KR20130127513A - 여과에 의해 백혈구 및 종양 세포를 단리하는 장비 및 방법 - Google Patents

여과에 의해 백혈구 및 종양 세포를 단리하는 장비 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치료제 예컨대 항암 약물의 세포내 농도를 변화시키지 않으면서 여과에 의해 혈액 샘플로부터 혈액 세포의 부분집합 예컨대 백혈구 및/또는 순환 종양 세포를 단리 또는 회수하기 위한 신규한 장비 및 방법을 제공한다. 종래의 기술과 반대로, 본 발명의 장비 및 방법은 유리하게는 치료제 예컨대 항암 약물의 실질적 희석 없이 회수된 세포 예컨대 백혈구 및/또는 순환 종양 세포로부터의 세포 용해물을 제공한다.

Description

여과에 의해 백혈구 및 종양 세포를 단리하는 장비 및 방법 {APPARATUS AND METHOD FOR ISOLATING LEUKOCYTES AND TUMOR CELLS BY FILTRATION}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2011 년 2 월 17 일에 제출된, 미국 가 특허 출원 제 61/444,044 호 및 2011 년 5 월 25 일에 제출된, 제 61/489,998 호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 공개는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
암은 미국에서 두번째 사망 원인이다. 암의 진단 및 예측을 위한 종양원성 마커 (oncogenic marker) 의 정확한 분석에 대한 필요가 계속 증가하고 있다. 예를 들어, 종양원성 마커의 어레이의 탐지는 의사가 초기 암을 탐지하고 암 진행을 모니터링하는 것을 허용할 수 있다. 약물 개시 전에 항암 요법에 대한 환자의 반응성을 알면, 의사는 각각의 개별 환자를 위한 최선의 치료 과정을 선별할 수 있을 것이다. 게다가, 치료 과정 동안 약물 효과성의 일상적 분석은 특정 항-암 약물에 대한 환자의 무반응성을 밝힐 수 있다. 이러한 정보는 약물 치료 섭생의 선별을 개선하는데 사용될 수 있을 것이다.
종양원성 마커 분석을 위한 현재의 방법은 정상 및 암 세포의 불균일 혼합물 예컨대 전혈 중 악성 세포를 심문하는 것에 기초한다. 방법 예컨대 LeukoLOCK Total RNA Isolation System (Ambion) 은 혈액 샘플을 일회용 백혈구 고갈 필터 (disposable Leukocyte Depletion Filter) 를 통해 통과시킴으로써 전혈로부터 순환 악성 세포를 포획한다. 전형적으로는, 이러한 고갈 필터가 완충제 예컨대 PBS 로 씻어지면서 악성 세포가 회수된다. 이러한 세정 단계는 이전에 세포에 노출된 항암 약물의 세포내 농도를 변화시킴으로써, 아마도 세포 내부에서 새로운 신호전달 반응을 야기하고 종양원성 마커의 발현을 변경할 것이다. 그 결과, 분석된 샘플 중 종양원성 마커의 발현은 특정 항암 요법에 대한 환자의 반응을 부정확하게 반영할 것이다. 이는 부정확한 진단 및/또는 예후 평가를 초래할 것이다. 본 발명은 항암 약물의 세포내 농도를 변화시키지 않으면서 혈액 세포의 부분집합을 단리하는 방법 및 장비를 제공함으로써 이러한 잠재적 오류 요인을 극복한다.
본 발명은 치료제 (therapeutic agent) 즉, 항암 약물 (anticancer drug) (예를 들어, 티로신 키나제 저해제 (tyrosine kinase inhibitor)) 의 세포내 (생체내) 농도를 변화시키지 않으면서 여과 (filtration) 에 의해 혈액 샘플로부터 혈액 세포의 부분집합 예컨대 정상 백혈구 (normal leukocytes), 병든 백혈구 (diseased leukocytes), 악성 백혈구 (malignant leukocytes), 백혈병 세포 (leukemia cells), 포말 세포 (foam cells), 및/또는 순환 종양 세포 (circulating tumor cell: CTC) 를 단리 (isolating), 수확 (harvesting) 및/또는 회수 (recovering) 하는 장비 및 방법을 제공한다. 특정 양상에서, 본 발명은 여과 장치 (filtration device) 및 수집 튜브 (collection tube) 를 포함하는 세포 단리 장비 (cell isolation apparatus) 를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 전혈 샘플 (whole blood sample) 중 적혈구로부터 백혈구를 단리 및 분리하는 장비를 제공한다:
상실 (upper chamber), 하실 (lower chamber), 및 상실 및 하실 사이의 하나 이상의 적층 필터 막 (stacked filter membranes) 을 포함하는 여과 장치 (filtration device), 여기서 하나 이상의 적층 필터 막은 백혈구를 보유하는 능력이 있음; 및
전혈 샘플로부터 적혈구를 수집하기 위한 수집 튜브 (collection tube), 여기서 여과 장치는 수집 튜브의 정상부에 배치되고, 적혈구는 원심분리 후에 백혈구로부터 분리되고 수집 튜브 내에 수집됨. 바람직한 양상에서, 하실은 상실 및 수집 튜브 사이에 배치된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 치료제 (예를 들어, 항암 약물) 의 실질적 희석 없이 전혈 샘플로부터 백혈구의 용해물 (lysate of leukocytes) 을 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 전혈 샘플을 세포 단리 (여과) 장비 예컨대 본원에 기재된 장비 내로 로딩하는 단계;
(b) 장비를 원심분리하여 백혈구를 하나 이상의 적층 필터 막 상에 포획하고 적혈구를 상기 튜브 내로 분리하는 단계; 및
(c) 단계 (b) 및 (c) 사이에 세정 단계 없이, 하나 이상의 적층 필터 막 상에 포획된 백혈구를 용해 완충제 (lysis buffer) 로 용해하여 백혈구의 용해물을 제조하는 단계.
또다른 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 혈액성 악성종양 (hematological malignancy) 을 갖는 대상에서 항암 약물의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다:
항암 약물을 대상에게 투여하는 단계, 여기서 항암 약물의 제 1 투여는 시간 T1 에서임;
대상으로부터의 샘플 중 시간 T2 에서 BCR-ABL 의 활성화 상태 (activation state) 및 또는 발현 수준 (expression level) 을 측정하는 단계; 및
BCR-ABL 의 활성화 상태 및 또는 발현 수준에 기초하여 치료 과정을 결정하는 단계.
특정 구현예에서, 상기 방법은 T0 에서, 즉, 항암 약물의 제 1 투여 전에 BCR-ABL 의 활성화 상태를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 경우에, 혈액성 악성종양은 림프종 (lymphoma) 또는 백혈병 (leukemia) 예컨대 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia: CML) 이다. T1 및 T2 사이의 시간 차이는 약 1 주 ~ 약 6 월 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 주이다. T0 및 T1 사이의 시간 차이는 약 1 일 ~ 약 3 주이다. 특정 다른 양상에서, 상기 방법은 하나 이상의 다른 신호 전달 분자 예컨대 CRKL, AKT, STAT5 및 SRC 의 발현 및 또는 활성화 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 양상에서, 치료 과정은 항암 약물 투여량의 변화, 부가적 항암 약물을 포함하는, 항-암 약물의 변화, 치료 기간의 변화 및 기존 치료 과정의 유지로부터 선별된다.
특정 양상에서, 샘플은 단리된 세포의 추출물 (extract of isolated cells) 을 포함한다. 특정 양상에서, 단리된 세포는 T0 에서 (치료의 개시 전에) 하나 이상의 항암 약물 (예를 들어, 2 개의 항암 약물) 과 함께 시험관내 인큐베이션된다. 다른 경우에, 단리된 세포는 T2 에서, 치료 과정을 결정하기 전에 2 개 이상의 항암 약물과 함께 시험관내 인큐베이션된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 혈액성 악성종양을 갖는 대상에서 항암 약물을 선별하는 방법을 제공한다:
대상으로부터의 샘플로부터의 단리된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 수준을 측정하는 단계;
단리된 세포를 치료의 개시 전에 하나 이상의 항암 약물과 인큐베이션하는 단계;
인큐베이션된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 수준을 측정하는 단계; 및
BCR-ABL 의 활성화 상태 수준에 기초하여 치료 과정을 선별하는 단계.
특정 양상에서, 치료 과정은 항암 약물의 선별, 항암 약물 투여량의 선별, 및 치료 기간의 결정으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 다른 양상에서, 상기 방법은 하나 이상의 다른 신호 전달 분자 예컨대 CRKL, AKT, STAT5 및 SRC 의 발현 및 또는 활성화 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
그와 같이, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 혈액성 악성종양을 갖는 대상에서 항암 약물을 선별하는 방법을 제공한다:
1) 대상으로부터의 샘플로부터의 단리된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 수준을 측정하는 단계;
2) 단리된 세포를 치료의 개시 전에 하나 이상의 항암 약물과 인큐베이션하는 단계;
3) 인큐베이션된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 수준을 측정하고; BCR-ABL 의 활성화 상태 수준에 기초하여 치료 과정을 선별하는 단계.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 혈액성 악성종양을 갖는 대상에서 항암 약물의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다:
a) T0 에서, 항암 약물의 제 1 투여 전에 BCR-ABL 의 활성화 상태를 측정하는 단계;
b) 항암 약물을 대상에게 투여하는 단계, 여기서 항암 약물의 제 1 투여는 시간 T1 에서임;
c) 대상으로부터의 샘플 중 시간 T2 에서 BCR-ABL 의 활성화 상태 및 또는 발현 수준을 측정하는 단계; 및
d) BCR-ABL 의 활성화 상태 및 또는 발현 수준에 기초하여 치료 과정을 결정하는 단계.
본 발명의 다른 목적, 특색, 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도 1 은 본 발명의 하나의 구현예의 흐름도를 나타낸다.
도 2A-G 는 세포 단리 장비 (cell isolation apparatus) 의 구현예를 나타낸다. 도 2A 는 상실 (upper chamber) 의 구현예이다. 도 2B-C 는 캡 (cap) 이 있는 상실을 보여준다; 도 2D-E 는 하실 (upper chamber) 이고; 도 2F-G 는 수집 튜브 (collection tube) 이다.
도 3A-D 는 다양한 깔때기 (funnel) 기능성이 있는 하실의 구현예를 나타낸다.
도 4A-D 는 세포 단리 장비의 구현예를 나타낸다. 도 4A 는 상실 및 하실의 구현예이고; 도 4B 는 상실 및 하실의 구현예이고; 도 4C 는 수집 튜브의 구현예이고; 도 4D 는 상실, 하실 및 수집 튜브의 집합체 (aggregation) 의 구현예이다.
도 5A-D 는 세포 단리 장비의 또다른 구현예를 나타낸다. 도 5A 는 상실 및 하실의 구현예이고; 도 5B 는 캡이 있는 상실 및 하실의 구현예이고; 도 5C 는 캡이 있는 수집 튜브의 구현예이고; 도 5D 는 하실 및 깔때기의 구현예이다.
도 6A-C 는 세포 단리 장비의 또다른 구현예를 나타낸다. 도 6A 는 상실 및 하실의 구현예이고; 도 6B 는 중간 슬리브 (middle sleeve) 가 있는 상실 및 하실의 구현예이고; 도 6C 는 하실의 구현예이다.
도 7A-B 는 총 (total) 및 인산화된 (phosphorylated) BCR-ABL 둘다가 여과에 의해 K562 세포로부터 제조된 세포 용해물 중에서 탐지 및 측정될 수 있음을 나타낸다. 여과 후에 세포 중 총 BCR-ABL 의 수준은 여과되지 않은 샘플 중 관찰된 수준과 유사하다. 부가적으로, 도 7B 는 여과 후에 K562 세포 중 인산화된 BCR-ABL 의 수준이 가공되지 않은 세포 중 탐지된 수준과 비슷함을 보여준다.
도 8A-B 는 총 (도 8A) 및 인산화된 BCR-ABL 수준 (도 8B) 둘다가 세포 용해물 중에서 탐지 및 측정될 수 있음을 나타내며, 여기서 세포 용해물은 K562 세포로 스파이크 (spike) 된 혈액 샘플로부터 제조되고, 여과 막을 통하여 여과되고, 마이크로어레이 예컨대 본원에 기재된 근접-매개 면역검정 (proximity-mediated immunoassay) 에 의해 분석된다. 도 8B 는 다양한 속도에서 원심분리되었던 상이한 샘플 중 총 및 인산화된 BCR-ABL 의 백분율 회수가 비교될 수 있음을 보여준다. 회수된 포스포-BCR-ABL (phospho-BCR-ABL) (63.60%) 및 총 BCR-ABL (141.55%) 신호의 최고 백분율은 PALL 여과 막을 사용하고 600 rpm 에서 원심분리한 경우로부터였다.
도 9A-B 는 인산화된 BCR-ABL 수준 (A) 이 다양한 양의 K562 세포로 스파이크된 혈액 샘플로부터 제조되고, 여과 막을 통하여 여과되고, 마이크로어레이 예컨대 본원에 기재된 근접-매개 면역검정에 의해 분석된 세포 용해물 중에서 탐지 및 측정될 수 있음을 나타낸다. 본 발명의 방법은 K562 세포로 스파이크된 샘플 중 포스포-BCR-ABL 의 수준을 탐지하는데 사용될 수 있다. 특히, 인산화된 BCR-ABL 의 측정된 수준은 혈액 샘플에 첨가된 K562 세포의 수와 관련된다. 도 9B 는 총 BCR-ABL 회수를 보여준다.
도 10 은 발명의 하나의 구현예에서 분석된 환자에 대해 작성된 표이다. 환자 1 은 활성 CML 을 갖고 2006 년 12 월부터 치료를 받아 왔다. 또한 활성 CML 을 갖는 환자 2 는 1 월부터 이마티닙 치료를 받아 왔다.
도 11A-B 는 환자 1 (A) 이 환자 2 (예를 들어, 185,934 CU/㎖ + 11,019 CU/㎖) (B) 에 비해 혈액 1 ㎖ 당 더 적은 양의 포스포-BCR-ABL (예를 들어, 10,979 CU/㎖ + 1,245 CU/㎖) 을 가짐을 나타내어, 환자 1 이 이마티닙 치료에 반응함을 시사한다. 상기 값들은 혈액 배경을 뺄셈하지 않고 측정되었다.
도 12A-B 는 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 BCR-ABL 의 활성화된 (인산화된) 수준의 탐지를 보여준다. 환자 1 로부터 단리된 세포 용해물 샘플은 실시예 6 에 기재된 방법에 따라 1:5 및 1:20 희석되었다. 표준 샘플은 80 ㎕ 의 용해물 당 다양한 # 의 세포 (예를 들어, 10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 또는 0 세포 / 80 ㎕) 를 함유하는 미처리된 K562 세포 용해물을 나타낸다. 도 12A 의 위쪽 패널은 BCR-ABL CEER 검정의 이미지를 보여준다.
도 13A-B 는 환자 1 로부터의 혈액 샘플의 이마티닙을 이용한 시험관내 처리가 인산화된 BCR-ABL 의 양을 닐로티닙 처리에 비해 극적으로 감소시켰음을 보여준다. 도 13A 는 BCR-ABL CEER 검정의 이미지를 보여준다.
도 14 는 증가하는 양의 BCR-ABL 저해제 (예를 들어, 이마티닙 또는 닐로티닙) 로 처리될 때 환자 1 의 혈액 샘플 중 활성화된 BCR-ABL 수준이 변화함을 보여준다. 상이한 농도의 약물이 환자 1 의 혈액 샘플과 함께 1.5 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션되었다. 평균 CU 값은 1μM 이마티닙 처리 후 26 이었고, 0.1μM 이마티닙 처리 후 110 이었다. 도 13 의 위쪽 패널은 BCR-ABL CEER 검정의 이미지를 보여준다.
도 15A-B 는 환자 1 의 혈액 샘플 중 활성화된 BCR-ABL 단백질을 감소시키는데 이마티닙이 닐로티닙보다 더욱 효과적임을 보여준다. 막대 그래프는 1μM 이마티닙 처리가 미처리된 샘플에 비해 활성화된 BCR-ABL 수준을 감소시켰음 (A) 을 보여준다. 도 15B 는 혈액 배경을 뺄샘한 후이다.
도 16A-D 는 다른 인산화 신호 전달 경로 구성요소 예컨대 CRKL (A), AKT (B), STAT5 (C) 및 SRC (D) 의 경로 프로파일 (pathway profile) 을 나타낸다. 그것은 다사티닙 요법이 환자 1 의 혈액 샘플 중 활성화된 AKT, STAT4 및 SRC 의 수준을 감소시킬 수 있음을 보여준다. 1μM 다사티닙을 이용한 환자의 혈액 샘플의 시험관내 처리는 10μM 이마티닙 또는 10μM 닐로티닙보다 더욱 효과적이었다.
도 17 은 환자 1 의 혈액 샘플이 매우 높은 수준의 총 BCR (약 8,000,000 CU/㎖) 을 함유함을 보여준다.
도 18A-B 는 환자 2 로부터의 시험관내-처리된 혈액 샘플 중 활성화된 BCR-ABL 수준을 감소시키는데 닐로티닙이 이마티닙보다 더욱 효과적임을 나타낸다. 도 18A 는 포스포 BCR-ABL 신호의 % 회수를 감소시키는데 환자 2 의 혈액 샘플의 10μM 닐로티닙과의 시험관내 인큐베이션이 가장 효과적인 처리였음을 보여준다. 1.5 시간 동안 37℃ 에서 상이한 투여량의 BCR-ABL 저해제에 의한 환자 혈액 샘플의 시험관내 처리 후 인산화된 BCR-ABL 수준이 탐지 및 측정되었다. 도 18B 는 증가하는 투여량의 닐로티닙은 활성화된 BCR-ABL 을 감소시키지만 이마티닙은 환자 2 의 혈액 샘플에 대해 효과가 없음을 보여준다. 포스포 BCR-ABL 신호의 % 회수는 10μM 닐로티닙에 의해 39.35% 로 감소되었고, 10μM 이마티닙에 의해 오직 96.46% 로 감소되었다.
도 19A-D 는 다사티닙에 의한 환자 2 의 혈액 샘플의 시험관내 처리가 활성화된 CRKL (A), AKT (B), STAT5 (C) 및 SRC (D) 의 수준을 감소시킬 수 있음을 보여준다. 반면에, 이마티닙 또는 닐로티닙 처리에 의한 유사한 처리는 오직 인산화된 AKT 를 감소시킨다.
도 20A-D 는 티로신 키나제 저해제로 또한 시험관내 처리되었던 여러 환자 혈액 샘플에서 인산화된 CRKL 수준이 탐지 및 측정될 수 있음을 보여준다. BCR-ABL 저해제 예컨대 이마티닙 및 닐로티닙은 오직 환자 1 로부터의 혈액 샘플 중 CRKL 수준을 감소시킬 수 있고, 환자 2 로부터의 혈액 샘플 중 CRKL 수준은 감소시킬 수 없다. 도 20A-B 는 포스포 CRKL 수준 (CU/혈액의 ㎖) 이 10μM 이마티닙 또는 10μM 닐로티닙으로 시험관내 처리된 환자 1 샘플에서, 비-처리된 샘플에 비해, 감소했음을 보여준다. 유사하게, 도 20C-D 는 환자 1 샘플에서, 포스포 CRKL 신호의 백분율이 시험관내 처리 후 감소되었음을 보여준다. 유사한 반응이 환자 2 샘플에서는 관찰되지 않는다.
도 21A-D 는 환자 1 및 환자 2 가 이마티닙 및 닐로티닙에 유사하게 반응하지 않음을 나타낸다. 활성화된 AKT 는 이마티닙 처리 후 환자 1 로부터의 샘플에서 증가했으나, 환자 2 로부터의 샘플에서는 감소했다. 닐로티닙에 반응하여, AKT 수준은 환자 1 로부터의 샘플에서 비-처리된 샘플에 비해 거의 변함 없이 유지되고, 환자 2 로부터의 샘플에서 크게 감소한다. 도 21A-B 는 검정된 세포 1000 개 당 활성화된 AKT 의 피코그램으로서 계산된 결과를 보여준다. 도 21C-D 는 CEER 검정으로부터 회수된 AKT 신호의 백분율로서 결정된 결과를 보여준다.
도 22A-B 는 환자 1 (A) 및 환자 2 (B) 로부터의 시험관내-처리된 혈액 샘플의 활성화된 STAT5 프로파일을 보여준다. 다사티닙 처리는 환자 1 및 2 로부터의 샘플 중 포스포-STAT5 수준을 감소시켰다. 이마티닙 또는 닐로티닙 처리는 활성화된 STAT5 를 동일한 정도로 변화시키지 않았다.
도 23A-D 는 환자 1 및 2 둘다로부터의 샘플이 이마티닙, 닐로티닙 및 다사티닙에 대한 반응으로 더 낮은 수준의 포스포-SRC 를 가짐을 보여준다. 도 23A-B 는 검정된 세포 1000 개 당 피코그램으로서 계산된 포스포-SRC 수준을 나타낸다. 도 23C-D 는 회수된 포스포 SRC 신호의 백분율로서 포스포 SRC 수준을 나타낸다.
도 24 는 이 연구에 참여한 환자의 목록을 나타낸다. 환자들은 CML 로 진단되었고, 표적화 치료를 받았다. CEER 검정을 통한 BCR-ABL 저해의 생체내 조정이 모니터링되었다.
도 25 는 이 연구에 참여한 일부 환자의 목록을 나타낸다. 별표는 본 발명의 세포 단리 장비의 튜브 구현예를 사용하여 가공된 혈액 샘플을 나타낸다. 다른 혈액 샘플은 96-웰 구현예를 사용하여 가공되었다.
도 26 은 정상, 건강한 대상으로부터의 혈액 샘플 중 BCR-ABL, BCR 및 ABL 의 발현 수준를 나타낸다.
도 27A-B 는 다수의 시점에서 환자 1 (A) 및 7 (B) 의 활성화된 BCR-ABL 수준을 나타낸다. WBC = 백혈구. pBCR-ABL= 포스포-BCR-ABL. tBCR-ABL= 총 BCR-ABL. %P/T = 포스포-BCR-ABL/tBCR-ABL (단위: 백분율).
도 28A-C 는 다수의 시점에서 환자 2 의 BCR-ABL 프로파일을 나타낸다. 도 28A 는 pBCR-ABL/WBC 비가 5/11 에 채취된 혈액에서 하락했고 10/12 까지 증가했음을 보여준다. 별표는 pBCR-ABL 데이타가 그래프 상에서 보일 수 있도록 10 배로 증대되었음을 나타낸다. 도 28B 는 pBCR-ABL/총 BCR-ABL 비가 5/11 에 최저였음을 보여준다. 도 28C 는 BCR-ABL 용 MolecularMD 키트 및 낮은 수준의 mRNA 를 사용하는 정량적 RT-PCR 분석의 결과를 보여준다. BCR-ABL/ABL 의 백분율은 샘플에 존재하는 mRNA 의 양에 따라 다르다.
도 29A-B 는 다수의 시점에서 환자 3 의 WBC 수 및 pBCR-ABL/WBC 비를 나타낸다 (A). 도 29B 는 총 및 활성화된 BCR-ABL 수준 및 mRNA 백분율의 변화를 보여준다.
도 30A-B 는 다수의 시점에서 환자 8 의 총 및 활성화된 BCR-ABL 수준을 나타낸다 (A). 도 30B 는 처리 후 총 및 활성화된 BCR-ABL 수준 및 mRNA 백분율의 변화가 이마티닙으로부터 다사티닙까지 변화했음을 보여준다.
도 31A-B 는 다수의 시점에서 환자 14 (B) 및 18 (A) 중 총 및 활성화된 BCR-ABL 수준을 나타낸다.
도 32A-B 는 이마티닙 또는 닐로티닙의 시험관내 처리에 대한 환자 14 의 반응을 보여준다. 총 및 포스포-BCR-ABL 수준이 약물 처리 후 감소되었다.
I. 서론
본 발명은 유리하게는 치료제 예컨대 항암 약물 (예를 들어, 티로신 키나제 저해제 예컨대, 예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 포나티닙 (AP24534), 및 그들의 조합) 의 세포내 농도를 변화시키지 않으면서 여과에 의해 혈액 샘플로부터 혈액 세포의 부분집합 예컨대 정상 및/또는 악성 백혈구, 백혈병 세포, 포말 세포, 및/또는 순환 종양 세포 (CTC) 를 단리 또는 회수하기 위한 신규한 장비 및 방법을 제공한다. 종래의 기술과 반대로, 본 발명의 장비 및 방법은 치료제 예컨대 항암 약물 (예를 들어, 티로신 키나제 저해제) 의 실질적 희석 없이 회수된 세포 예컨대 백혈구, 백혈병 세포, 포말 세포, 및/또는 순환 종양 세포로부터의 세포 용해물을 제공한다.
BCR-ABL 융합 단백질은 만성 골수성 백혈병 (CML) 뿐만 아니라 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia: ALL) 과 연관된다. 특히, BCR-ABL 단백질은 암 발병기전에 대단히 중요한 활성 티로신 키나제이다. 이마티닙 (Gleevec®) 은 CML 로 새롭게 진단된 환자를 위한 현재의 제 1 선 요법이지만, 환자의 약 20-25% 는 지속되는 완전한 세포유전학적 반응을 달성하지 않는다. 연구들은 계속된 이마티닙 치료의 존재시 BCR-ABL 키나제 활성의 재활성화가 저항성의 주된 원인임을 밝혔다. 그와 같이, BCR-ABL 활성의 측정은 티로신 키나제 저해제 예컨대 이마티닙을 이용한 요법에 대한 반응을 예측함에 있어서 뿐만 아니라 그러한 저해제에 대한 저항성을 발달시키는 환자를 동정함에 있어서 유용하다.
특정 구현예에서, 본 발명의 장비 및 방법은 샘플 예컨대 혈액으로부터 관심의 세포 (예를 들어, 백혈구, 백혈병 세포, 포말 세포, 및/또는 순환 종양 세포) 를 단리 또는 회수하고, 그로부터 용해물을 제조하는데 사용될 수 있으며, 여기서 분석물질 예컨대, 예를 들어, 결과로서 얻어지는 세포 용해물에 존재하는 BCR-ABL 은 검정 예컨대 공동 효소 증강 반응성-면역검정 (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive-immunoassay: CEER™) [또한 공동 근접 면역검정 (COllaborative Proximity ImmunoAssay (COPIA)) 으로 알려짐] 을 사용하여 그들의 발현 및/또는 활성화 수준에 대해 심문될 수 있다. CEER™ 는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 하기 특허 문헌에 기재되어 있다: PCT 공개 번호 WO 2008/036802; PCT 공개 번호 WO 2009/012140; PCT 공개 번호 WO 2009/108637; PCT 공개 번호 WO 2010/132723; PCT 공개 번호 WO 2011/008990; 및 2010 년 10 월 20 일에 제출된 PCT 출원 번호 PCT/US2010/053386.
특정 구현예에서, 하나 이상의 종양원성 융합 단백질 (oncogenic fusion protein), 그의 기질, 및/또는 다른 신호 전달 경로 단백질 (signal transduction pathway protein) (예를 들어, BCR-ABL, BCR, ABL, CRKL, JAK2, STAT5, Src, FAK, c-ABL, c-CBL, SHC, SHP-2, VAV, BAP-1, AKT, SRC, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR, c-Met, c-KIT, IGF-IR, PI3K 등) 의 발현/활성화 프로파일링이 본 발명의 장비 및 방법을 사용하여 제조된 세포 용해물에 대해 수행되어 BCR-ABL 매개 질환 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병) 이 있는 환자에 대한 저해제 요법의 효능을 확인할 수 있다. 일부 경우에, 환자는 저해제 요법 예컨대 본원에 기재된 티로신 키나제 저해제를 이용한 치료를 받고 있을 수 있다. 특정 경우에, 백혈병 세포는 티로신 키나제 저해제의 실질적 희석 없이 그러한 환자의 혈액 샘플로부터 단리된다. 특정 다른 경우에, 티로신 키나제 저해제를 이용한 시험관내 처리 후 샘플 중 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 경로 구성요소의 발현/활성화 프로파일링은 임상의가 효과적 치료적 섭생을 선별할 수 있게 하는 귀중한 정보를 제공할 수 있다.
비제한적 예로서, 티로신 키나제 저해제 요법을 받고 있는 환자로부터의 혈액 샘플이 분석되어 요법의 효과성을 확인할 수 있다. 환자의 혈액이 채취될 수 있고, 관심의 세포 예컨대 백혈구, 백혈병 세포, 및/또는 순환 종양 세포가 발명의 장비 및 방법을 사용하여 여과에 의해 단리된다. 그 후 세포가 용해되고, 검정 예컨대 CEER™ 을 사용하여 심문되어 하나 또는 복수의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL), 그의 기질 (예를 들어, BCR-ABL 기질 예컨대 CRKL, JAK2, STAT5, Src, FAK, c-ABL, c-CBL, SHC, SHP-2, VAV, 및/또는 BAP-1), 및/또는 다른 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 총량에 대한 티로신 키나제 저해제 치료의 효과를 확인한다. 특정 구현예에서, 백혈구, 백혈병 세포, 및/또는 순환 종양 세포의 수 및 인산화된 BCR-ABL 및 다른 신호 전달 경로 구성요소의 프로파일이 확인될 수 있다. 인산화 신호 비가 또한 분석으로부터 계산되고 환자의 예후를 결정하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 시간 T1 에서 티로신 키나제 저해제를 투여하고, 환자로부터의 샘플 중 시간 T2 에서 BCR-ABL 의 활성화 상태 및/또는 발현 수준을 측정하고, BCR-ABL 의 활성화 상태 및/또는 발현 수준에 기초하여 치료 과정을 결정함으로써 환자에서 티로신 키나제 저해제 요법의 효능이 모니터링될 수 있다.
또다른 비제한적 예로서, 환자 (예를 들어, 티로신 키나제 저해제 치료를 받고 있지 않는) 로부터의 혈액 샘플이 백혈구, 백혈병 세포 및/또는 순환 종양 세포 (CTC) 의 단리 전에 하나 이상의 저해제와 함께 시험관내 인큐베이션될 수 있다. 특정 경우에, CML 로 진단된 환자로부터 수집된 전혈 샘플이 하나 이상의 티로신 키나제 저해제 (예를 들어, 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙 등) 로 처리된다. 관심의 세포 예컨대 백혈병 세포가 본 발명의 장비 및 방법을 사용하여 여과에 의해 단리된다. 그 후 세포가 용해되고 검정 예컨대, 예를 들어, CEER™ 을 사용하여 심문되어 하나 또는 복수의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL), 그의 기질 (예를 들어, BCR-ABL 기질 예컨대 CRKL, JAK2, STAT5, Src, FAK, c-ABL, c-CBL, SHC, SHP-2, VAV, 및/또는 BAP-1) 및/또는 다른 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 총량에 대한 티로신 키나제 저해제 치료의 효과를 확인한다. 특정 구현예에서, 샘플로부터의 단리된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 또는 수준을 측정하고, 단리된 세포를 치료의 개시 전에 하나 이상의 항암 약물 예컨대 하나 이상의 티로신 키나제 저해제와 인큐베이션하고, 인큐베이션된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 또는 수준을 측정하고, BCR-ABL 의 활성화 상태 또는 수준에 기초하여 치료 과정을 선별함으로써, 환자에 적합한 티로신 키나제 저해제가 선별될 수 있다.
II. 정의
본원에서 사용되는 하기 용어들은 다르게 명시되지 않으면 그들에게 부여된 의미를 갖는다.
용어 "암" 은 이상 세포의 조절되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환 부류의 임의의 일원을 포함한다. 상기 용어는, 악성, 양성, 연조직 또는 고형으로 특징지어지든 아니든, 모든 알려진 암 및 신생물 상태, 및 전이전 및 전이후 암을 포함하는 모든 단계 및 등급의 암을 포함한다. 상이한 유형의 암의 비제한적 예는 혈액성 악성종양 (예를 들어, 백혈병, 림프종); 골육종 (예를 들어, 유잉 육종); 연조직 육종 (예를 들어, 융기성피부섬유육종 (DFSP), 횡문근육종); 다른 연조직 악성종양, 유두상 갑상선 암종; 전립선암; 위암 (예를 들어, 위); 유방암; 폐암 (예를 들어, 비-소 세포 폐암); 소화 및 위장관 암 (예를 들어, 대장직장암, 위장관 기질 종양, 위장관 카르시노이드 종양, 대장암, 직장암, 항문암, 담도암, 및 소장암); 식도암; 담낭암; 간암; 췌장암; 맹장암; 난소암; 신장암 (예를 들어, 신세포 암종); 중추신경계의 암; 피부암; 융모암종; 및 두경부암을 포함한다. 본원에서 사용되는, "종양" 은 하나 이상의 암 세포를 포함한다.
"혈액성 악성종양" 은 혈액, 골수, 및/또는 림프절에 영향을 미치는 임의의 유형의 암을 포함한다. 혈액성 악성종양의 예는 백혈병, 림프종, 및 다발성 골수종을 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다. 상이한 종류의 백혈병의 비제한적 예는 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 대형 과립 림프구성 백혈병을 포함한다. CML 의 하위유형은, 예를 들어, 만성 단핵구성 백혈병을 포함한다. ALL 의 하위유형은, 예를 들어, 전구체 B-세포 급성 림프구성 백혈병, 프로-B-세포 급성 림프구성 백혈병, 전구체 T-세포 급성 림프구성 백혈병, 및 급성 이중표현형 백혈병을 포함한다. CLL 의 하위유형은, 예를 들어, B-세포 전림프구성 백혈병을 포함한다. AML 의 하위유형은, 예를 들어, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수모세포성 백혈병, 및 급성 거대핵모세포성 백혈병을 포함한다. 상이한 종류의 림프종의 예는 호지킨 림프종 (4 개의 하위유형) 및 비-호지킨 림프종, 예컨대, 예를 들어, 소림프구성 림프종 (SLL), 확산 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 소포 림프종 (FL), 외투 세포 림프종 (MCL), 모발상 세포 백혈병 (HCL), 변연부 림프종 (MZL), 버킷 림프종 (BL), 이식후 림프증식성 장애 (PTLD), T-세포 전림프구성 백혈병 (T-PLL), B-세포 전림프구성 백혈병 (B-PLL), 발덴스트룀 거대글로불린혈증 (또한 림프형질세포성 림프종), 및 기타 NK- 또는 T-세포 림프종을 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다.
용어 "분석물질" 은 존재, 양, 및/또는 정체가 결정되는 임의의 관심의 분자, 전형적으로 거대분자, 예를 들어, 폴리펩티드를 포함한다. 특정 경우에, 분석물질은 암 세포의 세포 성분, 바람직하게는 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자이다.
용어 "변환" 또는 "변환한다" 는 분석물질을 추출하거나 본원에 기재된 바와 같이 분석물질을 변화 또는 개질시키는 분석물질 또는 샘플의 물리적 및/또는 화학적 변화를 포함한다. 본원에서 사용되는, 추출, 조작, 화학적 침전, ELISA, 복합체화, 면역-추출, 분석물질의 수준 또는 농도 또는 활성화 상태를 측정하는 분석물질 또는 샘플의 물리적 또는 화학적 개질은 모두 변환을 구성한다. 다시 말하면, 변환 단계 전에 및 후에 분석물질 또는 샘플이 동일하지 않는 한, 변화 또는 개질은 변환이다.
본원에 사용되는 용어 "희석 시리즈" 는 특정 샘플 (예를 들어, 세포 용해물) 또는 시약 (예를 들어, 항체) 의 농도가 감소되는 시리즈를 포함하는 것으로 의도된다. 희석 시리즈는 전형적으로 측정된 양의 출발 농도의 샘플 또는 시약을 희석제 (예를 들어, 희석 완충제) 와 혼합하여 더 낮은 농도의 샘플 또는 시약을 제조하고, 이 과정을 충분한 회수로 반복하여 원하는 수의 계단 희석물을 수득하는 과정에 의해 생성된다. 샘플 또는 시약은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500, 또는 1000-배로 계단 희석되어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 개의 감소하는 농도의 샘플 또는 시약을 포함하는 희석 시리즈를 생성할 수 있다. 예를 들어, 1 ㎎/㎖ 출발 농도에서 포획 항체 시약의 2-배 계단 희석물을 포함하는 희석 시리즈는 일정량의 출발 농도의 포획 항체를 동일양의 희석 완충제와 혼합하여 0.5 ㎎/㎖ 농도의 포획 항체를 생성하고, 이 과정을 반복하여 0.25 ㎎/㎖, 0.125 ㎎/㎖, 0.0625 ㎎/㎖, 0.0325 ㎎/㎖ 등의 포획 항체 농도를 수득함으로써 생성될 수 있다.
용어 "융합 단백질" 또는 "키메라 단백질" 은 원래 별개의 단백질을 인코딩하는 둘 이상의 유전자의 연결을 통해 생성되는 단백질을 포함한다. 그러한 유전자 융합은 전형적으로 염색체 전위가 하나의 유전자의 말단 엑손을 제 2 유전자로부터의 온전한 엑손으로 교체할 때 생성된다. 이는 기능적 융합 단백질로 전사, 스플라이싱, 및 해독될 수 있는 단일 유전자를 생성한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 종양원성 융합 단백질, 즉, 종양형성에 관여되는 융합 단백질이다. 종양원성 융합 단백질의 예는 BCR-ABL, DEK-CAN, E2A-PBX1, RARα-PML, IREL-URG, CBFβ-MYH11, AML1-MTG8, EWS-FLI, LYT-10-Cα1, HRX-ENL, HRX-AF4, NPM-ALK, IGH-MYC, RUNX1-ETO, TEL-TRKC, TEL-AML1, MLL-AF4, TCR-RBTN2, COL1A1-PDGF, E2A-HLF, PAX3-FKHR, ETV6-NTRK3, RET-PTC, TMRSS-ERG, 및 TPR-MET 를 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다.
용어 "신호 전달 분자" 또는 "신호 전달인자" 는 세포외 신호 또는 자극을, 전형적으로 세포 내부에서의 정연한 순서의 생화학 반응을 포함하는, 반응으로 전환시키는 과정을 수행하는 단백질 및 기타 분자를 포함한다. 신호 전달 분자의 예는 수용체 티로신 키나제 예컨대 EGFR (예를 들어, EGFR/HER-1/ErbB1, HER-2/Neu/ErbB2, HER-3/ErbB3, HER-4/ErbB4), VEGFR-1/FLT-1, VEGFR-2/FLK-1/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, PDGFR (예를 들어, PDGFRA, PDGFRB), c-Met, c-KIT/SCFR, INSR (인슐린 수용체), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (인슐린 수용체-관련 수용체), CSF-1R, FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, V-카드헤린, LTK (백혈구 티로신 키나제), ALK (역형성 림프종 키나제), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, RTK 106, 및 수용체 티로신 키나제의 절두된 (truncated) 형태 예컨대 p95ErbB2; 비-수용체 티로신 키나제 예컨대 Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, 및 LIMK; 티로신 키나제 신호전달 케스케이드 성분 예컨대 Akt, MAPK/ERK, MEK, RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66), PI3K, Ras (예를 들어, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Rac1, Cdc42, PLC, PKC, p70 S6 키나제, p53, 사이클린 D1, STAT1, STAT3, PIP2, PIP3, PDK, mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, PTEN, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67, 및 팍실린; 핵 호르몬 수용체 예컨대 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 안드로겐 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 미네랄코르티코이드 수용체, 비타민 A 수용체, 비타민 D 수용체, 레티노이드 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 및 고아 수용체; 핵 수용체 공활성화인자 및 억제인자; 및 그들의 조합을 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플" 은 환자로부터 수득된 임의의 생물학적 시편을 포함한다. 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 도관 세척 유체, 유두 흡인물, 림프 (예를 들어, 림프절의 파종성 종양 세포), 골수 흡인물, 타액, 소변, 대변 (즉, 배설물), 가래, 기관지 세척 유체, 눈물, 미세 바늘 흡인물 (예를 들어 무작위 유륜주위 미세 바늘 흡인에 의해 수확된), 임의의 기타 체액, 조직 샘플 (예를 들어, 종양 조직) 예컨대 종양의 생검 (예를 들어 바늘 생검) 또는 림프절 (예를 들어, 전초 림프절 생검), 및 이의 세포 추출물을 제한 없이 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 전혈 또는 그의 성분 예컨대 혈장, 혈청, 적혈구, 백혈구 예컨대 말초 혈액 단핵 세포, 및/또는 희귀 순환 세포이다. 특정 구현예에서, 샘플은 당업계에 알려진 임의의 기술을 사용하여 전혈 또는 그의 세포성 분획으로부터 고형 종양의 순환 세포 또는 백혈구를 단리함으로써 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은, 예를 들어, 고형 종양으로부터의 포르말린 고정 파라핀 내입 (FEPE) 종양 조직 샘플이다.
본원에서 사용되는 용어 "순환 세포" 는 고형 종양으로부터 전이되거나 소전이된 종양외 세포를 포함한다. 순환 세포의 예는 순환 종양 세포, 암 줄기 세포, 및/또는 종양으로 이동하는 세포 (예를 들어, 순환 내피 전구 세포, 순환 내피 세포, 순환 혈관형성촉진 골수 세포, 순환 수지상 세포 등) 를 제한 없이 포함한다.
"생검" 은 진단 또는 예후 평가를 위해 조직 샘플을 제거하는 과정, 및 조직 시편 그 자체를 언급한다. 당업계에 알려진 임의의 생검 기술이 본 발명의 방법 및 조성물에 적용될 수 있다. 적용되는 생검 기술은 일반적으로, 기타 인자들 중에서, 평가되는 조직 유형 및 종양의 크기 및 유형 (즉, 고형 또는 현탁형 (즉, 혈액 또는 복수 (ascites)) 에 의존할 것이다. 대표적인 생검 기술은 절제 생검 (excisional biopsy), 절개 생검 (incisional biopsy), 바늘 생검 (예를 들어, 중심 바늘 생검 (core needle biopsy), 미세 바늘 흡인 생검 (fine-needle aspiration biopsy) 등), 외과 생검, 및 골수 생검을 포함한다. 생검 기술은, 예를 들어, Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70 및 Part V. 전체에서 논의되어 있다. 당업자는 생검 기술을 수행하여 제공된 조직 샘플에서 암 및/또는 전암 세포를 동정할 수 있음을 이해할 것이다.
용어 "대상", "환자", 또는 "개체" 는 전형적으로 인간을 포함하나, 예를 들어, 기타 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 양, 돼지 등을 포함하는 기타 동물을 또한 포함한다.
"어레이" 또는 "마이크로어레이"는 고체 지지체 예컨대, 예를 들어, 유리 (예를 들어, 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드 (예를 들어, 자기 비드, 폴리스티렌 비드 등), 종이, 막 (예를 들어, 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 등), 섬유 다발, 또는 임의의 기타 적합한 기질에 고정되거나 구속된 포획 항체의 별개의 세트 및/또는 희석 시리즈를 포함한다. 포획 항체는 일반적으로 공유적 또는 비공유적 상호작용 (예를 들어, 이온 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 쌍극자-쌍극자 결합) 을 통해 고체 지지체에 고정되거나 구속된다. 특정 경우에, 포획 항체는 고체 지지체에 결합된 포획제와 상호작용하는 포획 태그를 포함한다. 본원에 기재된 검정에 사용되는 어레이는 전형적으로 상이한 알려진/어드레싱가능 위치에서 고체 지지체의 표면에 커플링되는 복수의 상이한 포획 항체 및/또는 포획 항체 농축물을 포함한다.
용어 "포획 항체" 는 샘플 예컨대 백혈구 또는 희귀 순환 세포의 세포 추출물 내의 하나 이상의 관심의 분석물질에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 고정된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 어레이에서 고체 지지체 상에 구속된다. 고체 지지체 상에 임의의 다양한 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자를 고정시키기에 적합한 포획 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), 및 BD Biosciences (San Jose, CA) 로부터 입수가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "탐지 항체" 는 샘플 내의 하나 이상의 관심의 분석물질에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 탐지가능한 표지를 포함하는 항체를 포함한다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 관심의 분석물질에 특이적인 항체를 포함하며, 상기 항체는 탐지가능한 표지를 포함하는 또다른 종에 의해 결합될 수 있다. 탐지가능한 표지의 예는 비오틴/ 스트렙타비딘 표지, 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 표지, 화학적 반응 표지, 형광 표지, 효소 표지, 방사선 표지, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 임의의 다양한 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 총량을 탐지하기에 적합한 탐지 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), 및 BD Biosciences (San Jose, CA) 로부터 입수가능하다. 비제한적인 예로서, 신호 전달 분자 예컨대 EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, Akt, MAPK, PTEN, Raf, 및 MEK 의 다양한 인산화된 형태에 대한 포스포(phospho)-특이적 항체가 Santa Cruz Biotechnology 로부터 입수가능하다.
용어 "활성화 상태-의존적 항체" 는 샘플 내의 하나 이상의 관심의 분석물질의 특정 활성화 상태에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 탐지 항체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 활성화 상태-의존적 항체는 하나 이상의 분석물질 예컨대 하나 이상의 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 인산화, 유비퀴틴화된 및/또는 복합체화 상태를 탐지한다. 일부 구현예에서, BCR-ABL 융합 단백질의 ABL 키나제 도메인의 인산화가 활성화 상태-의존적 항체를 사용하여 탐지된다. 다른 구현예에서, 수용체 티로신 키나아제의 EGFR 패밀리 일원의 인산화 및/또는 EGFR 패밀리 일원 사이의 이종이합체 복합체의 형성이 활성화 상태-의존적 항체를 사용하여 탐지된다.
활성화 상태-의존적 항체를 이용한 탐지에 적합한 종양원성 융합 단백질의 활성화 상태의 비제한적 예는 BCR-ABL, DEK-CAN, E2A-PBX1, RARα-PML, IREL-URG, CBFβ-MYH11, AML1-MTG8, EWS-FLI, LYT-10-Cα1, HRX-ENL, HRX-AF4, NPM-ALK, IGH-MYC, RUNX1-ETO, TEL-TRKC, TEL-AML1, MLL-AF4, TCR-RBTN2, COL1A1-PDGF, E2A-HLF, PAX3-FKHR, ETV6-NTRK3, RET-PTC, TMRSS-ERG, 및 TPR-MET 의 인산화된 형태를 포함한다. 활성화 상태-의존적 항체를 이용한 탐지에 적합한 신호 전달 분자의 활성화 상태 (괄호 안에 열거됨) 의 예는 EGFR (EGFRvIII, 인산화된 (p-) EGFR, EGFR:Shc, 유비퀴틴화된 (u-) EGFR, p-EGFRvIII); ErbB2 (p95:절두된 (Tr)-ErbB2, p-ErbB2, p95:Tr-p-ErbB2, HER-2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c-Met (p-c-Met 또는 c-Met/HGF 복합체), ER (p-ER (S118, S167); IGF-1R (p-IGF-1R, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); 키트 (p-KIT); FLT3 (p-FLT3); HGFRI (p-HGFRI); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRa (p-PDGFRa); PDGFRP (p-PDGFRP); VEGFRI (p-VEGFRI, VEGFRI:PLCg, VEGFR1:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCy, VEGFR2:Src, VEGFR2:헤파린 설페이트, VEGFR2:VE-카드헤린); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); Tie1 (p-Tie1); Tie2 (p-Tie2); EphA (p-EphA); EphB (p-EphB); NFKB 및/또는 IKB (p-IK (S32), p-NFKB (S536), p-P65:IKBa); Akt (p-Akt (T308, S473)); PTEN (p-PTEN); Bad (p-Bad (S112, S136), Bad:14-3-3); mTor (p-mTor (S2448)); p70S6K (p-p70S6K (T229, T389)); Mek (p-Mek (S217, S221)); Erk (p-Erk (T202, Y204)); Rsk-1 (p-Rsk-1 (T357, S363)); Jnk (p-Jnk (T183, Y185)); P38 (p-P38 (T180, Y182)); Stat3 (p-Stat-3 (Y705, S727)); Fak (p-Fak (Y576)); Rb (p-Rb (S249, T252, S780)); Ki67; p53 (p-p53 (S392, S20)); CREB (p-CREB (S133)); c-Jun (p-c-Jun (S63)); cSrc (p-cSrc (Y416)); 및 팍실린 (p-팍실린 (Y118)) 을 포함한다.
용어 "활성화 상태-비의존적 항체" 는 활성화 상태와 무관하게 샘플 내의 하나 이상의 관심의 분석물질에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 탐지 항체를 포함한다. 예를 들어, 활성화 상태-비의존적 항체는 하나 이상의 분석물질 예컨대 하나 이상의 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 인산화된 형태 및 인산화되지 않은 형태 둘다를 탐지할 수 있다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일- 또는 이중-가닥 형태의 이들의 중합체 예컨대, 예를 들어, DNA 및 RNA 를 포함한다. 핵산은 합성, 자연 발생적 및 비-자연 발생적이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 수식된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 그러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 및 펩티드-핵산 (PNA) 을 제한 없이 포함한다. 특별히 제한되지 않으면, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오티드의 알려진 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 다르게 명시되지 않으면, 특정 핵산 서열은 그의 보존적으로 수식된 변이체 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명백히 표시된 서열을 또한 암묵적으로 포괄한다.
용어 "티로신 키나제 저해제" 는 수용체 및/또는 비-수용체 티로신 키나제의 선별적 또는 비-선별적 저해제로서 작용하는 임의의 다양한 치료제 또는 약물을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 티로신 키나제 저해제는 일반적으로 효소의 ATP-결합 자리에 결합함으로써 표적 티로신 키나제를 저해한다. 티로신 키나제 저해제의 예는 이마티닙 (Gleevec®; STI571), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®; SU11248), 에를로티닙 (Tarceva®; OSI-1774), 라파티닙 (GW572016; GW2016), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (Zactima™; ZD6474), 포나티닙 (AP24534), 그들의 유도체, 그들의 유사체, 및 그들의 조합을 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 부가적 티로신 키나제 저해제는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,618,829, 5,639,757, 5,728,868, 5,804,396, 6,100,254, 6,127,374, 6,245,759, 6,306,874, 6,313,138, 6,316,444, 6,329,380, 6,344,459, 6,420,382, 6,479,512, 6,498,165, 6,544,988, 6,562,818, 6,586,423, 6,586,424, 6,740,665, 6,794,393, 6,875,767, 6,927,293, 및 6,958,340 에 기재되어 있다. 당업자는 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 티로신 키나제 저해제를 알 것이다. 특정 경우에, 티로신 키나제 저해제는 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염 예컨대 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 또는 아연 염; 암모늄 염 예컨대 3차 아민 또는 4차 암모늄 염; 및 산 염 예컨대 숙시네이트, 타르타레이트, 바이타르타레이트, 디하이드로클로라이드, 살리실레이트, 헤미숙시네이트, 시트레이트, 이소시트레이트, 말레이트, 말레에이트, 메실레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 아세테이트, 카르바메이트, 설페이트, 니트레이트, 포르메이트, 락테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 피루베이트, 옥살아세테이트, 푸마레이트, 프로피오네이트, 아스파르테이트, 글루타메이트, 또는 벤조에이트 염을 제한 없이 포함하는 제약적으로 수용가능한 형태로 투여된다.
용어 "인큐베이션" 은 "접촉" 및 "노출" 과 동의어로 사용되고, 다르게 명시되지 않으면 임의의 특정 시간 또는 온도 요구조건을 포함하지 않는다.
용어 "요법의 과정" 은 암 예컨대 혈액성 악성종양 (예를 들어, 백혈병, 림프종 등) 과 연관되는 하나 이상의 증상을 완화 또는 방지하기 위해 취해지는 임의의 치료적 접근을 포함한다. 상기 용어는 암이 있는 개체의 건강을 개선하는데 유용한 임의의 화합물, 약물, 절차, 및/또는 섭생을 투여하는 것을 포괄하고, 본원에 기재된 임의의 치료제를 포함한다. 당업자는 본 발명의 방법을 사용하여 결정된 하나 이상의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준에 기초하여 요법의 과정 또는 현재의 요법의 과정의 투여량이 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소) 될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
III. 구현예의 설명
본 발명은 유리하게는 치료제 예컨대 항암 약물 (예를 들어, 티로신 키나제 저해제 예컨대, 예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 포나티닙 (AP24534), 및 그들의 조합) 의 세포내 농도를 변화시키지 않으면서 여과에 의해 혈액 샘플로부터 혈액 세포의 부분집합 예컨대, 예를 들어, 백혈구 (예를 들어, 정상 및/또는 악성 백혈구), 백혈병 세포, 포말 세포, 및/또는 순환 종양 세포 (CTC) 를 단리 또는 회수하기 위한 신규한 장비 및 방법을 제공한다. 종래의 기술과 반대로, 본 발명의 장비 및 방법은 치료제 예컨대 항암 약물 (예를 들어, 티로신 키나제 저해제) 의 실질적 희석 없이 회수된 세포 예컨대 백혈구, 백혈병 세포, 포말 세포, 및/또는 순환 종양 세포로부터의 세포 용해물을 제공한다.
특정 경우에, 본 발명은 고형 종양의 호모지네이트 (homogenate), 용해물, 또는 세포 추출물로부터 종양 세포를 단리하기 위한 장비 및 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 장비 및 방법은, 표적 단백질 예컨대 관심의 분석물질을 붕괴 또는 탈인산화할 수 있는 프로테아제 및 포스파타제를 함유하는, 혈장을 실질적으로 제거하고, 표적 단백질 검정에 영향을 미칠 수 있는 간섭 단백질을 또한 실질적으로 제거한다.
도 1 은 본 발명의 종양 세포를 단리 및 수확하는 방법의 하나의 구현예를 나타낸다. 당업자는 본 발명의 범위 내에서의 방법에 대한 다른 변화 및 수식을 인식할 것이다.
하나의 방법 100 에서, 환자 예컨대 CML 을 앓는 환자 (임의로 치료 중인) 로부터 종양 세포가 단리 및 수확된다. 도 1 에 나타난 바와 같이, 전혈이 수집되고 110 여과되어 적혈구가 제거된다. 특정 경우에, 환자로부터의 전혈은 단리 전에 항암 약물, 예컨대 BCR-ABL 저해제로 처리되거나 또는 처리되지 않을 수 있다. 유리하게는, 상기 방법은 생체내에서 세포에 존재하는 저해제 또는 치료제의 양 및 농도가 시험관내에서 유지되는 것을 보장한다. 특정 양상에서, 본 발명은 치료제 예컨대 항암 약물의 실질적 희석 없이 또는 본질적으로 희석 없이 전혈 샘플로부터 백혈구의 용해물을 제조하는 방법을 제공한다. 수집된 전혈은 본원에 기재된 장비 내로 로딩된다. 특정 양상에서, 혈액은 백혈구의 단리 전에 갓 채취된다. 신선한 혈액 샘플이 입수불가능한 경우, 혈액 샘플은 채취 후 3 시간, 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간 (1 일), 36 시간, 48 시간 등의 기간 내에 가공될 수 있다. 샘플은 전형적으로 가공 전에 실온에서 유지된다. 특정 양상에서, 프로테아제 및/또는 포스파타제 저해제가 혈액 샘플 110 에 첨가될 수 있다. 그 후, 혈액은 예를 들어, 튜브 또는 바이알 (vial) 내에서 부드럽게 위아래로 뒤집음으로써 혼합된다.
그 후, 적혈구가 전형적으로 필터 또는 막을 통한 원심분리에 의해 제거된다 121. 특정 양상에서, 본원에 제시된 바와 같이 특별히 디자인된 여과 장비가 사용된다. 바람직하게는, 적혈구는 원심분리 후 수집 튜브 내에 존재한다. 하나의 양상에서, 방법은 바이알 또는 튜브 장비를 원심분리하여 필터 막 예컨대 필터 막의 적층 수집물 (하나 이상의 필터) 상에 백혈구를 포획 또는 단리하고 142, 적혈구 (및 혈장) 를 수집 튜브 내로 분리하는 것을 포함한다.
적혈구 (및 혈장) 의 여과 또는 원심분리 후에, 용해 완충제가 사용되어 포획된 백혈구를 용해한다 167. 하나의 양상에서, 단백질 층 용해 완충제가 사용될 수 있다. 포획 후에, 그러나 포획 후 세정 단계 없이, 백혈구가 용해되어 백혈구의 용해물이 제조된다. 전혈 세포 중 치료제 농도 (therapy concentration) 는 절차 100 전에 및 후에 동일하다. 일부 경우에, 치료제 농도는 절차 100 전에 10 μM, 절차 100 후에 10 μM 이다. 다른 경우에, 치료제 농도는 절차 100 전에 1 μM, 절차 100 후에 1 μM 이다. 다른 경우에, 치료제 농도는 절차 100 전에 0.1 μM, 절차 100 후에 0.1 μM 이다. 용해물이 그 후 제 2 수집 튜브 내에, 예를 들어, 원심분리에 의해 수집된다 173. 백혈구로부터의 용해물은 치료제 예컨대 항암 약물의 실질적 희석이 없거나 또는 본질적으로 희석이 없다. 즉, 치료제 (예를 들어, 항암 약물) 의 생체내 세포 농도는 세포 용해물 중 치료제 (예를 들어, 항암 약물) 의 시험관내 농도와 본질적으로 또는 실질적으로 동일하다.
또다른 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 치료제 (예를 들어, 항암 약물) 의 실질적 희석 없이 전혈 샘플로부터 백혈구의 용해물 (예를 들어, 정상, 악성, 및/또는 병든 백혈구) 을 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 전혈 샘플을 세포 단리 (여과) 장비 예컨대 본원에 기재된 장비 내로 로딩하는 단계;
(b) 장비를 원심분리하여 백혈구를 하나 이상의 적층 필터 막 상에 포획하고 적혈구 (및 혈장) 를 수집 튜브 내로 분리하는 단계; 및
(c) 단계 (b) 및 (c) 사이에 세정 단계 없이, 하나 이상의 적층 필터 막 상에 포획된 백혈구를 용해 완충제로 용해하여 백혈구의 용해물을 제조하는 단계.
특정 구현예에서, 발명의 방법은 단계 (b) 및 (c) 사이에 수집 튜브를 제 2 수집 튜브로 교체하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 다른 구현예에서, 발명의 방법은 단계 (c) 에서 백혈구를 용해한 후 제 2 수집 튜브를 함유하는 장비를 원심분리하고 제 2 수집 튜브 내에 백혈구의 용해물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 전혈 샘플은 치료제 (예를 들어, 항암 약물) 를 수령하고 있는 대상으로부터 수득된다. 다른 구현예에서, 전혈 샘플은 장비 내로 로딩하기 전에 치료제 (예를 들어, 항암 약물) 와 함께 시험관내 인큐베이션된다.
추가의 구현예에서, 전혈 샘플은 죽상동맥경화증을 갖는 또는 갖는 것으로 의심되는 또는 죽상동맥경화증에 대한 치료 (예를 들어, 스타틴 요법) 를 받고 있는 대상으로부터 수득된다. 다른 구현예에서, 전혈 샘플은 암 예컨대 혈액성 악성종양 (예를 들어, 백혈병 예컨대 만성 골수성 백혈병 (CML)) 을 갖는 또는 갖는 것으로 의심되는 또는 암에 대한 치료 (예를 들어, 항암 약물 요법) 를 받고 있는 대상으로부터 수득된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준이 백혈구의 용해물 중에서 측정된다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL 이다. 관심의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 부가적 예가 본원에 기재되어 있다.
그와 같이, 하나의 양상에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 전혈 샘플 중 적혈구 (및 혈장) 로부터 백혈구 (예를 들어, 정상, 악성, 및/또는 병든 백혈구) 를 단리 및 분리하기 위한 장비를 제공한다:
상실, 하실, 및 상실 및 하실 사이의 하나 이상의 적층 필터 막을 포함하는 여과 장치, 여기서 하나 이상의 적층 필터 막은 백혈구를 보유하는 능력이 있음; 및
전혈 샘플로부터 적혈구 (및 혈장) 를 수집하기 위한 수집 튜브, 여기서 여과 장치는 수집 튜브의 정상부에 배치되고, 적혈구 (및 혈장) 는 원심분리 후에 백혈구로부터 분리되고 수집 튜브 내에 수집된다.
일부 구현예에서, 전혈 샘플은 여과 장치의 상실 내로 로딩된다. 다른 구현예에서, 여과 장치는 2, 3, 또는 4 개의 적층 필터 막을 포함한다. 특정 구현예에서, 상실은 그것에 부착된 스냅-캡 뚜껑 (snap-cap lid) 을 추가로 포함한다.
추가의 구현예에서, 장비는 제 2 수집 튜브를 추가로 포함하며, 여기서 적혈구 (및 혈장) 를 함유하는 (제 1) 수집 튜브는 (제 1) 원심분리 후에 제 2 수집 튜브로 교체된다. 일부 경우에, 상실로의 용해 완충제의 첨가 및 (제 2) 원심분리 후에 백혈구의 용해물이 제 2 수집 튜브 내에 수집된다. 특정 경우에, 하나 이상의 적층 필터 막의 세정 없이 용해 완충제가 상실에 첨가된다. 일부 구현예에서, 원심분리 및 제 2 수집 튜브 내에 수집 전에 용해 완충제가 필터와 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 또는 120 분, 바람직하게는 약 15 ~ 약 30 분 동안, 4℃ 에서 (또는 얼음 위에서) 인큐베이션된다.
대안적 구현예에서, 장비는 제 2 수집 튜브를 추가로 포함하며, 여기서 하나 이상의 적층 필터 막은 원심분리 후에 여과 장치로부터 제거되고 (예를 들어, 겸자로) 제 2 수집 튜브 내로 배치된다. 일부 경우에, 제 2 수집 튜브는 용해 완충제를 함유하고, 하나 이상의 적층 필터 막이 제 2 수집 튜브 내로 배치 또는 인큐베이션된 후에 백혈구가 용해된다.
특정 경우에, 본 발명의 장비를 사용하여 제조된 용해물은 정상 및/또는 악성 (예를 들어, 암) 백혈구 예컨대, 예를 들어, 호중구, 호염기구, 및 호산구를 포함하는 과립백혈구 (다형핵 백혈구); 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 예컨대 림프구 및 단핵구를 포함하는 무과립백혈구 (단핵 백혈구), 예를 들어, 만성 골수성 백혈병 (CML) 세포를 포함하는 백혈병 세포; 예를 들어, 포말 세포를 포함하는 마크로파지; 및 그들의 혼합물의 세포 추출물을 포함한다.
특정 구현예에서, 전혈 샘플에 존재하는 백혈구, 백혈병 세포, 포말 세포, 순환 세포, 또는 기타 세포는 하나 이상의 치료제 예컨대 하나 이상의 관심의 항암 약물과의 인큐베이션 전에, 동안, 및/또는 후에 하나 이상의 성장 인자로 시험관내 자극될 수 있다. 자극성 성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF), 헤레굴린 (HRG), TGF-α, PIGF, 안지오포이에틴 (Ang), NRG1, PGF, TGF-α, VEGF, PDGF, IGF, FGF, HGF, 사이토카인, 등을 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다. 전혈에 존재하는 세포의 자극 및 용해에 대한 프로토콜이 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO 2008/036802 에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 전혈 샘플은 암을 갖는 또는 갖는 것으로 의심되는 대상으로부터 수득된다. 일부 경우에, 암은 암 세포 내의 염색체 전위로 인한 종양원성 융합 단백질의 형성에 의해 야기될 수 있다. 그러한 암의 비제한적 예는 혈액성 악성종양, 골육종, 연조직 육종, 및 그들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 혈액성 악성종양은 백혈병 또는 림프종이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 백혈병은 만성 골수성 백혈병 (CML) 이다. 다른 경우에, 대상은 항암 약물 요법을 받고 있거나 받고 있지 않다.
특정 다른 구현예에서, 항암 약물은 항-신호전달제 (즉, 세포증식억제 약물) 예컨대 모노클로날 항체 또는 티로신 키나제 저해제; 항-증식제; 화학치료제 (즉, 세포독성 약물); 호르몬 치료제; 방사선치료제; 백신; 및/또는 이상 세포 예컨대 암 세포의 제어되지 않는 성장을 저해 또는 차단하는 능력이 있는 임의의 기타 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 하나 이상의 화학치료제와 조합된 하나 이상의 항-신호전달제, 항-증식제, 및/또는 호르몬 치료제로 처리된다.
항-신호전달제의 예는 모노클로날 항체 예컨대 트라스투주맙 (Herceptin®), 알렘투주맙 (Campath®), 베바시주맙 (Avastin®), 세툭시맙 (Erbitux®), 겜투주맙 (Mylotarg®), 파니투무맙 (Vectibix®), 리툭시맙 (Rituxan®), 및 토시투모맙 (BEXXAR®); 티로신 키나제 저해제 예컨대 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레플루노미드 (SU101), 포나티닙 (AP24534), 및 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474); 및 그들의 조합을 제한 없이 포함한다.
예시적 항-증식제는 mTOR 저해제 예컨대 시롤리무스 (rapamycin), 템시롤리무스 (CCI-779), 및 에베롤리무스 (RAD001); Akt 저해제 예컨대 1L6-히드록시메틸-키로-이노시톨-2-(R)-2-O-메틸-3-O-옥타데실-sn-글리세로카르보네이트, 9-메톡시-2-메틸엘립티시늄 아세테이트, 1,3-디히드로-1-(1-((4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐)메틸)-4-피페리디닐)-2H-벤지미다졸-2-온, 10-(4'-(N-디에틸아미노)부틸)-2-클로로페녹사진, 3-포르밀크로몬 티오세미카르바존 (Cu(II)Cl2 복합체), API-2, 원종양유전자 TCL1 의 아미노산 10-24 에서 유래하는 15-mer 펩티드 (Hiromura et al., J. Biol. Chem., 279:53407-53418 (2004), KP372-1, 및 Kozikowski et al., J. Am. Chem. Soc., 125:1144-1145 (2003) 및 Kau et al., Cancer Cell, 4:463-476 (2003) 에 기재된 화합물; 및 그들의 조합을 포함한다.
화학치료제의 비제한적 예는 백금-계 약물 (예를 들어, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 카르보플틴, 스피로플라틴, 이프로플라틴, 사트라플라틴 등), 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 부술판, 멜팔란, 메클로레타민, 우라무스틴, 티오테파, 니트로소우레아 등), 항대사물질 (예를 들어, 5-플루오로우라실, 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 류코보린, 카페시타빈, 시타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 젬시타빈 (Gemzar®), 페메트렉세드 (ALIMTA®), 랄티트렉세드 등), 식물 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 포도필로톡신, 파클리탁셀 (Taxol®), 도세탁셀 (Taxotere® 등), 토포아이소머레이스 저해제 (예를 들어, 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포시드 (VP16), 에토포시드 포스페이트, 테니포시드 등), 항종양 항생제 (예를 들어, 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 미토산트론, 플리카마이신 등), 그의 제약적으로 수용가능한 염, 그의 입체이성질체, 그의 유도체, 그의 유사체, 및 그들의 조합을 포함한다.
호르몬 치료제의 예는 아로마타제 저해제 (예를 들어, 아미노글루테티미드, 아나스트로졸 (Arimidex®), 레트로졸 (Femara®), 보로졸, 엑세메스탄 (Aromasin®), 4-안드로스텐-3,6,17-트리온 (6-OXO), 1,4,6-안드로스타트리엔-3,17-디온 (ATD), 포르메스탄 (Lentaron® 등), 선별적 에스트로겐 수용체 조정제 (예를 들어, 바제독시펜, 클로미펜, 풀베스트란트, 라소폭시펜, 라록시펜, 타목시펜, 토레미펜 등), 스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손), 피나스테리드, 및 고나도트로핀-방출 호르몬 아고니스트 (GnRH) 예컨대 고세렐린, 그의 제약적으로 수용가능한 염, 그의 입체이성질체, 그의 유도체, 그의 유사체, 및 그들의 조합을 제한 없이 포함한다.
암 백신의 비제한적 예는 Active Biotech 로부터의 ANYARA, Northwest Biotherapeutics 로부터의 DCVax-LB, IDM Pharma 로부터의 EP-2101, Pharmexa 로부터의 GV1001, Idera Pharmaceuticals 로부터의 IO-2055, Introgen Therapeutics 로부터의 INGN 225 및 Biomira/Merck 로부터의 Stimuvax 를 포함한다.
방사선치료제의 예는 임의로 종양 항원으로 향해지는 항체에 임의로 접합된 방사성핵종 예컨대 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 및 212Bi 를 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다.
특정 다른 구현예에서, 전혈 샘플은 죽상동맥경화증 (또한 동맥경화성 혈관 질환 또는 ASVD 로서 알려짐) 을 갖는 또는 갖는 것으로 의심되는 대상으로부터 수득된다. 죽상동맥경화증은 전형적으로 동맥 혈관에 영향을 미치는 질환으로서, 마크로파지 예컨대 포말 세포의 축적에 의해 주로 야기되고, 고밀도 지질단백질 (HDL) 의 작용에 의한 마크로파지로부터의 지방 및 콜레스테롤의 적절한 제거 없이 저밀도 지질단백질 (콜레스테롤 및 트리글리세리드를 운반하는 혈장 단백질) 에 의해 촉진되는 동맥벽에서의 만성 염증 반응이다. 죽상동맥경화증의 치료에 적합한 약물의 예는 스타틴 예컨대 아토르바스타틴 (Lipitor 및 Torvast), 플루바스타틴 (Lescol), 로바스타틴 (Mevacor, Altocor, Altoprev), 메바스타틴 (Compactin), 피타바스타틴 (Livalo, Pitava), 프라바스타틴 (Pravachol, Selektine, Lipostat), 로수바스타틴 (Crestor), 심바스타틴 (Zocor, Lipex), 그들의 조합, 뿐만 아니라 조합 제제 예컨대 에제티미베 및 심바스타틴 (Vytorin), 로바스타틴 및 니아신 (Advicor), 아토르바스타틴 및 암로디핀 베실레이트 (Caduet), 및 심바스타틴 및 니아신 (Simcor) 을 제한 없이 포함한다. 일부 경우에, 대상은 죽상동맥경화증 약물 예컨대 스타틴을 이용한 요법을 받고 있거나 받고 있지 않다.
다른 구현예에서, 전혈 샘플은 백혈구의 단리 전에 하나 이상의 치료제 예컨대 하나 이상의 항암 약물과 함께 시험관내 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 필터 막 상에 보유되는 또는 포획되는 백혈구는 정상 백혈구, 악성 백혈구, 또는 그들의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 발명의 장비는 세포 회수 또는 단리 후에 임의의 세정 단계 없이 관심의 세포 예컨대 악성 백혈구 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병 (CML) 세포) 를 회수 또는 단리함으로써 전혈 샘플로부터 용해물 또는 세포 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 그에 따라 수득된 세포 추출물은 하나 이상의 종양원성 융합 단백질 예컨대 BCR-ABL 의 발현 및/또는 활성화의 수준, 그의 기질, 그의 경로, 또는 그들의 조합에 대해 분석될 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 세포 단리 후 임의의 세정 단계에 대한 필요를 제거하는 것은 치료제 예컨대 항암 약물 (예를 들어, 티로신 키나제 저해제) 의 세포내 농도를 변화시키지 않으면서 혈액으로부터 관심의 세포가 회수될 수 있기 때문에 유리하다. 하기 실시예에서 제시된 바와 같이, 임의의 세정 단계 없이 본원에 기재된 장비를 사용하는 세포 단리는 단리 후 세포를 세정하는 종래의 관습에 반하고, 세포 내부의 치료제 예컨대 항암 약물 (예를 들어, 티로신 키나제 저해제 예컨대, 예를 들어, Gleevec®, Tasigna®, Sprycel® 등) 의 실질적 희석 없이 회수된 세포로부터의 세포 추출물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 장비는 본원에 묘사된 장비와 실질적으로 유사 또는 동일하다. 당업자는 파라미터 예컨대, 예를 들어, 장비 내로 로딩되는 샘플의 부피, 장비를 회전시키는데 사용되는 원심분리기의 유형, 장비의 상실에 첨가되는 용해 완충제의 부피 등을 고려하여 본원에 기재되고 설명된 장비의 하나 이상의 부품의 치수가 다를 수 있음을 이해할 것이다.
도 2A-G 에서, 샘플 수집을 위한 여과 장치 또는 장비가 나타나 있다. 도 2A 는 수 나선형 릿지 또는 나사산 (male helical ridges or threads) 210 이 있는 원통형 튜브인 장비의 상부 또는 상실 (upper portion or chamber) 201 이다. 캡 215 이 있는 상부가 도 2B-C 에 나타나 있다. 이러한 상부 201 는 탁 닫아서 샘플의 유출을 방지하는 캡 215 을 임의로 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 스냅-캡 뚜껑 215 은 스트랩 (strap) 217 을 통해 상부에 매여 있고, 샘플 및/또는 시약이 여과 장치에 첨가된 후 상실의 개구부 (opening) 를 단단히 (securely) 폐쇄하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 장비의 상실 201 은 바람직하게는 도 2D-E 에 나타낸 하부 또는 하실 (lower portion or chamber) 222 에 부착한다. 상부의 나사산 210 은 하부 또는 하실 222 의 암 골 (female grooves) 221 내에 단단히 맞는다. 바람직하게는, 상실 및 하실의 내직경이 유사해서 그것을 통해서 액체가 흐를 수 있는 원통형 튜브를 형성한다.
특정 양상에서, 여과 장치 또는 장비의 하실 222 은 한쪽 끝 221 에 내부 나사산이 있는 원통형 튜브이다 (도 2E). 특정 양상에서, 실들 (chambers) 이 함께 단단히 부착되기 전에 하나 이상의 (예를 들어, 복수 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의) 적층 필터 막이 상실 및 하실의 나사산 사이에 배치된다. 필터(들)은 도 2E 에 나타낸 하실의 핀 휠 (pin wheel) 225 에 얹혀 있다.
특정 양상에서, 필터 막은 2-4 (예를 들어, 2, 3, 또는 4) 개의 층의 필터 예컨대 Pall 필터 (예를 들어, Leukosorb Medium) 일 수 있다. 다른 양상에서, 여과 장치는 예컨대 키트 내의 사용 전에 함께 연결되는 별도의 실들 및 필터들의 조립체이다. 여과 장치는 환자 혈액 샘플로부터 적혈구 (및 혈장) 의 분리를 위한 도 2F-G 에 나타낸 수집 튜브 250 의 정상부에 배치될 수 있다. 도 2A, 도 2D 및 도 2F 의 부분들이 함께 연결되거나 또는 맞춰져서 본 발명의 장비 여과 장치의 하나의 구현예를 형성한다. 여과 장치 (상실 및 하실) 는 환자 혈액 샘플로부터 적혈구의 분리를 위한 수집 베셀 250 의 정상부에 배치될 수 있다. 조립된 여과 장치의 하실은 개구부 255 를 통해 수집 베셀 내에 위치하고, 상실은 수집 베셀의 개구부의 정상부에 있다. 수집 베셀 250 의 예는 튜브 예컨대 용량이 1 ㎖, 2 ㎖, 3 ㎖, 4 ㎖, 5 ㎖, 6 ㎖, 7 ㎖, 8 ㎖, 14 ㎖, 16 ㎖ 등인 플라스틱 배양 튜브를 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다.
특정 양상에서, 본 발명의 여과 장치 하부는 하부에 내장된 (built-in) 또는 임의적 깔때기를 갖는다. 도 3A-E 에 나타난 바와 같이, 깔때기는 샘플이 하부의 내벽을 타고 내려가지 않으면서 하실 내로 그리고 그것을 통해 수집 튜브 내로 통과할 수 있게 하는 특정 각도를 가질 수 있다. 예를 들어, 도 3A 는 수평으로부터 약 2°의 내부 깔때기 301 를 보여준다. 도 3B 는 수평으로부터 대략 7°의 내부 깔때기 310 를 보여준다. 특정 다른 양상에서, 도 3C 는 수평으로부터 대략 12°의 깔때기를 보여준다. 도 3D 및 도 3E 는 본 발명의 깔때기 디자인의 또다른 구현예이다. 당업자는 깔때기 디자인이 여과물이 하부의 벽으로부터 떨어져 있도록 하는 각도일 수 있다는 것을 이해하고 인식할 것이다. 깔때기 부분에 대한 적합한 각도는 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10°, 11°, 12°, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°또는 그이상을 포함한다. 대안적 구현예에서, 도 3E 는 본 발명의 여과 장치의 하부 내로의 깔때기 삽입물 325 을 보여준다.
특정 양상에서, 본 발명의 여과 장치가 도 4A-D 에 나타나 있다. 도 4A 는 상부 또는 상실 410, 하부 또는 하실 420 및 중간의 적층 필터 412 의 분해도를 나타낸다. 도 4A 에서, 그림 405 는 장치를 내려다보고 있고, 그림 422 는 장치를 올려다보고 있다. 도 4B 는 함께 나사로 조여진 상부 430 및 하실 또는 하부 420 를 보여준다. 도 4B 에서, 그림 405 는 장치를 내려다보고 있고, 그림 425 는 장치를 올려다보고 있다. 도 4C 는 수집 튜브 435 를 보여준다. 작동시, 특정 양상에서, 수집 튜브 435 는 바람직하게는 적혈구를 보유한다. 도 4C 에서, 그림 434 는 장치를 내려다보고 있고, 그림 440 은 장치를 올려다보고 있다. 도 4D 는 상실 410 및 하실 또는 하부 420 과 연결된 수집 튜브 435 를 나타낸다. 도 4D 에서, 그림 405 는 장치를 내려다보고 있고, 그림 461 은 장치를 올려다보고 있다.
일부 구현예에서, 작동시, 프로테아제 및/또는 포스파타제 저해제를 포함하는 용액 혼합물로 처리된 특정 부피 (예를 들어, 1 ㎖) 의 환자 혈액이 조립된 세포 단리 장비의 상실 내로 로딩된다. 장비는 탁상형 또는 임상용 원심분리기, 예컨대 Allegra 6R 원심분리기 (Beckman), Sorvall Legend 원심분리기 (Thermo Scientific), 또는 Heraeus Megafuge 원심분리기 (Kendro) 에서 원심분리될 수 있다. 일부 양상에서, 장비가 5-30 분 동안 600-2,000 rpms 에서 4℃ 에서 원심분리된다. 원심분리 후에, 적혈구 (및 혈장) 를 함유하는 수집 베셀이 세포 단리 장비로부터 제거되고, 뚜껑이 닫히고, 한쪽으로 치워진다.
추가의 구현예에서, 제 2 수집 베셀이 여과 장치에 부착되어 있다. 세포 용해물용 제 2 수집 튜브의 비제한적 예는 1.5 ㎖ 및 2 ㎖ 마이크로원심분리기 튜브를 포함한다. 세정 단계 없이, 용해 완충제가 여과 장치의 상실에 첨가된다. 상실이 뚜껑이 닫히고, 여과 장치 및 제 2 수집 튜브가 격렬히 흔들어진다. 특정 경우에, 세포 단리 장비는 4℃ 에서 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 또는 120 분, 바람직하게는 약 15 ~ 약 30 분 동안 인큐베이션된다. 장비는 그 후 원심분리될 수 있다 (예를 들어, 3,000 rpm 에서 5 분 동안). 세포 용해물은 -70℃ 에서 저장을 위해 또다른 원심분리기 베셀 예컨대 마이크로원심분리기 튜브에 이송될 수 있다.
도 5A-D 는 본 발명의 샘플 수집을 위한 여과 장치 또는 장비 500 의 대안적 구현예를 보여준다. 이 구현예에서, 슬리브 또는 중간 커넥터 (sleeve or middle connector) 522 가 있는 상부 501 및 바닥부 또는 바닥실 530 이 있다. 중간 커넥터 또는 슬리브 522 는 상부 501 또는 바닥부 530 에 임의로 고정될 수 있다. 도 5B 에 나타난 바와 같이, 특정 양상에서, 상부은 릿지 또는 수 릿지를 갖고, 슬리브 또는 바닥부에 고정될 수 있다. 도 5B 에서, 캡 510 이 있는 장비가 제시되어 있다. 도 5C 는 바닥부 530 가 이 부분을 밀폐 상태로 유지하도록 캡 534 을 임의로 가질 수 있음을 보여준다. 도 5D 는 암 골을 명백히 보여주는 하실 또는 하부 522 를 나타낸다. 이 부분은 바닥부에 임의로 고정되어 슬리브가 장치의 바닥부에 통합될 수 있다.
도 6A-C 는 본 발명의 또다른 양상을 보여준다. 도 6A 는 본 발명의 장치의 횡단면도이며, 여기서 바닥부 610 는 연결을 가능하게 하는 슬리브 633 로 상부 625 와 연결되어 있다. 삽화 도 6B 는 깔때기 구획이 있는 중간 구획 633 및 나사산 625 으로 연결된 부분의 클로즈업이다. 수집실 610 이 또한 나타나 있다. 도 6C 는 핀휠 기하구조를 갖는 중간 구획을 보여준다. 적층 필터는 임의로 이러한 핀휠 위에 얹혀 있다.
다른 추가의 구현예에서, 세포 단리 장비가 원심분리되고, 적혈구가 수집 튜브 내에 수집되고 한쪽으로 치워진 후, 여과 장치의 상실 및 하실이 분리된다 (예를 들어, 나사가 풀린다). 겸자를 사용하여, 분리된 백혈구 및/또는 순환 종양 세포를 함유하는 필터 막 422 (도 4A) 이 세포 용해 완충제를 함유하는 제 2 수집 베셀 내에 배치된다. 제 2 수집 베셀의 비제한적 예는 1.5 ㎖ 및 2 ㎖ 마이크로원심분리기 튜브를 포함한다. 일부 경우에, 제 2 수집 베셀은 4℃ 에서 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 또는 120 분, 바람직하게는 약 15 ~ 약 30 분 동안 추가로 인큐베이션된다. 다른 양상에서, 제 2 수집 베셀은 얼음 위에 배치되고, 총 30 분 동안 매 10 분 마다 10 초 동안 잠깐 볼텍싱된다. 일부 구현예에서, 세포 용해물은 -70℃ 에서 저장된다. 다른 구현예에서, 용해물을 함유하는 베셀은 원심분리되어 필터 막 및 세포 조각을 제거한다. 세포 용해물의 상청액은 -70℃ 에서의 저장을 위해 또다른 튜브로 이송될 수 있다.
일부 구현예에서, 발명의 장비는 멸균 키트로서 제공된다. 일부 경우에, 멸균 키트는 상실 (부착된 스냅-캡 뚜껑이 임의로 있음), 하실 및 하나 이상의 적층 필터 막 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4 층의 필터 막), 및 하나 또는 복수의 수집 튜브 (스냅-캡 뚜껑이 임의로 있음) 를 포함하는 여과 장치를 포함한다. 각각의 부품은 별도로 포장될 수 있고, 조립된 키트 또는 각각의 부품이 멸균 패키지 내로 배치될 수 있다. 다른 경우에, 멸균 키트는 튜브 필터 유닛 및 하나 또는 복수의 수집 튜브 (임의로 스냅-캡 뚜껑이 있음) 를 포함한다. 튜브 필터 유닛은 하나 이상의 (예를 들어, 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의) 필터 막이 있는 한쪽 끝에 고정된 원통형 튜브를 포함하며, 여기서 막은 전혈 샘플로부터의 건강한 및 악성 백혈구 및/또는 순환 종양 세포를 보유하는 능력이 있다. 특정 경우에, 필터 막은 (예를 들어, 2, 3, 또는 4) 개의 층의 필터 예컨대 PALL 필터 (예를 들어, Leukosorb Medium) 이다. 다른 경우에, 멸균 키트는 튜브 필터 유닛, 플라스틱 어댑터 및 하나 또는 복수의 수집 튜브 (임의로 스냅-캡 뚜껑이 있음) 를 포함한다. 어댑터는 수집 튜브의 개구부에 위치하고, 튜브 필터 유닛의 필터 막에 단단히 부착되어 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 장비는 복수의 여과 장치 또는 튜브 필터 유닛 및 다중-웰 또는 다중-튜브 수집 베셀 예컨대 2-웰, 12-웰, 24-웰, 48-웰, 또는 96-웰 플레이트를 포함한다. 특정 경우에, 복수의 여과 장치는 도 4D 에 도시된 장치 2 개 이상과 실질적으로 유사할 수 있다. 특정 다른 구현예에서, 여과 장치의 어레이는 다중-웰 플레이트 예컨대 96-웰 세포 단리 플레이트일 수 있다. 예를 들어, 제 1 96-웰 여과 플레이트에는 필터 막 (예를 들어, LeukoLOCK (Life Technologies), 또는 Acroprep (PALL) 또는 Leukosorb (PALL)) 또는 그와 실질적으로 유사한 막이 달릴 수 있다. 다른 구현예에서, 제 1 96-웰 여과 플레이트는 필터 막, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나, Millipore Cat. #MAMIC8510 및 #MSBCS1210 이 달린 시판 중인 다중-웰 플레이트이거나 그와 실질적으로 유사하다. 일부 경우에, 시판 중인 다중-웰 플레이트는 멸균되고, 필터 막이 달린 제 1 다중-웰 플레이트 및 제 1 다중-웰 플레이트 아래 달린 제 2 다중-웰 플레이트를 포함하고, 수집 베셀로서 사용될 수 있다. 이들 구현예에서, 신선한 수집된 혈액은 제 1 96-웰 세포 단리 플레이트의 웰 내로 로딩될 수 있다. 제 1 다중-웰 플레이트는 위에서 논의된 여과 장치의 상실 및 하실 둘다와 유사하다. 제 2 96-웰 마이크로플레이트는 혈액 수집 플레이트 (수집 튜브와 유사함) 로서의 역할을 할 수 있고, 제 1 다중-웰 플레이트 즉, 필터 막이 있는 세포 단리 플레이트 아래 배치될 수 있다. 이러한 플레이트 조립체는 실온에서 약 5 분 동안 약 600 rpm ~ 3,000 rpm, 예컨대 예를 들어, 약 600 rpm, 1,000 rpm, 2,000 rpm, 및 3,000 rpm 의 속도에서 원심분리될 수 있다. 원심분리 후에, 필터 막은 원심분리 튜브로 이송될 수 있고, 필터 막 상의 세포는 세포를 용해시키기 위해 특정 부피의 용해 완충제 (예를 들어, 300 ㎕ 의 용해 완충제) 로 처리되고 잠깐 볼텍싱될 수 있다. 세포 용해물을 함유하는 원심분리 튜브는 얼음 위에 약 30 분 동안 배치되고, 약 매 10 분 마다 잠시 동안의 볼텍싱에 적용될 수 있다. 그 후 튜브는 약 15 분 동안 원심분리되어 상청액으로부터 세포 잔해물을 분리할 수 있다. 용해물을 함유하는 상청액이 수집되고 분석될 수 있다. 특정 양상에서, 복수의 여과 장치는 컴퓨터 제어 하의 로봇 전기자 (robotic armature) 로 조작된다. 높은 처리율 샘플 분석이 수행되고, 복수의 샘플이 분석된다. 절차 100 의 단계, 예컨대 포획된 백혈구를 용해하는 용해 완충제의 첨가 167 는 컴퓨터화된 로봇 시스템으로 임의로 수행된다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 항암 약물에 의한 환자 혈액 샘플의 시험관내 처리 및 샘플 분석이 높은 처리율 방식으로 수행된다.
IV. 약물 선별 및 암 요법을 위한 최적화
특정 양상에서, 본 발명은 혈액성 악성종양이 있는 대상에서 암 요법의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 특정 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 탈조절된 신호전달 경로를 하향-조절 또는 폐쇄하는 적당한 요법의 선별 방법을 제공한다. 특정 다른 양상에서, 본 발명은 암을 갖고 암의 치료를 위한 요법의 과정을 받는 대상에서 요법 최적화 및/또는 독성 감소 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 소정의 환자의 암 또는 종양 중 활성화된 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 단백질의 수집에 의해 제공되는 특정 분자 서명에 기초하는 개인화된 요법의 디자인을 촉진하는데 사용될 수 있다.
따라서, 하나의 특정 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 혈액성 악성종양을 갖는 대상에서 항암 약물의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다:
(a) 항암 약물을 대상에게 투여하는 단계, 여기서 항암 약물의 제 1 투여는 시간 T1 에서임;
(b) 대상으로부터의 샘플 중 시간 T2 에서 암의 세포를 단리하는 단계;
(c) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(d) 대상으로부터의 샘플 중 시간 T2 에서 종양원성 융합 단백질의 활성화 상태 및 또는 발현 수준을 측정하고;
종양원성 융합 단백질의 활성화 상태 및 또는 발현 수준에 기초하여 치료 과정을 결정하는 단계.
특정 구현예에서, 상기 방법은 T0 에서, 즉, 항암 약물의 제 1 투여 전에 종양원성 융합 단백질의 활성화 상태를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL 이다. 특정 경우에, 혈액성 악성종양은 림프종 또는 백혈병 예컨대 만성 골수성 백혈병 (CML) 이다. T1 및 T2 사이의 시간 차이는 약 1 주 ~ 약 6 월 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 주이다. T0 및 T1 사이의 시간 차이는 약 1 일 ~ 약 3 주이다. 특정 다른 양상에서, 상기 방법은 하나 이상의 다른 신호 전달 분자 예컨대 CRKL, AKT, STAT5 및 SRC 의 발현 및 또는 활성화 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 양상에서, 치료 과정은 항암 약물 투여량의 변화, 부가적 항암 약물을 포함하는, 항-암 약물의 변화, 치료 기간의 변화 및 기존 치료 과정의 유지로부터 선별된다.
특정 양상에서, 샘플은 단리된 세포의 추출물을 포함한다. 특정 양상에서, 단리된 세포는 T0 에서 (치료의 개시 전에) 하나 이상의 항암 약물 (예를 들어, 2 개의 항암 약물) 과 함께 시험관내 인큐베이션된다. 다른 경우에, 단리된 세포는 T2 에서, 치료 과정을 결정하기 전에 2 개 이상의 항암 약물과 함께 시험관내 인큐베이션된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 혈액성 악성종양을 갖는 대상에서 항암 약물을 선별하는 방법을 제공한다:
(a) 대상으로부터 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 대상으로부터의 샘플로부터의 단리된 세포 중 종양원성 융합 단백질의 활성화 상태 수준을 측정하는 단계;
(d) 단리된 세포를 치료의 개시 전에 하나 이상의 항암 약물과 인큐베이션하는 단계;
(e) 치료의 개시 전에 하나 이상의 항암 약물과 인큐베이션된 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(f) 인큐베이션된 세포 중 종양원성 융합 단백질의 활성화 상태 수준을 측정하는 단계; 및
(g) 종양원성 융합 단백질의 활성화 상태 수준에 기초하여 치료 과정을 선별하는 단계.
또다른 구현예에서, 본 발명은 혈액성 악성종양을 갖는 대상에서 항암 약물을 선별하는 방법을 제공한다:
(a) 대상으로부터 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 대상으로부터의 샘플로부터의 단리된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 수준을 측정하는 단계;
(d) 단리된 세포를 치료의 개시 전에 하나 이상의 항암 약물과 인큐베이션하는 단계;
(e) 치료의 개시 전에 하나 이상의 항암 약물과 인큐베이션된 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(f) 인큐베이션된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 수준을 측정하는 단계; 및
(g) BCR-ABL 의 활성화 상태 수준에 기초하여 치료 과정을 선별하는 단계.
특정 양상에서, 치료 과정은 항암 약물의 선별, 항암 투여량의 선별, 및 치료 기간의 결정으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 다른 양상에서, 상기 방법은 하나 이상의 다른 신호 전달 분자 예컨대 CRKL, AKT, STAT5 및 SRC 의 발현 및 또는 활성화 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암을 갖고 암의 치료를 위한 요법의 과정을 받는 대상에서 요법 최적화 및/또는 독성 감소 방법을 제공한다:
(a) 항암 약물 (예를 들어, 하나 이상의 티로신 키나제 저해제 예컨대 Gleevec®, Tasigna®, Sprycel® 등) 의 투여 후에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 본원에 기재된 검정을 사용하여 세포 추출물 중 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화의 측정된 수준을 요법의 과정 동안 더 이른 시간에 측정된 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화의 수준과 비교하는 단계; 및
(e) 단계 (d) 로부터의 비교에 기초하여 대상에 대한 요법의 과정의 후속 투여량 또는 상이한 요법의 과정이 대상에게 투여되어야 하는지 여부를 결정하는 단계.
특정 구현예에서, 총 및 활성화된 (예를 들어, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 수준 둘다가 본 발명의 항체-기반 검정에 따라 세포 추출물 중 측정되고, 활성화된 대 총 종양원성 융합 단백질 수준 (예를 들어, 포스포/총 BCR-ABL 단백질 수준의 비) 의 비가 계산되고, 예를 들어, 종양원성 융합 단백질 수준의 포스포/총 비를 더 이른 시간에 (예를 들어, 항암 약물 요법 중의 더 이른 시간에 또는 항암 약물 요법 전의 시점에) 대상에 대해 동일하게 계산된 비와 비교함으로써, 대상에 대한 요법의 과정을 평가하는데 사용될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료에 적합한 항암 약물을 선별하는 방법을 제공한다:
(a) 항암 약물의 투여 후에, 또는 항암 약물과의 인큐베이션 전에 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 본원에 기재된 검정을 사용하여 세포 추출물 중 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준을 결정하는 단계; 및
(d) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준을 항암 약물의 부재 하에 생성된 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써 항암 약물이 암의 치료에 적합한지 또는 부적합한지 여부를 결정하는 단계.
바람직한 구현예에서, 암의 치료에 적합한 항암 약물을 선별하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 항암 약물의 투여 후에, 또는 항암 약물과의 인큐베이션 전에 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 희석 시리즈를 포함하는 검정을 사용하여 세포 추출물 중 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준을 결정하는 단계, 여기서 포획 항체는 고형 지지체 상에 구속되어 있음;
(d) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준을 항암 약물의 부재 하에 생성된 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일에 비해 변화될 때 (예를 들어, 실질적으로 감소될 때) 항암 약물이 암의 치료에 적합하다고 표시하는 단계.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 암 예컨대, 예를 들어, 혈액성 악성종양의 치료에 적합한 항암 약물의 선별을 지원 또는 보조하는데 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 암 예컨대, 예를 들어, 혈액성 악성종양의 치료에 적합한 항암 약물의 선별을 개선하는데 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일에 비해 변화되지 않을 때 (예를 들어, 실질적으로 감소되지 않을 때) 항암 약물이 암의 치료에 부적합하다고 표시하는 단계를 추가로 또는 대안적으로 포함한다. 추가의 구현예에서, 세포 추출물 중 존재하는 하나 이상의 신호 전달 분자가 하나 이상의 종양원성 융합 단백질에 더하여 탐지되고, 분자 프로파일에 기초하여 항암 약물이 적합한지 또는 부적합한지가 결정된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 항암 약물을 이용한 치료에 대한 암의 반응을 동정하는 방법을 제공한다:
(a) 항암 약물의 투여 후에, 또는 항암 약물과의 인큐베이션 전에 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 본원에 기재된 검정을 사용하여 세포 추출물 중 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준을 결정하는 단계; 및
(d) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준을 항암 약물의 부재 하에 생성된 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써 암을 항암 약물을 이용한 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성으로서 동정하는 단계.
바람직한 구현예에서, 항암 약물을 이용한 치료에 대한 암의 반응을 동정하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 항암 약물의 투여 후에, 또는 항암 약물과의 인큐베이션 전에 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 희석 시리즈를 포함하는 검정을 사용하여 세포 추출물 중 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준을 결정하는 단계, 여기서 포획 항체는 고형 지지체 상에 구속되어 있음;
(d) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준을 항암 약물의 부재 하에 생성된 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일에 비해 변화될 때 (예를 들어, 실질적으로 감소될 때) 암이 항암 약물을 이용한 치료에 반응성이라고 표시하는 단계.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 약물을 이용한 치료에 대한 암 예컨대, 예를 들어, 혈액성 악성종양의 반응의 동정을 지원 또는 보조하는데 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 약물을 이용한 치료에 대한 암 예컨대, 예를 들어, 혈액성 악성종양의 반응의 동정을 개선하는데 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일에 비해 변화되지 않을 때 (예를 들어, 실질적으로 감소되지 않을 때) 암이 항암 약물을 이용한 치료에 비-반응성이라고 표시하는 단계를 추가로 또는 대안적으로 포함한다. 추가의 구현예에서, 세포 추출물 중 존재하는 하나 이상의 신호 전달 분자가 하나 이상의 종양원성 융합 단백질에 더하여 탐지되고, 이러한 분자 프로파일에 기초하여 암이 치료에 반응성 또는 비-반응성으로서 동정된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 항암 약물을 이용한 치료에 대한 암을 갖는 대상의 반응을 예측하는 방법을 제공한다:
(a) 항암 약물의 투여 후에, 또는 항암 약물과의 인큐베이션 전에 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 본원에 기재된 검정을 사용하여 세포 추출물 중 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준을 결정하는 단계; 및
(d) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준을 항암 약물의 부재 하에 생성된 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 단계.
바람직한 구현예에서, 항암 약물을 이용한 치료에 대한 암을 갖는 대상의 반응을 예측하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 항암 약물의 투여 후에, 또는 항암 약물과의 인큐베이션 전에 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 희석 시리즈를 포함하는 검정을 사용하여 세포 추출물 중 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준을 결정하는 단계, 여기서 포획 항체는 고형 지지체 상에 구속되어 있음;
(d) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준을 항암 약물의 부재 하에 생성된 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일에 비해 변화될 때 (예를 들어, 실질적으로 감소될 때) 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 반응할 가능성이 높다고 표시하는 단계.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 암 예컨대, 예를 들어, 혈액성 악성종양에 대한 항암 약물을 이용한 치료에 대한 대상의 반응 가능성의 예측을 지원 또는 보조하는데 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 암 예컨대, 예를 들어, 혈액성 악성종양에 대한 항암 약물을 이용한 치료에 대한 대상의 반응 가능성의 예측을 개선하는데 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일에 비해 변화되지 않을 때 (예를 들어, 실질적으로 감소되지 않을 때) 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 반응하지 않을 것이라고 표시하는 단계를 추가로 또는 대안적으로 포함한다. 추가의 구현예에서, 세포 추출물 중 존재하는 하나 이상의 신호 전달 분자가 하나 이상의 종양원성 융합 단백질에 더하여 탐지되고, 이러한 분자 프로파일에 기초하여 대상이 치료에 반응할 가능성이 예측된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 저항성인지 여부를 결정하는 방법을 제공한다:
(a) 항암 약물의 투여 후에, 또는 항암 약물과의 인큐베이션 전에 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 본원에 기재된 검정을 사용하여 세포 추출물 중 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준을 결정하는 단계; 및
(d) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준을 더 이른 시간에 항암 약물의 부재 하에 또는 항암 약물의 존재 하에 생성된 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 저항성 또는 민감성인지 여부를 결정하는 단계.
바람직한 구현예에서, 암을 갖는 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 저항성인지 여부를 결정하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 항암 약물의 투여 후에, 또는 항암 약물과의 인큐베이션 전에 암의 세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 세포를 용해하여 세포 추출물을 생성하는 단계;
(c) 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 희석 시리즈를 포함하는 검정을 사용하여 세포 추출물 중 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준을 결정하는 단계, 여기서 포획 항체는 고형 지지체 상에 구속되어 있음;
(d) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준을 더 이른 시간에 항암 약물의 부재 하에 또는 항암 약물의 존재 하에 생성된 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화의 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일에 비해 변화되지 않을 때 (예를 들어, 실질적으로 감소되지 않을 때) 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 저항성이라고 표시하는 단계.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 약물을 이용한 치료에 저항성인 암을 갖는 대상의 동정 또는 암을 갖는 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 저항성인지 여부의 결정을 지원 또는 보조하는데 유용할 수 있으며, 여기서 대상은 암 예컨대, 예를 들어, 혈액성 악성종양을 갖는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 약물을 이용한 치료에 저항성인 암을 갖는 대상의 동정 또는 암을 갖는 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 저항성인지 여부의 결정을 개선하는데 유용할 수 있으며, 여기서 대상은 암 예컨대, 예를 들어, 혈액성 악성종양을 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 종양원성 융합 단백질에 대해 탐지된 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 의 수준이 참조 발현 또는 활성화 프로파일에 비해 변화될 때 (예를 들어, 실질적으로 감소될 때) 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 민감성이라고 표시하는 단계를 추가로 또는 대안적으로 포함한다. 암을 갖는 대상이 항암 약물을 이용한 치료에 저항성인 이유의 비제한적 예는 관심의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 중 하나 이상의 돌연변이의 존재, 치료적 섭생에의 비-순응도, 및/또는 차선의 약물 투여량의 투여를 포함한다. 항암 약물의 차선의 약물 투여량과 관련하여, 상기 방법은 대상에게 투여되는 항암 약물의 다음 또는 후속 투여량을 증가시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 세포 추출물 중 존재하는 하나 이상의 신호 전달 분자가 하나 이상의 종양원성 융합 단백질에 더하여 탐지되고, 이러한 분자 프로파일에 기초하여 대상이 치료에 저항성 또는 민감성으로서 동정된다.
V. 종양원성 융합 단백질
특정 구현예에서, 하나 이상의 종양원성 융합 단백질의 발현/활성화 프로파일링이, 단독으로 또는 그의 기질 및/또는 다른 신호 전달 경로 단백질의 발현/활성화 프로파일링과 조합되어 본 발명의 장비 및 방법을 사용하여 제조된 세포 용해물에 대해 수행되어, 예를 들어, 티로신 키나제 저해제 요법이 필요한 환자 (예를 들어, BCR-ABL 매개 질환 예컨대 만성 골수성 백혈병이 있는 환자) 에 대해 티로신 키나제 저해제 요법의 효능이 결정될 수 있다. 종양원성 융합 단백질 및 다른 분석물질은 유리하게는 발명의 장비 및 방법에 의해 제조된 세포 용해물 중에서 티로신 키나제 저해제의 세포내 농도를 변화시키지 않으면서 심문된다.
특정 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 및 그들의 연관된 신생물의 형성을 야기하는 인간 종양 중 전위는 하기를 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다:
만성 골수성 백혈병 (CML): 필라델피아 염색체는 BCR/ABL (키나제) 를 초래하는 전위이다.
급성 림프구성 백혈병 (ALL): 키메라 종양원성 단백질은 하기를 포함한다:
Figure pct00001
버킷 림프종: c-myc 유전자 전위 t(8;14)(q24;q32). 가장 흔한 키메라 종양단백질은 c-myc/IGH 이다.
AML: 염색체 8 의 일부의 염색체 21 로의 전위. 결과로서 얻어지는 키메라 종양단백질은 RUNX1/ETO 이다. 또다른 전위 t(12;15)(p13;q25) 는 TEL/TrkC (키나제) 키메라 종양단백질을 초래한다.
유잉 육종: 염색체 11 및 22 사이의 전위. 결과로서 얻어지는 키메라 종양단백질은 EWS/FLI (전사 인자) 이다.
DFSP: DFSP 종양의 95% 초과가, 키메라 종양단백질 COL1A1/PDGF (PDGFR 에 결합하고 그것을 활성화시킴) 을 초래하는, 염색체 전위 t(17;22) 를 갖는다.
급성 전골수구성 백혈병: t(15;17)(q22;q12) 로 표시되는 전위. 결과로서 얻어지는 키메라 종양단백질은 RARα/PML (전사 복합체 단백질) 이다.
프로 (Pro)-B-세포 급성 림프구성 백혈병: 키메라 종양단백질 E2A/HLF (세포자멸사 저해제) 를 초래하는, 전위 t(17;19).
급성 전 (pre)-B-세포 백혈병: 전위 t(1;19). 키메라 종양단백질은 E2A/Pbx1 (키나제 기질) 이다.
횡문근육종 : 키메라 종양단백질 PAX3/FKHR (전사 인자) 을 초래하는, t(2:13)(q35;q14) 의 전위.
매우 어린 어린이의 연조직 악성종양: 하기 키메라 종양단백질을 초래하는 t(12;15)(p13;q25) 재배열: 단백질 티로신 키나제 ETV6/NTRK3 (키나제).
유두상 갑상선 암종: 키메라 종양단백질은 RET/PTC (키나제) 이다.
전립선 암: 키메라 종양단백질은 이다 TMRSS/ERG (키나제).
종양원성 융합 단백질 및 그들의 연관된 신생물의 형성을 야기하는 인간 종양 중 전위의 부가적 예:
Figure pct00002
VI. 실시예
하기 실시예는 청구된 발명을 설명하기 위해 제공되나, 그에 제한되지 않는다.
실시예 1. 예시적 세포 단리 장비.
이 실시예는 여과 방법을 사용하여 환자 전혈로부터의 백혈구의 분리를 위한 예시적 세포 단리 장비를 서술한다. 본 발명의 세포 단리 장비의 구현예 및 양상이 도 2-6 에 나타나 있다.
본 발명의 세포 단리 장비는 전혈에 존재하는 다른 세포로부터 적혈구를 분리하는데 사용된다. 특히, 백혈구 및/또는 순환 종양 세포는 전혈에 존재하는 상당한 수의 적혈구 및 혈장로부터 분리된다. 본 발명의 세포 단리 장비는 여과 장치 및 수집 베셀을 포함한다. 여과 장치는 상실, 하실 및 상실 및 하실 사이의 하나 이상의 (예를 들어, 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의) 적층 필터 막을 포함하는 조립체이다. 상실 및 하실은 재료 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리프로필렌 및 폴리스티렌으로부터 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 필터 막은 공극 크기가 8 ㎛, 두께가 355.6-558.8 ㎛ 이고, 백혈구 잔류 수율이 70-80% 이다. 필터 막의 비제한적 예는 백혈구 단리 (Leukosorb) 배지 (PALL Cat. No. BSP0669) 를 포함한다.
전형적으로, 프로테아제 저해제 및 포스파타제 저해제로 처리된 1 ㎖ 의 환자 혈액이 세포 단리 장비의 상실 내로 로딩된다. 유닛은 탁상형 원심분리기 예컨대 Allegra 6R 원심분리기 (Beckman), Sorvall Legend 원심분리기 (Thermo Scientific), 또는 Heraeus Megafuge 원심분리기 (Kendro) 내에서 5-30 분 동안 600-2000 rpms (예를 들어, 800 rpms) 에서 4℃ 에서 원심분리된다. 특정 경우에, 적혈구를 함유하는 제 1 수집 베셀이 세포 단리 장비로부터 제거되고, 제 2 수집 베셀이 부착된다. 세정 단계 없이, 200 ㎕-1 ㎖ 의 용해 완충제가 여과 장치의 상실에 첨가된다. 상실이 뚜껑이 닫히고, 여과 장치 및 제 2 수집 베셀이 15-30 분 동안 4℃ 에서 격렬히 진탕된다. 여과 장치 및 제 2 수집 베셀이 원심분리기 내에 배치되고, 약 3,000 rpm 에서 약 5 분 동안 회전된다. 세포 용해물은 -70℃ 에서의 저장을 위해 또다른 베셀로 이송될 수 있다.
다른 경우에, 적혈구를 함유하는 제 1 수집 베셀이 세포 단리 장비로부터 제거되고, 필터 막을 함유하는 여과 장치가 해체된다. 상실 및 하실이 나사가 풀려서 그들이 분리된다. 겸자를 사용하여, 분리된 백혈구를 함유하는 필터 막이 용해 완충제를 함유하는 제 2 수집 베셀 내에 배치된다. 제 2 수집 베셀의 비제한적 예는 1.5 ㎖ 및 2 ㎖ 마이크로원심분리기 튜브를 포함한다. 일부 경우에, 제 2 수집 베셀은 추가로 인큐베이션된다 4℃ 에서 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 또는 120 분, 바람직하게는 약 15 ~ 약 30 분 동안. 다른 경우에, 제 2 수집 베셀은 얼음 위에 배치되고,총 30 분 동안 매 10 분 마다 10 초 동안 잠깐 볼텍싱된다. 일부 구현예에서, 세포 용해물은 -70℃ 에서 저장된다. 다른 구현예에서, 용해물을 함유하는 베셀은 원심분리되어 필터 막 및 세포 조각을 제거한다. 세포 용해물의 상청액은 -70℃ 에서의 저장을 위해 또다른 튜브로 이송된다.
또다른 구현예에서, 세포 단리 장비는 튜브 필터 유닛 및 수집 베셀을 포함한다 (도 2-6). 튜브 필터 유닛은 하나 이상의 (예를 들어, 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의) 필터 막과 함께 한쪽 끝에 부착된 원통형 튜브를 포함하며, 여기서 막은 전혈 샘플로부터의 건강한 및 악성 백혈구 및/또는 순환 종양 세포를 보유하는 능력이 있다. 특정 경우에, 필터 막은 (예를 들어, 2, 3, 또는 4) 층의 필터 예컨대 PALL 필터 (예를 들어, Leukosorb Medium) 이다. 특정 경우에, 각각의 필터는 공극 크기가 8 ㎛ 이고, 두께가 355.6-558.8 ㎛ 이고, 백혈구 잔류 수율이 70-80% 이다. 특정 경우에, 튜브 필터 유닛은 수집 베셀에 플라스틱 어댑터를 통해 부착된다. 튜브 필터 유닛의 필터 막은 수집 튜브의 개구부에 위치하는 어댑터에 단단히 부착되어 있다. 수집 베셀의 예는 3 ㎖, 5 ㎖, 8 ㎖, 14 ㎖ 및 16 ㎖ 플라스틱 배양 튜브를 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 프로테아제 저해제 및 포스파타제 저해제로 처리된 1 ㎖ 의 환자 전혈이 세포 단리 장비의 튜브 필터 유닛의 정상부 내로 로딩된다. 장비는 탁상형 원심분리기 예컨대 Allegra 6R 원심분리기 (Beckman), Sorvall Legend 원심분리기 (Thermo Scientific), 또는 Heraeus Megafuge 원심분리기 (Kendro) 내에서 5-30 분 동안 600-2000 rpms (예를 들어, 800 rpms) 에서 4℃ 에서 원심분리된다. 특정 경우에, 적혈구를 함유하는 수집 튜브가 세포 단리 장비로부터 제거되고, 새로운 수집 튜브가 부착된다. 세정 단계 없이, 200 ㎕-1 ㎖ 의 용해 완충제가 세포 단리 장비의 튜브 필터 유닛의 개구부에 첨가된다. 장비가 밀봉되거나 뚜껑이 덮힌 후, 15-30 분 동안 4℃ 에서 격렬히 진탕된다. 세포 단리 장비는 탁상형 원심분리기 내에서 약 3000 rpm 에서 약 5 분 동안 원심분리되고 회전된다. 세포 용해물은 그 후 수집 베셀로부터 -70℃ 에서의 저장을 위해 또다른 베셀로 이송될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 세포 단리 장비는 복수의 여과 장치 또는 튜브 필터 유닛 및 다중-웰 또는 다중-튜브 수집 베셀을 포함한다. 상기 여과 장치 및 튜브 필터 유닛은 다중-포맷 플레이트, 예컨대 12-웰 , 24-웰, 48-웰, 또는 96-웰 플레이트의 웰에 부착될 수 있다.
실시예 2. 세포 단리 장비를 사용하는 여과 방법에 의하는 CML 환자 혈액으로부터의 종양 세포 단리를 위한 프로토콜.
이 실시예는 본 발명의 방법을 사용하여 개별 환자 전혈 중 CML 종양 세포를 단리 및 수확하는데 사용되는 프로토콜을 상세히 설명한다. 환자로부터의 전혈은 단리 전에 BCR-ABL 저해제로 시험관내 처리 또는 비-처리될 수 있다.
갓 채취한 혈액 샘플이 종양 세포의 단리에 최선이다. 신선한 샘플이 수득될 수 없는 경우, 혈액 샘플은 채취된 후 1-3 일 내에 가공될 수 있다. EDTA (Becton Dickenson cat. no. #366643, EDTA (K2) 멸균 튜브) 내에 수집된 샘플은 채취된 날에 가공을 위해 발송된다. 샘플은 가공 전에 실온에서 유지되어야 한다. 이 때 샘플의 냉장 또는 냉동을 회피하는 것이 중요하다.
EDTA 튜브 (BD #366643) 내에 수집된 혈액 샘플은 프로테아제 및 포스파타제 저해제로 처리된다. 혈액의 튜브는 4-6 회 서서히 뒤집어서 부드럽게 혼합된 후, 1 ㎖ 혈액 당 0.05 ㎖ 의 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일이 첨가된다. 프로토콜 중 이 시점에, "종양 및 백혈구의 단리 및 용해" 라는 제목의 이 실시예의 섹션으로 진행함으로써 종양 및 백혈구가 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다. 임의로, 그 구획으로 진행하기 전에 혈액 샘플이 약물로 처리될 수 있다.
환자 혈액 샘플의 약물 처리
약물 예컨대 BCR-ABL 저해제는 그것이 혈액 샘플에 첨가되기 전에 Hank's Balanced Salts 용액 (HBSS) 중에 희석된다. 1.0 ㎖ 의 환자의 혈액 샘플이 배양 튜브 내로 배치된다. 원하는 농도의 약물이 환자의 혈액의 각각의 부분표본 (aliquot) 에 첨가된다. 예를 들어, 10 μM, 1 μM 또는 0.1 μM 의 약물 농도에 해당하는 10 ㎕, 1 ㎕ 또는 0.1 ㎕ 가 튜브에 첨가된다. 별도의 튜브 내의 1 밀리리터 (1 ㎖) 의 미처리된 혈액이 대조군으로서 사용될 수 있다. 튜브는 그 후 CO2 인큐베이터 내에서 4 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션된다. 그 후, 약물 처리된 샘플은 샘플의 종양 및 백혈구를 단리 및 용해하기 위해 다음 섹션의 절차에 따라 추가로 가공될 수 있다.
종양 및 백혈구의 단리 및 용해
튜브를 4-6 회 서서히 뒤집음으로써 여과 장치에 첨가될 혈액 샘플을 부드럽게 혼합한다. 1 ㎖ 피펫을 사용하여, 수집 튜브 내에 수용되어 있는 여과 장치의 상실에 1 ㎖ 의 혈액 샘플을 로딩한다. 샘플이 로딩된 후, 여과 장치를 탁 닫는다. 세포 단리 장비가 Allegra 6R 원심분리기 내에 배치되고, 15 분 동안 1,000 rpms 에서 4℃ 에서 원심분리된다. 원심분리 후에, 세포 단리 장비가 원심분리기로부터 제거된다. 적혈구를 함유하는 제 1 수집 튜브가 여과 유닛으로부터 제거되고, 제 2, 깨끗한 수집 튜브로 교체된다. 혈액을 함유하는 제 1 수집 튜브가 안전을 위해 뚜껑이 닫히고, 추후 사용을 위해 실온에서 유지된다.
200 ㎕ 의 용해 완충제 (얼음 위에 유지됨) 가 백혈구가 있는 막을 함유하는 여과 장치의 상실에 첨가된 후, 유닛이 탁 닫힌다. 세포 단리 장비가 4℃ 에서 유지되는 진탕 (회전) 플랫폼 위에 배치된다. 진탕 플랫폼은 세포 단리 장비와 함께 1 사이클 당 2 분 동안의 진탕 및 그 후 5 분 동안의 정지를 포함하는 3 사이클을 겪는다. 그 다음에, 세포 단리 장비는 2,000 rpm 에서 10 분 동안 4℃ 에서 원심분리된다. 제 2 수집 튜브 내에 위치하는 세포 용해물은 CEER 면역검정 예컨대 BCR-ABL 검정 및 다른 경로 마커 검정에서의 사용을 위해 1 ㎖ 피펫으로 2 ㎖ 원심분리 튜브로 이송된다. 임의로, 세포 용해물은 -70℃ 에서 저장된다.
실시예 3. 항암 약물의 희석 없이 전혈로부터 여과 방법에 의하는 백혈구 단리 및 수확.
이 실시예는 여과 방법을 사용하여 환자 전혈로부터 백혈구를 단리 및 용해하기 위한 프로토콜을 설명한다. 약물 농도를 희석하지 않으면서 그리고 오염 적혈구의 양을 간섭하지 않으면서 전혈로부터 정상, 건강한 백혈구에 더하여 악성 백혈구 예컨대 만성 골수성 백혈병 (CML) 종양 세포가 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 환자로부터의 전혈은 단리 전에 하나 이상의 티로신 키나제 저해제 (예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 포나티닙 (AP24534), 및 그들의 조합) 로 시험관내 처리 또는 비-처리될 수 있다. 만성 골수성 백혈병은 백혈구의 암이다. 그것은 골수 중 특히 골수 세포의 증가된 및 조절되지 않는 성장 및 혈액 중 이들 세포의 축적을 특징으로 하는 백혈병의 형태이다. 그러므로, 혈액 내의 상당한 수의 적혈구 및 혈장으로부터 종양 세포를 백혈구와 함께 추출함으로써 환자 의 CML 종양 중 종양원성 마커의 수준을 결정하는 것이 진단 및 예후 평가에 중요하게 되었다. 이 실시예는 항암 약물의 희석 없이 환자 혈액으로부터 백혈구 및/또는 순환 종양 세포의 회수를 가능하게 하는 여과 방법을 서술한다.
전형적으로, EDTA 또는 다른 항응고제를 함유하는 혈액 수집 튜브 내로 환자 혈액이 채취되고, 뒤집음으로써 부드럽게 혼합된다. 혈액 샘플은 실온에서 저장되고 24-72 시간 내에 가공되고, 전형적으로는 냉장 또는 냉동되지 않는다. 전혈을 함유하는 튜브는 위아래로 부드럽게 뒤집음으로써 혼합되고, 프로테아제 저해제 및 포스파타제 저해제를 함유하는 용액 혼합물로 처리된다. 용액 혼합물은 나트륨 오르토바나데이트 (200 mM, 2mM 의 최종 농도로), Sigma 프로테아제 저해제 (50x; 1x 의 최종 농도로), 및 Halt 포스파타제 저해제 (100x; 2x 의 최종 농도로) 를 포함할 수 있고, 환자의 혈액 샘플과 혼합된다. 프로테아제 저해제 및 포스파타제 저해제의 예는 Halt 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일 (Therma Scientific); 완전 ULTRA 및 PhosSTOP (Roche Applied Science); 프로테아제 저해제 세트 (EMD Chemicals); 및 포스파타제 저해제 칵테일 세트 I-IV (EMD Chemicals) 를 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다.
세포 단리 장비는 환자 혈액 샘플 중 다른 세포 예컨대 백혈구 및/또는 순환 종양 세포로부터 적혈구를 분리하는데 사용된다. 세포 단리 장비는 도시된 바와 같이 여과 장치 및 수집 베셀을 포함한다. 특정 양상에서, 여과 장치는 여과 장치의 상실 및 하실 사이에 하나 이상의 (예를 들어, 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의) 백혈구-보유 필터 막을 삽입함으로써 조립된다. 필터 막은 공극 크기가 8 ㎛ 이고, 두께가 355.6-558.8 ㎛ 이고, 백혈구 잔류 수율이 70-80% 일 수 있다. 필터 막의 비제한적 예는 백혈구 단리 (Leukosorb) 배지 (PALL Cat. No. BSP0669) 를 포함한다. 조립된 여과 장치는 수집 베셀의 정상부에 배치된다. 세포 단리 장비는 그 안으로 혈액 샘플이 로딩되기 전에 뚜껑이 열린다. 수집 베셀의 예는 튜브 예컨대 용량이 3 ㎖, 5 ㎖, 8 ㎖, 14 ㎖, 또는 16 ㎖ 인 플라스틱 배양 튜브를 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다.
환자의 혈액 샘플로부터 백혈구 및/또는 순환 종양 세포를 단리 및 용해하는 예시적 방법은 하기 단계들을 포함한다. 프로테아제 저해제 및 포스파타제 저해제로 전처리된 1 ㎖ 의 혈액 샘플이 뒤집음으로써 부드럽게 혼합된다. 그 다음에, 위에 기재된 바와 같이 조립된 세포 단리 장비의 상실 내로 1 ㎖ 의 혈액 샘플이 로딩된다. 세포 단리 장비는 임상용 또는 탁상형 원심분리기, 예컨대 Allegra 6R 원심분리기 (Beckman), Sorvall Legend 원심분리기 (Thermo Scientific), 또는 Heraeus Megafuge 원심분리기 (Kendro) 내로 배치된다. 전형적으로, 세포는 5-30 분 동안 600-2,000 rpms (예를 들어, 800 rpms) 에서 4℃ 에서 원심분리된다. 원심분리 동안 세포 단리 장비를 원심분리기 회전자 내로 고정시도록 어댑터가 사용될 수 있다. 원심분리 후에, 원심분리기로부터 세포 단리 장비가 제거되고, 여과 장치를 통과한 적혈구를 함유하는 수집 베셀로부터 여과 장치가 분리된다. 적혈구가 있는 수집 베셀은 생물학적 안전성을 위해 뚜껑이 닫히고, 한쪽으로 치워진다.
특정 구현예에서, 새로운 수집 베셀, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 또다른 수집 튜브 또는 마이크로원심분리기 튜브가 여과 장치 아래 배치된다. 세정 단계의 추가 없이, 200 ㎕-1 ㎖ 의 용해 완충제가 여과 장치의 상실에 첨가된다. 상실의 뚜껑이 닫히고, 여과 장치 및 새로운 수집 베셀이 15-30 분 동안 4℃ 에서 격렬히 진탕된다. 여과 장치 및 새로운 수집 베셀이 원심분리기 예컨대 마이크로원심분리기 내에 배치되고, 약 3,000 rpm 에서 약 5 분 동안 회전된다. 세포 용해물은 -70℃ 에서의 저장을 위해 또다른 원심분리기 베셀 예컨대 마이크로원심분리기 튜브로 이송될 수 있다.
또다른 구현예에서, 원심분리기로부터 세포 단리 장비가 제거되고 적혈구를 함유하는 수집 튜브로부터 여과 장치가 분리된 후, 여과 장치의 상실 및 하실 사이의 하나 또는 복수의 필터 막이 단리된다. 상실 및 하실이 탈착되고 (예를 들어, 나사가 풀리고), 필터 막이 겸자를 사용하여 단리된다. 막은 새로운 수집 베셀, 예컨대, 1 ㎖ 의 세포 용해 완충제를 함유하는, 1.5 ㎖ 또는 2.0 ㎖ 마이크로원심분리기 튜브 내로 배치된다. 필터 막 상의 세포를 용해하기 위해, 새로운 수집 베셀이 즉시 볼텍싱된다. 베셀은 그 후 얼음 위에 배치되고, 총 30 분 동안 매 10 분 마다 10 초 동안 잠깐 볼텍싱된다. 세포 용해물은 그 후 또다른 베셀, 예컨대 1.5 ㎖ 또는 2.0 ㎖ 마이크로원심분리기 튜브 내로 이송되고, -70℃ 에서 저장된다.
실시예 4. 96-웰 세포 단리 장비를 사용하는 세포 여과 방법에 의하는 세포의 단리.
이 실시예는 여과 방법 또는 여과 방법과 함께 자석 구슬 포획 (magnetic bead capture) 을 사용하는 샘플 예컨대, 예를 들어, 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 가래, 기관지 세척 유체, 눈물, 유두 흡인물, 림프, 타액, 및/또는 미세 바늘 흡인물 (FNA) 로부터의 단리된 세포의 회수를 설명하며, 여기서 단리된 세포는 본 발명에서 하나 또는 복수의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 및/또는 신호 전달 분자 (예를 들어, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR, c-Met, c-KIT, IGF-IR, SHC, PI3K 등) 의 활성화 상태 및/또는 총량을 탐지하는데 사용될 수 있다. 특히, 이 실시예는 여과 방법을 단독으로 사용하는 또는 항-CD45 항체가 있는 자석 구슬 포획 후에 여과 방법을 사용하는 K562 세포로 스파이크된 혈액으로부터의 K562 세포 (즉, 인간 만성 골수성 백혈병 세포주로부터의 세포) 의 회수, 및 그에 뒤이은 K562 세포 용해물의 제조 및 하나 이상의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 의 발현 및/또는 활성화 상태, 그의 기질, 그의 경로, 또는 그들의 조합의 확인을 설명한다. 이 실시예는 또한 여과 방법 또는 항-CD45 항체가 있는 자석 구슬 포획 전에 여과 방법을 사용하는 환자 혈액 샘플로부터의 혈액 세포의 부분집합 (즉, 백혈구) 의 회수, 및 그에 뒤이은 세포 용해물의 제조 및 하나 이상의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 의 발현 및/또는 활성화 상태, 그의 기질, 그의 경로, 또는 그들의 조합의 확인을 설명한다. 환자 샘플 수집 및 세포 단리 후 임의의 세정 단계에 대한 필요를 제거함으로써, 본원에 기재된 방법은 항암 약물 예컨대 티로신 키나제 저해제의 세포내 농도를 변화시키지 않으면서 혈액으로부터 관심의 세포가 회수될 수 있기 때문에 유리하다. 종래의 기술과 반대로, 이 실시예에 기재된 방법은 항암 약물 예컨대 티로신 키나제 저해제 (예를 들어, Gleevec®, Tasigna®, Sprycel® 등) 의 실질적 희석 없이 회수된 세포로부터의 세포 용해물을 제공한다.
갓 수집된 혈액으로부터 백혈구 및/또는 K562 세포를 단리하는 96-웰 세포 단리 플레이트가 제조될 수 있다. 96-웰 여과 플레이트로부터의 제 1, 원래의 막이 제거되고 필터 막 (예를 들어, LeukoLOCK (Life Technologies), Acroprep (PALL) 및 Leukosorb (PALL)) 으로 교체될 수 있다. 이들 구현예에서, K562 세포로 스파이크된 또는 스파이크되지 않은 갓 수집된 혈액이 96-웰 세포 단리 플레이트의 웰 내로 로딩될 수 있다. 제 2 96-웰 마이크로플레이트가 혈액 폐 수집 플레이트로서의 역할을 할 수 있고, 필터 막이 있는 세포 단리 플레이트 아래 배치될 것이다. 플레이트 조립체는 실온에서 약 5 분 동안 속도 약 600 rpm ~ 3,000rpm, 예컨대 예를 들어, 약 600 rpm, 1,000 rpm, 2,000 rpm, 및 3,000 rpm 에서 원심분리될 수 있다. 원심분리 후에, 필터 막은 원심분리 튜브로 이송될 수 있고, 필터 막 상의 세포는 세포를 용해시키기 위해 특정 부피의 용해 완충제 (예를 들어, 300 ㎕ 의 용해 완충제) 로 처리되고 잠시 및 즉시 볼텍싱될 수 있다. 세포 용해물을 함유하는 원심분리 튜브는 얼음 위에 약 30 분 동안 배치되고, 약 매 10 분 마다 잠시 동안의 볼텍싱에 적용될 수 있다. 튜브는 약 15 분 동안 원심분리되어 상청액으로부터 세포 잔해물을 분리할 수 있다. 용해물을 함유하는 상청액이 수집되고 마이크로어레이 예컨대 근접-매개 면역검정에 의해 분석되어 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 및/또는 신호 전달 분자 (예를 들어, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR, c-Met, c-KIT, IGF-IR, SHC, PI3K 등) 를 탐지할 수 있다.
K562 세포로 스파이크된 또는 스파이크되지 않은 갓 수집된 혈액은 항-CD45 항체가 있는 자석 구슬 포획에 의한 초기 가공 후에 본원에 기재된 세포 단리를 위한 여과 방법을 겪을 수 있다. K562 세포로 스파이크된 또는 스파이크되지 않은 갓 수집된 혈액은 항-CD45 항체와 커플링된 세정된 자석 구슬 (예를 들어, CD45 Dynalbeads (Invitrogen)) 과 함께 인큐베이션될 수 있다. 세정된 자석 구슬은 제조사의 지침에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 절차는 하기 단계들을 포함할 수 있다: 1) 항-CD45 항체에 커플링된 100 ㎕ 의 자석 구슬을 1.5 ㎖ 원심분리기 튜브로 이송하는 단계; 2) 1 ㎖ 의 완충제를 첨가하고 부드럽게 혼합하는 단계; 3) 원심분리기 튜브를 자석 위에 1 분 동안 배치하는 단계; 4) 상청액을 제거하는 단계; 및 5) 튜브를 자석으로부터 제거하고, 자석 구슬을 100 ㎕ 의 완충제 중에 재현탁시키는 단계. 특정 경우에, 100 ㎕ 의 세정된 구슬이 각각의 K562 스파이크된 혈액 샘플에 첨가될 수 있다. 샘플은 그 후 약 20 분 ~ 2 시간 동안 실온에서 또는 4℃ 의 냉장실 내에서 회전자 위에서 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 시간은, 예를 들어, 적어도 20 분, 30 분, 1 시간, 1.5 시간 또는 2 시간일 수 있다. 그 다음에, 샘플은 자석 (예를 들어, DynaMag magnet) 위에 배치될 수 있다. 상청액이 수집되고 96-웰 세포 단리 플레이트의 웰 내로 로딩될 수 있다. 여과에 의한 세포 단리 방법이 위에 기재된 바와 같이 실시될 수 있다.
혈액 세포의 부분집합 (예를 들어, 백혈구) 이 본원에 기재된 여과 방법에 의해 갓 수집된 CML 환자 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다. 특정 경우에, 혈액 샘플은 티로신 키나제 저해제 (예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 및 그들의 조합) 를 받는 CML 환자로부터 수집될 수 있다. 본 발명의 이점은, 티로신 키나제 요법을 받는 환자로부터의 혈액 샘플을 포함하는, 환자로부터의 혈액 샘플이 부가적 세정 또는 가공을 요구하지 않는다는 점이다. 위에 기재된 바와 유사하게, 원래의 막을 96-웰 여과 플레이트로부터 제거하고 그것을 관심의 혈액 세포 (예를 들어, 백혈구) 를 포획할 수 있는 막 필터 (예를 들어, LeukoLOCK (Life Technologies) 또는 Acroprep (PALL)) 로 교체함으로써 96-웰 세포 단리 플레이트가 제조될 수 있다. CML 환자로부터의 갓 수집된 혈액이 96-웰 세포 단리 플레이트의 웰 내로 로딩될 수 있고, 제 2 96-웰 마이크로플레이트가 필터 막이 있는 세포 단리 플레이트 아래 배치될 수 있다. 플레이트 조립체는 실온에서 약 5 분 동안 속도 약 600 rpm ~ 3,000 rpm, 예컨대, 예를 들어, 약 600 rpm, 1,000 rpm, 2,000 rpm, 및 3,000 rpm 에서 원심분리될 수 있다. 원심분리 후에, 필터 막은 원심분리 튜브로 이송될 수 있다. 세포를 용해하기 위해, 약 300 ㎕ 의 용해 완충제가 튜브에 첨가된 후, 튜브가 잠깐 볼텍싱될 수 있다. 세포 용해물을 함유하는 튜브가 얼음 위에 약 30 분 동안 배치되고, 약 매 10 분 마다 잠시 동안의 볼텍싱에 적용될 수 있다. 튜브는 약 15 분 동안 원심분리되어 상청액으로부터 세포 물질을 분리할 수 있다. 용해물을 함유하는 상청액이 수집되고, 마이크로어레이 검정 예컨대 본원에 기재된 근접-매개 면역검정에 의해 분석될 수 있다.
CML 환자로부터의 갓 수집된 혈액은 본원에 기재된 세포 단리를 위한 여과 방법 전에 항-CD45 항체가 있는 자석 구슬 포획에 의해 초기 가공될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체와 커플링된 세정된 자석 구슬 (예를 들어, CD45 Dynalbeads (Invitrogen)) 이 CML 환자로부터 수집된 혈액과 함께 인큐베이션될 수 있다. 세정된 자석 구슬은 제조사의 지침에 따라 제조될 수 있고, 예를 들어, 절차는 하기 단계를 포함할 수 있다: 1) 항-CD45 항체에 커플링된 100 ㎕ 의 자석 구슬을 1.5 ㎖ 원심분리기 튜브로 이송하는 단계; 2) 1 ㎖ 의 완충제를 첨가하고 부드럽게 혼합하는 단계; 3) 원심분리기 튜브를 자석 위에 1 분 동안 배치하는 단계; 4) 상청액을 제거하는 단계; 및 5) 튜브를 자석으로부터 제거하고, 자석 구슬을 100 ㎕ 의 완충제 중에 재현탁시키는 단계. 특정 경우에, 100 ㎕ 의 세정된 구슬이 각각의 K562 스파이크된 혈액 샘플에 첨가될 수 있다. 샘플은 그 후 약 20 분 ~ 2 시간 동안 실온에서 또는 4℃ 의 냉장실 내에서 회전자 위에서 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 시간은, 예를 들어, 적어도 20 분, 30 분, 1 시간, 1.5 시간 또는 2 시간일 수 있다. 그 다음에, 샘플은 자석 위에 배치될 수 있다. 상청액이 수집되고 96-웰 세포 단리 플레이트의 웰 내로 로딩될 수 있다. 여과에 의한 세포 단리 방법이 위에 기재된 바와 같이 실시될 수 있다.
도 7 는 본 발명의 백혈구 여과 방법을 사용하여 K562 세포로 스파이크된 혈액 샘플로부터 단리된 K562 세포로부터 제조된 세포 용해물 중에서 총 및 인산화된 BCR-ABL 둘다가 탐지되고 측정될 수 있음을 나타낸다. 도 7A 는 여과 후 세포 중 총 BCR-ABL 의 수준이 여과되지 않은 샘플 중 관찰된 수준과 유사했음을 보여준다. 부가적으로, 도 7B 는 여과 후 K562 세포 중 인산화된 BCR-ABL 의 수준이 가공되지 않은 세포 중 탐지된 수준과 비슷했음을 보여준다.
도 8A-B 는 세포 용해물 중에서 총 및 인산화된 BCR-ABL 수준 둘다가 탐지 및 측정되었음을 나타내며, 여기서 세포 용해물은 K562 세포로 스파이크된 혈액 샘플로부터 제조되고, 여과 막을 통하여 여과되고, 마이크로어레이 예컨대 근접 검정 예컨대 그의 공개가 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 2010 년 7 월 15 일에 제출된 PCT 출원 번호 PCT/US2010/042182, 및 미국 특허 공개 번호 20080261829, 20090035792, 및 20100167945 에 기재된 공동 근접 면역검정 (COPIA) 에 의해 분석되었다. 특히, 본원에 기재된 방법에 의해 단리된 5,000 개의 세포가 BCR-ABL CEER 검정에서 사용되었다. 다양한 속도에서 원심분리되었던 상이한 샘플 중 총 및 인산화된 BCR-ABL 의 백분율 회수가 비교되었다 도 8A 는 PALL 필터 막이 있는 여과 장비 및 속도 600 rpm 에서의 원심분리 단계를 포함하는 본 발명의 세포 단리 방법 후에 단리된 K562 세포 중 총 BCR-ABL 신호의 141.55% 회수가 있었음을 보여준다. 이에 비해, 세포 단리 방법이 LeukoLock 필터 막 및 속도 600 rpm 에서의 원심분리 단계를 포함했을 때, 총 BCR-ABL 신호 회수는 128.88% 였다. 특히, 원심분리 속도가 1,000 rpm 으로 증가되었을 때 백분율 회수는 62.71% 로 감소되었다. 도 8B 는 본 발명의 방법을 사용하여 K562 세포로 스파이크된 1 ㎖ 혈액 샘플로부터 단리된 세포 중 인산화된 BCR-ABL 신호의 백분율 회수를 보여준다. 인산화된 BCR-ABL 신호의 63.60% 가 PALL 여과 막에 의한 세포 단리 및 600 rpm 에서의 여과 장비의 원심분리를 포함했던 여과 방법을 사용하여 단리된 K562 세포 중 탐지되었다. 59.64% 의 인산화된 BCR-ABL 신호가 LeukoLOCK 여과 막에 의한 세포 단리 및 1,000 rpm 에서의 여과 장비의 원심분리를 포함했던 여과 방법을 사용하여 단리된 K562 세포 중 탐지되었다. 원심분리 속도가 600 rpm 으로 감소되었을 때, LeukoLock 막에 의한 백분율 회수가 57.89% 로 감소되었다.
도 9A 는 다양한 양의 K562 세포로 스파이크된 혈액 샘플로부터 제조되고, 여과 막을 통하여 여과되고, 마이크로어레이 예컨대 본원에 기재된 근접-매개 면역검정에 의해 분석된 세포 용해물 중에서 인산화된 BCR-ABL 수준이 탐지 및 측정될 수 있었음을 나타낸다. 본 발명의 방법이 K562 세포로 스파이크된 샘플 중 포스포-BCR-ABL 의 수준을 탐지하는데 사용되었다. 특히, 인산화된 BCR-ABL 의 측정된 수준은 혈액 샘플에 첨가된 K562 세포의 수와 관련된다. 인산화된 BCR-ABL 신호의 백분율 회수는 300,000 K562 세포로 스파이크된 샘플에 대해 123.32%, 100,000 K562 세포로 스파이크된 샘플에 대해 75.21%, 30,000 K562 세포로 스파이크된 샘플에 대해 63.16%, 및 10,000 K562 세포로 스파이크된 샘플에 대해 159.12% 였다.
도 9B 는 세포가 혈액 중 스파이크될 때 여과 후에 회수된 K562 세포 중 BCR-ABL 신호를 나타낸다. 인산화된 BCR-ABL 신호의 백분율 회수는 1,000,000 K562 세포로 스파이크된 샘플에 대해 63.60% 였고, 총 108.61% 였다.
실시예 5. 96-웰 세포 단리 장비를 사용하는 여과 방법에 의해 CML 환자 혈액으로부터 종양 세포를 단리하기 위한 프로토콜.
이 실시예는 여과 방법을 사용하여 환자 전혈로부터 만성 골수성 백혈병 (CML) 종양 세포를 단리 및 수집하기 위한 프로토콜을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 환자로부터의 전혈은 단리 전에 티로신 키나제 저해제 (예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 포나티닙 (AP24534), 및 그들의 조합) 로 시험관내 처리 또는 비-처리될 수 있다. 만성 골수성 백혈병은 백혈구의 암이다. 그것은 골수 중 특히 골수 세포의 증가된 및 조절되지 않는 성장 및 혈액 중 이들 세포의 축적을 특징으로 하는 백혈병의 형태이다. 95% 의 CML 암 세포가 BCR-ABL 종양단백질을 발현한다. 그러므로, 혈액 내의 적혈구로부터 종양 세포를 백혈구와 함께 추출함으로써 환자의 CML 종양 중 BCR-ABL 의 수준을 결정하는 것이 중요하게 되었다. 이 실시예는 환자 혈액으로부터 종양 세포 (예를 들어 백혈구 및 다른 백혈구) 의 회수를 가능하게 하는 여과 방법을 서술한다.
전형적으로, 환자 혈액은 EDTA 를 함유하는 혈액 수집 튜브 내로 채취되고, 뒤집음으로써 부드럽게 혼합된다. 전혈 샘플은 실온에서 저장되고 24 시간 내에 가공된다. 여과 플레이트는 전혈로부터 백혈구 (예를 들어, 백혈구) 의 회수를 허용할 수 있는 웰의 바닥에 막이 있는 96-웰 플레이트를 포함한다. 여과 플레이트가 시판되지 않는 경우, 여과 플레이트는 일련의 단계 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 하기 단계들을 통해 제조될 수 있다: a) 원래의 필터 막을 Whatman 96-웰 유니필터 (Unifilter) 플레이트로부터 제거하는 단계; b) LeukoLOCK 총 RNA 필터 막을 그것의 필터 카트리지 하우징으로부터 제거하는 단계; c) LeukoLOCK 총 RNA 필터 막에 0.25 인치 직경의 구멍을 뚫어서 새롭게 생성된 막 서클 (membrane circle) 이 96-웰 여과 플레이트의 웰에 꼭 들어맞도록 하는 단계; 및 d) 새로운 LeukoLOCK 총 RNA 필터 막 서클을 원래의 막이 제거된 Whatman 96-웰 유니필터 플레이트 내로 부드럽게 배치하는 단계. 그 다음에, 96-웰 마이크로플레이트가 96-웰 여과 플레이트 아래 배치되고, 플레이트 둘다가 테이프로 함께 밀봉되어 여과 플레이트 듀엣 (duet) 을 형성한다. 96-웰 마이크로플레이트는 통과하는 혈액을 수집하는 역할을 한다.
여과 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다. 환자 혈액 샘플이 1 ㎖ 피펫으로 5-10 회 위아래로 피펫팅함으로써 혼합된다. 1 ㎖ 피펫을 사용하여, 300 ㎕ 의 환자 혈액이 미리 만들어진 96-웰 여과 플레이트 듀엣의 웰 내로 로딩된다. 플레이트 듀엣은 탁상형 원심분리기 (예를 들어, Allegra 6R (Beckman Coulter)) 내에서 5 분 동안 3,000 rpm 에서 실온에서 원심분리된다. 원심분리 후에, 플레이트 듀엣이 원심분리기로부터 제거된다. 테이프가 제거되고, 플레이트 듀엣의 플레이트가 분리된다. 114 mm (41/2") 해부용 겸자를 사용하여, LeukoLOCK 필터 막 서클이 여과 플레이트의 웰로부터 제거되고, 300 ㎖ 의 단백질 용해 완충제를 함유하는 2 ㎖ 원심분리 튜브 내로 배치된다. 그 다음에, 원심분리 튜브가 즉시 볼텍싱된다. 원심분리 튜브는 얼음 위에 배치되고,총 30 분 동안 매 10 분 마다 10 초 동안 잠깐 볼텍싱된다. 용해물은 1 ㎖ 피펫을 사용하여 새로운 2 ㎖ 원심분리 튜브 내로 이송된다. 이때, 용해물은 -70℃ 에서 저장되거나, 하나 또는 복수의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 및/또는 신호 전달 분자 (예를 들어, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR, c-Met, c-KIT, IGF-IR, SHC, PI3K 등) 의 활성화 상태 및/또는 총량을 탐지하는 검정에서 사용된다.
여과 방법은 또한 하기 단계들을 포함할 수 있다. 환자 혈액 샘플이 여과 전에 티로신 키나제 저해제로 처리되어 환자 혈액으로부터 종양 세포 (예를 들어 백혈구 및 다른 백혈구) 를 회수한다. 특정 경우에, 1.2 ㎖ 의 갓 수집된 환자 혈액이 배양 튜브로 이송되고, 특정 농도 범위의 티로신 키나제 저해제 약물, 예컨대 10 μM, 1 μM 또는 0.1 μM 다사티닙; 10 μM, 1 μM 또는 0.1 μM 이마티닙; 및 10 μM, 1 μM 또는 0.1 μM 닐로티닙이 첨가된다. 혈액은 약 1 ~ 24 시간 (예를 들어, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 또는 24 시간) 동안 37℃ 의 CO2 인큐베이터 내에서 또는 실온에서 인큐베이션된다.
실시예 6. 제 1 및 제 2 채취로부터의 환자 2 의 혈액 샘플로부터 포스포-BCR-ABL, 총 BCR-ABL 및 BCR 수준을 확인하기 위한 CEER 면역-마이크로어레이에 대한 프로토콜.
이 실시예는 환자의 혈액 샘플 중 BCR-ABL 의 발현 및 활성화를 탐지하기 위한 CEER 면역-마이크로어레이의 실시 절차를 나타낸다. 백혈구 및 순환 종양 세포가 본원에 기재된 방법에 따라 단리된다. 단리된 세포는 용해되고, 근접 검정 예컨대 그의 공개가 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 2010 년 7 월 15 일에 제출된 PCT 출원 번호 PCT/US2010/042182, 및 미국 특허 공개 번호 20080261829, 20090035792, 및 20100167945 에 기재된 공동 근접 면역검정 (COPIA) 에서 사용된다. 특정 구현예에서, 프로토콜은 BCR 에 결합하는 자석 구슬에 의한 환자의 혈액 샘플의 처리를 포함한다.
CEER 면역-마이크로어레이를 위한 K562 세포 용해물의 희석.
미처리된 K562 세포 용해물을 본 발명의 방법, 예컨대 실시예 2 및 3 에 기재된 방법에 따라 제조했다. 검정 희석 완충제 중 미처리된 K462 세포 용해물의 계단 희석을 표 1 에 따라 실시했다. 세포 용해물을 3 개의 CEER 슬라이드에 의해 스크리닝했다.
표 1
Figure pct00003
CEER 면역-마이크로어레이를 위한 환자 혈액 샘플로부터 세포 용해물의 희석.
환자 혈액 샘플로부터 제조된 세포 용해물을 본 발명의 방법, 예컨대 실시예 1, 2 및 10 에 기재된 방법에 따라 제조했다. 3 개의 CEER 슬라이드와 함께 사용할 환자 세포 용해물의 희석 절차가 표 2 에 나타나 있다.
표 2
Figure pct00004
CEER 면역-마이크로어레이 절차.
1. 슬라이드 차단:
1.1. 슬라이드를 TBST 로 2 회 헹군다.
1.2. 슬라이드를 80 ㎕ 의 무단백질 (protein-free) (TBS) 차단 완충제로 1 hr 동안 차단한다.
1.3. 차단 단계 후 TBST 로 2 회 세정한다.
1.4. 1 ㎖ 의 검정 희석 완충제 (2%BSA/0.1% 트리톤/10mM EDTA/ TBS) 당 10 ㎕ 의 1mM Na3VO4 를 첨가한다.
2. 세포 용해물과의 인큐베이션:
2.1. 표 ## 및 ## 에 기재된 바와 같이 검정 희석 완충제에 의한 세포 용해물의 계단 희석을 실시한다.
2.2. 구슬과의 인큐베이션을 위한 세포 용해물의 부분표본을 제거하고, 동일 부피의 검정 희석 완충제를 자석 구슬 (예를 들어, BCR-1684 구슬) 과 인큐베이션되지 않을 용해물의 부분표본에 첨가한다.
2.3. 80 ㎕ 의 세포 용해물을 슬라이드에 첨가하고, 슬라이드를 밀봉한다.
2.4. 밤새 실온에서 인큐베이션한다.
2.5. 슬라이드를 5 회 세정한다 (첫번째 세정은 1.25㎖ TBST 에 의한 빠른 헹굼이고, 나머지 세정은 각각 3 분 동안이다).
3. 탐지 항체와의 인큐베이션:
3.1. 라벨링된 항체를 검정 희석 완충제 중에 적당한 농도로 희석한다.
3.1.1 4G10-HRP: 1:320 희석한다 (Millipore # 05-777)
3.1.2 BCR-GO-AF5129: 1:80 및 1:160 희석한다 (R&D # AF5129)
3.1.3 Abl-HRP-AF5414: 1:900 희석한다 (R&D # AF5414)
3.1.4 BCR-HRP-1684-B-덱스트란: 1:80 희석한다 (Epitomics # 1684-B)
3.1.5 GO-덱스트란: 1:80 희석한다
3.2. 80 ㎕ 의 항체 용액을 적당한 슬라이드에 첨가하고 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션한다.
3.2.1 자유 BCR 슬라이드의 경우: BCR-HRP 1:80, GO-덱스트란 1:80.
3.2.2 총 BCR-ABL 슬라이드의 경우: Abl-HRP 1:900, BCR-GO 1:80.
3.2.3 포스포-BCR-ABL 슬라이드의 경우: 4G10-HRP 1:320, BCR-GO 1:160.
3.3. 슬라이드를 5 회 세정한다 (첫번째 세정은 1.25㎖ TBST 에 의한 빠른 헹굼이고, 나머지 세정은 각각 3 분 동안이다).
4. 티라미드 매개 신호 증폭:
4.1. 50 mM 글루코스/PBS 중 1:320 희석으로 80 ㎕ 의 비오틴-티라미드를 첨가한다 (BCR-HRP+GO-덱스트란의 경우).
4.2. 50 mM 글루코스/PBS-RK 중 6.25ug/㎖ 로 80 ㎕ 의 비오틴-티라미드를 첨가한다 (4G10-HRP+ BCR-GO 및 ABL-HRP+ BCR-GO 의 경우).
4.3. 15 분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.
4.4. 슬라이드를 5 회 세정한다 (첫번째 세정은 1.25㎖ TBST 에 의한 빠른 헹굼이고, 나머지 세정은 각각 3 분 동안이다).
5. 알렉사 플루오르 접합된 스트렙타비딘과의 인큐베이션:
5.1. 검정 희석 완충제 중 0.4 ㎍/㎖ (1:4,000 희석) 로 80 ㎕ 의 스트렙타비딘-알렉사 647 과 함께 40 분 동안 인큐베이션한다.
5.2. 슬라이드를 5 회 세정한다 (첫번째 세정은 1.25㎖ TBST 에 의한 빠른 헹굼이고, 나머지 세정은 각각 3 분 동안이다).
5.3. 물로 1 회 세정한다.
5.4. 프레임을 제거하고 슬라이드를 물로 여러번 헹군다.
5.5. 슬라이드를 50 ㎖ 튜브 내에서 1500 rpm 에서 3 분 동안 원심분리한다.
6. 슬라이드를 건조시키고 퍼킨 엘머 스캐너 (Perkin Elmer scanner) 로 적당한 레이저 설정에서 스캔한다:
6.1. 슬라이드를 건조시킨다.
6.2. 슬라이드를 퍼킨 엘머 스캐너로 적당한 레이저 설정에서 스캔한다.
6.3. 이미지 및 스캔 세트 (scan set) 를 파일 및 서버에 저장한다.
실시예 7. 활성화된 BCR-ABL 수준이 특징인 혈액성 악성종양이 있는 환자를 위한 항암 요법의 선별 방법.
이 실시예는 BCR-ABL 매개 질환 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병) 이 있는 환자를 위한 항암 요법의 선별 방법을 설명한다. 환자는 이전에 BCR-ABL 매개 질환에 대해 치료된 적이 없고, 약물 예컨대 티로신 키나제 저해제 (예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 포나티닙 (AP24534), 및 그들의 조합) 를 받은 적이 없다. 환자의 혈액 샘플이 채취되고, 다양한 투여량의 상이한 항암 약물과 함께 1.5 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션된다. 이러한 시험관내 약물 치료 후에, 백혈구 및/또는 순환 종양 세포가 환자 혈액으로부터 회수된다. 단리된 세포는 용해되고, 근접 검정 예컨대 그의 공개가 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 2010 년 7 월 15 일에 제출된 PCT 출원 번호 PCT/US2010/042182, 및 미국 특허 공개 번호 20080261829, 20090035792, 및 20100167945 에 기재된 공동 근접 면역검정 (COPIA) 에서 사용된다. 약물 처리된 환자 샘플 중 신호 전달 경로 단백질 (예를 들어, BCR-ABL, BCR, ABL, CRKL, AKT, SRC) 의 분석물질의 발현/활성화 프로파일링에 기초하는, 경로 프로파일이 항암 약물의 존재 하에 확인된다. 프로파일은 긍정적 임상 결과를 달성하는 것을 목표로 하는 항암 치료 섭생을 선별하는데 사용된다.
그와 같이, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 혈액성 악성종양을 갖는 대상에서 항암 약물을 선별하는 방법을 제공한다: 1) 대상으로부터의 샘플로부터의 단리된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 수준을 측정하는 단계, 2) 단리된 세포를 치료의 개시 전에 하나 이상의 항암 약물과 인큐베이션하는 단계; 3) 인큐베이션된 세포 중 BCR-ABL 의 활성화 상태 수준을 측정하고; BCR-ABL 의 활성화 상태 수준에 기초하여 치료 과정을 선별하는 단계. 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 혈액성 악성종양을 갖는 대상에서 항암 약물의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다: 1) 항암 약물의 제 1 투여 전에, T0 에서 BCR-ABL 의 활성화 상태를 측정하는 단계; 2) 항암 약물을 대상에게 투여하는 단계, 여기서 항암 약물의 제 1 투여는 시간 T1 에서임; 2) 대상으로부터의 샘플 중 시간 T2 에서 BCR-ABL 의 활성화 상태 및 또는 발현 수준을 측정하는 단계; 및 3) BCR-ABL 의 활성화 상태 및 또는 발현 수준에 기초하여 치료 과정을 결정하는 단계.
실시예 8. 환자 1: 시험관내 BCR-ABL 저해 프로파일에 기초하여 최선의 치료 전략을 선별하기 위한 및/또는 치료의 효능을 확인하기 위한 경로 프로파일링
이 실시예는 대상의 혈액 샘플 중 신호 전달 경로 단백질 (예를 들어, BCR-ABL, BCR, ABL, CRKL, AKT, SRC) 의 분석물질의 발현/활성화 프로파일링에 기초하는, BCR-ABL 매개 질환 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병) 을 갖는 환자에 대한 저해제 요법의 효능의 확인을 설명한다. 특정 경우에, 환자는 저해제 요법 예컨대 티로신 키나제 저해제 (예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar ®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 포나티닙 (AP24534), 및 그들의 조합) 를 이용한 치료를 받고 있을 수 있다. 다른 구현예에서, BCR-ABL 기질 예컨대 CRKL, AKT, STAT5 및 SRC 의 존재 및/또는 활성화 상태는 근접 검정 예컨대 그의 공개가 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 2010 년 7 월 15 일에 제출된 PCT 출원 번호 PCT/US2010/042182, 및 미국 특허 공개 번호 2008/0261829, 2009/0035792, 및 2010/0167945 에 기재된 공동 근접 면역검정 (COPIA) 을 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 티로신 키나제 저해제를 이용한 시험관내 처리 후 대상의 샘플 중 키나제 및 다른 신호 전달 경로 구성요소의 발현/활성화 프로파일링은 임상의가 효과적 치료적 섭생을 선별하는 것을 가능하게 하는 귀중한 정보를 제공할 수 있다.
예시적 실시예에서, 환자 (환자 1) 로부터의 혈액 샘플이 분석되어 환자의 이마티닙 요법의 효과성을 확인했다. 환자 1 은 만성 골수성 백혈병 (CML) 으로 일차 진단된 55 세 백인, 여성이다. 그녀는 활성 CML 을 갖고, 진단 이후로 이마티닙을 수령해 왔다. 환자의 혈액이 채취되고, 위에 기재된 방법을 사용하여 백혈구가 단리되었다. 간략히, 환자 1 의 전혈 샘플이 여과 플레이트를 통하여 여과되어 백혈구 및 순환 종양 세포가 회수되었다. 세포가 그 후 용해되고, 하나 또는 복수의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 및/또는 신호 전달 분자 (예를 들어, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR, c-Met, c-KIT, IGF-IR, SHC, PI3K) 의 활성화 상태 및/또는 총량을 탐지하는 근접 검정 (예를 들어, CEER 및 COPIA) 에서 사용되었다. 특정 경우에, 근접 검정에서 사용되는 포획 항체의 희석 시리즈가 1:5 또는 1:20 로 희석되어 원하는 농도를 달성한다. 백혈구의 수 및 인산화된 BCR-ABL 및 다른 신호 전달 경로 구성요소의 프로파일이 근접 검정을 사용하여 확인되었다. 인산화 신호 비가 또한 분석으로부터 계산되고, 환자의 예후를 결정하는데 사용되었다.
바람직한 구현예에서, 환자의 혈액 샘플은 백혈구 또는 순환 종양 세포의 단리 전에 저해제 치료제와 함께 시험관내 인큐베이션될 수 있다. 특정 경우에, CML 로 진단된 환자로부터 수집된 전혈 샘플은 0.1μM, 1μM 또는 10μM BCR-ABL 저해제 (예를 들어, 이마티닙, 닐로티닙 및 다사티닙) 로 1.5 시간 동안 37℃ 에서 처리된다. 백혈구 또는 순환 종양 세포가 전혈로부터 여과 방법을 사용하여 단리되고, 당업계에 알려진 기술을 사용하여 용해된다. 세포 용해물은 그 후 하나 또는 복수의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 및/또는 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 총량에 대한 BCR-ABL 저해제 치료의 효과를 확인하는 근접 검정에서 사용된다. 특정 구현예에서, BCR-ABL 저해제를 이용한 시험관내 처리는 인산화된 CRKL 의 수준을 감소시킬 수 있다. 특정 경우에, 환자 샘플 중 CRKL 활성화는 BCR-ABL 활성화로 인한 것일 수 있다. 또다른 구현예에서, 특이적 저해제 예컨대 다사티닙은 활성화된 형태의 AKT, STAT5 및 SRC 를 약화시킬 수 있다. 다른 경우에, 다른 저해제 예컨대 이마티닙 및 닐로티닙은 동일한 환자 중 인산화된 AKT 및 STAT5 의 수준을 감소시킬 수 없다. 특정 경우에, 인산화된 AKT 및 STAT 신호전달은 BCR-ABL 활성화 상태에 의존적일 수 없다. 또다른 양상에서, 현재 이마티닙을 수령하고 있는 환자는 BCR-ABL 기질 예컨대 CRKL, STAT5 및 SRC 의 약화된 발현/활성화로 인해 조합 요법 예컨대 이마티닙 및 다사티닙에 반응할 것이고 그것을 받을 것이다.
도 10 은 이 연구에서 분석된 환자를 기술한다. 환자 1 은 활성 CML 을 갖고 적어도 5 년 동안 치료를 받아 왔다. 환자 2 도 활성 CML 를 갖고 1 년 동안 이마티닙 치료를 받아 왔다. 도 11A-B 는 환자 1 이 환자 2 에 비해 혈액 1 ㎖ 당 더 적은 양의 포스포-BCR-ABL 을 가짐 (10,979 CU/㎖ 대 185,934 CU/㎖) 을 나타내어, 환자 1 이 이마티닙 치료에 반응했음을 시사한다. 도 12A-B 는 백혈구 및 다른 순환 종양 세포의 여과 단리 후에 샌드위치 ELISA 에 의해 확인된 총 및 BCR-ABL 의 활성화된 (인산화된) 수준의 탐지를 보여준다. 근접 검정은 K562 세포 중 포스포르-BCR-ABL 의 수준을 탐지할 수 있다. 도 13A-B 는 환자 1 로부터의 혈액 샘플의 이마티닙을 이용한 시험관내 처리가 인산화된 BCR-ABL 의 양을 닐로티닙 치료에 비해 극적으로 감소시켰음을 보여준다. 도 14 및 15 는 환자 1 의 증가하는 양의 BCR-ABL 저해제로 처리되었을 때 혈액 샘플 중 활성화된 BCR-ABL 수준이 변화되었음을 보여준다. 이 실험에서, 환자 1 로부터의 혈액 샘플은 1.5 시간 동안 다양한 양의 BCR-ABL 저해제 (예를 들어 10μM, 1μM 또는 0.1μM 이마티닙, 또는 10μM, 1μM 또는 0.1μM 닐로티닙) 로 시험관내 처리되었다. 결과는 평균 포스포-BCR-ABL 신호가 10μM 이마티닙의 경우 84 CU for , 1μM 이마티닙의 경우 26 CU, 0.1μM 이마티닙의 경우 110 CU 였음을 보여준다. 활성화된 BCR-ABL 신호의 평균 수준은 10μM 닐로티닙의 경우 47 CU, 1μM 닐로티닙의 경우 61 CU, 0.1μM 닐로티닙의 경우 306 CU 였음을 보여준다. 도 15A-B 는 환자 1 의 혈액 샘플 중 활성화된 BCR-ABL 단백질을 감소시키는데 이마티닙이 닐로티닙보다 더욱 효과적이었음을 보여준다. 활성화된 BCR-ABL 신호의 백분율 회수는 1μM 이마티닙으로 시험관내 처리된 샘플에서 -18.46%, 1μM 닐로티닙에 노출된 샘플에서 19.15% 였다 (도 15B). 도 16A-D 는 다른 인산화 신호 전달 경로 구성요소 예컨대 CRKL (A), AKT (B), STAT5 (C) 및 SRC (D) 의 경로 프로파일을 나타낸다. 그것은 다사티닙 요법이 환자 1 의 혈액 샘플 중 활성화된 AKT, STAT4 및 SRC 의 수준 감소를 초래했으나, 이마티닙 또는 닐로티닙은 그렇지 않았음을 보여준다. 도 17 은 환자 1 의 혈액 샘플이 매우 높은 수준의 총 BCR (8 백만 CU/㎖) 을 함유했음을 보여준다.
실시예 9. 환자 2: 시험관내 BCR-ABL 저해 프로파일에 기초하여 최선의 치료 전략을 선별하기 위한 및/또는 치료의 효능을 확인하기 위한 경로 프로파일링.
이 실시예는 대상의 혈액 샘플 중 신호 전달 경로 단백질 (예를 들어, BCR-ABL, BCR, ABL, CRKL, AKT, SRC) 의 분석물질의 발현/활성화 프로파일링에 기초하는, BCR-ABL 매개 질환 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병) 을 갖는 환자에 대한 저해제 요법의 효능의 확인을 설명한다. 특정 경우에, 환자는 저해제 요법 예컨대 티로신 키나제 저해제 (예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 포나티닙 (AP24534), 및 그들의 조합) 를 이용한 치료를 받고 있을 수 있다. 다른 구현예에서, BCR-ABL 기질 예컨대 CRKL, AKT, STAT5 및 SRC 의 존재 및/또는 활성화 상태는 근접 검정 예컨대 그의 공개가 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 2010 년 7 월 15 일에 제출된 PCT 출원 번호 PCT/US2010/042182, 및 미국 특허 공개 번호 2008/0261829, 2009/0035792, 및 2010/0167945 에 기재된 공동 근접 면역검정 (COPIA) 을 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 티로신 키나제 저해제를 이용한 시험관내 처리 후 대상의 샘플 중 키나제 및 다른 신호 전달 경로 구성요소의 발현/활성화 프로파일링은 임상의가 효과적 치료적 섭생을 선별하는 것을 가능하게 하는 귀중한 정보를 제공할 수 있다.
예시적 예에서, 환자 (환자 2) 는 1 월에 CML 로 진단받은 39-세 백인, 남성이다. 환자 2 는 진단 이후로 이마티닙을 수령해 왔고, 활성 질환을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 환자의 혈액이 채취되고, 위에 기재된 방법을 사용하여 백혈구가 단리된다. 간략히, 환자 2 의 전혈 샘플이 여과 플레이트를 통하여 여과되어 백혈구 및 순환 종양 세포가 회수되었다. 세포가 그 후 용해되고, 하나 또는 복수의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 및/또는 신호 전달 분자 (예를 들어, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR, c-Met, c-KIT, IGF-IR, SHC, PI3K) 의 활성화 상태 및/또는 총량을 탐지하는 근접 검정 (예를 들어, CEER and COPIA) 에서 사용되었다. 특정 경우에, 근접 검정에서 사용되는 포획 항체의 희석 시리즈가 1:5 또는 1:20 로 희석되어 원하는 농도를 달성할 수 있다. 백혈구의 수 및 인산화된 BCR-ABL 및 다른 신호 전달 경로 구성요소의 프로파일이 근접 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 인산화 신호 비가 또한 분석으로부터 계산되고, 환자의 예후를 결정하는데 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 환자의 혈액 샘플은 백혈구 또는 순환 종양 세포의 단리 전에 저해제 치료제와 함께 시험관내 인큐베이션될 수 있다. 특정 경우에, CML 로 진단된 환자로부터 수집된 전혈 샘플은 1uM BCR-ABL 저해제 (예를 들어, 이마티닙, 닐로티닙 및 다사티닙) 로 1.5 시간 동안 37℃ 에서 처리된다. 백혈구 또는 순환 종양 세포가 전혈로부터 여과 방법을 사용하여 단리되고, 당업계에 알려진 기술을 사용하여 용해된다. 세포 용해물은 그 후 하나 또는 복수의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 및/또는 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 총량에 대한 BCR-ABL 저해제 치료의 효과를 확인하는 근접 검정에서 사용된다. 특정 구현예에서, 닐로티닙을 이용한 시험관내 처리는 환자의 혈액 샘플 중 회수된 포스포-BCR-ABL 의 백분율을 감소시킬 것이나, 이마티닙은 그렇지 않을 것이다. 특정 경우에, 이러한 경로 프로파일을 갖는 환자는, 이마티닙에 비해, 닐로티닙 요법에 더 잘 반응할 것이다. 다른 구현예에서, BCR-ABL 저해제를 이용한 시험관내 처리는 인산화된 CRKL 에 영향을 미치지 않을 것이다. 또다른 구현예에서, 특이적 저해제 예컨대 다사티닙은 활성화된 형태의 AKT, STAT5 및 SRC 를 약화시킬 수 있다. 다른 경우에, 다른 저해제 예컨대 이마티닙 및 닐로티닙은 동일한 환자 샘플 중 인산화된 AKT 의 수준을 감소시킬 수 있다. 또다른 경우에, 인산화된 STAT5 및 SRC 는 이마티닙 및 닐로티닙을 이용한 시험관내 처리로 인해 약 20% 만큼 감소된다. 또다른 양상에서, 현재 이마티닙을 수령하고 있는 환자는, BCR-ABL 기질 예컨대 AKT, STAT5 및 SRC 의 약화된 발현/활성화로 인해, 다사티닙 요법에 더 잘 반응할 것이고 이를 받을 것이다.
도 18A-B 는 1.5 시간 동안 37℃ 에서 상이한 투여량의 BCR-ABL 저해제로 환자 2 의 혈액 샘플을 시험관내 처리한 후 인산화된 BCR-ABL 이 탐지 및 측정되었음을 보여준다. 그것은 또한 환자 2 로부터의 시험관내-처리된 혈액 샘플 중 활성화된 BCR-ABL 을 감소시키는데 닐로티닙이 이마티닙에 비해 더욱 효과적임을 보여준다. 닐로티닙의 농도 증가 (예를 들어, 0.1μM, 1μM. 및 10μM) 는 활성화된 BCR-ABL 을 감소시켰지만, 다양한 이마티닙 농도는 더 적은 효과를 가졌다 (도 18B). 이마티닙은 환자 2 에서 활성화된 BCR-ABL 수준에 매우 적은 효과를 가졌다. 도 19A-D 는 다사티닙을 이용한 환자 2 의 혈액 샘플의 시험관내 처리가 활성화된 AKT (B), STAT5 (C) 및 SRC (D) 의 수준을 감소시켰음을 보여준다. 반면에, 이마티닙 또는 닐로티닙 치료를 이용한 유사한 치료는 오직 인산화된 AKT 를 감소시켰다 (예를 들어, 비-처리된 샘플에서의 100% 와 비교되는 10μM 이마티닙 치료 샘플에서의 55.54%).
실시예 10. 만성 골수성 백혈병으로 이마티닙 요법 중인 환자로부터의 혈액 샘플의 경로 프로파일의 비교
이 실시예는 대상의 혈액 샘플 중 신호 전달 경로 단백질 (예를 들어, BCR-ABL, BCR, ABL, CRKL, AKT, SRC) 의 분석물질의 발현/활성화 프로파일링에 기초하는 경로 프로파일이 확인되고 비교되어 다양한 치료적 섭생의 효능을 확립할 수 있음을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, BCR-ABL 기질 예컨대 CRKL, AKT, STAT5 및 SRC 의 존재 및/또는 활성화 상태는 근접 검정 예컨대 그의 공개가 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 2010 년 7 월 15 일에 제출된 PCT 출원 번호 PCT/US2010/042182, 및 미국 특허 공개 번호 2008/0261829, 2009/0035792, 및 2010/0167945 에 기재된 공동 근접 면역검정 (COPIA) 을 사용하여 측정될 수 있다. 다른 구현예에서, 환자는 저해제 요법 예컨대 티로신 키나제 저해제 (예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 포나티닙 (AP24534), 및 그들의 조합) 를 이용한 치료를 받고 있을 수 있다. 다른 구현예에서, 환자 혈액 샘플은 티로신 키나제 저해제로 1.5 시간 동안 37℃ 에서 시험관내 처리될 수 있다. 그 후, 순환 종양 세포 및/또는 백혈구가 본원에 기재된 여과 방법을 사용하여 혈액 샘플로부터 회수될 수 있다. 단리된 세포가 용해되고, 하나 또는 복수의 종양원성 융합 단백질 (예를 들어, BCR-ABL) 및/또는 신호 전달 분자 (예를 들어, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR, c-Met, c-KIT, IGF-IR, SHC, PI3K, CRKL, AKT, STAT5, SRC) 의 의 활성화 상태 및/또는 총량을 탐지하는 근접 검정 (예를 들어, CEER 및 COPIA) 에서 사용될 수 있다. 이들 단백질의 측정된 수준은 동일한 환자 또는 다른 환자로부터의 샘플 사이에 비교될 수 있다. 경로 프로파일의 비교는 임상의가 BCR-ABL 매개 질환을 갖는 환자에 가장 효과적인 요법을 선별하는 것을 가능하게 해준다.
도 20A-D 는 인산화된 CRKL 수준이 티로신 키나제 저해제로 또한 시험관내 처리된 혈액 샘플 중에서 탐지 및 측정되었음을 보여준다. 이 실험에서, 근접 검정에서 사용되는 포획 항체가 1:10 또는 1:50 희석되어 원하는 농도를 달성했다. 환자 1 은 환자 2 에 비해 더 높은 수준의 활성화된 CRKL 을 보였다. BCR-ABL 저해제 예컨대 이마티닙 및 닐로티닙은 오직 환자 1 로부터의 혈액 샘플 중 CRKL 수준을 감소시켰고, 환자 2 로부터의 샘플 중 CRKL 수준은 감소시키지 않았다.
도 21A-D 는 환자 1 및 환자 2 이 이마티닙 및 닐로티닙에 유사하게 반응하지 않음을 나타낸다. 이마티닙 치료 후 환자 1 로부터의 샘플 중 활성화된 AKT 수준이 증가하지만, 환자 2 로부터의 샘플 중 활성화된 AKT 수준은 감소한다. 닐로티닙에 반응하여, 환자 1 로부터의 샘플 중 AKT 수준은 거의 변화하지 않고 유지되지만, 환자 2 로부터의 샘플 중 AKT 수준은 크게 감소한다.
도 22A-B 는 시험관내 다사티닙 처리가 환자 1 (A) 및 2 (B) 로부터의 샘플 중 포스포-STAT5 수준을 감소시킬 수 있음을 보여준다. 활성화된 STAT5 수준은 비처리, 10μM 이마티닙 및 10μM 닐로티닙을 수령한 환자 1 또는 환자 2 로부터의 샘플에서 유사하다.
도 23A-D 는 환자 1 및 2 로부터의 샘플 둘다가 이마티닙, 닐로티닙 및 다사티닙에 반응하여 더 낮은 수준의 포스포-SRC 를 가짐을 보여준다. 다사티닙은 환자 1 및 환자 2 샘플 둘다에서 포스포-SRC 수준을 감소시키는데 이마티닙 및 닐로티닙에 비해 더욱 효과적이었다.
실시예 11 CML 환자에서 BCR-ABL 의 활성화의 탐지 및 모니터링.
이 실시예는 CML 로 진단된 환자에서 치료 반응을 모니터링하는 본 발명의 방법을 나타낸다. 이 실시예는 상기 방법이 제한된 수의 세포로부터 여러 단백질의 발현 및 활성화 상태를 탐지할 수 있음을 나타낸다. 이 실시예는 본 발명의 세포 단리 장비의 사용 방법 및 CEER 면역검정이, mRNA-기반 분석에 비해, 기능적 표적 조정의 더욱 민감한 정량적 분석을 제공함을 보여준다.
CML 치료 반응을 모니터링하는 전통적 방법은 세포유전학적 시험, 골수 흡인 도말 평가 (bone marrow aspiration smear evaluation), Ph 염색체의 형광 동소 혼성화 (FISH), 및 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응 (Q-PCR) 을 포함한다. 전형적으로, 세포유전학적 시험 또는 뼈 흡인 도말 평가는 치료의 3, 6, 및 12 월에 또는 CCyR 획득시까지 수행된다. 현재, Q-PCR 이 치료 반응에 대한 가장 민감한 시험이다. 본 발명은 Q-PCR 보다 민감하고 환자의 혈액 샘플 중 약물의 제거 또는 희석을 요구하지 않는, BCR-ABL 키나제 저해의 생체내 조정을 모니터링하는 방법을 제공한다.
이 연구에서, 본 발명의 방법을 사용하여 총 및 활성화된 BCR-ABL 의 수준이 CML 환자로부터 분석되었다. 도 24 는 이 연구에서 평가된 환자의 표를 나타낸다. 진단 일자 및 환자의 치료 과정이 기록되었다. 혈액이 연구 과정 동안 다양한 시점에 채취되었다. 백혈구 및 순환 종양 세포가 환자 혈액 샘플로부터 단리되었고, 본원에 기재된 방법에 따라 용해되었다. 세포 용해물이 실시예 6 에 기재된 방법에 의해 가공되고 분석되었다. 환자 혈액 샘플 중 BCR-ABL 및 다른 신호전달 분자 (예를 들어, AKT, SRC, CRKL 및 STAT5) 의 발현 및 활성화의 조정이 근접 검정 (예를 들어, COPIA 또는 CEER) 을 사용하여 확인되었다. 근접 검정 예컨대 공동 근접 면역검정 (COPIA) 의 상세한 설명이 그의 공개가 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 2010 년 7 월 15 일에 제출된 PCT 출원 번호 PCT/US2010/042182, 및 미국 특허 공개 번호 2008/0261829, 2009/0035792, 및 2010/0167945 에 기재되어 있다.
약물 치료 후 환자에서 CML 진행의 모니터링.
도 25 는 본 발명의 방법을 사용하여 환자 샘플 중 탐지된 총 및 활성화된 BCR-ABL 수준을 나타낸다. 환자 샘플의 추가의 설명이 이 실시예에 기재되어 있다.
총 BCR, ABL 및 BCR-ABL 수준이 정상, 건강한 대상으로부터의 혈액 샘플로부터 확인되었다. 예상된 바와 같이, BCR-ABL 수준은 음성 (negative) 이었다 (도 26 참고).
환자 1 은 2006 년 12 월에 CML 로 진단되었고, 이마티닙 (Gleevec) 치료를 받았다. 이마티닙에 대한 환자 1 의 반응을 확인하기 위해, 총 및 활성화된 BCR-ABL 수준이 3 개의 시점 (1/31, 4/25, 및 10/24) 에 분석되었다. 환자 1 은 인산화된 BCR-ABL/백혈구 비가 시점 1 에 0.130, 시점 2 에 0.133, 세번째 시점 3 에 0.078 이었다 (도 27A). 시점 2 및 3 에서 mRNA 값은 각각 0.04+0.01% 및 0.04% 로, mRNA 발현 검정에 의해 시점들 사이의 인산화된 BCR-ABL 수준의 변화가 탐지되지 않았다. RNA 발현 검정은 표준 기준선 값으로부터 3 로그 감소 (three log reduction) 에서 활성 종양 세포를 탐지한다. CEER 면역-마이크로어레이의 이점은 그것이 3 초과의 로그 감소에서 포스포-BCR-ABL 을 탐지한다는 점이다.
환자 7 로부터의 결과는 BCR-ABL 수준의 mRNA 수준은 탐지불가능했으나, 총 및 활성화된 BCR-ABL 수준은 CEER 면역-마이크로검정을 사용하여 탐지되었음을 보여준다. 본 발명의 방법은 총 BCR-ABL 보다 활성화된 BCR-ABL 을 탐지하는데 10 배 더 민감한 것으로 드러났다. 특히, CEER 면역검정은 환자에서 BCR-ABL 의 발현 및 활성화 상태를 활성 종양 세포 대 총 백혈구 비 0.05% 로 탐지하며, 이는 표준 기준선 값으로부터 4 초과의 로그 감소에 해당한다. 환자 7 은 5 월에 CML 로 진단되었고, 4 월에 이마티닙 치료를 개시했다. 치료에 대한 반응이 치료 후 2 개의 시점 (예를 들어, 6 월 및 2 월) 에 모니터링되었다. 결과는 포스포-BCR-ABL 이 시간의 흐름에 따라 감소했음을 보여준다 (도 27B 의 막대 그래프 및 선 그래프 참고).
환자 2 는 1 월에 진단되었고, 2 월에 이마티닙 치료를 받았다. 환자로부터의 백혈구 및 CTC 가 2/2 및 3/2 에 채취된 혈액으로부터 세포 단리 장비의 96-웰 구현예를 사용하여 단리되고 용해되었다. 본 발명의 세포 단리 장비의 튜브 구현예가 10/12 및 12/21 에 채취된 혈액으로부터 사용되었다. 본 발명의 방법을 사용하여, 환자 2 가 5 월의 시점에 더 낮은 수준의 활성화된 BCR-ABL 을 발현했음이 확인되었다 (예를 들어, 도 28A, B 의 막대 그래프 및 선 그래프 참고). 그러나, 그 수준은 10 월까지 증가했다. CEER 면역검정으로부터의 결과는 mRNA 발현 데이타와 상관관계가 있다. 표준 방법 (예를 들어, BCR-ABL 용 MolecularMD 키트) 및 낮은 수준의 mRNA 을 사용하는 Q-PCR 의 정확도가 도 28C 에 강조되어 있다. BCR-ABL 대 ABL 의 % 는 샘플에 존재하는 mRNA 의 양에 따라 다르다.
환자 샘플에서 시험관내 약물 반응의 모니터링.
시험관내에서 약물 치료에 대한 환자 2 의 반응을 확인하기 위해, 혈액 샘플이 다양한 양의 이마티닙 또는 닐로티닙으로 처리되었고, BCR-ABL 의 총 및 활성화된 상태가 검정되었다. CEER 면역검정은 환자 7 의 샘플에서 약물 치료에 대한 반응을 탐지할 수 있었고, 따라서 이 검정이 환자를 위한 최선의 요법을 결정함에 있어서 유용한 도구임을 입증했다.
환자 3 은 CML 로 진단되었고, 다사티닙 (Sprycel) 치료를 받았다. 총 및 활성화된 BCR-ABL 수준이 5 개의 시점 (2/07 4/04/, 7/25, 8/22/ 및 10/17) 에 모니터링되었다. 2/07 및 4/04 에 채취된 혈액은 세포 단리 장비의 96-웰 구현예를 사용하여 가공되었고, 7/25 및 8/22 에 채취된 혈액은 본 발명의 장비의 튜브 구현예를 사용하여 가공되었다. 도 29A 는 pBCR/WBC 비가 10/17 에 최저였음을 보여준다. 도 29B 는 포스포-BCR-ABL 수준이 7/25 샘플에서 최고점에 도달했고, 10/17 샘플에서 그것의 최저 수준으로 감소했음을 나타낸다. 환자 3 은 다사티닙에 반응했고, 마지막 시점에 더 낮은 수준의 활성화된 BCR-ABL 을 가졌으며, 이는 도 29A 에 강조되어 있다. 포스포-BCR-ABL 에 대한 CEER 검정의 결과는 mRNA 발현 데이타와 상관관계가 있다.
환자 8 은 2007 년 7 월에 CML 로 진단되었고, 05/25 에 이마티닙 치료에서 다사티닙 치료로 바꿨다. 혈액은 5/18 및 6/20 에 채취되었고, 본 발명의 세포 단리 장비의 96-웰 구현예를 사용하여 가공되었다. 7/18, 08/18 및 10/13 에 채취된 혈액으로부터 본 발명의 튜브 구현예를 사용하여 백혈구 및 CTC 가 단리되고 용해되었다. 도 30A 는 포스포 BCR-ABL/WBC 비가 5/18 로부터 8/18 까지 감소했으나, 03/13 에 증가했음을 보여준다. 포스포 BCR-ABL/총 BCR-ABL 비는 환자가 다사티닙을 받는 동안 증가했으며 (도 30B), 이는 아마도 CML 의 진행으로 인한 것일 것이다.
환자 18 은 08/20 에 닐로티닙의 초기 치료에, 그리고 그 후 08/22 에 포나티닙의 치료에 반응했다. 이 연구에서 환자로부터 채취된 모든 혈액은 본 발명의 세포 단리 장비의 튜브 구현예를 사용하여 가공되었다. 본 발명의 방법으로부터의 결과는 pBCR-ABL/WBC 비가 요법의 과정 동안 감소했음을 보여준다. 당업자에게 알려진 표준 방법에 의해 확인된 mRNA 비도 또한 측정된 기간 동안의 BCR-ABL 의 감소를 보여준다.
환자 14 는 6 월에 CML 로 진단되었고, 6/28 에 히드록시우레아 치료를, 그리고 08/29 에 다사티닙 치료를 받았다. 8/29 및 10/03 에 채취된 혈액은 본 발명의 세포 단리 장비의 튜브 구현예를 사용하여 가공되었다. 도 31B 는 활성화된 포스포-BCR-ABL 수준 (pBCR-ABL/WBC 비) 이 제 1 시점 (6/28) 후에 감소되었고, 마지막 시점 (10월 20일) 에 그것의 최저였음을 보여준다. 환자 14 로부터의 혈액 샘플은 상이한 농도의 이마티닙 또는 닐로티닙으로 시험관내 처리되었다. 도 32 A-B 는 약물 치료에 대한 환자 14 의 시험관내 반응이 이마티닙 또는 닐로티닙 치료시 인산화된 BCR-ABL 의 감소를 초래함을 보여준다.
결론
이 실시예는 20 명의 CML 환자로부터 수득된 세포 용해물 중 BCR-ABL 발현 및 인산화의 분석을 나타낸다. 이 실시예는, 세포 단리 방법 및 CEER 면역검정을 포함하는, 본 발명의 방법의 용도를 나타낸다. 특히, 혈액 중 약물 수준을 제거 또는 희석시키지 않으면서 혈액 세포 및 순환 종양 세포가 환자의 전혈의 샘플로부터 단리된 동안. 상이한 수준의 BCR-ABL 키나제 저해가 표적화 치료를 받는 환자에서 관찰되었다. 이 실시예는 또한 CEER 면역검정에 의한 BCR-ABL 의 탐지가 높은 수준의 기능적 민감성을 갖고, CML 진행의 모니터링에 임상적으로 유용함을 보여준다. 본 발명의 방법은 약물의 효능을 스크니링 및 모니터링하는데 사용될 수 있으며, 이는 표적화 요법을 받는 CML 환자에게 큰 유익이다. 마찬가지로, 본 발명의 방법은 임상의가 환자에게 가장 효과적인 치료 옵션을 결정하는 것을 보조할 수 있다.
2010 년 10 월 20 일 제출된 PCT 출원 번호 PCT/US2010/053386 을 포함하는 본 명세서에서 언급된 모든 공개물 및 특허 출원은 각 개별 공개물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 명시된 경우와 같이 본원에 참조로 포함된다. 앞서 기술한 본 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되었으나, 첨부된 청구항의 기술사상 또는 범위에서 벗어나지 않으면서 그에 특정 변화 및 수정이 가해질 수 있음은 본 발명의 교시에 비추어 당업자에게 자명할 것이다.

Claims (27)

  1. 하기를 포함하는, 전혈 샘플 (whole blood sample) 중 적혈구로부터 백혈구를 단리 및 분리하는 장비:
    상실 (upper chamber), 하실 (lower chamber), 및 상기 상실 및 하실 사이의 하나 이상의 적층 필터 막 (stacked filter membranes) 을 포함하는 여과 장치 (filtration device), 여기서 상기 하나 이상의 적층 필터 막은 상기 백혈구를 보유하는 능력이 있음; 및
    상기 전혈 샘플로부터 적혈구를 수집하기 위한 수집 튜브 (collection tube), 여기서 상기 여과 장치는 상기 수집 튜브의 정상부에 배치되고, 상기 적혈구는 원심분리 후에 상기 백혈구로부터 분리되고 상기 수집 튜브 내에 수집됨.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 전혈 샘플이 상기 여과 장치의 상기 상실 내로 로딩되는 장비.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 여과 장치가 2, 3, 또는 4 개의 적층 필터 막을 포함하는 장비.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상실이 그것에 부착된 스냅-캡 뚜껑 (snap-cap lid) 을 추가로 포함하는 장비.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 수집 튜브를 추가로 포함하며, 여기서 상기 적혈구를 함유하는 상기 수집 튜브가 원심분리 후에 상기 제 2 수집 튜브로 교체되는 장비.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 백혈구의 용해물이 용해 완충제의 상기 상실로의 첨가 및 원심분리 후에 상기 제 2 수집 튜브 내에 수집되는 장비.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 하나 이상의 적층 필터 막의 세정 없이 상기 용해 완충제가 상기 상실로 첨가되는 장비.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 수집 튜브를 추가로 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 적층 필터 막이 원심분리 후에 상기 여과 장치로부터 제거되고, 상기 제 2 수집 튜브 내로 배치되는 장비.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 제 2 수집 튜브가 용해 완충제를 함유하는 장비.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전혈 샘플이 혈액성 악성종양 (hematological malignancy) 을 갖는 또는 갖는 것으로 의심되는 대상으로부터 수득되는 장비.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 혈액성 악성종양이 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia: CML) 인 장비.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 대상이 치료제를 이용한 요법을 받고 있거나 받고 있지 않는 장비.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 치료제가 항암 약물인 장비.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 항암 약물이 티로신 키나제 저해제, 화학치료제, 호르몬 치료제, 방사선치료제, 모노클로날 항체, 백신, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 장비.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 티로신 키나제 저해제가 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 닐로티닙 (Tasigna®), 다사티닙 (Sprycel®), 보수티닙 (SKI-606), 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 장비.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전혈 샘플이 상기 백혈구의 단리 전에 상기 치료제와 함께 시험관내 인큐베이션되는 장비.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백혈구가 정상 백혈구, 악성 백혈구, 병든 백혈구, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 장비.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장비가 복수의 여과 장치인 장비.
  19. 하기 단계를 포함하는, 치료제의 실질적 희석 없이 전혈 샘플로부터 백혈구의 용해물 (lysate of leukocytes) 을 제조하는 방법:
    (a) 상기 전혈 샘플을 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 장비 내로 로딩하는 단계;
    (b) 상기 장비를 원심분리하여 상기 백혈구를 상기 하나 이상의 적층 필터 막 상에 포획하고 상기 적혈구를 상기 수집 튜브 내로 분리하는 단계; 및
    (c) 단계 (b) 및 (c) 사이에 세정 단계 없이, 상기 하나 이상의 적층 필터 막 상에 포획된 상기 백혈구를 용해 완충제 (lysis buffer) 로 용해하여 백혈구의 용해물을 제조하는 단계.
  20. 제 19 항에 있어서, 단계 (b) 및 (c) 사이에 상기 수집 튜브를 제 2 수집 튜브로 교체하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 단계 (c) 에서 상기 백혈구를 용해한 후에 상기 제 2 수집 튜브를 함유하는 상기 장비를 원심분리하고 상기 백혈구의 용해물을 상기 제 2 수집 튜브 내에 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전혈 샘플이 치료제를 수령하고 있는 대상으로부터 수득되는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 치료제가 항암 약물인 방법.
  24. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전혈 샘플이 상기 장비 내로 로딩되기 전에 치료제와 함께 시험관내 인큐베이션되는 방법.
  25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 종양원성 융합 단백질 (oncogenic fusion protein) 및/또는 신호 전달 분자 (signal transduction molecule) 의 발현 및/또는 활성화 수준 (expression and/or activation level) 이 상기 백혈구의 용해물 중에서 측정되는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 종양원성 융합 단백질이 BCR-ABL 을 포함하는 방법.
  27. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장비가 복수의 여과 장치인 방법.
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