く 知られている各種のコ ロニー刺激因 子 (colony-stimulating factor : C S F ) 等力、 *挙げられ る。 これらは、 通常と同様な方法で利用する こ とができ る。 その具体例と しては、 例えば各種のサイ ト力イ ン類 〔 ； f 1 t — 3 リ ガン ド （ fit- 3 ligand ： F L ) , イ ンタ —ロイキン— 6 ( interleukin- 6 ： I L - 6 ) 等〕 、 幹細 胞因子 （stem cell factor ： S C F ) に対 して相乗作用 を示すイ ンタ一ロイキン— 7 ( interleukin- 7 ： I L - 7 ) 、 C D 3 4 分子の架橋 （以下、 C D 3 4 x L という ） 等を 例示する こ とができ る。
なお、 「 C D 3 4 X L」 とは、 C D 3 4 陽性細胞に対 してその表面上に発現している C D 3 4 分子を架橋する こ とによ り刺激を加える こ とを意味する。 ま た、 こ の
「 C D 3 4 X L」 を行う ためには、 限定はされないが、 通常、 固相化した抗 C D 3 4抗体が用いられる。
付着性培養器と しては、 浮遊性細胞培養用の処理がし てある ものや細胞付着性が著し く 低 く なる よ う な処理ま たは材質の ものでない限り、 特に制限されない力、'、 好適 にはポ リ スチ レ ン製の培養器が举げられる。 よ り好適に は、 付着性細胞の培養を容易にするべ く 細胞接着性を増 強させる処理が表面に施された容器である。
液体培養の条件は、 特に限定される こ とな く 一般に用 い られる各種の条件をいずれも採用する こ とができる。
液体培養に用い られる培地と しては、 代表的には、 造 血幹細胞を培養するためによ く 使用されている培養液、 例えは、 a — M E M ( a -Minimum Essential Medium) 、 ィ ス コ フ改変ダルベッ コ培地 （ I M D M ) 等の適当な培地 を基本培地と して、 これに、 非働化胎児ゥ シ血清 （ F B S ) 及び非働化ゥマ血清 （horse serum) をそれぞれ 1 0 %程度加えたもの、 更に細胞の維持及び増殖を促す添加 物と して、 例えば f 1 t 一 3 リ ガン ド （ f It- 3 ligand) 1 0 0 ng/ml、 イ ンタ ー ロ イ キ ン 一 6 1 0 ng/m ィ ン ターロイキン一 7 1 0 ng/m または固相化した抗 C D 3 4抗体 （ 1 0 β g / m 1 の濃度でプレー ト に固相ィ匕 し た もの） を、 それぞれ単独で或いは組み合わせて添加 し た ものが举げられる。
培養条件は、 通常の ヒ ト細胞の培養と同様でよ く、 一 般には、 3 7 °C、 5 % C 0 2下で行なう こ とができ る。
本発明の培養方法によ っ て、 得られる培養細胞は、 い ずれも C D 3 4 陽性 （ C D 3 4 +) を示 し、 C D 1 1 7
(以下、 c- kitという ） 分子の発現程度が陰性から高い陽 性 （high) まで認め られる という特徴を有する。 これら の細胞のう ち、 c- kit分子の発現程度が低い陽性 （ low) の細胞 （c-kit' °w細胞） 及び高い陽性 （high) の細胞
( C- kith i "細胞） に関 しては、 さ らに E p o、 I L - 3、 G M- C S F、 G - C S F、 S C F等の存在下で、 赤血球 系コ ロニー、 顆粒球 /マ ク ロ フ ァ ージ系コ ロニー、 マク ロ フ ア ジ系コ ロニー、 顆粒球 赤血球系ノ巨核球//マク ロ フ ァ 一ジ系コ ロニーを形成する能力を有する という特 徴を有する。 ― 害 施 例
以下、 本発明を更に詳し く 説明するため実施例を挙げ るが、 本発明は、 これらの実施例によ ってなん ら限定さ れる ものではない。 実施例 1
1. 造血幹細胞 （ C D 3 4 +c- kit ) の分離
( 1 ) 材料及び方法
ィ ン フ ォ ーム ド コ ンセ ン 卜 が行なわれた健常人ボラ ン テ ィ アか らの臍帯血を、 A C D — A液 （ ク ェ ン酸ナ ト リ ゥ ム 2. 2 0 w/v%、 ク ェ ン酸 0. 8 0 w/v%、 ブ ドウ糖
2. 2 0 w/v%、 p H 4. 5 〜 5. 5 ： Terumo, Shibuya Tokyo, Japan) カヽ' 6 m 1 入 っ た 5 0 m 1 容量チ ュ ーブに 採取 した。 こ れに 2 %デキス ト ラ ン溶液 （： Dextran
T - 500 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) を 2 % ( w/v) の 濃度で生理食塩水に溶解 した も の〕 を、 A C D — A液に 対 して容積比 2 ： 1 とな る割合で添加 し、 撹拌後、 3 0 分間静置 し、 上清を臍帯血有核血球 （Cord Blood
Nuclear Cells ： CBNC) 分画と して回収 した。
こ の分画を Lymphoprep ( Nycomed, Oslo, Norway) ίこ 重層 し、 2 0 0 0 rpmで 3 0分間遠心する こ と によ り—臍帯 血単核球画分 ( Cord Blood Mononuclear Cells ： CBMNC) を得た。
更に、 C D 3 4 マノレチ ソ ー ト キ ッ ト （ CD34 raultisort kit ： Miltenyi Biotec, Bergi sch Gladbach, Germany) 及び ミ ニマ ッ ク ス ( MiniMACS ： Miltenyi Biotec,
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) を用い て C D 3 4 +細胞を単離した。
こ の C D 3 4 +細胞を F I T C ( fluorescein
isothiocyanate) 標識抗 C D 3 4 ク ラス III抗体 ( HPCA2 ： Cat. No. 348053, Bee ton Dickenson I mraunoc tome t ry Systras, San Jose, CA, USA)及び P E (Phycoerythrin) 標識抗 c - kit抗体 ( Cat. No. 1360, Itnraunotech,
Merseile, France) を用いて二重染色 し、 次いで F A C S t a r ( Becton Dickenson I mmunocy tometry Systems, San Jose, CA， USA )を用いてソ一ティ ング した。
また、 アイ ソタイ プ適合コ ン ト ロールと して F I T C 標識マウス I g G 1 ( Cat. No.9041, Becton Dickenson I nimunocytometry Systems, San Jose, C A, USA ) 及び P E標識マウス I g G 1 ( Cat. No.9043, Becton
Dickenson I mraunocy tometry Systems, San Jose, CA, USA) を用いた。
これらの単離細胞のコ ロニー形成能を調べるために、 上記単離細胞を完全メ チルセルロース培地 （Methocult GF H4434V, Stemcell technoloies Inc.， Vancouver, BC, Canada) に懸濁 して、 その 0. 8 m l づっを 1 2 ゥ ヱ ノレプレー 卜 ( Cat. No.76-063-05, Flow Laboratories Inc. , McLean, USA) に播種して、 3 7。C、 5 % C 0 2の 条件で C O 2イ ンキュベーター （Tabai, Japan) 中にて培 養を行な っ た。 1 4 日後に倒立顕微鏡下においてコ ロニ —を判另 lj及び計沏 J し、 B F U— E (Burst— forming unit - ery throia 、 C F U - G ( Colony-forming unit- granulocyte/macrophage) 、 C F U - M (Colony-forming unit- macrophage) 及び C F U - G E M M ( Colony- forming unit-granulocyte/erythroid/megakaryocyte/ macrophage ) 数を算出 した 0
各実験は 4 回行ない、 結果は平均 （Mean) 土標準誤差 ( S E ) と して求めた。
( 2 ) 結果
結果を図 1 に示す。
図 1 中 Aは、 ヒ ト臍帯血から、 C D 3 4 マノレチソー ト キッ トを用いた免疫ビーズ法において陽性選択して得ら れた、 C D 3 4 +細胞分画の F S C (前方散乱） - S S C (側方散乱） パター ンを示す。 これから、 blast gate ( R 1 ) をかけた集団の F I T C - P Eパター ンを図 1 の B及び C に示す。 具体的には、 図 1 中 C は、 F I T C 標識抗 C D 3 4 ク ラス III抗体及び P E標識抗 c- kit抗体 で二重染色した結果を示 し、 ま た B はアイ ソタイ プ適合 コ ン ト ロールである F I T C標識マウス I g G l 及び P E標識マウス I g G l で二重染色した結果を示す。 また、 闵 1 の C 中、 R 2、 R 3及び R 4 はそれぞれ C D 3 4 + c- kit―、 C D 3 4 +c- kit' °w及び C D 3 4 +c- kith i hをソ 一ティ ングするためのゲ一 トである。
C D 3 4 陽性細胞 （ C D 3 4 +細胞） の う ち、 P E標識 マウス I g G 1 を用いたネガティ ブ細胞の蛍光強度よ り も充分に低い蛍光強度を示す画分を 「c- kit陰性画分」 ( C D 3 4 +c- kit 分画） と し、 ネガティ ブ細胞の蛍光強 度よ り少 し強い画分を 「c- kit弱陽性」 （ C D 3 4 + c-kit'°w分画） と し、 また c- kitが最も強い発現量を示す 画分を 「c-kit強陽性画分」 （ C D 3 4 +c- kith i g h分画） と して、 それぞれゲー ト設定した。
上記で設定した F A C S t a r を用いて、 上記で設定 したそれぞれの細胞をソーティ ングし、 分け られた分画 を同様に設定された F A C S c a n (Bee ton Dickinson I mmunocy tome try Systems ： SanJ ose, CA， USA ) を用いて 再解析 した結果、 C D 3 4 +c- kit 分画、 C D 3 4 + c - kitl QW分画及び C D 3 4 +c- kith i s h分画において、 設 定通り の細胞が得られている こ とが確認された。
次に、 これらの各分画の細胞のコ ロニー形成能を調べ るために、 メ チルセルロース培地を用いて コ ロニー形成 分析を行った。 結果を表 1 に示す。 く表 1 〉
Figure imgf000017_0001
表 1 よ り、 c-kit抗原の発現が高い分画ほどコ ロニー形 成能も高いこ とが示された。 一方、 C- kit抗原の発現が陰 性であ る分画、 つま り C D 3 4 +c- kit 分画はコ ロニー形 成能を殆ど有しないこ とが示された。
2. 造血幹細胞の培養
( 1 ) 材料と方法
得られた C D 3 4 c- kit 分画、 C D 3 4 +c- kit【 ow分 画及び C D 3 4 + C- kith i irh分画をそれぞれ、 1 0 %熱非 働ィ匕 F B S (Stemcell Technology Inc. , Vancouver, BC Canada) 及び 1 0 %熱非働化ゥマ血清 （ H o S ： Stem cell Technology Inc. , Vancouver, BC， Canada ) ¾：含 、 a -M E M ( Gibco, Grand Island, NY, USA) に懸溺 し、 細胞付着性の 2 4 ゥ ヱノレプレー ト （Cat. No.76-063- 05, Flow Laboratories Inc. , McLean, USA) に播種した。
また、 同様に、 各分画の細胞をそれぞれ、 細胞非付着 性の 2 4 ゥ ヱルプレー ト （浮遊培養用マルチプレー ト ； Cat. o. MS-8024R, Sumitomo Bankelite Co. , Ltd. , Tokyo, Japan) またはス ク リ ューキャ ッ プ付きポ リ プロ ピレ ン 製 1. 7 m 1 チュ ーブ （： GENE twist top vial ； Cat. No.
1441, Yashi ma Purechemica 1 s Co. , Ltd. , Osaka, Japan) にも播種した。
これ らのプレー ト及びチューブをそれぞれ 3 7 °C、 5 % C 0 2の条件下で、 C 0 2イ ンキュベータ一 （Tabai, Japan) 中にて培養 した。
培養液中に添加する造血幹細胞増殖因子と して、 組換 ぇ ヒ ト F L ( recombinant human f 11 - 3 1 igand, rhFL ： Cat. No.80-3692-01, Genzyme, Cambrige, MA, USA) ヽ 組換え ヒ 卜 I L - 6 ( recombinant human IL - 6， rhIL-6 ： Cat. No. 1131567, Boehl inger Mannheim Biomedica, Germany) または組換え ヒ ト I L— 7 ( recombinant human IL-7, rhIL-7 ： Cat. No. Fl - 1587- 1， Genzyme, Cambrige, MA, USA ) 等のサイ ト 力イ ンを用いた。
抗 C D 3 4 ク ラ ス I I I抗体 （ Cat. No. 550018, Beet on Dickinson I mmunocy tomet ry Systems, San J ose, CA, USA) を 1 0 μ g / m 1 の濃度となる よ う に P B S (- )で 希釈し、 2 4 ゥ ヱルプレー 卜 に 3 0 0 〃 1 づっ添加 した。
3 7 °Cで 6 0分間イ ンキュベー ト し、 抗体溶液を除い た後、 — M E M ( 1 0 % F B S + 1 0 % H o S を含有） を添加 して、 3 7 °Cで 3 0 分間ブロ ッキ ングした。
次いで、 P B S ( 0. 1 % F B S含有） で各ゥ ヱ ノレを 3 回洗浄して抗 C D 3 4抗体を固相化した培養用プレー トを調製 し、 得られた抗 C D 3 4抗体固相化プレー ト上 で C D 3 4 陽性細胞を培養する こ とによ っ て、 C D 3 4 陽性細胞に対して C D 3 4 x L を行な っ た。
細胞は、 液体培養後ピペッ ティ ング操作によ り 2 4 ゥ ヱノレプレー ト よ り 回収 し、 一部を完全メ チルセルロース 培地 ( Methocult GF H4434V, Steracell technoloies " Inc. , Vancouver, BC, Canada) に懸濁 してヽ 0. 8 m l づっを 1 2 ウ エノレプレー 卜 （Cat. No. 76— 063— 05, Flow Laboratories Inc. , McLean, USA) に播種して 3 7 °C 5 % C 0 2の条件で、 C 0 2イ ンキュベーター （Tabai,
Japan) 中にて培養を行な っ た。 1 4 日後に倒立顕微鏡下 においてコ ロニーを判別及び計測 して、 B F U - E、 C F U - G M、 C F U -M及び C F U - G E M M数を算出 した。 各実験は 4 回行ない、 結果を平均 （Mean) 土標準誤差 ( S E ) で表した。
また残り の細胞は， F I T C標識抗 C D 3 4 ク ラス III 抗体及び P E標識抗 c- kit抗体で染色 し、 C D 3 4 抗原及 び c- kit抗原の発現量を F A C S c a n で測定 し、 平均蛍 光強度 ( Mean f luorescense intesity) を検出器のチ ヤ ンネノレで表わ した。
( 2 ) 結果
単離 した C D 3 4 +c- kit 細胞分画（R 2 ) ， C D 3 4 + c- kitl°w細胞分画 （ R 3 ) 及び C D 3 4 +c- kith ' 2h細胞 分画 （ R 4 ) を、 — M E M ( 1 0 % F B S + 1 0 % H o S含有） に懸濁 して、 細胞付着性 2 4 ゥ エルプレー ト にて 2 4 時間培養 した。 培養前及び 2 4 時間培養後の各 分画 R 2、 R 3 及び R 4 の細胞を、 それぞれ F I T C標 識抗 C D 3 4 ク ラ ス III抗体及び P E標識抗 c- kit抗体を 用いて染色 し、 F A C S c a n を用いて C D 3 4 +細胞に おける c-kit抗原分子の発現状態を調べた。
そ の結果を図 2 に示す。
図 2 は、 ソ一テ ィ ング後の各分画 （ R 2、 R 3及び R 4 ) の培養前の発現パター ン （図 2 中、 A ) 、 及び 2 4 時間培養後の各分画 （ R 2、 R 3及び R 4 ) の発現パタ — ン （図 2 中、 B ) を示す。
図 2 からわかる よ う に、 全ての分画において、 培養前 ( A ) の c_kitの発現に比べて、 2 4 時間培養後 （ B ) の c- kitの発現が増強していた。 C D 3 4 +C - kit—分画 （ R 2 ) において も c- kit分子の発現が認め られた力、'、 2 4 時 間後に回収される細胞数は少なかつ た。
この分画 （ R 2 ) の細胞の回収率を向上させるため、 造血幹細胞増殖因子と して、 F L， I L — 6 といっ たサ イ ト 力イ ン、 固相化抗 C D 3 4 抗体を用いた C D 3 4 x L、 並びに S C F ( stem cell factor) に対 してネ目乗作 用を示す I L 一 7 を、 それぞれ単独又は組み合わせて、 培地に添加 して培養を行な つ た。
即ち、 C D 3 4 +c- kit—細胞を 7 0 0 0 個づつ、 それぞ れ 2 4 ゥ ヱルプレー ト に播種し、 上記各添加物の所定量 を添加 （無添加を対照とする） して、 3 日 間培養 し、 培 養細胞を ピベッ テ ィ ングによ り 回収 して細胞数を計測 し その後、 細胞を F I T C標識抗 C D 3 4 ク ラス III抗体 及び P E標識抗 c- kit抗体を用いて染色して、 F A C S c a n を用いて C D 3 4 +細胞における c- kit分子の発現状 態を調べた。
その結果を図 3 に示す。 図 3 において、 （ A ) .は無添加対照 （培地のみ） の結 果を、 （B ) は F L ( 1 0 0 ng/ml) 添加の結果を、 （ C ) は I L - 6 ( 1 0 ng/ml) 添加の結果を、 （D ) は固相化抗 C D 3 4 抗体を用いた C D 3 4 x Lの結果を、 （E ) は F L ( 1 0 0 ng/ml) + I L - 6 ( 1 0 ng/ml) 添加の結果を. ( F ) は F L ( 1 0 0 ng/ml) - I L - 6 ( 1 0 ng/ml) + I L - 7 ( 1 0 ng/ml) 添加の結果を、 （ G ) は F L ( 100 ng/ml) + I L - 6 ( 1 0 ng/ml) + I L - 7 ( 1 0 ng/ml) + C D 3 4 x L添加の結果をそれぞれ示す。
回収された細胞数を計測 した結果を下記表 2 に示す。 く表 2 > 群 回収細胞数
(A) 群 （無添加対照） 500
CB) 群 （FL単独） 3000
(C)群 （ Iい 6単独） 2500
(D)群 （CD 34 XL単独） 1500
(E) 群 （FL+ I 3L - 6) 3000
(F)群 （FL+ I L - 6 + I L— 7) 6000
(G) 群 （F L+ Iい 6 + 5500
I L-7 + CD 34XL) 図 3 及び表 2 よ り、 細胞付着性プレー ト上での培養に おいて、 F L、 I L — 6 の添加及び C D 3 4 X L はいず れも c- kit分子を発現させ、 且つ造血幹細胞の回収率を向 上させる こ とが明 らかである。 特に、 F L は、 培養液に 添加する こ とによ って、 C D 3 4 +c_kit 細胞に対 して単 独で最も細胞回収率及び発現強度を高めるサイ ト カイ ン である こ とが示された。 ま た、 これを併用する こ とによ り、 細胞の回収率は一層向上し、 特に F L + I L - 6 + 1 L - 7 培養系及び F L + I L - 6 + I L - 7 + C D 3 4 x L 培養系では、 添加 した細胞とほぼ同程度の細胞を回収で きた。
次に、 上記 F L + I L - 6 + I L - 7 + C D 3 4 x L培 養系における C- kit分子発現の力イ ネティ ッ ク スをと つ た 結果、 培養後 1 〜 3 日 の時点において、 C- kit分子の発現 は急激に上昇し、 8 日 目に ピー ク に達する こ とが明 らか となっ た。 一方、 この培養系では、 培養 3 日 目で C D 3 4 — c_kit の細胞集団が出現し、 これは更に分化の進んだ 細胞である と考え られた。
更に、 C D 3 4 +C- kit 細胞の培養によ り誘導された上 記 C D 3 4 +C- kit +細胞がどのよ う なコ ロニ一形成能を有 しているかを調べるために、 C D 3 4 +C- kit 細胞を細胞 付着性プレー ト上で、 F L + I L - 6 + I L - 7 + C D 3 4 x L で刺激しながら培養 した。 4 8 時間後に培養細胞 を回収 して、 F I T C標識抗 C D 3 4 ク ラ ス III抗体及び P E標識抗 C- kit抗体を用いて染色して、 F A C S t a r を用いて、 図 1 の Cで示 した R 3 ( C D 3 4 +c-kit 1 ow) 及び R 4 ( C D 3 4 +C- kith i g h) の各細胞の分画をソ一 ティ ングし、 その細胞のコ ロニー形成能をコ ロニーフ ォ — ミ ングア ツ セィ によ って調べた。
この結果を、 誘導前の C D 3 4 +C- kit—細胞のコ ロニー 形成能及び同時にソーティ ングした C D 3 4 +c- kit 1 °w細 胞と C D 3 4 +c-kith i s h細胞のそれぞれの コ ロニー形成 能の結果と共に、 次の表 3 に示す。
く表 3 >
Figure imgf000025_0001
表 3 から分かる よ う に、 C D 3 4 +c- kit 細胞を細胞付 着性プレー ト上で F L + I L - 6 + I L - 7 + C D 3 4 x Lで刺激、 培養する こ とによ っ て誘導された C D 3 4 + c-kitl aw細胞及び C D 3 4 +c- kith 1 細胞は、 誘導前の C D 3 4 +c- kit 細胞に比べて、 コ ロニー形成能が著 し く 増加 し、 最初に単離した C D 3 4 + C- kitl clw細胞及び C D 3 4 +c- kith 18 h細胞 （前記表 1 参照） と同程度のコ ロニ 一形成能を有する こ とが明 らかとな っ た。
最後に、 C D 3 4 +c- kit—細胞力、らの C- kit分子の発現 誘導が細胞付着性プレー ト以外の培養器において も起こ り得る ものであ るか否かを調べるために， C D 34 + C- kit一 細胞を細胞付着性の少ない浮遊細胞培養用プレー ト及び 細胞がほとんど付着 しないポ リ プロ ピ レ ン製チューブに それぞれ播種して、 5 % C 02、 3 7 °C下に 2 4 時間培養 を行な った。
その結果を図 4 に示す。
図 4 において、 Aは C D 3 4 +c- kit—細胞を α — M E M ( 1 0 % F B S + 1 0 % H o S 含有） のみに懸濁させて 浮遊細胞培養用プレー ト 中で培養した結果を、 B は C D 3 4 +c- kit一細胞を F L ( 1 0 0 ng/ml) を含むひ — M E M ( 1 0 % F B S + 1 0 % H o S含有） に懸濁させて浮 遊細胞培養用プレー ト 中で培養 した結果を、 また C は C D 3 4 +c-ki1;—細胞を ー M E M ( 1 0 % F B S + 1 0 % H o S含有） のみに懸濁させてプロ ピレ ン製チューブで 培養した結果をそれぞれ示す。
図 4 からわかる よ う に、 図 2 の B ( R 2 ) 及び図 3 の ( A ) に比べて、 細胞付着性の低い培養器ほど、 c-kit分 子の発現誘導が低下する こ とが明 らかとな った。 特に、 プロ ピレ ン製チュ ーブを用いた場合は、 全 く C- kit分子の 誘導は認め られなかっ た。 ま た、 この c- kit分子の発現誘 導の低下は、 F Lの添加によ っ て も回復させる こ とはで きなかっ た。
これ らの こ とよ り、 C D 3 4 +C- kit 細胞を起源細胞と して用いて、 液体培養によ って、 F L + I L - 6 + I L - 7 + C D 3 4 x L で刺激、 培養 して、 C D 3 4 +c- kit +細 胞、 すなわち C D 3 4 +c- kit ' °w/h 1 g h細胞を得るために は、 細胞付着性の培養器が必須である こ とが示された。

Claims

請求の範囲
1 造血幹細胞増殖因子の存在下に、 表現型が C D 3 4 +及び c - k i t—と して特徴づけ られる ヒ ト造血幹細胞を、 付着性培養器を用いて液体培養する こ とを特徴とする造 血幹細胞の培養方法。
2 造血幹細胞増殖因子が、 コ ロ ニー刺激因子である こ とを特徴とする請求項 1 記載の造血幹細胞の培養方法 (
3 造血幹細胞増殖因子が、 f 1 t - 3 リ ガン ド （ F L ) . イ ン タ 一 ロ イ キ ン 一 6、 C D 3 4 x L 及びイ ン タ 一 ロ イ キン一 7 からなる群から選択されるいずれか少な く と も 一種である こ とを特徴とする請求項 1 記載の造血幹細胞 の培養方法。
4 ヒ ト造血幹細胞が、 臍帯血幹細胞ま たは末梢血幹 細胞に由来する ものである こ とを特徴とする請求項 1 乃 至 3 のいずれかに記載の造血幹細胞の培養方法。
5 付着性培養器が、 ポ リ ス チ レ ン製の培養器である こ とを特徴とする請求項 1 乃至 4 のいずれかに記載の造 血幹細胞の培養方法 (
6 付着性培養器が、 その培養表面が細胞接着性を増 強させる処理がなされた ものである こ とを特徴とする請 求項 5 記載の造血幹細胞の培養方法。
7 液体培養が、 1 0 %非働化 F B S及び 1 0 %非働 ィ匕ゥマ血清を添加 した α — M E Mまたはイ ス コ フ改変ダ ルべッ コ培地で行われる こ とを特徴とする請求項 1 乃至 6 のいずれかに記載の造血幹細胞の培養方法。
8 更に、 f 1 t - 3 リ ガン ド 1 0 0 ng/ml、 イ ンター ロイキン一 6 1 0 ng/ml、 イ ンター ロイ キン一 7 1 0 ng/ml及び固相化抗 C D 3 4 抗体 （ 1 0 g/mlの濃度で固 相化） からなる群から選択される少な く と も一種を添加 したな — M E Mまたはイ スコ フ改変ダルべッ コ培地で、 液体培養が行われる こ とを特徴とする請求項 7 記載の造 血幹細胞の培養方法。
9 液体培養が、 3 7 ° (：、 5 % C 0 2下で行われる こ と を特徴とする請求項 1 乃至 8 のいずれかに記載の造血幹 細胞の培養方法。 1 0 請求項 1 乃至 9 のいずれかに記載の培養方法によ り、 増殖取得される造血幹細胞。 1 1 表現型が C D 3 4 +及び c- kit+と して特徴づけ られ る ものである、 請求項 1 0 記載の造血幹細胞。
1 2 表現型が C D 3 4 +及び c- kit'°wま たは C D 3 4 + 及び c-kith i ghと して特徵づけ られる ものである、 請求項 1 1 記載の造血幹細胞。
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