CN103501832A - 通过过滤分离白细胞和肿瘤细胞的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过过滤从血样中分离或回收血细胞亚群例如白细胞和/或循环肿瘤细胞,而不改变治疗剂例如抗癌药的细胞内浓度的新的装置和方法。与本领域现有技术不同,本发明的装置和方法有利地提供了来自回收的细胞例如白细胞和/或循环肿瘤细胞的细胞裂解物,而基本上不稀释治疗剂例如抗癌药。
Description
与相关申请的交叉引用
本发明要求对2011年2月17日提交的美国临时专利申请号61/444,044和2011年5月25日提交的61/489,998的优先权,其公开以其整体引入本文作为参考用于所有目的。
发明背景
癌症是美国的第二大致死原因。对准确分析用于癌症的诊断和预后的致癌标记物的需求日益增长。例如,检测致癌标记物阵列可允许医生检测早期癌症和监控癌症进展。结合患者在药物开始前对抗癌疗法的反应性,医生可选择针对每位个体患者的最佳疗程。此外,在疗程中对药物有效性的常规分析可揭示患者对特定抗癌药的无反应性。此信息可用于改善对药物治疗方案的选择。
用于致癌标记物分析的现有方法是基于在正常和癌细胞的异质混合物例如全血中查询恶性细胞。例如LeukoLOCK总RNA分离系统(Ambion)的方法通过使血样通过一次性白细胞消耗滤器捕获循环恶性细胞。通常在回收恶性细胞时用缓冲剂例如PBS冲洗这些消耗滤器。此洗涤步骤改变了先前暴露于细胞的抗癌药的细胞内浓度,因此可能导致细胞内的从头信号传递响应并改变致癌标记物的表达。因此,在分析的样品中的致癌标记物的表达不能准确反映患者对特定抗癌疗法的反应。这可导致不正确的诊断和/或预后评估。本发明通过提供用于分离血细胞亚群而不改变抗癌药的细胞内浓度的方法和装置克服了此潜在的错误原因。
发明概述
本发明提供了装置和方法,所述装置和方法用于通过过滤从血样中分离、收获和/或回收血细胞亚群,例如正常白细胞、患病白细胞、恶性白细胞、白血病细胞、泡沫细胞和/或循环肿瘤细胞(CTC),而不改变治疗剂即抗癌药(例如酪氨酸激酶抑制剂)的细胞内(体内)浓度。在某些方面,本发明提供了包含过滤设备和收集管的细胞分离装置。
在一个方面,本发明提供了用于将白细胞与全血样品中的红血细胞分离和分隔的装置,所述装置包含:
过滤设备,其包含上室、下室和在上室和下室之间的一层或多层堆积的滤膜,其中所述一层或多层堆积的滤膜能够保留白细胞;和
收集管,其用于从全血样品中收集红血细胞,其中所述过滤设备放置于收集管顶部,且其中在离心后将红血细胞与白细胞分隔并将红血细胞收集在收集管中。在优选的方面,下室被放置在上室和收集管之间。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于从全血样品中制备白细胞裂解物而基本不稀释治疗剂(例如抗癌药)的方法,所述方法包括:
(a)将全血样品装载至细胞分离(过滤)装置,例如本文描述的装置中;
(b)离心所述装置以在一层或多层堆积的滤膜上捕获白细胞,从而将红血细胞分隔进收集管中;和
(c)用裂解缓冲剂裂解在一层或多层堆积的滤膜上捕获的白细胞,但在步骤(b)和(c)之间没有洗涤步骤,从而制备白细胞的裂解物。
在另一个方面,本发明提供了用于在对象中监控抗癌药的效力的方法,其中所述对象具有恶性血液病,所述方法包括:
对对象施用抗癌药,其中在时间T1首次施用抗癌药;
在时间T2测量来自对象的样品中的BCR-ABL的激活状态和或表达水平;和
基于BCR-ABL的激活状态和或表达水平决定疗程。
在某些实施方案中,所述方法还包括在T0,即在抗癌药的首次施用前测量BCR-ABL的激活状态。在某些情况下,所述恶性血液病是淋巴瘤或白血病,例如慢性骨髓性白血病(CML)。T1和T2之间的时间差为约1周至约6个月,例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,或24周。T0和T1之间的时间差为约1天至约3周。在某些其他方面,所述方法还包括测量至少另一种信号转导分子例如CRKL,AKT,STAT5和SRC的表达和或激活水平。
在某些方面,疗程选自改变抗癌药剂量,改变抗癌药,包括另外的抗癌药,改变治疗时间和维持现有疗程。
在某些方面,样品包含分离的细胞的提取物。在某些方面,在T0(开始治疗前)用至少一种抗癌药(例如2种抗癌药)体外孵育分离的细胞。在其他情况下,在决定疗程前,在T2用至少2种抗癌药体外孵育分离的细胞。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于在具有恶性血液病的对象中选择抗癌药的方法:
测量来自对象的样品中的分离的细胞中的BCR-ABL激活状态水平;
在治疗开始前用至少一种抗癌药孵育分离的细胞;
测量孵育的细胞中的BCR-ABL激活状态水平;和
基于BCR-ABL的激活状态水平选择疗程。
在某些方面,所述疗程选自选自抗癌药,选择抗癌剂量和决定治疗时间。在某些其他方面,方法还包括测量至少另一种信号转导分子例如CRKL,AKT,STAT5和SRC的表达和或激活水平。
本发明本身提供了:用于在具有恶性血液病的对象中选择抗癌药的方法,所述方法包括:
1)测量来自对象的样品中的分离的细胞中的BCR-ABL激活状态水平;
2)在治疗开始前用至少一种抗癌药孵育分离的细胞;
3)测量孵育的细胞中的BCR-ABL激活状态水平;和基于BCR-ABL的激活状态水平选择疗程。
本发明也提供了用于监控对象中抗癌药的效力的方法,其中所述对象具有恶性血液病,所述方法包括:
a)在抗癌药的首次施用前,在T0测量BCR-ABL的激活状态;
b)对对象施用抗癌药,其中在时间T1首次施用抗癌药;
c)在时间T2测量来自对象的样品中的BCR-ABL的激活状态和或表达水平;和
d)基于BCR-ABL的激活状态和或表达水平决定疗程。
通过以下详述和附图,本发明的其他目的、特征和优势对本领域技术人员将是显而易见的。
附图简述
图1图示了本发明的一个实施方案的流程图。
图2A-G图示了细胞分离装置的实施方案。图2A是上室的实施方案。图2B-C显示了有帽的上室;图2D-E是下室;而图2F-G是收集管。
图3A-D图示了具有多种漏斗功能的下室的实施方案。
图4A-D图示了细胞分离装置的实施方案。图4A是上室和下室的实施方案;图4B是上室和下室的实施方案;图4C是收集管的实施方案;而图4D是上室、下室和收集管的集合体的实施方案。
图5A-D图示了细胞分离装置的另一个实施方案。图5A是上室和下室的实施方案;图5B是有帽的上室和下室的实施方案;图5C是有帽的收集管的实施方案;而图5D是下室和漏斗的实施方案。
图6A-C图示了细胞分离装置的另一个实施方案。图6A是上室和下室的实施方案;图6B是具有中间套管的上室和下室的实施方案;图6C是下室的实施方案。
图7A-B图示了在通过过滤从K562细胞制备的细胞裂解物中能够检测和测量到的总BCR-ABL和磷酸化的BCR-ABL。过滤后细胞中的总BCR-ABL水平与在未过滤的样品中观察到的水平类似。另外,图7B显示在过滤后K562细胞中的磷酸化的BCR-ABL水平与在未处理的细胞中检测到的水平是可比较的。
图8A-B图示了在细胞裂解物中可检测和测量到的总BCR-ABL(图8A)和磷酸化的BCR-ABL水平(图8B),其中所述细胞裂解物从掺有K562细胞的血样制备,过滤通过滤膜,并通过微阵列(例如本文描述的临近介导的免疫测定)分析。图8B显示了能够比较以多种速度离心的不同样品中的总BCR-ABL和磷酸化的BCR-ABL的百分比回收。回收的磷酸-BCR-ABL(63.60%)和总BCR-ABL(141.55%)信号的最高百分比来自使用PALL滤膜和以600rpm离心。
图9A-B图示了在细胞裂解物中可检测和测量到的磷酸化的BCR-ABL水平(A),所述细胞裂解物从掺有不同量的K562细胞的血样制备,过滤通过滤膜,并通过微阵列(例如本文描述的临近介导的免疫测定)分析。本发明的方法可用于检测掺有K562细胞的样品中的磷酸-BCR-ABL水平。特别地,测量的磷酸化的BCR-ABL水平与加入到血样中的K562细胞数相关。图9B显示了总BCR-ABL回收。
图10列出了在本发明的一个实施方案中分析的患者的表格。患者1患有活跃性CML并从2006年12月起接受治疗。也患有活跃性CML的患者2从1月起接受伊马替尼(imatinib)治疗。
图11A-B图示了较之相比患者2(例如,185,934CU/ml±11,019CU/ml)(B),患者1(A)每ml血液具有的较低的磷酸-BCR-ABL量(例如,10,979CU/ml±1,245CU/ml),提示患者1响应伊马替尼治疗。测定值而没有减去血液背景。
图12A-B显示通过本文描述的方法测定的BCR-ABL的激活的(磷酸化的)水平的检测。根据实施例6中描述的方法将从患者1中分离的细胞裂解物样品以1∶5和1∶20稀释。标准样品代表每80μl裂解物具有不同细胞数(例如10000,3000,1000,300,100,30,10或0个细胞/80μl)的未处理的K562细胞裂解物。图12A的上图显示了BCR-ABL CEER测定的图。
图13A-B显示相比尼罗替尼(nilotinib)处理,用伊马替尼体外处理来自患者1的血样大大降低了磷酸化的BCR-ABL的量。图13A显示了BCR-ABL CEER测定的图。
图14显示当用增加量的BCR-ABL抑制剂(例如,伊马替尼或尼罗替尼)处理时,患者1血样中的激活的BCR-ABL水平发生变化。不同药物浓度与患者1的血样在37℃孵育1.5小时。在1μM伊马替尼处理后的平均CU值为26,在0.1μM伊马替尼处理后为110。图13的上图显示了BCR-ABL CEER测定的图。
图15A-B显示伊马替尼比尼罗替尼更有效地降低患者1血样中的激活的BCR-ABL蛋白质。条形图显示相比未处理的样品,1μM伊马替尼处理使激活的BCR-ABL水平(A)下降。图15B是减去了血液背景后的图。
图16A-D图示了其他磷酸化的信号转导途径组分例如CRKL(A),AKT(B),STAT5(C)和SRC(D)的途径谱。其显示达沙替尼(dasatinib)疗法能够降低患者1血样中的激活的AKT,STAT4和SRC水平。用1μM达沙替尼体外处理患者血样比10μM伊马替尼或10μM尼罗替尼更有效。
图17显示患者1的血样含有极高水平的总BCR(约8,000,000CU/ml)。
图18A-B图示了尼罗替尼比伊马替尼更有效地降低来自患者2的体外处理的血样中的激活的BCR-ABL水平。图18A显示用10μM尼罗替尼体外孵育患者2的血样是降低磷酸BCR-ABL信号的%回收的最有效的处理。
在用不同剂量的BCR-ABL抑制剂在37℃体外处理患者血样1.5小时后,检测和测量了磷酸化的BCR-ABL水平。图18B显示增加剂量的尼罗替尼降低了激活的BCR-ABL,而伊马替尼对患者2的血样没有效果。使用10μM尼罗替尼使磷酸BCR-ABL信号的%回收降低为39.35%,而用10μM伊马替尼仅为96.46%。
图19A-D显示用达沙替尼体外处理患者2的血样能够降低激活的CRKL(A),AKT(B),STAT5(C)和SRC(D)水平。另一方面,用伊马替尼或尼罗替尼处理的类似处理仅降低磷酸化的AKT。
图20A-D显示在也用酪氨酸激酶抑制剂体外处理的若干名患者的血样中能够检测和测量磷酸化的CRKL水平。BCR-ABL抑制剂例如伊马替尼和尼罗替尼仅能够降低来自患者1,而不是患者2的血样中的CRKL水平。图20A-B显示相比未处理样品,在用10μM伊马替尼或10μM尼罗替尼体外处理的患者1样品中磷酸CRKL水平(CU/ml血液)下降。类似地,图20C-D显示在患者1样品中,磷酸CRKL信号的百分比在体外处理后下降。在患者2样品中看不到类似的反应。
图21A-D图示了患者1和患者2不类似地响应伊马替尼和尼罗替尼。在用伊马替尼处理后,激活的AKT在来自患者1的样品中增加,而在来自患者2的样品中下降。响应于尼罗替尼,相比未处理样品,AKT水平在来自患者1的样品中几乎维持不变,而在来自患者2的样品中大大下降。图21A-B显示了以激活的AKT(皮克)/1000个测定的细胞计算的结果。图21C-D显示了以从CEER测定中回收的AKT信号的百分比测定的结果。
图22A-B图示来自患者1(A)和患者2(B)的体外处理的血样的激活的STAT5谱。达沙替尼处理使来自患者1和2的样品中的磷酸-STAT5水平下降。伊马替尼或尼罗替尼处理没有在相同的程度上改变激活的STAT5。
图23A-D显示来自患者1和2二者的样品响应于伊马替尼、尼罗替尼和达沙替尼具有较低水平的磷酸-SRC。图23A-B图示了以皮克/1000个测定的细胞计算的磷酸-SRC水平。图23C-D图示了作为回收的磷酸SRC信号的百分比的磷酸SRC水平。
图24显示了参与此研究的患者列表。患者被诊断患有CML并接受靶向治疗。在这些患者中监控了通过CEER测定的BCR-ABL抑制的体内调节。
图25显示了参与此研究的一些患者的列表。星号提示使用本发明的细胞分离装置的管实施方案处理的血样。其他血样使用96孔实施方案处理。
图26图示了在来自正常、健康对象的血样中的BCR-ABL,BCR和ABL的表达水平。
图27A-B图示了在多个时间点处患者1(A)和7(B)的激活的BCR-ABL水平。WBC=白血细胞。pBCR-ABL=磷酸-BCR-ABL。tBCR-ABL=总BCR-ABL。%P/T=以百分比表示的磷酸-BCR-ABL/tBCR-ABL。
图28A-C图示了在多个时间点处患者2的BCR-ABL谱。图28A显示在5/11抽取的血液中pBCR-ABL/WBC比例下降,并在10/12前增加。星号提示将pBCR-ABL数据乘10以使数据在图上可见。图28B显示pBCR-ABL/总BCR-ABL比例在5/11最低。图28C显示了使用用于BCR-ABL和低水平mRNA的MolecularMD试剂盒的定量RT-PCR分析的结果。BCR-ABL/ABL的百分比随样品中存在的mRNA的量而变化。
图29A-B图示了在多个时间点处患者3的WBC计数和pBCR-ABL/WBC比例(A)。图29B显示了总的和激活的BCR-ABL水平和mRNA百分比的变化。
图30A-B图示了在多个时间点处患者8的总的和激活的BCR-ABL水平(A)。图30B显示在处理从伊马替尼变为达沙替尼后,总的和激活的BCR-ABL水平和mRNA百分比的变化。
图31A-B图示了在多个时间点处在患者14(B)和18(A)中的总的和激活的BCR-ABL水平。
图32A-B显示患者14对伊马替尼或尼罗替尼的体外处理的响应。在药物处理后,总BCR-ABL和磷酸-BCR-ABL水平下降。
发明详述
I.引言
本发明有利地提供了新装置和方法,所述新装置和方法用于通过过滤从血样中分离或回收血细胞亚群例如正常和/或恶性白细胞、白血病细胞、泡沫细胞和/或循环肿瘤细胞(CTC),而不改变治疗剂的细胞内浓度,所述治疗剂例如抗癌药(例如,酪氨酸激酶抑制剂,例如,伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(bosutinib)(SKI-606),吉非替尼(gefitinib)舒尼替尼(sunitinib)埃罗替尼(erlotinib)拉帕替尼(lapatinib)(GW-572016;),卡奈替尼(canertinib)(CI 1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584),索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006;),来氟米特(leflunomide)(SU101),凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMATM;ZD6474),ponatinib(AP24534),及其组合)。与本领域现有技术不同,本发明的装置和方法提供了来自回收的细胞例如白细胞、白血病细胞、泡沫细胞和/或循环肿瘤细胞的细胞裂解物,而基本上不稀释治疗剂例如抗癌药(例如,酪氨酸激酶抑制剂)。
BCR-ABL融合蛋白与慢性骨髓性白血病(CML)以及急性成淋巴细胞白血病(ALL)有关。特别地,BCR-ABL蛋白是对癌症发病机理至关重要的活跃的酪氨酸激酶。尽管目前伊马替尼是新诊断患有CML的患者的一线疗法,约20-25%的患者不能达到可持久的完全的细胞遗传反应。研究已显示在存在持续的伊马替尼治疗时,BCR-ABL激酶活性的再活化是抗性的主要原因。就其本身而论,将BCR-ABL活性的测量用于预测对使用酪氨酸激酶抑制剂例如伊马替尼的疗法的反应以及鉴定对此类抑制剂产生抗性的患者。
在某些实施方案中,本发明的装置和方法能够用于从样品例如血液中分离或回收目的细胞(例如,白细胞、白血病细胞、泡沫细胞和/或循环肿瘤细胞)并从其制备裂解物,其中可使用例如协同酶增强反应免疫测定(CEERTM)(又称协同临近免疫测定(COPIA))的测定检查在得到的细胞裂解物中存在的分析物例如BCR-ABL的表达和/或激活水平。在以下专利文件中描述了CEERTM,为了所有目的将这些文件以其整体引入本文作为参考:PCT公开号WO 2008/036802;PCT公开号WO 2009/012140;PCT公开号WO 2009/108637;PCT公开号WO 2010/132723;PCT公开号WO2011/008990;和在2010年10月20日提交的PCT申请号PCT/US2010/053386。
在特别的实施方案中,能够对使用本发明的装置和方法制备的细胞裂解物进行一种或多种致癌融合蛋白,其底物,和/或其他信号转导途径蛋白(例如,BCR-ABL,BCR,ABL,CRKL,JAK2,STAT5,Src,FAK,c-ABL,c-CBL,SHC,SHP-2,VAV,BAP-1,AKT,SRC,EGFR,HER-2,HER-3,HER-4,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,PDGFR,c-Met,c-KIT,IGF-IR,PI3K,等等)的表达/激活制谱分析,以测定抑制剂疗法对患有BCR-ABL介导的疾病(例如,慢性骨髓性白血病)的患者的效力。在一些情况下,患者可能正在接受抑制剂疗法,例如使用本文描述的酪氨酸激酶抑制剂治疗。在特别的情况下,从此类患者的血样中分离白血病细胞,而基本上不稀释酪氨酸激酶抑制剂。在某些其他情况下,在使用酪氨酸激酶抑制剂体外处理后的样品中的致癌融合蛋白和/或信号转导途径组分的表达/激活制谱分析能够提供有价值的信息,使临床医生能够选择有效的治疗方案。
作为非限制性例子,能够分析来自接受酪氨酸激酶抑制剂疗法的患者的血样以测定疗法的有效性。可抽取患者血液,并使用本发明的装置和方法通过过滤分离目的细胞,例如白细胞、白血病细胞和/或循环肿瘤细胞。然后裂解细胞并使用例如CEERTM的测定检查细胞,以测定酪氨酸激酶抑制剂治疗对一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL),其底物(例如,BCR-ABL底物例如CRKL,JAK2,STAT5,Src,FAK,c-ABL,c-CBL,SHC,SHP-2,VAV和/或BAP-1),和/或其他信号转导分子的激活状态和/或总量的影响。在特别的实施方案中,能够测定白细胞、白血病细胞和/或循环肿瘤细胞的数量和磷酸化的BCR-ABL和其他信号转导途径组分的谱。也能够从分析中计算磷酸化信号比例并用于测定患者的预后。在特别的实施方案中,能够通过在时间T1施用酪氨酸激酶抑制剂,在时间T2在来自患者的样品中测量BCR-ABL的激活状态和/或表达水平,并基于BCR-ABL的激活状态和/或表达水平决定疗程,来在患者中监控酪氨酸激酶抑制剂疗法的效力。
作为另一个非限制性例子,在分离白细胞、白血病细胞和/或循环肿瘤细胞(CTC)前,能够用一种或多种抑制剂在体外孵育来自患者(例如,不正在接受酪氨酸激酶抑制剂治疗)的血样。在特别的情况下,用一种或多种酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼,尼罗替尼,达沙替尼,等等)处理从诊断患有CML的患者中收获的全血样品。使用本发明的装置和方法通过过滤分离目的细胞,例如白血病细胞。然后裂解细胞并使用例如CEERTM的测定检查细胞,以测定酪氨酸激酶抑制剂治疗对一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL),其底物(例如,BCR-ABL底物例如CRKL,JAK2,STAT5,Src,FAK,c-ABL,c-CBL,SHC,SHP-2,VAV和/或BAP-1),和/或其他信号转导分子的激活状态和/或总量的影响。在特别的实施方案中,能够基于下述方法为患者选择合适的酪氨酸激酶抑制剂:测量从样品中分离的细胞中的BCR-ABL激活状态或水平,在治疗开始前用至少一种抗癌药,例如一种或多种酪氨酸激酶抑制剂孵育分离的细胞,测量孵育的细胞中的BCR-ABL激活状态或水平,并基于BCR-ABL激活状态或水平选择疗程。
II.定义
除非另外说明,如本文中使用的以下术语具有通常理解的含义。
术语“癌症”包括特征为异常细胞的失控生长的疾病类别的任意成员。术语包括所有已知的癌症和致瘤性转化病况,不论特征为恶性、良性、软组织或实体,和所有阶段和等级的癌症,包括转移前和转移后的癌症。不同类型的癌症的非限制性例子包括恶性血液病(例如,白血病、淋巴瘤);骨肉瘤(例如,尤文肉瘤);软组织肉瘤(例如,隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、横纹肌肉瘤);其他软组织恶性肿瘤、甲状腺乳头状癌;前列腺癌;胃癌(例如,胃);乳腺癌;肺癌(例如,非小细胞肺癌);消化和胃肠道癌(例如,结直肠癌、胃肠道间质瘤、胃肠道类癌肿瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌和小肠癌);食管癌;胆囊癌;肝癌;胰腺癌;阑尾癌;卵巢癌;肾癌(例如,肾细胞癌);中枢神经系统癌;皮肤癌;绒毛膜癌;和头颈癌。如本文中使用的“肿瘤”包含一种或多种癌细胞。
“恶性血液病”包括影响血液、骨髓和/或淋巴结的任意类型的癌症。恶性血液病包括但不限于,白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。不同类型的白血病的非限制性例子包括慢性骨髓性白血病(CML)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)和大颗粒淋巴细胞白血病。CML的亚型包括,例如,慢性单核细胞性白血病。ALL的亚型包括,例如,前体B细胞急性成淋巴细胞白血病、祖B细胞急性成淋巴细胞白血病、前体T细胞急性成淋巴细胞白血病和急性双表型白血病。CLL的亚型包括,例如,B细胞幼淋巴细胞白血病。AML的亚型包括,例如,急性早幼粒细胞白血病、急性原粒细胞白血病和急性巨核细胞白血病。淋巴瘤的不同类型的例子包括但不限于,霍奇金淋巴瘤(4种亚型)和非霍奇金淋巴瘤,例如小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病(HCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt,slymphoma)(BL)、移植后淋巴增生性病症(PTLD)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病(B-PLL)、氏巨球蛋白血症(又称淋巴浆细胞淋巴瘤),和其他NK或T细胞淋巴瘤。
术语“分析物”包括任意目的分子,一般为大分子例如多肽,测定其存在、量和/或身份。在某些情况下,分析物是癌细胞的细胞组分,优选致癌融合蛋白或信号转导分子。
术语“转化”包括分析物或样品的物理和/或化学变化,为了如本文定义地提取分析物或改变或修饰分析物。如本文中使用的,测量分析物的水平或浓度或激活状态的分析物或样品的提取、操纵、化学沉淀、ELISA、复合、免疫提取、物理或化学修饰都构成转化。换句话说,只要在转化步骤前和后分析物或样品不一样,则改变或修饰是转化。
如本文中使用的,术语“稀释系列”旨在包括特别的样品(例如,细胞裂解物)或试剂(例如,抗体)的递减浓度系列。稀释系列一般通过这样的过程产生,所述过程用稀释剂(例如,稀释缓冲剂)混合测得量的初始浓度的样品或试剂以产生较低浓度的样品或试剂,并重复此过程足够多次以得到期望数量的连续稀释物。能够系列稀释样品或试剂至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,100,500或1000倍以产生包含至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45或50个样品或试剂的递减浓度的稀释系列。例如,能够通过下述方法产生包含1mg/ml初始浓度的捕获抗体的2倍系列稀释物的稀释系列:混合一定量的初始浓度的捕获抗体和等量的稀释缓冲剂以产生0.5mg/ml的捕获抗体浓度,重复此过程以得到0.25mg/ml,0.125mg/ml,0.0625mg/ml,0.0325mg/ml,等等的捕获抗体浓度。
术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”包括通过连接2个或多个原来编码单独的蛋白质的基因产生的蛋白质。当染色体易位使一个基因的末端外显子替换为第二个基因的完整外显子时,通常生成此类基因融合物。这产生能够被转录、剪接和翻译以生产功能性融合蛋白的单个基因。在特别的实施方案中,融合蛋白是致癌融合蛋白,即参与癌发生的融合蛋白。致癌融合蛋白的例子包括但不限于,BCR-ABL,DEK-CAN,E2A-PBX1,RARα-PML,IREL-URG,CBFβ-MYH11,AML1-MTG8,EWS-FLI,LYT-10-Cα1,HRX-ENL,HRX-AF4,NPM-ALK,IGH-MYC,RUNX1-ETO,TEL-TRKC,TEL-AML1,MLL-AF4,TCR-RBTN2,COL1A1-PDGF,E2A-HLF,PAX3-FKHR,ETV6-NTRK3,RET-PTC,TMRSS-ERG和TPR-MET。
术语“信号转导分子”或“信号转导物”包括蛋白质和其他分子,通过所述蛋白质和其他分子执行的过程细胞将细胞外信号或刺激转化为响应,一般涉及细胞内生化反应的有序序列。信号转导分子的例子包括但不限于,受体酪氨酸激酶,例如EGFR(例如,EGFR/HER-1/ErbB1,HER-2/Neu/ErbB2,HER-3/ErbB3,HER-4/ErbB4),VEGFR-1/FLT-1,VEGFR-2/FLK-1/KDR,VEGFR-3/FLT-4,FLT-3/FLK-2,PDGFR(例如,PDGFRA,PDGFRB),c-Met,c-KIT/SCFR,INSR(胰岛素受体),IGF-IR,IGF-IIR,IRR(胰岛素受体相关受体),CSF-1R,FGFR 1-4,HGFR 1-2,CCK4,TRK A-C,MET,RON,EPHA 1-8,EPHB 1-6,AXL,MER,TYRO3,TIE 1-2,TEK,RYK,DDR 1-2,RET,c-ROS,V-钙粘蛋白,LTK(白细胞酪氨酸激酶),ALK(间变性淋巴瘤激酶),ROR 1-2,MUSK,AATYK 1-3,RTK106,和受体酪氨酸激酶的截短形式例如p95ErbB2;非受体酪氨酸激酶,例如Src,Frk,Btk,Csk,Abl,Zap70,Fes/Fps,Fak,Jak,Ack和LIMK;酪氨酸激酶信号转导级联反应组分,例如Akt,MAPK/ERK,MEK,RAF,PLA2,MEKK,JNKK,JNK,p38,Shc(p66),PI3K,Ras(例如,K-Ras,N-Ras,H-Ras),Rho,Rac1,Cdc42,PLC,PKC,p70 S6激酶,p53,细胞周期蛋白D1,STAT1,STAT3,PIP2,PIP3,PDK,mTOR,BAD,p21,p27,ROCK,IP3,TSP-1,NOS,PTEN,RSK 1-3,JNK,c-Jun,Rb,CREB,Ki67,和桩蛋白(paxillin);核激素受体,例如雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、雄激素受体、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、维生素A受体、维生素D受体、类维生素A受体、甲状腺激素受体和孤儿受体;核受体辅激活物和阻抑物;及其组合。
如本文中使用的术语“样品”包括从患者得到的任意生物样本。样品包括但不限于,全血、血浆、血清、导管灌洗液、乳头抽吸物、淋巴液(例如,淋巴结的播散肿瘤细胞)、骨髓吸取液、唾液、尿、粪便(即排泄物)、痰、支气管灌洗液、眼泪、细针抽吸物(例如,通过随机乳晕细针抽吸物收获的)、任意其他体液、组织样品(例如,肿瘤组织),例如肿瘤活检(例如,针吸活检)或淋巴结活检(例如,前哨淋巴结活检),及其细胞提取物。在一些实施方案中,样品是全血或其部分组分,例如血浆、血清、红血细胞、白细胞例如外周血单核细胞和/或罕见的循环细胞。在特别的实施方案中,通过使用本领域已知的任意技术从全血或其细胞部分分离白细胞或实体瘤的循环细胞得到样品。在其他实施方案中,样品是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织样品,例如来自实体瘤。
如本文中使用的,术语“循环细胞”包含已从实体瘤转移的或微小转移的(micrometastasized)肿瘤外(extratumoral)细胞。循环细胞的例子包括但不限于,循环肿瘤细胞、癌干细胞和/或迁移至肿瘤的细胞(例如,循环内皮祖细胞、循环内皮细胞、循环促血管生成(pro-angiogenic)骨髓细胞、循环树突状细胞等等)。
“活检”指移取组织样品用于诊断或预后评估的过程,和组织样本自身。可对本发明的方法和组合物应用本领域已知的任意活检技术。应用的活检技术一般将特别地依赖于待评估的组织类型和肿瘤的大小和类型(即实体或悬浮的(即血液或腹水))。代表性活检技术包括切除活检、切口活检、针活检(例如,芯针活检、细针抽吸活检等)、外科活检和骨髓活检。例如,在Harrison’s Principles of Internal Medicine,Kasper,等人,编,第16版,2005,第70章和整个第V部分讨论了活检技术。本领域技术人员将理解,可进行活检技术以鉴定在给定组织样品中的癌细胞和/或癌前细胞。
术语“对象”或“患者”或“个体”一般包括人,但也可包括其他动物,例如其他灵长类、啮齿类、犬、猫、马、绵羊、猪,等等。
“阵列”或“微阵列”包含固定或限制在固体支持物上的捕获抗体的不同的组和/或稀释系列,所述固体支持物为例如玻璃(例如,载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠(例如,磁珠、聚苯乙烯珠,等等)、纸、膜(例如,尼龙、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF),等等)、纤维束、或任意其他合适的基质。一般通过共价或非共价相互作用(例如,离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)将捕获抗体固定或限制在固体支持物上。在某些情况下,捕获抗体包含与结合在固体支持物上的捕获剂相互作用的捕获标签。在本发明的测定中使用的阵列一般包含与在不同已知/可寻址的位置上的固体支持物的表面偶联的多种不同的捕获抗体和/或捕获抗体浓度。
术语“捕获抗体”旨在包括固定的抗体,所述固定的抗体对于样品的一种或多种目的分析物(例如白细胞或罕见的循环细胞的细胞提取物)是特异性的(即结合、被结合或形成复合物)。在优选的实施方案中,在固体支持物上限制处于阵列的捕获抗体。用于在固体支持物上固定多种致癌融合蛋白或信号转导分子中的任一种的合适的捕获抗体可以从Upstate(Temecula,CA),Biosource(Camarillo,CA),Cell SignalingTechnologies(Danvers,MA),R&D Systems(Minneapolis,MN),LabVision(Fremont,CA),Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA),Sigma(St.Louis,MO)和BD Biosciences(San Jose,CA)获得。
如本文中使用的术语“检测抗体”包括抗体,所述抗体包含对于样品中的一种或多种目的分析物特异性(即结合、被结合或形成复合物)的可检测标签。术语也涵盖对于一种或多种目的分析物特异性的抗体,其中所述抗体能够被包含可检测标签的另一种物质结合。可检测标签的例子包括但不限于,生物素/链霉抗生物素标签、核酸(例如,寡核苷酸)标签、化学反应性标签、荧光标签、酶标签、放射性标签及其组合。用于检测多种致癌融合蛋白或信号转导分子中的任一种的激活状态和/或总量的合适的检测抗体可从Upstate(Temecula,CA),Biosource(Camarillo,CA),CellSignaling Technologies(Danvers,MA),R&D Systems(Minneapolis,MN),Lab Vision(Fremont,CA),Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA),Sigma(St.Louis,MO)和BD Biosciences(San Jose,CA)获得。作为非限制性例子,针对信号转导分子例如EGFR,c-KIT,c-Src,FLK-1,PDGFRA,PDGFRB,Akt,MAPK,PTEN,Raf和MEK的多种磷酸化的形式的磷酸特异性抗体可从Santa Cruz Biotechnology得到。
术语“激活状态依赖性抗体”包括对于样品中一种或多种目的分析物的特别的激活状态特异性(即结合、被结合或形成复合物)的检测抗体。在优选的实施方案中,激活状态依赖性抗体检测一种或多种分析物(例如一种或多种致癌融合蛋白或信号转导分子)的磷酸化、泛素化和/或复合态。在一些实施方案中,使用激活状态依赖性抗体检测BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶结构域的磷酸化。在其他实施方案中,使用激活状态依赖性抗体检测受体酪氨酸激酶EGFR家族成员的磷酸化和/或在EGFR家族成员间的异源二聚体复合物的形成。
适于用激活状态依赖性抗体检测的致癌融合蛋白的激活状态的非限制性例子包括BCR-ABL,DEK-CAN,E2A-PBX1,RARα-PML,IREL-URG,CBFβ-MYH11,AML1-MTG8,EWS-FLI,LYT-10-Cα1,HRX-ENL,HRX-AF4,NPM-ALK,IGH-MYC,RUNX1-ETO,TEL-TRKC,TEL-AML1,MLL-AF4,TCR-RBTN2,COL1A1-PDGF,E2A-HLF,PAX3-FKHR,ETV6-NTRK3,RET-PTC,TMRSS-ERG和TPR-MET的磷酸化形式。适于用激活状态依赖性抗体检测的信号转导分子的激活状态(在括号列出的)的例子包括但不限于,EGFR(EGFRvIII,磷酸化的(p-)EGFR,EGFR:Shc,泛素化的(u-)EGFR,p-EGFRvIII);ErbB2(p95:截短的(Tr)-ErbB2,p-ErbB2,p95:Tr-p-ErbB2,HER-2:Shc,ErbB2:PI3K,ErbB2:EGFR,ErbB2:ErbB3,ErbB2:ErbB4);ErbB3(p-ErbB3,ErbB3:PI3K,p-ErbB3:PI3K,ErbB3:Shc);ErbB4(p-ErbB4,ErbB4:Shc);c-Met(p-c-Met或c-Met/HGF复合物),ER(p-ER(S118,S167);IGF-1R(p-IGF-1R,IGF-1R:IRS,IRS:PI3K,p-IRS,IGF-1R:PI3K);INSR(p-INSR);KIT(p-KIT);FLT3(p-FLT3);HGFRI(p-HGFRI);HGFR2(p-HGFR2);RET(p-RET);PDGFRa(p-PDGFRa);PDGFRP(p-PDGFRP);VEGFRI(p-VEGFRI,VEGFRI:PLCg,VEGFR1:Src);VEGFR2(p-VEGFR2,VEGFR2:PLCy,VEGFR2:Src,VEGFR2:硫酸肝素,VEGFR2:VE-钙粘蛋白);VEGFR3(p-VEGFR3);FGFR1(p-FGFR1);FGFR2(p-FGFR2);FGFR3(p-FGFR3);FGFR4(p-FGFR4);Tie1(p-Tie1);Tie2(p-Tie2);EphA(p-EphA);EphB(p-EphB);NFKB和/或IKB(p-IK(S32),p-NFKB(S536),p-P65:IKBa);Akt(p-Akt(T308,S473));PTEN(p-PTEN);Bad(p-Bad(S112,S136),Bad:14-3-3);mTor(p-mTor(S2448));p70S6K(p-p70S6K(T229,T389));Mek(p-Mek(S217,S221));Erk(p-Erk(T202,Y204));Rsk-1(p-Rsk-1(T357,S363));Jnk(p-Jnk(T183,Y185));P38(p-P38(T180,Y182));Stat3(p-Stat-3(Y705,S727));Fak(p-Fak(Y576));Rb(p-Rb(S249,T252,S780));Ki67;p53(p-p53(S392,S20));CREB(p-CREB(S133));c-Jun(p-c-Jun(S63));cSrc(p-cSrc(Y416));和桩蛋白(p-桩蛋白(Y118))。
术语“激活状态非依赖性抗体”包括这样的检测抗体,所述检测抗体对于样品中一种或多种目的分析物是特异性的(即结合、被结合或形成复合物),而与其激活状态无关。例如,激活状态非依赖性抗体能够检测一种或多种分析物(例如一种或多种致癌融合蛋白或信号转导分子)的磷酸化和非磷酸化的形式二者。
术语“核酸”或“多核苷酸”包括脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物,例如DNA和RNA。核酸包括含有合成的、天然存在的和非天然存在的已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸,且其与参考核酸具有类似的结合性能。这样的类似物的例子包括但不限于,硫代磷酸、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。除非另外限制,术语涵盖与参考核酸具有类似结合性能的含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外指示,特别的核酸序列也默认涵盖其保守修饰的变体和互补序列以及明确指示的序列。
术语“酪氨酸激酶抑制剂”包括充当受体和/或非受体酪氨酸激酶的选择性或非选择性抑制剂的多种治疗剂或药物中的任一种。不受任何特定理论束缚,酪氨酸激酶抑制剂一般通过结合酶的ATP结合位点抑制靶酪氨酸激酶。酪氨酸激酶抑制剂的例子包括但不限于,伊马替尼(STI571),尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼(SU11248),埃罗替尼(OSI-1774),拉帕替尼(GW572016;GW2016),卡奈替尼(CI1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY43-9006),来氟米特(SU101),凡德他尼(ZactimaTM;ZD6474),ponatinib(AP24534),其衍生物,其类似物及其组合。适用于本发明的另外的酪氨酸激酶抑制剂在例如,美国专利号5,618,829,5,639,757,5,728,868,5,804,396,6,100,254,6,127,374,6,245,759,6,306,874,6,313,138,6,316,444,6,329,380,6,344,459,6,420,382,6,479,512,6,498,165,6,544,988,6,562,818,6,586,423,6,586,424,6,740,665,6,794,393,6,875,767,6,927,293和6,958,340中描述。本领域技术人员将知道适用于本发明的其它酪氨酸激酶抑制剂。在某些情况下,以可药用的形式施用酪氨酸激酶抑制剂,所述形式包括但不限于,碱或碱土金属盐,例如铝、钙、锂、镁、钾、钠或锌盐;铵盐,例如叔胺或季铵盐;和酸盐,例如琥珀酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、二盐酸化物、水杨酸盐、半琥珀酸盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、乙酸盐、氨基甲酸盐、硫酸盐、硝酸盐、甲酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、丙酮酸盐、草乙酸盐、延胡索酸盐、丙酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐或苯甲酸盐。
术语“孵育”与“接触”和“暴露”同义地使用,除非另外指示,不暗示任意特定的时间或温度要求。
术语“疗程”包括为减轻或预防与癌症(例如恶性血液病(例如,白血病、淋巴瘤等))相关的一种或多种症状采取的任意治疗方法。术语涵盖施用对改善患有癌症的个体的健康有用的任意化合物、药物、程序和/或方案,并包括本文描述的任意治疗剂。本领域技术人员将理解,基于使用本发明的方法测定的一种或多种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的表达和/或激活水平,可改变(例如,增加或减少)疗程或当前疗程的剂量。
III.实施方案的描述
本发明有利地提供了新装置和方法,所述新装置和方法通过过滤从血样中分离或回收血细胞亚群例如白细胞(例如,正常和/或恶性白细胞)、白血病细胞、泡沫细胞和/或循环肿瘤细胞(CTC),而不改变治疗剂的细胞内浓度,所述治疗剂例如抗癌药(例如,酪氨酸激酶抑制剂,例如,伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼埃罗替尼拉帕替尼(GW-572016;),卡奈替尼(CI 1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY43-9006;),来氟米特(SU101),凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474),ponatinib(AP24534),及其组合)。与现有技术不同,本发明的装置和方法提供了来自回收的细胞例如白细胞、白血病细胞、泡沫细胞和/或循环肿瘤细胞的细胞裂解物,而基本上不稀释治疗剂例如抗癌药(例如,酪氨酸激酶抑制剂)。
在某些情况下,本发明提供了用于从实体瘤的匀浆、裂解物或细胞提取物中分离肿瘤细胞的装置和方法。
在特别的实施方案中,本发明的装置和方法基本上去除了含有能够降解或使靶蛋白(例如目的分析物)去磷酸化的蛋白酶和磷酸酶的血浆,并且基本上去除了可影响靶蛋白测定的干扰蛋白。
图1代表了本发明的分离和收获肿瘤细胞的一个实施方案。本领域技术人员将识别在本发明范围内的对方法的其他改变和修饰。
在方法100中,分离和收获了来自患者,例如患有CML(任选地正在治疗)的患者的肿瘤细胞。如图1中所示,收集全血110并过滤去除红血细胞。在某些情况下,在分离前,能够用抗癌药例如BCR-ABL抑制剂处理或不处理来自患者的全血。有利地,本发明的方法确保在体外维持细胞中存在的抑制剂或治疗剂的体内量和浓度。在某些方面,本发明提供了用于从全血样品制备白细胞裂解物,而基本上不稀释或实质上不稀释治疗剂例如抗癌药的方法。将收集的全血装载至本文描述的装置中。在某些方面,在分离白细胞前新鲜抽取血液。如果不能获得新鲜的血样,能够在抽取后例如3小时,6小时,12小时,18小时,24小时(1天),36小时,48小时等的时间内处理血样。在处理前一般在室温保存样品。在某些方面,可对血样110添加蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂。之后通过例如在管子或小瓶中轻轻地上下颠倒混合血液。
然后,一般由离心通过滤器或膜去除红血细胞121。在某些方面,如本文所示使用特别设计的过滤装置。优选地,在离心后红血细胞存在于收集管中。在一个方面,方法包括离心小瓶或管装置以在滤膜例如堆积的滤膜集合(一层或多层滤器)上捕获或分离白细胞142,并将红血细胞(和血浆)分离在收集管中。
在过滤或离心红血细胞(血浆)后,使用裂解缓冲剂以裂解捕获的白细胞167。在一个方面,稍后可使用蛋白质裂解缓冲剂。在捕获后再裂解白细胞,但在捕获后没有洗涤步骤,这样制备白细胞裂解物。在程序100前和后,白细胞中的疗法浓度是相同的。在一些情况下,疗法浓度在程序100前是10μM,在程序100后是10μM。在其他情况下,疗法浓度在程序100前是1μM,在程序100后是1μM。在其他情况下,疗法浓度在程序100前是0.1μM,在程序100后是0.1μM。然后在第二收集管中收集裂解物173,例如通过离心。来自白细胞的裂解物基本上没有稀释或实质上没有稀释治疗剂例如抗癌药。也就是说,治疗剂(例如,抗癌药)的体内细胞浓度与细胞裂解物中的治疗剂(例如,抗癌药)的体外浓度实质上或基本上相同。
在另一个方面,本发明提供了用于从全血样品制备白细胞(例如,正常、恶性和/或患病的白细胞)的裂解物,而基本上不稀释治疗剂(例如,抗癌药)的方法,所述方法包括:
(a)将全血样品装载至细胞分离(过滤)装置,例如本文描述的装置中;
(b)离心所述装置以在一层或多层堆积的滤膜上捕获白细胞并将红血细胞(和血浆)分离在收集管中;和
(c)用裂解缓冲剂裂解在一层或多层堆积的滤膜上捕获的白细胞,但在步骤(b)和(c)之间没有洗涤步骤,从而制备白细胞裂解物。
在某些实施方案中,本发明的方法还包括在步骤(b)和(c)之间将收集管替换为第二收集管。在某些其他实施方案中,本发明的方法还包括在步骤(c)的裂解白细胞以后离心含有第二收集管的装置并在第二收集管中收集白细胞裂解物。
在一些实施方案中,从接受治疗剂(例如,抗癌药)的对象得到全血样品。在其他实施方案中,在装载至装置中以前,体外孵育全血样品和治疗剂(例如,抗癌药)。
在其他实施方案中,从患有或怀疑患有动脉粥样硬化或接受动脉粥样硬化治疗(例如,他汀类疗法)的对象得到全血样品。在其他实施方案中,从患有或怀疑患有癌症,例如恶性血液病(例如,白血病,例如慢性骨髓性白血病(CML))或接受癌症治疗(例如,抗癌药疗法)的对象得到全血样品。
在特别的实施方案中,在白细胞裂解物中测量至少一种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的表达和/或激活水平。在优选的实施方案中,至少一种致癌融合蛋白是BCR-ABL。本文描述了目的致癌融合蛋白和/或信号转导分子的其他例子。
就本身而言,在一个方面,本发明提供了用于从全血样品中分离和分隔白细胞(例如,正常、恶性和/或患病的白细胞)和红血细胞(和血浆)的装置,所述装置包含:
过滤设备,其包含上室、下室和在上室和下室之间的一层或多层堆积的滤膜,其中所述一层或多层堆积的滤膜能够保留白细胞;和
收集管,其用于从全血样品中收集红血细胞,其中所述过滤设备放置于收集管顶部,且其中在离心后将红血细胞(和血浆)与白细胞分隔并将红血细胞收集在收集管中。
在一些实施方案中,将全血样品装载至过滤设备的上室中。在其他实施方案中,过滤设备包含2、3或4层堆积的滤膜。在某些实施方案中,上室还包含附着于其的按扣盖(snap-cap lid)。
在其他实施方案中,所述装置还包含第二收集管,其中在(首次)离心后将含有红血细胞(和血浆)的(第一)收集管替换为第二收集管。在一些情况下,在向上室添加裂解缓冲剂和(第二次)离心后在第二收集管中收集白细胞裂解物。在特别的情况下,向上室添加裂解缓冲剂而不洗涤一层或多层堆积的滤膜。在一些实施方案中,在离心和在第二收集管中收集以前,在4℃(或在冰上)在滤器上孵育裂解缓冲剂至少1,5,10,15,20,30,60,或120分钟,优选地在约15至约30分钟之间。
在可选的实施方案中,所述装置还包含第二收集管,其中在离心后从过滤设备中移除(例如,用镊子)一层或多层堆积的滤膜并放置于第二收集管中。在一些情况下,第二收集管包含裂解缓冲剂,并且在将一层或多层堆积的滤膜放置于第二收集管中或在第二收集管中孵育后裂解白细胞。
在某些情况下,使用本发明的装置制备的裂解物包含正常和/或恶性(例如,癌性)白细胞的细胞提取物,所述白细胞为例如粒细胞(多形核白细胞),其包括例如,中性粒细胞、嗜碱性细胞和嗜酸性细胞;无颗粒白细胞(单核白细胞),其包括例如,外周血单核细胞例如淋巴细胞和单核细胞,白血病细胞,其包括例如,慢性骨髓性白血病(CML)细胞;巨噬细胞,其包括例如,泡沫细胞;及其混合物。
在某些实施方案中,在与一种或多种目的治疗剂例如一种或多种抗癌药孵育前、孵育期间和/或孵育后,能够在体外用一种或多种生长因子刺激全血样品中存在的白细胞、白血病细胞、泡沫细胞、循环细胞或其他细胞。刺激生长因子包括但不限于,表皮生长因子(EGF),调蛋白(HRG),TGF-α,PIGF,血管生成素(Ang),NRG1,PGF,TNF-α,VEGF,PDGF,IGF,FGF,HGF,细胞因子等等。刺激和裂解在全血中发现的细胞的方案在PCT公开号WO 2008/036802中描述,为了所有目的以其整体引入本文作为参考。
在某些实施方案中,从患有或怀疑患有癌症的对象处得到全血样品。在一些情况下,癌症可能由癌细胞中染色体易位引起的致癌融合蛋白的形成导致。这样的癌症的非限制性例子包括恶性血液病、骨肉瘤、软组织肉瘤及其组合。在特别的实施方案中,恶性血液病是白血病或淋巴瘤。在一个优选的实施方案中,白血病是慢性骨髓性白血病(CML)。在其他情况下,对象接受或未接受抗癌药疗法。
在某些其他实施方案中,抗癌药包含抗信号传递剂(即抑制细胞生长的药物),例如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂;抗增殖剂;化学治疗剂(即细胞毒性药物);激素治疗剂;放射治疗剂;疫苗;和/或能够减少或阻止异常细胞例如癌细胞失控生长的任意其他化合物。在一些实施方案中,用一种或多种抗信号传递剂、抗增殖剂和/或激素治疗剂和至少一种化学治疗剂的组合处理分离的细胞。
抗信号传递剂的例子包括但不限于,单克隆抗体例如曲妥珠单抗阿仑单抗贝伐单抗西妥昔单抗吉妥珠单抗帕尼单抗(VectibixTM),利妥昔单抗和托西莫单抗酪氨酸激酶抑制剂例如伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼埃罗替尼拉帕替尼(GW-572016;),卡奈替尼(CI 1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY 43-9006;),来氟米特(SU101),ponatinib(AP24534)和凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474);及其组合。
抗增殖剂的例子包括mTOR抑制剂例如西罗莫司(雷帕霉素)、替西罗莫司(CCI-779)和依维莫司(RAD001);Akt抑制剂例如1L6-羟甲基-手性-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八基-sn-甘油碳酸酯、9-甲氧基-2-甲基依利醋铵(methylellipticinium acetate)、1,3-二氢-1-(1-((4-(6-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮、10-(4’-(N-二乙基氨基)丁基)-2-氯吩恶嗪、3-甲酰色酮缩氨基硫脲(Cu(II)Cl2复合物)、API-2、源自原癌基因TCL1的氨基酸10-24的15肽(Hiromura等人,J.Biol.Chem.,279:53407-53418(2004)、KP372-1和在Kozikowski等人,J.Am.Chem.Soc.,125:1144-1145(2003)和Kau等人,Cancer Cell,4:463-476(2003)中描述的化合物;及其组合。
化学治疗剂的非限制性例子包括基于铂的药物(例如,奥沙利铂、顺铂、卡铂、螺铂、异丙铂、沙铂等等),烷化剂(例如,环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑、氮芥、乌拉莫司汀、噻替哌、亚硝基脲等等),抗代谢物例如,5-氟尿嘧啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨培美曲塞雷替曲塞等等),植物生物碱(例如,长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、足叶草毒素、紫杉醇多西他赛等等),拓扑异构酶抑制剂(例如,伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷(VP16)、磷酸依托泊苷、替尼泊苷等等),抗肿瘤抗生素(例如,多柔比星、阿霉素、道诺霉素、表柔比星、放线菌素、博来霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等等),其可药用的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物及其组合。
激素治疗剂的例子包括但不限于,芳香化酶抑制剂(例如,氨鲁米特、阿那曲唑来曲唑伏氯唑、依西美坦4-雄甾烯-3,6,17-三酮(6-OXO)、1,4,6-androstatrien-3,17-二酮(ATD)、福美司坦等等),选择性雌激素受体调节物(例如,巴多昔芬、氯米芬、氟维司群、拉索昔芬、雷洛昔芬、它莫西芬、托瑞米芬等等),类固醇(例如,地塞米松),非那雄胺,和促性腺激素释放激素激动剂(GnRH)例如戈舍瑞林,其可药用的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物及其组合。
癌症疫苗的非限制性例子包括来自Active Biotech的ANYARA、来自Northwest Biotherapeutics的DCVax-LB、来自IDMPharma的EP-2101、来自Pharmexa的GV1001、来自IderaPharmaceuticals的IO-2055、来自Introgen Therapeutics的INGN 225和来自Biomira/Merck的Stimuvax。
放射治疗剂的例子包括但不限于,放射性核素例如47Sc,64Cu,67Cu,89Sr,86Y,87Y,90Y,105Rh,111Ag,111In,117mSn,149Pm,153Sm,166Ho,177Lu,186Re,188Re,211At和212Bi,其任选地与针对肿瘤抗原的抗体缀合。
在某些其他实施方案中,从患有或怀疑患有动脉粥样硬化(又称动脉硬化性血管疾病或ASVD)的对象得到全血样品。动脉粥样硬化是一般影响动脉血管的疾病,是动脉壁中的慢性炎性反应,主要由巨噬细胞例如泡沫细胞的累积导致,并且由没有通过功能性高密度脂蛋白(HDL)适当去除巨噬细胞中的脂肪和胆固醇的低密度脂蛋白(携带胆固醇和甘油三酯的血浆蛋白)促进。适于治疗动脉粥样硬化的药物的例子包括但不限于,他汀类药物例如阿托伐他汀(Lipitor和Torvast),氟伐他汀(Lescol),洛伐他汀(Mevacor,Altocor,Altoprev),美伐他汀(Compactin),匹伐他汀(Livalo,Pitava),普伐他汀(Pravachol,Selektine,Lipostat),罗素伐他汀(Crestor),辛伐他汀(Zocor,Lipex),其组合,以及组合制品例如依泽替米贝(ezetimibe)和辛伐他汀(Vytorin),洛伐他汀和烟酸(Advicor),阿托伐他汀和氨氯地平苯磺酸盐(Caduet)和辛伐他汀和烟酸(Simcor)。在一些情况下,对象接受或未接受动脉粥样硬化药物例如他汀类的疗法。
在其他实施方案中,在分离白细胞前,体外孵育全血样品和一种或多种治疗剂例如一种或多种抗癌药。在特别的实施方案中,在滤膜上保留或捕获的白细胞包含正常白细胞、恶性白细胞或其组合。
在特定的实施方案中,本发明的装置提供了通过回收或分离目的细胞例如恶性白细胞(例如,慢性骨髓性白血病(CML)细胞)从全血样品制备裂解物或细胞提取物,而在细胞回收或分离后没有任何洗涤步骤。这样得到的细胞提取物可用于分析一种或多种致癌融合蛋白例如BCR-ABL、其底物、其途径或其组合的表达和/或激活水平。不受任何特定理论束缚,取消在细胞分离后对任意洗涤步骤的需要是有利的,因为能够从血液中回收目的细胞而不改变治疗剂例如抗癌药(例如,酪氨酸激酶抑制剂)的细胞内浓度。如在以下实施例中所述,使用本文描述的装置的没有任何洗涤步骤的细胞分离与在分离后洗涤细胞的本领域已接受的惯例相反,并提供了来自回收的细胞的细胞提取物而基本上不稀释细胞内的治疗剂例如抗癌药(例如,酪氨酸激酶抑制剂例如,等等)。
在特别的实施方案中,本发明的装置与本文描述的装置基本类似或相同。本领域技术人员将理解,考虑到例如待装载至装置中的样品的体积,待用于离心装置的离心机类型,和待添加至装置上室的裂解缓冲剂的体积等参数,能够改变本文描述和说明的装置的一种或多种组件的尺寸。
现在转向图2A-G,如图所示,有用于样品收集的过滤设备或装置。图2A是装置的上部或上室201,其是具有凸出螺脊或线210的圆柱形管。在图2B-C中显示了有盖215的上部。此上部201可任选地具有盖215,所述盖在按扣后避免样品溢出。在某些实施方案中,按扣盖215通过带217拴在上部并可用于在向过滤设备添加样品和/或试剂后牢固地关闭上室的开口。如图2D-E所示,本发明的装置的上室201优选地与下室部分或下室222连接。上部的线210与下部或下室222的凹槽221牢固地吻合。优选地,上室和下室的内径相似以产生允许液体流经过的圆柱形管。
在某些方面,过滤设备或装置的下室222是在一端221具有内部螺纹的圆柱形管(图2E)。在某些方面,在将两室牢固地连接在一起前,在上室和下室的螺线之间放置在一层或多层(例如,多层例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多层)堆积的滤膜。如图2E所示,(一层或多层)滤器放置于下室的针轮225上。
在特别的方面,滤膜能够为2-4(例如,2,3或4)层滤器例如Pall滤器(例如,Leukosorb Medium)。在其他方面,过滤设备是例如在试剂盒中的在使用前连接在一起的分离的室和滤器的组装件。如图2F-G中所示,能够将过滤设备放置于收集管250的顶部,以从患者血样中分离红血细胞(血浆)。图2A,图2D和图2F的部分连接或组装在一起形成本发明的装置过滤设备的一个实施方案。能够将过滤设备(上室和下室)放置于收集容器250的顶部,以从患者血样中分离红血细胞。组装的过滤设备的下室通过开口255放置于收集容器中,并且上室位于收集容器的开口的顶部。收集容器250的例子包括但不限于,管例如具有1ml,2ml,3ml,4ml,5ml,6ml,7ml,8ml,14ml,16ml等容量的塑料培养管。
在某些方面,本发明的过滤设备的下部具有内置或任选的在下部中的漏斗。如图3A-E所示,漏斗可具有特定的角度尺寸以确保样品进入和通过下室进入收集管,而不沿下部的内壁流下。例如,图3A显示了水平向下约2°的内部漏斗301。图3B显示了水平向下约7°的内部漏斗。在某些其他方面,图3C显示了水平向下约12°的漏斗。图3D和图3E是本发明的漏斗设计的其他实施方案。熟练技术人员将理解和领会,漏斗设计能够为使滤液远离下部壁的任意角度。漏斗部分的合适的角度包括1°,2°,3°,4°,5°,6°,7°,8°,9°,10°,11°,12°,13°,14°,15°,16°,17°,18°,19°,20°或更大。在可选的实施方案中,图3E显示了在本发明的过滤设备的下部中的漏斗插入物325。
在某些方面,本发明的过滤设备在图4A-D中显示。图4A显示了上部或上室410,下部或下室420和之间的滤器堆412的分解视图。在图4A中,视图405是往下看设备,视图422是往上看设备。图4B显示了拧在一起的上部430和下室或下部420。在图4B中,视图405是往下看设备,视图425是往上看设备。图4C显示了收集管435。在操作中,在某些方面,收集管435优选地装有红血细胞。在图4C中,视图434是往下看设备,视图440是往上看设备。图4D显示了与上室410和下室或下部420连接的收集管435。在图4D中,视图405是往下看设备,视图461是往上看设备。
在一些实施方案中,在操作中,将一定体积(例如,1ml)的用包含蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂的溶液混合物处理的患者血液装载至组装的细胞分离装置的上室。可在台式离心机或临床离心机例如Allegra 6R离心机(Beckman),Sorvall Legend离心机(Thermo Scientific)或HeraeusMegafuge离心机(Kendro)上离心装置。在一些方面,在4℃以600-2,000rpm离心装置5-30分钟。离心后,从细胞分离装置上去除含有红血细胞(和血浆)的收集容器,加盖并搁置。
在其他实施方案中,将第二收集容器与过滤设备连接。用于细胞裂解物的第二收集管的非限制性例子包括1.5ml和2ml微离心管。没有洗涤步骤,将裂解缓冲剂添加至过滤设备的上室。对上室加盖并剧烈振动过滤设备和第二收集管。在某些情况下,在4℃孵育细胞分离装置至少1,5,10,15,20,30,60,或120分钟,优选地在约15至约30分钟之间。然后能够离心装置(例如,3,000rpm,5分钟)。能够将细胞裂解物转移至另一个离心容器例如微离心管以在-70℃储存。
图5A-D显示了本发明的用于样品收集的过滤设备或装置500的可选实施方案。在此实施方案中,有上部501和底部或室530和套管或中间连接器522。中间连接器或套管522能够任选地固定至上部501或底部530。如图5B所示,在某些方面,上部具有脊或凸出脊,并且能够固定至套管或底部。在图5B中,显示了有盖510的装置。图5C显示底部530能够任选地具有盖534以保持此部分密封。图5D描绘了清楚显示凹槽的下室或下部522。此部分能够任选地固定至底部,使得套管与设备底部成为整体。
图6A-C显示了本发明的另一个方面。图6A是本发明设备的横断面视图,其中底部610与上部625连接,套管633使能够连接。插图图6B是与线625和中间部分633与漏斗部分连接在一起的部分的放大特写。也显示了收集室610。图6C显示了具有针轮几何体的中间部分。滤器堆任选地放置于此针轮上。
在一个其他实施方案中,在离心细胞分离装置和在收集管中收集和搁置红血细胞后,分离(例如拧开)过滤设备的上室和下室。使用镊子将含有分离的白细胞和/或循环肿瘤细胞的滤膜422(图4A)放置于含有细胞裂解缓冲剂的第二收集容器中。第二收集容器的非限制性例子包括1.5ml和2ml微离心管。在一些情况下,在4℃再孵育第二收集容器至少1,5,10,15,20,30,60,或120分钟,优选在约15至约30分钟之间。在其他方面,将第二收集容器放置于冰上并每10分钟短暂涡旋10秒,共30分钟。在一些实施方案中,将细胞裂解物储存在-70℃。在其他实施方案中,离心含有裂解物的容器以去除滤膜和细胞碎片。能够将细胞裂解物的上清转移至另一个管,在-70℃储存。
在一些实施方案中,作为无菌试剂盒提供本发明的装置。在一些情况下,无菌试剂盒包含过滤设备,所述过滤设备包含上室(任选地具有连接的按扣盖)、下室和一层或多层滤膜堆(例如1,2,3,或4层滤膜),和一个或多个收集管(任选地具有按扣盖)。每种组件能够单独包装,并且能够将组装的试剂盒或每种组件放置于无菌包装中。在其他情况下,无菌试剂盒包含管滤器单元和一个或多个收集管(任选地具有按扣盖)。管滤器单元包含在一端附有一层或多层(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多层)滤膜的圆柱形管,其中所述膜能够保留来自全血样品的健康和恶性白细胞和/或循环肿瘤细胞。在特别的情况下,滤膜是(例如,2,3,或4)层滤器,例如PALL滤器(例如,Leukosorb Medium)。在其他情况下,无菌试剂盒包含管滤器单元,塑料接头和一个或多个收集管(任选地具有按扣盖)。接头位于收集管的开口中并与管滤器单元的滤膜牢固地连接。
在其他实施方案中,本发明的装置包含多个过滤设备或管滤器单元和多孔或多管收集容器,例如2孔,12孔,24孔,48孔,或96孔板。在某些情况下,多个过滤设备能够与图4D中描绘的装置中的至少两个或更多基本相似。在某些其他实施方案中,过滤设备阵列能够为多孔板,例如96孔细胞分离板。例如,第一96孔过滤版可配备滤膜(例如,LeukoLOCK(Life Technologies),或Acroprep(PALL)或Leukosorb(PALL))或与其基本相似的膜。在其他实施方案中,第一96孔过滤板与可商购的配备滤膜的多孔板基本相似或为可商购的配备滤膜的多孔板,所述滤膜例如,但不限于,Millipore货号MAMIC8510和货号MSBCS1210。在一些情况下,可商购的多孔板是无菌的并包含配备第一滤膜的第一多孔板和安装在第一多孔板下面并能够用作收集容器的第二多孔板。在这些实施方案中,可将新鲜收集的血液装载至第一96孔细胞分离板的孔中。第一多孔板与上述过滤设备的上室和下室二者类似。第二96孔微板能够充当血液收集板(其与收集管类似)并能够放置于第一多孔板,即具有滤膜的细胞分离板的下面。能够在室温以范围从约600rpm至3,000rpm,例如约600rpm,1,000rpm,2,000rpm和3,000rpm的速度离心此板组装件约5分钟。离心后,能够将滤膜转移至离心管并能够用一定体积的裂解缓冲剂(例如,300μl裂解缓冲剂)处理滤膜上的细胞并短暂涡旋,以裂解细胞。能够将含有细胞裂解物的离心管放置于冰上约30分钟并每隔约10分钟进行短暂涡旋。之后能够将管离心约15分钟以分离细胞碎片和上清。能够收集和分析含有裂解物的上清。在某些方面,使用计算机控制的机器人电枢操纵多个过滤设备。进行高通量样品分析并分析多个样品。任选地用计算机化的机器人系统进行程序100的步骤,例如加入裂解缓冲剂以裂解捕获的白细胞167。在一些方面,以高通量方式进行本文描述的用抗癌药体外处理患者血样和样品分析。
IV.癌症疗法的药物选择和优化
在某些方面,本发明提供了用于在患有恶性血液病的对象中监控癌症疗法的效力的方法。在某些方面,本发明提供了用于选择合适的疗法以下调或关闭一种或多种去调控的信号传递途经的方法。在某些其他方面,本发明提供了用于在患有癌症并接受用于治疗癌症的疗程的对象中优化疗法和/或降低毒性的方法。因此,本发明可用于基于在给定患者的癌或肿瘤中激活的致癌融合蛋白和/或信号转导蛋白的集合提供的特别的分子标记,帮助设计个性化疗法。
因此,在一个特别的方面,本发明提供了用于监控在对象中抗癌药效力的方法,其中所述对象患有恶性血液病,所述方法包括:
(a)对对象施用抗癌药,其中抗癌药的首次施用是在时间T1;
(b)在时间T2分离来自对象的样品中的癌细胞;
(c)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(d)在时间T2测量来自对象的样品中的致癌融合蛋白的激活状态和或表达水平;和
基于致癌融合蛋白的激活状态和或表达水平决定疗程。
在某些实施方案中,方法还包括在T0,即在首次施用抗癌药前,测量致癌融合蛋白的激活状态。在一些情况下,致癌融合蛋白是BCR-ABL。在某些情况下,恶性血液病是淋巴瘤或白血病例如慢性骨髓性白血病(CML)。在T1和T2之间的时间差为约1周至约6个月,例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,或24周。T0和T1之间的时间差为约1天至约3周。在某些其他方面,方法还包括测量至少另一种信号转导分子例如CRKL,AKT,STAT5和SRC的表达或激活水平。
在某些方面,疗程选自改变抗癌药剂量,改变抗癌药,包括另外的抗癌药,改变治疗时间和维持现有疗程。
在某些方面,样品包含分离的细胞的提取物。在某些方面,在T0(开始治疗前),用至少一种抗癌药(例如,2种抗癌药)体外孵育分离的细胞。在其他情况下,在T2,在决定疗程前,用至少2种抗癌药体外孵育分离的细胞。
在其他实施方案中,本发明提供了用于选择在患有恶性血液病的对象中的抗癌药的方法:
(a)分离来自对象的癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)测量来自对象的样品的分离的细胞中的致癌融合蛋白的激活状态水平;
(d)在开始治疗前用至少一种抗癌药孵育分离的细胞;
(e)裂解在开始治疗前用至少一种抗癌药孵育的分离的细胞以产生细胞提取物;
(f)测量经孵育的细胞中的致癌融合蛋白的激活状态水平;和
(g)基于致癌融合蛋白的激活状态水平选择疗程。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于选择在患有恶性血液病的对象中的抗癌药的方法:
(a)分离来自对象的癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)测量来自对象的样品的分离的细胞中的BCR-ABL的激活状态水平;
(d)在开始治疗前用至少一种抗癌药孵育分离的细胞;
(e)裂解在开始治疗前用至少一种抗癌药孵育的分离的细胞以产生细胞提取物;
(f)测量经孵育的细胞中的BCR-ABL的激活状态水平;和
(g)基于BCR-ABL的激活状态水平选择疗程。
在某些方面,疗程选自选择抗癌药,选择抗癌剂量和决定治疗长度。在某些其他方面,方法还包括测量至少另一种信号转导分子例如CRKL,AKT,STAT5和SRC的表达或激活水平。
在另一个方面,本发明提供了用于在患有癌症并接受用于治疗癌症的疗程的对象中优化治疗和/或降低毒性的方法,所述方法包括:
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)使用本文描述的测定法测量细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或激活(例如,磷酸化)水平;和
(d)比较测量的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平和在疗程期间的较早时间测量的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平;和
(e)基于步骤(d)的比较决定用于对象的疗程的随后剂量或是否应对对象施用不同的疗程。
在特别的实施方案中,根据本发明的基于抗体的测定法测量细胞提取物中的总的和激活的(例如,磷酸化的)致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)水平,并且能够计算激活的比总的致癌融合蛋白水平的比例(例如,磷酸/总BCR-ABL蛋白水平的比例)并用于评估用于对象的疗程,例如,通过比较磷酸/总致癌融合蛋白水平的比例和在较早时间(例如,在接受抗癌药疗法时的较早时间或在抗癌药疗法前的时点)对对象相同计算的比例。
在另一个方面,本发明提供了选择合适的用于治疗癌症的抗癌药的方法,所述方法包括:
(a)在施用抗癌药后,或在用抗癌药孵育前分离癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)使用本文描述的测定法确定细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或激活(例如,磷酸化)的水平;和
(d)通过比较检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平和不存在抗癌药时产生的参考表达和/或激活谱,决定抗癌药是否适于或不适于治疗癌症。
在优选的实施方案中,选择用于治疗癌症的合适的抗癌药的方法包括:
(a)在施用抗癌药后,或在用抗癌药孵育前分离癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞裂解物;
(c)使用包含致癌融合蛋白特异性的捕获抗体的稀释系列的测定法测定细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或激活(例如,磷酸化)水平,其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上;
(d)比较检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平和不存在抗癌药时产生的参考表达和/或激活谱;和
(e)当检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平相比参考表达和/或激活谱改变(例如,基本上降低)时,指示抗癌药适于治疗癌症。
在一些实施方案中,本发明的方法可用于帮助或辅助选择用于治疗癌症,例如,恶性血液病的合适的抗癌药。在其他实施方案中,本发明的方法可用于改进用于治疗癌症,例如,恶性血液病的合适的抗癌药的选择。在某些实施方案中,方法还包括或可选地包括下述步骤,即当检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平相比参考表达和/或激活谱未改变(例如,未基本上降低)时,指示抗癌药不适于治疗癌症。在其他实施方案中,除了一种或多种致癌融合蛋白外,检测在细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子,并基于此“分子谱”决定抗癌药是合适的或不合适的。
在另一个方面,本发明提供了用于鉴定癌症对使用抗癌药治疗的响应的方法,所述方法包括:
(a)在施用抗癌药后,或在用抗癌药孵育前分离癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)使用本文描述的测定法测定细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或激活(例如,磷酸化)水平;和
(d)通过比较检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平和不存在抗癌药时产生的参考表达和/或激活谱,鉴定癌症为响应或不响应使用抗癌药的治疗。
在优选的实施方案中,用于鉴定癌症对使用抗癌药的治疗的响应的方法包括:
(a)在施用抗癌药后,或在用抗癌药孵育前分离癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)使用包含致癌融合蛋白的捕获抗体特异性的稀释系列的测定法测定细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或激活(例如,磷酸化)水平,其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上;
(d)比较检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平和不存在抗癌药时产生的参考表达和/或激活谱;和
(e)当检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平相比参考表达和/或激活谱改变(例如,基本上降低)时,指示癌症响应使用抗癌药的治疗。
在一些实施方案中,本发明的方法可用于帮助或辅助鉴定癌症,例如,恶性血液病对使用抗癌药的治疗的响应。在其他实施方案中,本发明的方法可用于改进癌症,例如,恶性血液病对使用抗癌药的治疗的响应的鉴定。在某些实施方案中,方法还包括或可选地包括下述步骤,即当检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平相比参考表达和/或激活谱未改变(例如,未基本上降低)时,指示癌症不响应使用抗癌药的治疗。在其他实施方案中,除了一种或多种致癌融合蛋白外,检测在细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子,并基于此“分子谱”鉴定癌症响应或不响应治疗。
仍然在另一个方面,本发明提供了用于预测患有癌症的对象对使用抗癌药的治疗的响应的方法,所述方法包括:
(a)在施用抗癌药后,或在用抗癌药孵育前分离癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)使用本文描述的测定法测定细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或激活(例如,磷酸化)水平;和
(d)通过比较检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平和不存在抗癌药时产生的参考表达和/或激活谱,预测对象将响应使用抗癌药的治疗的可能性。
在优选的实施方案中,用于预测患有癌症的对象对使用抗癌药的治疗的响应的方法包括:
(a)在施用抗癌药后,或在用抗癌药孵育前分离癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)使用包含致癌融合蛋白特异性的捕获抗体的稀释系列的测定法测定细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或激活(例如,磷酸化)水平,其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上;
(d)比较检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平和不存在抗癌药时产生的参考表达和/或激活谱;和
(e)当检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平相比参考表达和/或激活谱改变(例如,基本上降低)时,指示对象将可能响应使用抗癌药的治疗。
在一些实施方案中,本发明的方法可用于帮助或辅助预测对象响应癌症,例如恶性血液病的使用抗癌药的治疗的可能性。在其他实施方案中,本发明的方法可用于改进对象响应癌症,例如恶性血液病的使用抗癌药的治疗的可能性的预测。在某些实施方案中,方法还包括或可选地包括下述步骤,即当检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平相比参考表达和/或激活谱未改变(例如,未基本上降低)时,指示对象可能不响应使用抗癌药的治疗。在其他实施方案中,除了一种或多种致癌融合蛋白外,检测在细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子,基于此“分子谱”预测对象对治疗响应的可能性。
在另一个方面,本发明提供了用于测定患有癌症的对象是否抵抗使用抗癌药的治疗的方法,所述方法包括:
(a)在施用抗癌药后,或在用抗癌药孵育前分离癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)使用本文描述的测定法测定细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或激活(例如,磷酸化)水平;和
(d)通过比较检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平和不存在抗癌药或在存在抗癌药较早时间时产生的参考表达和/或激活谱,测定对象是否对抗癌药治疗抵抗或敏感。
在优选的实施方案中,用于测定患有癌症的对象是否抵抗抗癌药治疗的方法包括:
(a)在施用抗癌药后,或在用抗癌药孵育前分离癌细胞;
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物;
(c)使用包含致癌融合蛋白的捕获抗体特异性的稀释系列的测定法测定细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或激活(例如,磷酸化)水平,其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上;
(d)比较检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平和不存在抗癌药或在存在抗癌药较早时间时产生的参考表达和/或激活谱;和
(e)当检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平相比参考表达和/或激活谱未改变(例如,未基本上降低)时,指示对象对使用抗癌药的治疗抵抗。
在一些实施方案中,本发明的方法可用于帮助或辅助鉴定对使用抗癌药的治疗抵抗的患有癌症的对象,或帮助或辅助测定患有癌症的对象是否对抗癌药治疗抵抗,其中所述对象患有癌症,例如恶性血液病。在其他实施方案中,本发明的方法可用于改进对使用抗癌药的治疗抵抗的患有癌症的对象的鉴定,或改进患有癌症的对象是否对使用抗癌药的治疗抵抗的测定,其中所述对象患有癌症,例如恶性血液病。
在某些实施方案中,方法还包括或可选地包括下述步骤,即当检测的致癌融合蛋白的表达和/或激活水平相比参考表达和/或激活谱改变(例如,基本上降低)时,指示对象对使用抗癌药的治疗敏感。患有癌症的对象为何对使用抗癌药的治疗抵抗的原因的非限制性例子包括,在目的致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)中存在一种或多种突变,不依从治疗方案和/或施用次优药物剂量。在抗癌药的次优药物剂量方面,方法还能够包括增加对对象施用的抗癌药的下次剂量或随后的剂量的步骤。在其他实施方案中,除了一种或多种致癌融合蛋白外,检测在细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子,并基于此“分子谱”鉴定对象对治疗抵抗或敏感。
V.致癌融合蛋白
在特定的实施方案中,能够对使用本发明的装置和方法制备的细胞裂解物进行一种或多种致癌融合蛋白的单独的表达/激活制谱,或与其底物和/或其他信号转导途径蛋白的表达/激活制谱的组合,例如,以测定酪氨酸激酶抑制剂疗法对需要其的患者(例如,患有BCR-ABL介导的疾病例如慢性骨髓性白血病的患者)的效力。在通过本发明的装置和方法制备的细胞裂解物中有利地检查致癌融合蛋白和其他分析物,而不改变酪氨酸激酶抑制剂的细胞内浓度。
在某些实施方案中,导致致癌融合蛋白及其相关肿瘤形成的人肿瘤中的易位包括但不限于下述项:
慢性骨髓性白血病(CML):费城染色体是导致BCR/ABL(激酶)的易位。
急性成淋巴细胞白血病(ALL):嵌合致癌蛋白包括:
细胞遗传学易位 | 分子遗传学异常 | % |
cryptic t(12;21) | TEL/AML1(激酶) | 25.4% |
t(1;19)(q23;p13) | E2A/PBX(PBX1) | 4.8% |
t(9;22)(q34;q11) | BCR/ABL融合蛋白(P185) | 1.6% |
t(4;11)(q21;q23) | MLL/AF4融合蛋白 | 1.6% |
t(8;14)(q24;q32) | IGH/MYC融合蛋白 | |
t(11;14)(p13;q11) | TCR/RBTN2融合蛋白 |
伯基特氏淋巴瘤:c-myc基因易位t(8;14)(q24;q32)。最常见的嵌合癌蛋白是c-myc/IGH。
AML:染色体8的一部分易位至染色体21。得到的嵌合癌蛋白是RUNX1/ETO。另一种易位t(12;15)(p13;q25)导致TEL/TrkC(激酶)嵌合癌蛋白。
尤文肉瘤:染色体11和22之间的易位。得到的嵌合癌蛋白是EWS/FLI(转录因子)。
DFSP:超过95%的DFSP肿瘤具有染色体易位t(17;22),这导致嵌合癌蛋白COL1A1/PDGF(结合并激活PDGFR)。
急性早幼粒细胞白血病:名为t(15;17)(q22;q12)的易位。得到的嵌合癌蛋白是RARα/PML(转录复合体蛋白)。
祖B细胞急性成淋巴细胞白血病:易位t(17;19),这导致嵌合癌蛋白E2A/HLF(凋亡抑制剂)。
急性前体B细胞白血病:易位t(1;19)。嵌合癌蛋白是E2A/Pbx1(激酶底物)。
横纹肌肉瘤:t(2:13)(q35;q14)的易位,这导致嵌合癌蛋白PAX3/FKHR(转录因子)。
非常年幼儿童的软组织恶性肿瘤:t(12;15)(p13;q25)重排,这导致以下嵌合癌蛋白:蛋白酪氨酸激酶ETV6/NTRK3(激酶)。
甲状腺乳头状癌:嵌合癌蛋白是RET/PTC(激酶)。
前列腺癌:嵌合癌蛋白是TMRSS/ERG(激酶)。
导致致癌融合蛋白及其相关肿瘤形成的人肿瘤中的易位的其他例子:
改写自G.M.Cooper,Oncogenes,第2版.Boston and London:Jones andBartlett,1995.
VI.实施例
提供以下实施例以说明,但不是限制要求保护的发明。
实施例1.示例性细胞分离装置
此实施例描述了使用过滤法从患者全血中分离白细胞的示例性细胞分离装置。本发明的细胞分离装置的实施方案和方面在图2-6中显示。
本发明的细胞分离装置用于分离全血中存在的红血细胞和其他细胞。特别地,将全血中存在的白细胞和/或循环肿瘤细胞与大量红血细胞和血浆分离开。本发明的细胞分离装置包含过滤设备和收集容器。过滤设备是包含上室、下室和在上室和下室之间的一层或多层(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多层)堆积的滤膜的组装件。上室和下室能够由例如,但不限于,聚丙烯和聚苯乙烯的材料制造。在某些实施方案中,滤膜具有8μm的孔大小和355.6-558.8μm的厚度,并具有70-80%的白细胞保留率。滤膜的非限制性例子包括White Blood Cell Isolation(Leukosorb)Medium(PALL货号BSP0669)。
一般将用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂处理的1ml患者血液装载至细胞分离装置的上室中。在台式离心机例如Allegra 6R离心机(Beckman),Sorvall Legend离心机(Thermo Scientific),或HeraeusMegafuge离心机(Kendro)中在4℃以600-2000rpm(例如,800rpm)离心单元5-30分钟。在某些情况下,从细胞分离装置移除含有红血细胞的第一收集容器并连接第二收集容器。没有洗涤步骤,将200μl-1ml裂解缓冲剂加至过滤设备的上室中。将上室加盖,并在4℃剧烈振动过滤设备和第二收集容器15-30分钟。将过滤设备和第二收集容器放置于离心机中并以约3,000rpm离心约5分钟。能够将细胞裂解物转移至另一个容器中以在-70℃储存。
在其他情况下,从细胞分离装置移取含有红血细胞的第一收集容器并拆卸含有滤膜的过滤设备。拧开上室和下室以将其分离。使用镊子将含有分离的白细胞的滤膜放置于含有裂解缓冲剂的第二收集容器中。第二收集容器的非限制性例子包括1.5ml和2ml微离心管。在一些情况下,在4℃再孵育第二收集容器至少1,5,10,15,20,30,60,或120分钟,优选地在约15至约30分钟之间。在其他情况下,将第二收集容器放置于冰上并每10分钟短暂涡旋10秒,共30分钟。在一些实施方案中,将细胞裂解物储存于-70℃。在其他实施方案中,离心含有裂解物的容器以去除滤膜和细胞碎片。将细胞裂解物的上清转移至另一个管中以在-70℃储存。
在另一个实施方案中,细胞分离装置包含管滤器单元和收集容器(图26)。管滤器部件包含一端附加一层或多层(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多层)滤膜的圆柱形管,其中所述膜能够保留全血样品中的健康和恶性白细胞和/或循环肿瘤细胞。在特别的情况下,滤膜是(例如,2,3,或4)层滤器例如PALL滤器(例如,Leukosorb Medium)。在某些情况下,每个滤器具有8μm的孔径和355.6-558.8μm的厚度,并具有70-80%的白细胞保留率。在某些情况下,管滤器单元通过塑料接头的方式与收集容器连接。管滤器单元的滤膜与位于收集管开口的接头牢固地连接。收集容器的例子包括但不限于,3ml,5ml,8ml,14ml和16ml塑料培养管。在某些实施方案中,将用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂处理的1ml患者全血装载至细胞分离装置的管滤器单元顶部。在台式离心机例如Allegra 6R离心机(Beckman),Sorvall Legend离心机(Thermo Scientific),或HeraeusMegafuge离心机(Kendro)中在4℃以600-2000rpm(例如,800rpm)离心装置5-30分钟。在某些情况下,从细胞分离装置移除含有红血细胞的收集管并连接新的收集管。没有洗涤步骤,将200μl-1ml裂解缓冲剂加至细胞分离装置的管滤器单元的开口。将装置密封或加盖,然后在4℃剧烈振动15-30分钟。将细胞分离装置在台式离心机中以约3,000rpm离心和旋转约5分钟。然后能够将细胞裂解物从收集容器转移至另一个容器中以在-70℃储存。
在另一个实施方案中,本发明的细胞分离装置包含多个过滤设备或管滤器单元和多孔或多管收集容器。上述过滤设备和管滤器单元能够与多种规格的板,例如12孔,24孔,48孔,或96孔板的孔连接。
实施例2.使用细胞分离装置通过过滤法从CML患者血液分离肿瘤细胞的流程
此实施例详细说明了使用本发明的方法分离和收获个体患者全血中的CML肿瘤细胞的方案。在分离前能够用BCR-ABL抑制剂体外处理或不处理来自患者的全血。
新鲜抽取的血样用于分离肿瘤细胞是最好的。如果得不到新鲜样品,能够在抽取后1-3天内处理血样。在抽取当天,将在EDTA(BectonDickenson货号366643,EDTA(K2)无菌管)中收集的样品送出处理。在处理前必须在室温存放样品。此时避免冷藏或冷冻样品是很重要的。
用蛋白酶和磷酸酶抑制剂处理在EDTA管(BD #366643)中接受的血样。通过缓慢颠倒4-6次轻轻混合血液管,然后每1mL血液加入0.05mL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。在流程中此时,通过继续进行标题为“肿瘤细胞和白细胞的分离和裂解”的此实施例章节,能够从血样中分离肿瘤细胞和白细胞。任选地,能够在继续进行该章节前用药物处理血样。
患者血样的药物处理
在将药物加入血样前,在Hank平衡盐溶液(HBSS)中稀释药物例如BCR-ABL抑制剂。将1.0mL患者血样放置于培养管中。对患者血液的每份等分试样加入期望的药物浓度。例如,对管加入对应于10μM,1μM或0.1μM的药物浓度的10μl,1μl或0.1μl。能够使用在单独的管中的1毫升(1ml)未处理的血液作为对照。然后在CO2培养箱中在37℃孵育管4小时。之后,能够根据下一章节的程序进一步处理经药物处理的样品以分离和裂解样品中的肿瘤细胞和白细胞。
肿瘤细胞和白细胞的分离和裂解
通过缓慢颠倒管4-6次轻轻混合待加入至过滤设备的血样。使用1ml移液器将1mL血样装载至嵌入收集管中的过滤设备的上室。在装载了样品后,扣上过滤设备。将细胞分离装置置于Allegra 6R离心机中并在4℃以1,000rpm离心15分钟。离心后,从离心机中移除细胞分离装置。从过滤单元中移除含有红血细胞的第一收集管并替换为第二个干净的收集管。为了安全对含有血液的第一收集管的加盖并存放在室温供随后使用。
将200μL裂解缓冲剂(在冰上保存)加至含有具有白细胞的膜的过滤设备的上室,然后扣紧单元。将细胞分离装置置于维持在4℃的振动(旋转)平台上。振动平台与细胞分离装置一起经历3个循环,每个循环包括振动2分钟,然后静置5分钟。接下来,在4℃以2,000rpm离心细胞分离装置10分钟。用1mL移液器将位于第二收集管中的细胞裂解物转移至2mL离心管用于CEER测定,例如BCR-ABL测定和其他途径标记物测定。任选地,将细胞裂解物储存在-70℃。
实施例3.通过过滤法从全血中分离和收获白细胞而不稀释抗癌药
本实施例说明了使用过滤法从患者全血中分离和裂解白细胞的方案。除了正常、健康的白细胞,能够从全血中分离恶性白细胞,例如慢性骨髓性白血病(CML)肿瘤细胞,而不稀释药物浓度和不干扰污染的红血细胞的量。在某些实施方案中,在分离前能够用一种或多种酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼埃罗替尼拉帕替尼(GW-572016;),卡奈替尼(CI1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY43-9006;),来氟米特(SU101),凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474),ponatinib(AP24534),及其组合)体外处理或不处理来自患者的全血。慢性骨髓性白血病是白细胞癌。其是白血病的一种形式,特征为骨髓中显著的髓细胞的提高和失控的生长和这些细胞在血液中的累积。因此,通过从血液中的大量红血细胞和血浆中提取肿瘤细胞连同白细胞测定患者中CML肿瘤的致癌标记物水平对诊断和预后评估变得至关重要。此实施例描述了能够从患者血液中回收白细胞和/或循环肿瘤细胞,而不稀释抗癌药的过滤法。
一般将患者血液抽取至含有EDTA或其他抗凝血剂的血液收集管中,并通过颠倒轻轻混合。将血样室温储存并在24-72小时内处理,并一般不经冷藏或冷冻。通过轻轻地上下颠倒混合含有全血的管,并用包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的溶液混合物处理。溶液混合物能够包含原钒酸钠(200mM,终浓度为2mM),Sigma蛋白酶抑制剂(50x;终浓度为1x)和Halt磷酸酶抑制剂(100x;终浓度为2x)并与患者的血样混合。蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的例子包括但不限于,Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Therma Scientific);完全的ULTRA和PhosSTOP(Roche AppliedScience);蛋白酶抑制剂组(EMD Chemicals);和磷酸酶抑制剂混合物组I-IV(EMD Chemicals)。
使用细胞分离装置分离患者血样中的红血细胞和其他细胞,例如白细胞和/或循环肿瘤细胞。细胞分离装置包含上述过滤设备和收集容器。在某些方面,通过在过滤设备的上室和下室之间插入一层或多层(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多层)白细胞保留滤膜组装过滤设备。滤膜能够具有8μm的孔径,355.6-558.8μm的厚度和70-80%的白细胞保留率。滤膜的非限制性例子包括White Blood CellIsolation(Leukosorb)Medium(PALL货号BSP0669)。将组装的过滤设备放置于收集容器的顶部。在装载血样前打开细胞分离装置的盖子。收集容器的例子包括但不限于,管例如具有3ml,5ml,8ml,14ml,或16ml容量的塑料培养管。
从患者血样中分离和裂解白细胞和/或循环肿瘤细胞的示例方法包括以下步骤。通过颠倒轻轻混合用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂预处理的1ml血样。接下来,将1ml血样装载至如上述组装的细胞分离装置的上室中。将细胞分离装置置于临床或台式离心机,例如Allegra 6R离心机(Beckman),Sorvall Legend离心机(Thermo Scientific),或HeraeusMegafuge离心机(Kendro)中。一般在4℃以600-2,000rpm(例如,800rpm)离心细胞5-30分钟。在离心时能够使用接头以确保细胞分离装置进入离心机转子。离心后从离心机中移除细胞分离装置,并分离过滤设备和含有已经通过过滤设备的红血细胞的收集容器。为了生物安全性可将具有红血细胞的收集容器加盖并搁置。
在某些实施方案中,将新的收集容器,例如但不限于,另一个收集管或微离心管置于过滤设备下面。没有加入洗涤步骤,将200μl-1ml裂解缓冲剂加至过滤设备的上室。将上室加盖并在4℃剧烈振动过滤设备和新的收集容器15-30分钟。将过滤设备和新的收集容器置于离心机例如微离心机中并以约3,000rpm离心约5分钟。能够将细胞裂解物转移至另一个离心容器例如微离心管中以在-70℃储存。
在另一个实施方案中,在从离心机中移除细胞分离装置并且分离过滤设备和含有红血细胞的收集管后,分离在过滤设备的上室和下室之间的一层或多层滤膜。分开上室和下室(例如,拧开),并使用镊子分离滤膜。将膜置于新的收集容器,例如含有1ml细胞裂解缓冲剂的1.5ml或2.0ml微离心管。为了裂解滤膜上的细胞,立即涡旋新的收集容器。然后将容器置于冰上并每10分钟短暂涡旋10秒,共30分钟。然后将细胞裂解物转移至另一个容器,例如1.5ml或2.0ml微离心管中并储存在-70℃。
实施例4.使用96孔细胞分离装置通过过滤法分离细胞
此实施例证明了使用过滤法或过滤法和磁珠捕获的组合,从样品例如全血、血清、血浆、尿、痰、支气管灌洗液、眼泪、乳头抽吸物、淋巴、唾液和/或细针抽吸物(FNA)中回收分离细胞,其中所述分离细胞能够用于本发明中检测一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)和/或信号转导分子(例如,EGFR,HER-2,HER-3,HER-4,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,PDGFR,c-Met,c-KIT,IGF-IR,SHC,PI3K,等等)的激活状态和/或总量。特别地,此实施例证明了使用单独的过滤法或在用抗CD45抗体的磁珠捕获后使用过滤法从掺有K562细胞的血液中回收K562细胞(即,来自人慢性骨髓性白血病细胞系的细胞),随后制备K562细胞裂解物并测定一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL),其底物,其途径或其组合的表达和/或激活状态。此实施例也证明了使用过滤法,或在用抗CD45抗体的磁珠捕获前使用过滤法从患者血样中回收血细胞亚群(即白细胞),随后制备细胞裂解物并测定一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL),其底物,其途径或其组合的表达和/或激活状态。通过取消在患者样品收集和细胞分离后对任意洗涤步骤的需要,本文描述的方法是有利的,因为能够从血液中回收目的细胞而不改变抗癌药,例如酪氨酸激酶抑制剂的细胞内浓度。与本领域现有技术相反,在此实施例中描述的方法提供了来自回收的细胞的细胞裂解物,而基本上不稀释抗癌药,例如酪氨酸激酶抑制剂(例如,等等)。
能够准备96孔细胞分离板用于从新鲜收集的血液中分离白细胞和/或K562细胞。首先,能够去除96孔过滤板原来的膜并替换为滤膜(例如,LeukoLOCK(Life Technologies),Acroprep(PALL)和Leukosorb(PALL))。在这些实施方案中,可将掺有或未掺有K562细胞的新鲜收集的血液装载至96孔细胞分离板的孔中。第二96孔微板能够充当血液废弃物收集板并应置于具有滤膜的细胞分离板的下面。在室温以范围从约600rpm至3,000rpm的速度,例如,约600rpm,1,000rpm,2,000rpm和3,000rpm的速度离心板组装件约5分钟。离心后,能够将滤膜转移至离心管中并用一定体积的裂解缓冲剂(例如,300μl裂解缓冲剂)处理滤膜上的细胞并立即短暂涡旋以裂解细胞。能够将含有细胞裂解物的离心管置于冰上约30分钟,并大约每10分钟短暂涡旋一次。能够将管离心约15分钟以从上清中分离细胞碎片。能够收集含有裂解物的上清并通过微阵列(例如临近介导的免疫测定)分析,以检测致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)和/或信号转导分子(例如,EGFR,HER-2,HER-3,HER-4,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,PDGFR,c-Met,c-KIT,IGF-IR,SHC,PI3K,等等)。
在通过用抗CD45抗体的磁珠捕获最初处理后,可对掺有或未掺有K562细胞的新鲜收集的血液进行过滤法用于本文描述的细胞分离。能够用与抗CD45抗体偶联的洗过的磁珠(例如,CD45 Dynal珠(Invitrogen))孵育掺有或未掺有K562细胞的新鲜收集的血液。能够根据制造商的说明书制备洗涤过的磁珠。例如,程序可包括以下步骤:1)将100μl与抗CD45抗体偶联的磁珠转移至1.5ml离心管中;2)加入1ml缓冲剂并轻轻混合;3)将离心管置于磁铁上1分钟;4)去除上清;和5)从磁铁上移除管并在100μl缓冲剂中重悬磁珠。在特别的情况下,能够将100μl洗过的珠添加入每个掺有K562的血样。然后能够在4℃的冷室中或在室温在转子上孵育样品约20分钟至2小时。孵育时间可为,例如,至少20分钟、30分钟、1小时、1.5小时或2小时。接下来能够将样品置于磁铁(例如,DynaMag磁铁)上。能够收集上清并装载至96孔细胞分离板的孔中。能够如上所述进行通过过滤的细胞分离方法。
能够通过本文描述的过滤法从新鲜收集的CML患者血样中分离血细胞亚群(例如,白细胞)。在特别的情况下,能够从服用酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼埃罗替尼拉帕替尼(GW-572016;),卡奈替尼(CI1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY43-9006;),来氟米特(SU101),凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474),及其组合)的CML患者收集血样。本发明的优势在于,不需要另外洗涤或处理来自患者的血样,包括来自接受酪氨酸激酶抑制剂疗法的患者的血样。与上述类似地,能够通过去除96孔过滤板原来的膜并将其替换为能够捕获目的血细胞(例如白细胞)的滤膜(例如,LeukoLOCK(LifeTechnologies)或Acroprep(PALL))准备96孔细胞分离板。能够将从CML患者处新鲜收集的血液装载至96孔细胞分离板的孔中,并且能够将第二96孔微板置于具有滤膜的细胞分离板的下面。能够在室温以范围从约600rpm至3,000rpm的速度,例如,约600rpm,1,000rpm,2,000rpm和3,000rpm的速度离心板组装件约5分钟。离心后,能够将滤膜转移至离心管。为了裂解细胞,能够将约300μl裂解缓冲剂加入管,然后能够短暂涡旋管。能够将含有细胞裂解物的管置于冰上约30分钟,并大约每10分钟短暂涡旋一次。能够离心管约15分钟以分开细胞碎片和上清。能够收集含有裂解物的上清并通过微阵列测定例如本文描述的临近介导的免疫测定分析所述上清。
在用于本文描述的细胞分离的过滤法前,能够通过用抗CD45抗体的磁珠捕获最初处理从CML患者处新鲜收集的血液。在某些实施方案中,能够用从CML患者处收集的血液孵育洗过的与抗CD45抗体偶联的磁珠(例如,CD45 Dynal珠(Invitrogen))。能够根据制造商的说明书制备洗过的磁珠。例如,程序可包括以下步骤:1)将100μl与抗CD45抗体偶联的磁珠转移至1.5ml离心管中;2)加入1ml缓冲剂并轻轻混合;3)将离心管置于磁铁上1分钟;4)去除上清;和5)从磁铁上移除管并在100μl缓冲剂中重悬磁珠。在特别的情况下,能够将100μl洗过的珠添加入每个掺有K562的血样。然后能够在4℃的冷室中或在室温在转子上孵育样品约20分钟至2小时。孵育时间可为,例如,至少20分钟、30分钟、1小时、1.5小时或2小时。接下来能够将样品置于磁铁上。能够收集上清并装载至96孔细胞分离板的孔中。能够如上所述进行通过过滤的细胞分离方法。
图7说明了能够在从K562细胞制备的细胞裂解物中检测和测量总BCR-ABL和磷酸化的BCR-ABL所述K562细胞是通过使用本发明的白细胞过滤法从掺有K562细胞的血样中分离的。图7A显示在过滤后的细胞中的总BCR-ABL水平与在未过滤样品中观察到的水平类似。另外,图7B显示在过滤后的K562细胞中的磷酸化的BCR-ABL的水平与在未处理的细胞中检测到的水平是可比较的。
图8A-B说明了在细胞裂解物中检测和测量了总BCR-ABL和磷酸化的BCR-ABL水平,其中所述细胞裂解物从掺有K562细胞的血样制备,过滤通过滤膜,并通过微阵列(例如临近测定)分析,所述临近测定例如在2010年7月15日申请的PCT申请号PCT/US2010/042182和美国专利公开号20080261829,20090035792和20100167945中描述的协同临近免疫测定(COPIA),将其公开内容以其整体引入本文作为参考用于所有目的。特别地,在BCR-ABL CEER测定中使用通过本文描述的方法分离的5,000个细胞。比较了在以不同速度离心的不同样品中的总BCR-ABL和磷酸化的BCR-ABL的百分比回收。图8A显示在进行了包括具有PALL滤膜的过滤装置和600rpm速度的离心步骤的本发明的细胞分离方法后,在分离的K562细胞中得到141.55%回收的总BCR-ABL信号。相比之下,当细胞分离方法包括LeukoLock滤膜和600rpm速度的离心步骤时,总BCR-ABL信号回收为128.88%。当离心速度提高到1,000rpm时,百分比回收明显降低至62.71%。图8B显示了在下述细胞中的磷酸化的BCR-ABL信号的百分比回收,所述细胞是通过使用本发明的方法从1ml掺有K562细胞的血样中分离的。在下述K562细胞中检测到63.60%的磷酸化的BCR-ABL信号,所述K562细胞是使用包括用PALL滤膜分离细胞和以600rpm离心过滤装置的过滤法分离的。在下述K562细胞中检测到59.64%的磷酸化的BCR-ABL信号,所述K562细胞是使用包括用LeukoLOCK滤膜分离细胞和以1,000rpm离心过滤装置的过滤法分离的。当离心速度降低到600rpm时,使用LeukoLock膜的百分比回收降低至57.89%。
图9A说明了在细胞裂解物中检测和测量了磷酸化的BCR-ABL水平,所述细胞裂解物从掺有不同量的K562细胞的血样制备,过滤通过滤膜,并通过微阵列(例如本文描述的临近介导的免疫测定)分析。本发明的方法用于检测掺有K562细胞的样品中的磷酸-BCR-ABL水平。特别地,测量的磷酸化的BCR-ABL水平与加入血样中的K562细胞的数量有关。磷酸化BCR-ABL信号的百分比回收在掺有300,000个K562细胞的样品中为123.32%,在掺有100,000个K562细胞的样品中为75.21%,在掺有30,000个K562细胞的样品中为63.16%,而在掺有10,000个K562细胞的样品中为159.12%。
图9B说明了当在血液中掺有细胞时,在过滤后回收的K562细胞中的BCR-ABL信号。在掺有100,000个K562细胞的样品中,磷酸化的BCR-ABL信号的百分比回收为63.60%,总BCR-ABL信号的百分比回收为108.61%。
实施例5.使用96孔细胞分离装置通过过滤法从CML患者分离肿瘤细胞的方案
此实施例说明了使用过滤法从患者全血中分离和收获慢性骨髓性白血病(CML)肿瘤细胞的方案。在优选的实施方案中,在分离前能够用酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼埃罗替尼拉帕替尼(GW-572016;),卡奈替尼(CI 1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY 43-9006;),来氟米特(SU101),凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474),ponatinib(AP24534),及其组合)体外处理或不处理来自患者的全血。慢性骨髓性白血病是白细胞癌。其是白血病的一种形式,特征为骨髓中显著的髓细胞的提高和失控的生长和这些细胞在血液中的累积。95%的CML癌细胞表达BCR-ABL致癌蛋白。因此,通过从血液中的红血细胞中提取肿瘤细胞和白细胞测定患者中CML肿瘤的BCR-ABL水平变得至关重要。此实施例描述了能够从患者血液中回收肿瘤细胞(例如白细胞和其他白细胞)的过滤法。
一般将患者血液抽取至含有EDTA的血液收集管中,并通过颠倒轻轻混合。将全血样品储存在室温并在24小时内处理。过滤板包含在孔底部具有膜的96孔板,所述膜允许从全血中回收白细胞(例如,白细胞)。如果过滤板不是市售的,能够通过一系列步骤制备过滤板,所述步骤例如但不限于a)去除Whatman 96孔Unifilter板的原始滤膜;b)将LeukoLOCK总RNA滤膜从其滤盒外壳中移除;c)在LeukoLOCK总RNA滤膜上冲压出0.25英寸直径的洞,使新产生的膜环适合96孔过滤板的孔;和d)将新的LeukoLOCK总RNA滤膜环轻轻置入没有其原始膜的Whatman96孔Unifilter板中。接下来,将96孔微板置于96孔过滤板下面,并用胶带将两块板密封在一起以形成双过滤板。96孔微板用于收集通过的血液。
过滤方法能够包括以下步骤。使用1ml移液器通过上下吹吸5-10次混合患者血样。使用1ml移液器将300μl患者血液装载至预制的96孔双过滤板的孔中。在台式离心机(例如,Allegra 6R(Beckman Coulter))中在室温以3,000rpm离心双板5分钟。离心后,将双板从离心机中移除。去除胶带并分开双板的板。使用114mm(41/2”)解剖镊子,从过滤板的孔中移取LeukoLOCK滤膜环并置于含有300μl蛋白质裂解缓冲剂的2ml离心管中。接下来立即涡旋离心管。将离心管置于冰上,每10分钟短暂涡旋10秒,共30分钟。使用1ml移液器将裂解物转移至新的2ml离心管中。此时将裂解物储存于-70℃,或用于检测一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)和/或信号转导分子(例如,EGFR,HER-2,HER-3,HER-4,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,PDGFR,c-Met,c-KIT,IGF-IR,SHC,PI3K,等等)的激活状态和/或总量的测定中。
过滤方法也能够包括以下步骤。在从患者血液中过滤回收肿瘤细胞(例如白细胞和其他白细胞)前,用酪氨酸激酶抑制剂处理患者血样。在特别的情况下,将1.2ml新鲜收集的患者血液转移至培养管并加入特别的浓度范围的酪氨酸激酶抑制剂药物,例如10μM,1μM或0.1μM达沙替尼;10μM,1μM或0.1μM伊马替尼;和10μM,1μM或0.1μM尼罗替尼。在CO2培养箱中在37℃或在室温孵育血液约1至24小时(例如,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,或24小时)。
实施例6.用于测定来自第一和第二次抽血的患者2的血样中的磷酸-BCR-ABL、总BCR-ABL和BCR水平的CEER免疫微阵列流程
此实施例说明了进行CEER免疫微阵列以检测患者血样中的BCR-ABL表达和激活的程序。根据本文描述的方法分离白细胞和循环肿瘤细胞。裂解分离的细胞,并在临近测定,例如在2010年7月15日申请的PCT申请号PCT/US2010/042182和美国专利公开号20080261829,20090035792和20100167945中描述的协同临近免疫测定(COPIA)中使用,将其公开以其整体引入本文作为参考为了所有目的。在特别的实施方案中,流程包括用结合BCR的磁珠处理患者血样。
稀释K562细胞裂解物用于CEER免疫微阵列
根据本发明的方法,例如在实施例2和3中描述的方法制备未处理的K562细胞裂解物。根据表1在测定稀释缓冲剂中进行未处理的K462细胞裂解物的系列稀释。通过3块CEER玻片筛选细胞裂解物。
表1
稀释来自患者血样的细胞裂解液用于CEER免疫微阵列
根据本发明的方法,例如在实施例1,2和10中描述的方法制备从患者血样制备的细胞裂解物。稀释用于3块CEER玻片的患者细胞裂解液的程序在表2中说明。
表2
CEER免疫微阵列的程序
1.封闭玻片:
1.1.用TBST冲洗玻片2次。
1.2.用80μl无蛋白质的(TBS)封闭缓冲剂封闭玻片1小时。
1.3.在封闭步骤后,用TBST洗2次。
1.4.每ml测定稀释缓冲剂(2%BSA/0.1%triton/10mM EDTA/TBS)加入10μl1mM Na3VO4。
2.与细胞裂解物孵育:
2.1.如表1和2中所述用测定稀释缓冲剂进行细胞裂解物的系列稀释。
2.2.移取细胞裂解物的等分试样用于与珠孵育,对不与磁珠(例如,BCR-1684珠)孵育的裂解物的等分试样加入等体积的测定稀释缓冲剂。
2.3.对玻片加入80μl细胞裂解物并密封玻片。
2.4.在室温孵育过夜。
2.5.洗玻片5次,使得第一次洗涤是用1.25ml TBST快速冲洗,其余的洗涤为每次3分钟。
3.与检测抗体孵育:
3.1.在测定稀释缓冲剂中将经标记的抗体稀释至合适的浓度。
3.1.1 4G10-HRP:1∶320稀释(Millipore#05-777)
3.1.2 BCR-GO-AF5129:1∶80和1∶160稀释(R&D#AF5129)
3.1.3 Abl-HRP-AF5414:1∶900稀释(R&D#AF5414)
3.1.4 BCR-HRP-1684-B-Dextran:1∶80稀释(Epitomics#1684-B)
3.1.5 GO-Dextran:1∶80稀释
3.2.对合适的玻片加入80μl抗体溶液,并在室温孵育2小时。
3.2.1 用于游离BCR玻片:BCR-HRP 1∶80,GO-Dextran 1∶80.
3.2.2 用于总BCR-ABL玻片:Abl-HRP 1∶900,BCR-GO 1∶80.
3.2.3 用于磷酸-BCR-ABL玻片:4G10-HRP 1∶320,BCR-GO 1∶160.
3.3.洗玻片5次,使得第一次洗涤是用1.25ml TBST快速冲洗,其余的洗涤分别为3分钟。
4.酪胺介导的信号放大:
4.1.加入80μl在50mM葡萄糖/PBS(用于BCR-HRP+GO-Dextran)以1∶320稀释的生物素-酪胺。
4.2.加入80μl在50mM葡萄糖/PBS-RK(用于4G10-HRP+BCR-GO和ABL-HRP+BCR-GO)中的6.25ug/mL的生物素-酪胺。
4.3.在黑暗中孵育15分钟。
4.4.洗玻片5次,使得第一次洗涤是用1.25ml TBST快速冲洗,其余的洗涤为每次3分钟。
5.与Alexa Fluor缀合的链霉抗生物素孵育:
5.1.与80μl在测定稀释缓冲剂(1∶4,000稀释)中的0.4μg/ml的链霉抗生物素-Alexa 647孵育40分钟。
5.2.洗玻片5次,使得第一次洗涤是用1.25ml TBST快速冲洗,其余的洗涤为每次3分钟。
5.3.用水洗1次。
5.4.去除框架,用水冲洗玻片几次。
5.5.在50ml管中以1500rpm离心玻片3分钟。
6.干燥玻片,在Perkin Elmer扫描仪上在合适的激光设置上扫描玻片:
6.1.干燥玻片。
6.2.在Perkin Elmer扫描仪上在合适的激光设置上扫描玻片。
6.3.将图像和扫描设置保存在文件和服务器上。
实施例7.选择患有特征为激活的BCR-ABL水平的恶性血液病的患者的抗癌疗法的方法
此实施例证明了为患有BCR-ABL介导的疾病(例如,慢性骨髓性白血病)的患者选择抗癌疗法的方法。患者以前未治疗过BCR-ABL介导的疾病,并还未接受例如酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼埃罗替尼拉帕替尼(GW-572016;),卡奈替尼(CI 1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY 43-9006;),来氟米特(SU101),凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474),ponatinib(AP24534),及其组合)的药物。抽取患者血样并与多种剂量的不同抗癌药在37℃孵育1.5小时。在此体外药物处理后,从患者血液中回收白细胞和/或循环肿瘤细胞。裂解分离的细胞并用于临近测定,例如在2010年7月15日申请的PCT申请号PCT/US2010/042182和美国专利公开号20080261829,20090035792和20100167945中描述的协同临近免疫测定(COPIA),将其公开内容以其整体引入本文作为参考为了所有目的。在存在抗癌药时,基于在药物处理的患者样品中的信号转导途径蛋白(例如,BCR-ABL,BCR,ABL,CRKL,AKT,SRC)分析物的表达/激活制谱测定途径谱。使用所述谱选择抗癌治疗方案,以获得积极的临床结果。
就其本身而言,本发明提供了在患有恶性血液病的对象中选择抗癌药的方法,所述方法包括1)在来自对象的样品的分离的细胞中测量BCR-ABL的激活状态水平,2)在开始治疗前用至少一种抗癌药孵育分离的细胞;3)在孵育的细胞中测量BCR-ABL的激活状态水平;并基于BCR-ABL的激活状态水平选择疗程。本发明也提供了在对象中监控抗癌药的效力的方法,其中所述对象患有恶性血液病,所述方法包括:1)在首次施用抗癌药前,在T0测量BCR-ABL的激活状态水平;2)对对象施用抗癌药,其中在时间T1首次施用抗癌药;2)在来自对象的样品中在时间T2测量BCR-ABL的激活状态和或表达水平;和3)基于BCR-ABL的激活状态和或表达水平决定疗程。
实施例8.患者1:基于体外BCR-ABL抑制谱测定治疗效力和/或选择最佳治疗策略的途径制谱
此实施例证明了基于对象的血样中的信号传递转导途径蛋白(例如,BCR-ABL,BCR,ABL,CRKL,AKT,SRC)分析物的表达/激活制谱,测定患有BCR-ABL介导的疾病(例如,慢性骨髓性白血病)的患者的抑制剂疗法的效力。在特别的情况下,患者可正接受抑制剂疗法,例如用酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼埃罗替尼拉帕替尼(GW-572016;),卡奈替尼(CI 1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY 43-9006;),来氟米特(SU101),凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474),ponatinib(AP24534),及其组合)治疗。在其他实施方案中,能够使用临近测定测量BCR-ABL底物例如CRKL,AKT,STAT5和SRC的存在和/或激活状态,所述临近测定例如在2010年7月15日申请的PCT申请号PCT/US2010/042182和美国专利公开号20080261829,20090035792和20100167945中描述的协同临近免疫测定(COPIA),将其公开内容以其整体引入本文作为参考为了所有目的。另外,在用酪氨酸激酶抑制剂体外处理后,在对象的样品中的激酶和其他信号传递转导途径组分的表达/激活制谱能够提供有价值的信息,使临床医生能够选择有效的治疗方案。
在示例的例子中,分析来自患者(患者1)的血样以测定患者的伊马替尼疗法的有效性。患者1是初步诊断为慢性骨髓性白血病(CML)的55岁白人女性。她患有活跃性CML并自诊断后接受伊马替尼。抽取患者血液并使用上述方法分离白细胞。简单地说,使患者1的全血样品过滤通过过滤板以回收白细胞和循环肿瘤细胞。然后裂解细胞并用于临近测定(例如,CEER和COPIA),所述临近测定检测一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)和/或信号转导分子(例如,EGFR,HER-2,HER-3,HER-4,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,PDGFR,c-Met,c-KIT,IGF-IR,SHC,PI3K)的激活状态和/或总量。在特定的例子中,在临近测定中使用的捕获抗体的稀释系列为1∶5或1∶20稀释,以获得期望的浓度。使用临近测定测定白细胞数和磷酸化的BCR-ABL和其他信号传递转导途径组分的谱。从分析中也计算出磷酸化信号比例并用于测定患者的预后。
在优选的实施方案中,在分离白细胞或循环肿瘤细胞前,能够在体外用抑制剂处理孵育患者血样。在特别的情况下,用0.1μM,1μM或10μM BCR-ABL抑制剂(例如,伊马替尼,尼罗替尼和达沙替尼)在37℃处理从诊断患有CML的患者处收获的全血样品1.5小时。使用过滤法从全血中分离白细胞或循环肿瘤细胞并使用本领域技术人员已知的技术裂解。然后将细胞裂解物用于临近测定,以测定BCR-ABL抑制剂处理对一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)和/或信号转导分子的激活状态和/或总量的影响。在某些实施方案中,用BCR-ABL抑制剂的体外处理能够降低磷酸化的CRKL的水平。在某些情况下,在患者样品中的CRKL激活能够是由于BCR-ABL激活。在另一个实施方案中,特定的抑制剂例如达沙替尼可能够减弱AKT,STAT5和SRC的激活形式。在其他情况下,其他抑制剂例如伊马替尼和尼罗替尼可不降低相同患者中的磷酸化的AKT和STAT5的水平。在特别的情况下,磷酸化的AKT和STAT信号传递可不依赖于BCR-ABL激活状态。在另一个方面,由于BCR-ABL底物例如CRKL,STAT5和SRC的减弱的表达/激活,目前接受伊马替尼的患者将可能响应并应当接受组合疗法例如伊马替尼和达沙替尼。
图10描述了在此研究中分析的患者。患者1患有活跃性CML并已接受治疗至少5年。患有活跃性CML的患者2已接受伊马替尼治疗1年。图11A-B说明了较之患者2,患者1每ml血液具有的较低的磷酸-BCR-ABL量(10,979CU/ml对185,934CU/ml),提示患者1响应伊马替尼治疗。图12A-B显示在过滤分离白细胞和其他循环肿瘤细胞后,通过夹心ELISA测定的总的和激活的(磷酸化的)BCR-ABL水平的检测。临近测定可检测K562细胞中的磷酸-BCR-ABL水平。图13A-B显示较之尼罗替尼处理,用伊马替尼体外处理来自患者1的血样大大降低了磷酸化的BCR-ABL的量。图14和15显示当用增加量的BCR-ABL抑制剂处理时,患者1血样中的激活的BCR-ABL水平发生变化。在此实验中,用不同量的BCR-ABL抑制剂(例如,10μM,1μM或0.1μM伊马替尼,或10μM,1μM或0.1μM尼罗替尼)体外处理来自患者1的血样1.5小时。结果显示,10μM伊马替尼的平均磷酸-BCR-ABL信号为84CU,1μM伊马替尼为26CU,0.1μM伊马替尼为110CU。10μM尼罗替尼的激活的BCR-ABL信号的平均水平为47CU,1μM尼罗替尼为61CU,0.1μM尼罗替尼为306CU。图15A-B显示伊马替尼比尼罗替尼更有效地降低患者1血样中的激活的BCR-ABL蛋白质。在用1μM伊马替尼体外处理的样品中,激活的BCR-ABL信号的百分比回收为-18.46%,而在暴露于1μM尼罗替尼的样品中为19.15%(图15B)。图16A-D说明了其他磷酸化的信号传递转导途径组分例如CRKL(A),AKT(B),STAT5(C)和SRC(D)的途径谱。其显示达沙替尼治疗,而不是伊马替尼或尼罗替尼,导致患者1血样中的降低水平的激活的AKT,STAT4和SRC。图17显示患者1的血样含有极高水平的总BCR(8百万CU/ml)。
实施例9.患者2:基于体外BCR-ABL抑制谱测定治疗效力和/或选择最佳治疗策略的途径制谱
此实施例证明了基于对象血样中的信号传递转导途径蛋白(例如,BCR-ABL,BCR,ABL,CRKL,AKT,SRC)分析物的表达/激活制谱,测定患有BCR-ABL介导的疾病(例如,慢性骨髓性白血病)的患者的抑制剂疗法的效力。在特别的情况下,患者可正接受抑制剂治疗,例如酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼埃罗替尼拉帕替尼(GW-572016;),卡奈替尼(CI 1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY 43-9006;),来氟米特(SU101),凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474),ponatinib(AP24534),及其组合)治疗。在其他实施方案中,能够使用临近测定测量BCR-ABL底物例如CRKL,AKT,STAT5和SRC的存在和/或激活状态,所述临近测定例如在2010年7月15日申请的PCT申请号PCT/US2010/042182和美国专利公开号20080261829,20090035792和20100167945中描述的协同临近免疫测定(COPIA),将其公开内容以其整体引入本文作为参考为了所有目的。另外,在用酪氨酸激酶抑制剂体外处理后,在对象样品中的激酶和其他信号转导途径组分的表达/激活制谱能够提供有价值的信息,使临床医生能够选择有效的治疗方案。
在示例的例子中,患者(患者2)是在1月诊断患有CML的39岁白人男性。患者2自诊断起接受伊马替尼并具有活跃性疾病。在优选的实施方案中,抽取患者血液并使用上述方法分离白细胞。简单地说,使患者2的全血样品过滤通过过滤板以回收白细胞和循环肿瘤细胞。然后裂解细胞并用于临近测定(例如,CEER和COPIA),所述临近测定检测一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)和/或信号转导分子(例如,EGFR,HER-2,HER-3,HER-4,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,PDGFR,c-Met,c-KIT,IGF-IR,SHC,PI3K)的激活状态和/或总量。在特别的例子中,在临近测定中使用的捕获抗体的稀释系列可为1∶5或1∶20稀释,以获得期望的浓度。使用临近测定能够测定白细胞数和磷酸化的BCR-ABL和其他信号转导途径组分谱。从分析中也能够计算出磷酸化信号比例并用于测定患者的预后。
在优选的实施方案中,在分离白细胞或循环肿瘤细胞前,能够在体外用抑制剂处理孵育患者血样。在特别的情况下,用1μM BCR-ABL抑制剂(例如,伊马替尼,尼罗替尼和达沙替尼)在37℃处理从诊断患有CML的患者处收获的全血样品1.5小时。使用过滤法从全血中分离白细胞或循环肿瘤细胞并使用本领域技术人员已知的技术裂解所述细胞。然后将细胞裂解物用于临近测定,以测定BCR-ABL抑制剂处理对一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)和/或信号转导分子的激活状态和/或总量的影响。在某些实施方案中,使用尼罗替尼,而不是伊马替尼的体外处理将降低在患者血样中回收的磷酸-BCR-ABL的百分比。在特别的情况下,较之伊马替尼,具有此途径谱的患者将可能更好地响应尼罗替尼疗法。在其他实施方案中,使用BCR-ABL抑制剂的体外处理能够对磷酸化的CRKL没有影响。在另一个实施方案中,特定的抑制剂例如达沙替尼可能够减弱AKT,STAT5和SRC的激活形式。在其他情况下,其他抑制剂例如伊马替尼和尼罗替尼可降低相同患者样品中的磷酸化的AKT水平。在另一个情况下,由于使用伊马替尼和尼罗替尼的体外处理,磷酸化的STAT5和SRC降低了约20%。在另一个方面,由于BCR-ABL底物例如AKT,STAT5和SRC的减弱的表达/激活,目前接受伊马替尼的患者将可能更好地响应并应当接受达沙替尼治疗。
图18A-B显示在用不同剂量的BCR-ABL抑制剂在37℃体外处理患者2血样1.5小时后,检测和测量的磷酸化的BCR-ABL。其也显示尼罗替尼比伊马替尼更有效地减少来自患者2的经体外处理的血样中的激活的BCR-ABL。增加尼罗替尼的浓度(例如,0.1μM,1μM和10μM)减少激活的BCR-ABL,而改变伊马替尼的浓度具有较少的效果(图18B)。伊马替尼对患者2中的激活的BCR-ABL水平具有非常小的影响。图19A-D显示用达沙替尼体外处理患者2的血样降低了激活的AKT(B),STAT5(C)和SRC(D)的水平。另一方面,用伊马替尼或尼罗替尼处理的类似处理仅降低磷酸化的AKT(例如,相比在未处理样品中的100%,在10μM伊马替尼处理的样品中为55.54%)。
实施例10.来自接受伊马替尼的慢性骨髓性白血病患者的血样的途径谱的比较
本实施例证明,能够测定并比较基于对象血样中的信号传递转导途径蛋白(例如,BCR-ABL,BCR,ABL,CRKL,AKT,SRC)分析物的表达/激活制谱的通路谱,以确立多种治疗方案的效力。在优选的实施方案中,能够使用临近测定测量BCR-ABL底物例如CRKL,AKT,STAT5和SRC的存在和/或激活状态,所述临近测定例如在2010年7月15日申请的PCT申请号PCT/US2010/042182和美国专利公开号20080261829,20090035792和20100167945中描述的协同临近免疫测定(COPIA),将其公开内容以其整体引入本文作为参考为了所有目的。在其他实施方案中,患者可正接受抑制剂疗法,例如使用酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼甲磺酸尼罗替尼达沙替尼博舒替尼(SKI-606),吉非替尼舒尼替尼埃罗替尼拉帕替尼(GW-572016;),卡奈替尼(CI 1033),semaxinib(SU5416),瓦他拉尼(PTK787/ZK222584),索拉非尼(BAY 43-9006;),来氟米特(SU101),凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474),ponatinib(AP24534),及其组合)治疗。在其他实施方案中,能够用酪氨酸激酶抑制剂在37℃体外处理患者血样1.5小时。之后,能够使用本文描述的过滤法从血样中回收循环肿瘤细胞和/或白细胞。能够裂解分离的细胞并用于临近测定(例如,CEER和COPIA),所述临近测定检测一种或多种致癌融合蛋白(例如,BCR-ABL)和/或信号转导分子(例如,EGFR,HER-2,HER-3,HER-4,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,PDGFR,c-Met,c-KIT,IGF-IR,SHC,PI3K,CRKL,AKT,STAT5,SRC)的激活状态和/或总量。能够在来自相同患者或来自其他患者的样品之间比较这些蛋白质的测量的水平。途径谱的比较使临床医生能够为患有BCR-ABL介导的疾病的患者选择最有效的疗法。
图20A-D显示在也用酪氨酸激酶抑制剂体外处理的血样中检测和测量磷酸化的CRKL水平。在此实验中,在临近测定中使用的捕获抗体以1∶10或1∶50稀释以获得期望的浓度。患者1比患者2显示了更高的激活的CRKL水平。BCR-ABL抑制剂例如伊马替尼和尼罗替尼仅在来自患者1,而不是患者2的血样中降低CRKL水平。
图21A-D说明了患者1和患者2不类似地响应伊马替尼和尼罗替尼。在用伊马替尼处理后,激活的AKT在来自患者1的样品中增加,而在来自患者2的样品中减少。响应于尼罗替尼,AKT水平在来自患者1的样品中几乎维持不变,而在来自患者2的样品中大大减少。
图22A-B显示体外达沙替尼处理能够降低来自患者1(A)和2(B)的样品中的磷酸-STAT5水平。在来自未接受处理、接受10μM伊马替尼处理和10μM尼罗替尼处理的患者1或患者2的样品中激活的STAT5水平是类似的。
图23A-D显示响应于伊马替尼,尼罗替尼和达沙替尼,来自患者1和2的样品都具有较低的磷酸-SRC水平。在患者1和患者2样品中,达沙替尼都比伊马替尼和尼罗替尼更有效地降低磷酸-SRC水平。
实施例11 在CML患者中检测和监控BCR-ABL激活
此实施例说明了在诊断患有CML的患者中监控治疗反应的本发明的方法。此实施例说明了所述方法能够检测来自有限数量的细胞的多种蛋白质的表达和激活状态。此实施例显示,较之基于mRNA的分析,使用本发明的细胞分离装置和CEER免疫测定的方法提供了更灵敏和定量的功能靶调节分析。
监控CML治疗响应的传统方法包括细胞遗传学检测,骨髓吸取涂片评估,Ph染色体的荧光原位杂交(FISH)和实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)。一般在治疗的3,6和12个月时或直至达到CCyR时进行细胞遗传学检测或骨髓吸取涂片评估。目前Q-PCR是最灵敏的治疗响应检测。本发明提供了比Q-PCR更灵敏且不需要去除或稀释患者血样中的药物的监控BCR-ABL激酶抑制的体内调节的方法。
在此研究中,使用本发明的方法分析CML患者中的总的和激活的BCR-ABL水平。图24显示了在此研究中评估的患者列表。记录了诊断日期和患者的疗程。在研究过程中的不同时点抽取血液。根据本文描述的方法从患者血样中分离白细胞和循环肿瘤细胞并裂解。通过实施例6中描述的方法处理和分离细胞裂解物。使用临近测定(例如,COPIA或CEER)测定患者血样中的BCR-ABL和其他信号传递分子(例如,AKT,SRC,CRKL和STAT5)的表达和激活的调节。临近测定例如协同临近免疫测定(COPIA)的详述描述于2010年7月15日申请的PCT申请号PCT/US2010/042182和美国专利公开号20080261829,20090035792和20100167945中,将其公开内容以其整体引入本文作为参考为了所有目的。
在药物治疗后在患者中监控CML进展
图25显示使用本发明的方法在患者样品中检测总的和激活的BCR-ABL水平。在此实施例中描述了患者样品的其他细节。
在来自正常、健康的对象的血样中测定了总BCR,ABL和BCR-ABL水平。如预期地,BCR-ABL水平为阴性(见图26)。
患者1在2006年12月被诊断患有CML并接受伊马替尼(Gleevec)治疗。为了测定患者1对伊马替尼的响应,在3个时间点(1/31,4/25和10/24)分析了总的和激活的BCR-ABL水平。患者1在时间点1具有0.130的磷酸化的BCR-ABL/白细胞比例,在时间点2比例为0.133,在第三个时点间3比例为0.078(图27A)。通过mRNA表达测定没有检测到磷酸化的BCR-ABL水平在不同时间点的变化,因为在时间点2和3,mRNA值分别为0.04±0.01%和0.04%。RNA表达测定检测了比标准基线值减少3log的活跃肿瘤细胞。CEER免疫微阵列的优势在于,其检测大于3log减少的磷酸-BCR-ABL。
患者7的结果显示,检测不到BCR-ABL水平的mRNA水平,但使用CEER免疫微阵列检测到总的和激活的BCR-ABL水平。本发明的方法证明检测激活的BCR-ABL比总BCR-ABL灵敏10倍。特别地,CEER免疫测定检测具有活跃肿瘤细胞与总白细胞比率为0.05%的患者中的BCR-ABL的表达和激活状态,这对应于比标准基线值减少大于4log。患者7在5月被诊断患有CML并在4月开始伊马替尼治疗。在治疗后的2个时间点(例如,6月和2月)监控对治疗的响应。结果显示磷酸-BCR-ABL随时间减少(见图27B的条形图和线图)。
患者2在1月被诊断并在2月接受伊马替尼治疗。使用细胞分离装置的96孔实施方案从2/2和3/2抽取的血液中分离白细胞和CTC并裂解。对10/12和12/21抽取的血液使用本发明的细胞分离装置的管实施方案。使用本发明的方法测得,患者2在5月中的时间点表达较低水平的激活的BCR-ABL(见,例如,图28A,B的条形图和线图)。但是到10月水平上升。来自CEER免疫测定的结果与mRNA表达数据相符。图28C中突出显示了使用标准方法(例如,用于BCR-ABL的MolecularMD试剂盒)的Q-PCR的准确度和低水平mRNA。BCR-ABL相对ABL的%随样品中存在的mRNA量而变化。
监控患者样品中的体外药物响应
为了测定患者2对体外药物处理的响应,用不同量的伊马替尼或尼罗替尼处理血样并测定总BCR-ABL和激活状态的BCR-ABL。CEER免疫测定能够检测在患者7的样品中对药物处理的响应,因此证明此测定是决定患者的最佳疗法的有效工具。
患者3被诊断患有CML并接受达沙替尼(Sprycel)治疗。在5个时间点(2/07 4/04/,7/25,8/22/和10/17)监控了总的和激活的BCR-ABL水平。使用细胞分离装置的96孔实施方案处理在2/07和4/04抽取的血液,并使用本发明的装置的管实施方案处理在7/25和8/22抽取的血液。图29A显示,pBCR/WBC比例在10/17最低。图29B说明了磷酸-BCR-ABL水平在7/25的样品中达到峰值,并在10/17样品中降低至其最低水平。患者3响应达沙替尼并在最后一个时间点具有较低的激活的BCR-ABL水平,如在图29A中突出显示。磷酸-BCR-ABL的CEER测定结果与mRNA表达数据相符。
患者8在2007年7月被诊断患有CML,并在05/25从伊马替尼改为达沙替尼治疗。在5/18和6/20抽取血液,使用本发明的细胞分离装置的96孔实施方案处理。使用本发明的管实施方案从在7/18,08/18和10/13抽取的血液中分离和裂解白细胞和CTC。图30A显示磷酸BCR-ABL/WBC比例从5/18降低至8/18,但在03/13升高。磷酸BCR-ABL/总BCR-ABL比例在患者接受达沙替尼时升高(图30B),可能是由于CML的进展。
患者18响应08/20的尼罗替尼的最初治疗,然后响应08/22的ponatinib治疗。使用本发明的细胞分离装置的管实施方案处理从此研究中的患者抽取的全部血液。本发明的方法的结果显示,在疗法过程中pBCR-ABL/WBC比例降低。通过本领域技术人员已知的标准方法测定的mRNA比例也显示在测量的时期中BCR-ABL降低。
患者14在6月被诊断患有CML并在6/28接受羟基脲治疗和在08/29接受达沙替尼。使用本发明的细胞分离装置的管实施方案处理在8/29和10/03抽取的血液。图31B显示,激活的磷酸-BCR-ABL水平(pBCR-ABL/WBC比例)在第1个时间点(6/28)后降低,并在最后一个时间点(10月20日)最低。用不同浓度的伊马替尼或尼罗替尼体外处理来自患者14的血样。图32A-B显示,患者14对药物处理的体外响应导致在伊马替尼或尼罗替尼治疗时磷酸化的BCR-ABL减少。
结论
此实施例说明了在从20位CML患者处得到的细胞裂解物中的BCR-ABL表达和磷酸化的分析。此实施例说明了本发明的方法,包括细胞分离方法和CEER免疫测定的用途。特别地,从患者全血样品中分离白细胞和循环肿瘤细胞而不去除或稀释血液中的药物水平。在接受靶向治疗的患者中观察到不同水平的BCR-ABL激酶抑制。此实施例也显示,通过CEER免疫测定检测BCR-ABL具有高水平的功能灵敏度并在临床上具有监控CML进展的用途。本发明的方法能够用于筛选和监控药物的效力,这对接受靶向疗法的CML患者大有益处。同样地,所述方法能够辅助临床医生决定用于患者的最有效的治疗选择。
将在此说明书中引用的所有出版物和专利申请,包括在2010年10月20日申请的PCT申请号PCT/US2010/053386引入本文作为参考,就如同每一单个出版物或专利申请被明确和单独地说明被引用作为参考一样。尽管为了清楚理解的目的已通过说明和实施例已相当详细地描述了前述说明,鉴于本发明的教导,对本领域普通技术人员显而易见地,可对本发明进行某些改变和修改而不背离随附的权利要求书的精神或范围。
Claims (27)
1.用于将白细胞与全血样品中的红血细胞分离和分隔的装置,所述装置包含:
过滤设备,所述过滤设备包含上室、下室,和在所述上室和下室之间的一层或多层堆积的滤膜,其中所述一层或多层堆积的滤膜能够保留所述白细胞;和
收集管,所述收集管用于从所述全血样品收集红血细胞,其中所述过滤设备放置于所述收集管顶部,且其中在离心后将所述红血细胞与所述白细胞分隔并将所述红血细胞收集在所述收集管中。
2.权利要求1的装置,其中将所述全血样品装载至所述过滤设备的所述上室中。
3.权利要求1或2的装置,其中所述过滤设备包含2、3或4层堆积的滤膜。
4.权利要求1至3中任一项的装置,其中所述上室还包含与其连接的按扣盖。
5.权利要求1至4中任一项的装置,还包含第二收集管,其中在离心后用所述第二收集管替换含有所述红血细胞的所述收集管。
6.权利要求5的装置,其中在对所述上室加入裂解缓冲剂并离心后,在所述第二收集管中收集所述白细胞的裂解物。
7.权利要求6的装置,其中对所述上室加入所述裂解缓冲剂而不洗涤所述一层或多层堆积的滤膜。
8.权利要求1至4中任一项的装置,还包含第二收集管,其中在离心后从所述过滤设备移出所述一层或多层堆积的滤膜并将所述滤膜放置于所述第二收集管中。
9.权利要求8的装置,其中所述第二收集管含有裂解缓冲剂。
10.权利要求1至9中任一项的装置,其中从患有或怀疑患有恶性血液病的对象得到所述全血样品。
11.权利要求10的装置,其中所述恶性血液病是慢性骨髓性白血病(CML)。
12.权利要求10或11的装置,其中所述对象接受或未接受使用治疗剂的疗法。
13.权利要求12的装置,其中所述治疗剂是抗癌药。
14.权利要求13的装置,其中所述抗癌药选自由酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放射治疗剂、单克隆抗体、疫苗及其组合组成的组。
16.权利要求12至15中任一项的装置,其中在分离所述白细胞前用所述治疗剂体外孵育所述全血样品。
17.权利要求1至16中任一项的装置,其中所述白细胞选自由正常白细胞、恶性白细胞、患病白细胞及其组合组成的组。
18.权利要求1至17中任一项的装置,其中所述装置是多个过滤设备。
19.用于从全血样品中制备白细胞裂解物而基本不稀释治疗剂的方法,所述方法包括:
(a)将所述全血样品装载至权利要求1至18中任一项的装置中;
(b)离心所述装置以在所述一层或多层堆积的滤膜上捕获所述白细胞和以将所述红血细胞分隔至所述收集管中;和
(c)用裂解缓冲剂裂解在所述一层或多层堆积的滤膜上捕获的所述白细胞但在步骤(b)和(c)之间没有洗涤步骤,从而制备白细胞裂解物。
20.权利要求19的方法,还包括在步骤(b)和(c)之间用第二收集管替换所述收集管。
21.权利要求20的方法,还包括在步骤(c)中裂解所述白细胞后离心含有所述第二收集管的所述装置,并在所述第二收集管中收集所述白细胞裂解物。
22.权利要求19至21中任一项的方法,其中从接受治疗剂的对象得到所述全血样品。
23.权利要求22的方法,其中所述治疗剂是抗癌药。
24.权利要求19至21中任一项的方法,其中在装载至所述装置中前用治疗剂体外孵育所述全血样品。
25.权利要求19至24中任一项的方法,其中在所述白细胞裂解物中测量至少一种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的表达和/或激活水平。
26.权利要求25的方法,其中至少一种致癌融合蛋白包含BCR-ABL。
27.权利要求19至24中任一项的方法,其中所述装置是多个过滤设备。
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