CN104931324B - 一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒,包括固定液、免疫磁性微球和染色试剂,还包括封闭液,封闭液含有离子去污剂和蛋白保护剂,免疫磁性微球的表面被有抗EpCAM和Her2的联合抗体,染色试剂为含FITC‑CK19或FITC‑ Her2、Cy3‑CD45和DAPI的复合荧光染色试剂。这样循环肿瘤细胞的染色试剂盒具有血液白细胞干扰少,CTC细胞特有富集、捕获,循环肿瘤细胞染色效果好的优点。

Description

一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒
技术领域
[0001 ]本发明涉及细胞染色,具体涉及一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒。
背景技术
[0002]循环肿瘤细胞(CTC)是指进入人体外周血的肿瘤细胞。具有高度活力和高度转移 潜能的循环肿瘤细胞可以在血液循环系统中存活,并在合适的环境中增值,导致肿瘤的复 发和转移。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断,化疗药物的快速评估,个体 化治疗包括临床筛药、耐药性的检测,肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。循环肿瘤 细胞检测包括血液处理、细胞捕获、细胞染色和循环肿瘤细胞定性、定量检测。公开号为 CN102980793,就公开了一种循环肿瘤细胞染色试剂盒,该染色试剂盒包括固定液(多聚甲 醛+牛血清白蛋白)、等渗液(氯化钠溶液或葡萄糖溶液)、伊红染液、美蓝+天青染液,伊红染 液可以与碱性胞浆结合染色,美蓝+天青可以与细胞核结合染色,达到双重染色的效果,但 该染色试剂盒需要对循环肿瘤细胞分离后才能染色,检测过程细胞分离步骤复杂,检测效 率不高。公开号为CN 103472227,则公开了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒,该试剂盒包括免 疫磁性微球、磁分选装置(磁力架)和分析计数装置;试剂盒应用包含循环肿瘤细胞的计数、 定量、及分子和基因水平的分析,但是该试剂盒中免疫磁性微球的抗体富集及捕获CTC细胞 时,同时血液白细胞也有富集及捕获,因此无法排除血液白细胞的干扰,分析出的假阳性率 较高。
发明内容
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种血液白细胞干扰少,CTC细胞特有富集、捕 获,循环肿瘤细胞染色效果好的染色试剂盒。
[0004] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种循环肿瘤细胞的染色试剂 盒,包括固定液、免疫磁性微球和染色试剂,其特征在于还包括封闭液,所述封闭液为含有 质量百分浓度为〇 • 1%〜1%离子去污剂、质量百分浓度为0 • 5%〜3%蛋白保护剂的溶液,所述 免疫磁性微球的表面被有抗EpCAM和人类表皮生长因子受体(Her2)的联合抗体,所述染色 试剂为含有:FITC标记的抗细胞角蛋白19(CK19)或人类表皮生长因子受体2(Her2),Cy3标 记的抗白细胞共同抗原⑶45,DAPI的复合突光染色试剂。
[0005] 还包括抗荧光淬灭剂:含有质量百分浓度为0 • 1%〜1%P-苯二胺的甘油溶液。
[0006] 所述离子去污剂为高碳醇、脂肪酸、高碳脂肪胺、脂肪酰胺、环氧乙烷或聚乙二醇; 所述蛋白保护剂为甘油或多糖。封闭液可以屏蔽非特异性的免疫荧光染色。
[0007] 与现有技术相比,本发明的优点在于一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒,包括固定 液、免疫磁性微球和染色试剂,还包括封闭液,封闭液含有离子去污剂和蛋白保护剂,免疫 磁性微球的表面被有抗EpCAM和Her2的联合抗体,染色试剂为含:FITC-CK19或FITC- Her2, Cy3-CD45,DAPI的复合荧光染色试剂。抗EpCAM和Her2的联合抗体特有富集、捕获CTC细胞, 血液白细胞基本屏蔽捕获,因此排除白细胞干扰,CK19或HER2染色试剂特异识别腺癌含乳 腺癌,结里肠癌,則夕I」腺癌CTC,CD45为白细胞的通用标志物,可充分区别CTC与白细胞,DAP I 能够与DNA强力结合的荧光染料,封闭液可以屏蔽非特异性的免疫荧光染色,这样循环肿瘤 细胞的染色试剂盒具有血液白细胞干扰少,CTC细胞特有富集、捕获,循环肿瘤细胞染色效 果好的优点。
具体实施方式
[0008]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0009] 实施例1
[0010] —种循环肿瘤细胞的染色试剂盒,包括固定液(丙酮)、免疫磁性微球和染色试剂, 还包括封闭液:含有质量百分浓度为0.1%〜1%高碳醇、质量百分浓度为〇 • 5%〜3%甘油的溶 液,抗荧光淬灭剂:含有质量百分浓度为0 • 1%〜1%P-苯二胺的甘油溶液,其中免疫磁性微球 的表面被有抗EpCAM和人类表皮生长因子受体(Her2)的联合抗体,染色试剂为含有:FITC-CK19、Cy3- CD45和DAPI复合荧光染色试剂。
[0011] 实施例2
[0012]与实施例1基本相同,所不同的只是封闭液中高碳醇由脂肪酸或高碳脂肪胺或脂 肪酰胺或环氧乙烷或聚乙二醇替代,甘油由半乳糖、阿拉伯糖和麦芽糖等多糖替代,FITC-CK19荧光染色试剂由HTC- Her2荧光染色试剂替代。
[0013] 实施例3
[0014]利用实施例1的染色试剂盒进行循环肿瘤细胞染色过程:2.5 mL的血液加入到 15ml离心管,然后加入2.2 mL已经恢复到室温的血液前处理试剂(0.1-1%的界面活性试剂 与0.5_3%的蛋白保护剂),GF=800g,Temp=25°C离心10 min;小心的取出离心管,用移液器 吸取上清液(保留红细胞上部约1 mL的上清液),离心管中再加入1 mL血液前处理试剂;充 分混匀离心管;然后加入被有抗-EpCAM和Her2的联合抗体的免疫磁微100 yL,室温孵育30 min,每lOmin混匀一次,孵育结束置于磁性装置上,进行磁分离,磁分离后,加入磷酸盐缓 冲溶液(pH = 7.4,0.1mol/L)洗涤1〜3次,洗涤后,用移液枪取10-20UL(约200个)细 胞滴加至载玻片,用免疫组化笔小心地标记细胞所在的位置后,放入37°C (无风环境)干燥 lhr,滴加已经预冷过的细胞固定液,在-20°C±5°C冰箱中再次孵育lOmin;取出载玻片用移 液器去掉上清液,用磷酸盐缓冲溶液(内含〇. 1-0.5%吐温20)润湿载玻片5 min后,去掉上 清液,滴加〇. 3ml封闭液到载玻片表面,37°C孵育1个小时;将载玻片上清液吸去,用磷酸盐 缓冲溶液清洗3次后,将载玻片平整的放入孵育盒中,小心地滴加复合荧光染色试剂,37°C 环境中孵育lhr;去掉上清液,用磷酸盐缓冲溶液清洗3次后,滴加抗荧光淬灭剂,盖上盖玻 片;将载玻片放在4°C环境中孵育30 min,用倒置荧光显微镜观察,三通道同时观察并用 (XD采集图片,DAPI通道发射波长为447±30 nm,CK19通道发射波长为525±25 nm,CD45通 道发射波长为615±20 mu,三通道同时观察并用CCD采集图片,其中DAPI通道有蓝色荧光 细胞核、CK19通道有绿色荧光细胞,说明血液中含有循环肿瘤细胞(CTC细胞)XD45通道基 本无红色荧光细胞,若有红色荧光细胞,则说明白细胞也有极少数被捕获。同理可以用实施 例2的封闭液替代,复合荧光染色试剂也可以用实施例2的复合荧光染色试剂替代,只是 CK19通道改为HER2。

Claims (5)

1. 一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒,包括固定液、免疫磁性微球和染色试剂,其特征在 于还包括封闭液,所述封闭液为含有质量百分浓度为0.1%〜1 %离子去污剂、质量百分浓 度为0.5 %〜3 %蛋白保护剂的溶液,所述免疫磁性微球的表面被有抗EpCAM和人类表皮生 长因子受体的联合抗体,所述染色试剂为含有:(l)FITC标记的抗细胞角蛋白I9或人类表皮 生长因子受体2,⑵Cy:3标记的抗白细胞共同抗原CD45,⑶DAPI的复合荧光染色试剂,所述 离子去污剂为高碳醇、脂肪酸、高碳脂肪胺、脂肪酰胺、环氧乙烷或聚乙二醇。
2. 如权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒,其特征在于还包括抗荧光淬 灭剂,所述荧光淬灭剂为含有质量百分浓度为〇. 1 %〜1 %P_苯二胺的甘油溶液。
3. 如权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒,其特征在于所述蛋白保护剂 为甘油或多糖。
4. 如权利要求3所述的一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒,其特征在于所述多糖为半乳 糖。
5. 如权利要求3所述的一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒,其特征在于所述多糖为麦芽 糖。
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