JPS6291170A - 食品の冷凍保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「技術分野」 本発明は、食品、特に魚介類や畜肉その他の生鮮食品、
あるいはその他の生鮮調理食品を長期に渡って保存する
ための冷凍保存方法に関する。

「従来技術およびその問題点」 本出願人は、既に特公昭５９−４１３９１号で冷却工程
の中に分子生物理論を導入した画期的な冷凍保存方法を
開発した。

「発明の目的」 本発明は、この発明を基礎にしで、保存中の酵素活性を
抑え、解凍時には細胞の可逆的再生を可能にする全く新
しい冷凍保存法を得ることを目的とする。

「発明の概要」 本発明は、生細胞内の分子構造と、それを取つ春く細胞
内水の氷点を解明した結果完成されたもので、次のよう
な理論を背景としている。

細胞が新しく造られる場合、ＤＮＡの遺伝子情報に従い
、ミトコンドリアで生産されるエネルキＡＴＰ　％用い
で、ＲＮＡを働き手として使いながら、リポゾームにお
いてアミノ酸のペプチド結合か行なわれ、タンパク質が
造られることはよく知られている。このタンパク質の形
成過程においで、結合されたアミノ酸が一つのタンパク
質として完成された時、瞬時にまわりの本分子が付着し
、水分子の一番目の１分子層と、二番目の２．３分子層
の分子被膜か完成されることか最近になって判明してき
た。そして細胞膜内のタンパク質や生体高分子につく第
一層の本分子の結合は強く、　＝８０℃前後ではじめて
凍結し、第二層は一１０°Ｃ以下で凍結することが明ら
かとなった。

他方、このタンパク質のペプチド結合完成時の２つの氷
点が、実際の食品中のタンパク質についでも存在するか
否かは、膨大な量の細胞の塊っである食品中の細胞につ
き、その水分が実際に何度で凍結するのかを測定しなけ
ればならない。本発明者は、この実験を、水か凍るとき
潜熱を出す原理を利用して行なった。すなわち生体細胞
組織を冷やしていっでこの潜熱が何度で放出されるかを
測定したところ、細胞内には、タンパク質のペプチド結
合完成時の２つの氷点と同しく、−８０°Ｃ前後で凍る
水と、　−１０°Ｃ前後で凍る水との二種類の水が存在
することかわかったのである。この氷点は動物の細胞で
も植物の細胞でも同しである。

このように食品細胞中に一１０℃前債で凍る水と、　−
８０℃前後で凍る水とが存在することは次の二点におい
て特に重要であると考えられる。第一点は、従来食品を
冷凍保存する上での最大のポイントは、最大氷結晶生成
帯（−０，５〜−５°Ｃ）を如何に急速に通過させて氷
結晶の成長を抑えるかにあると信しられできたか、ざら
に−１０℃前後の氷点もまた極めて重要で、この氷点も
速やかに通過させなければ、全体として微細な氷結晶は
得られない。本発明では、この−１０℃前後の温度帯を
細胞内液凍結温度帯と名付ける。

第二点は、−８０℃前後で凍る水は、細胞内タンパク質
とか、その他の生体高分子に直接結合しでいる水で、強
くきっちり配列されているために凍りにくいと考えられ
ること、そしてこのように−８０℃前後でも凍らない水
が存在することが、解凍時に細胞の機能を回復する一つ
の大きな要因と考えられることである。

他方、細胞膜を自由に通過しで移動する自由水はナトリ
ウムイオンやカリウムイオンの電解質濃度を変え、生体
反応の阻害要因を生じさせる。この自由水の移動を防止
するため細胞内外の自由水を瞬時に凍結する必要がある
。また、これらの自由水の氷結晶が大きいと、凍結時に
おいてタンパク質を構成するアミノ酸のペプチド結合や
細胞膜等を切断したり傷つけたりするおそれがあるため
、氷結晶の大きざをＩＯｕｍ程度とすることも要求され
る。

これらの諸点と前研究の成果とを組合せて勘案すると、
食品の冷凍保存には、まず最大氷結晶生成帯を速やかに
通過させるとともに、生体細胞が内蔵する熱エネルギを
すみやかに放出せしめ、過冷却の未凍結状態のまま一１
０℃前後（細胞内液凍結温度帯）以下に冷却すること、
次（こ−１０℃前後で凍る細胞の内外の水を一挙に凍結
せしめ、従来の凍結法で起こる自由水の浸透圧による流
出に起因するｐｉ（の変化、生体高分子等に対する破損
の防止を図ること、すなわち細胞を凍結する場合に有害
な温度は、最大氷結晶生成帯ばかりでなく、細胞の動植
物等の種類に関係なく、細胞質が凍る細胞内液凍結温度
帯であるから、この危険な温度帯を速やかに通過させ、
微細な氷結晶を造ること、ざらに−８０℃前後で凍る水
は、未凍結のまま保持して解凍時にあ１する細胞の可逆
的変化を可能とすることが重要な要因であると考えられ
る。

本発明は、このような解析の下に完成されたもので、次
の各工程を含む。

すなわち、１）保存すべき食品の中心温度１０〜３℃に
冷却する予備冷却工程、続いて、２）最大氷結晶生成帯
および細胞内液凍結温度帯を過冷却状態で通過させ、食
品の中心温度を一１０℃以下にする過冷却工程、３）こ
の過冷却状態の食品に温度そ急上昇させる温度ショック
または機械的ショックを与え、食品内の自由水を凍結さ
せるショック凍結工程、および、４）凍結された食品を
−１０°Ｃ〜−７５℃の温度雰囲気で凍結保存する結氷
固定化工程とである。

本発明はざらに、以上の工程で食品を凍結保存するにつ
き、食品を空気または不活性ガスとともにフィルム中に
と封し、食品の外周にこれら空気または不活性ガスによ
る温度伝達鈍化層を設けるとよい、これは次の理由によ
る。

以上の各工程において食品をブライン中に浸漬する際に
は、浸漬の深さにより、食品に加わる加圧力が変化し、
その加圧力の差が熱伝導率を大きく変えてしまうため、
希望゛する冷却速度が得られないことがある。このよう
な場合に、食品をフィルムパックして、食品の外周に空
気または不活性ガスによる温度伝達鈍化層を設けると、
加圧差による温度伝達率の変化は小さくなり、ブライン
中への浸漬深さが異なっても、冷却速度に有害な差は生
しない。不活性ガスとしては、窒素ガス、炭酸ガス等、
食品に悪影響を与えないガスを用いる。

ざらに食品をフィルムパックするのは、次の理由からも
推奨される。すなわち食品が凍結する際には、内部膨圧
が発生するため、食品にひすみ、変形が生しやすい。フ
ィルム中に封入すると、ある程度このひすみ、変形を防
止することができる。またブラインの汚れを防ぎ、かつ
食品外周にグレーズが付着するのを防止するために効果
があるからである。ブラインがａＦ　Ｎ　Ｔ９触するこ
とによつ汚れると、不純物が混ざることとなって設定温
度を維持することが困難になる。また食品外周に温度シ
ョックを与えたとき、食品の外周部が解凍され、ざらに
次の工程で凍結してカプセル状の氷の膜ができるため、
食品の内部から水分が蒸発するのを防止し、空気との接
触による酸化を防止し、ざらにフィルム内部に水滴が付
着するのを防止して鮮度を維持することができる。なお
ショック凍結工程を加圧シャワーで行なうと、それ迄の
工程においでフィルム外面に付着していたグレーズを洗
い流すことができる効果がある。

以下各工程について説明する。

（１）予備冷却工程 この工程は、食品の外周と中心の温度差＠なくすととも
に、中心温度１ＦｒＯ〜３℃程度に下げで、次工程での
過冷却状態（スーパークーリング状態）ヲ作り出しやす
くする工程である。すなわち食品を急冷して過冷却状態
とするためには、食品の温度が凍結する直前の温度で均
衡しでいることが熱エネルギーの交換効率を上げる上で
望ましい。

またこの工程には、ＡＴＰの分解減少を抑制して食品の
鮮度が落ちるのを防止する目的がある。すなわち、ＡＴ
Ｐの分解減少は、細胞のレベルにおける生細胞の酵素系
自体の作用によってグリコーゲンが分解し、その結果乳
酸が主成されてｐＨが下がりＡＴＰａｓｅが作用するた
めに生じるが、食品温度を０〜３℃に低下させると、グ
リコーゲンの分解、つまりＡＴＰの減少を最低限に抑制
することができる。

この予備冷却の具体的な手段については、これを短時間
で行なう場合には、　−１０°Ｃ前後〜−３５℃程度に
温度設定されたブライン液（例えば塩化カルシウム溶液
、アルコール溶液）中に５〜１０分間食品を浸漬するこ
とで達成される。また肉厚の厚いもの等で温度均衡に時
間がかかる食品は、−３℃〜−５℃の冷風（冷蔵庫への
収納）で時間をかけて予備冷却しでもよい。

ブライン液中に浸漬する場合には次のメリットがある。

すなわち食品をブライン液中に浸漬すると、食品には均
等な外圧が加わるため、食品の構成体か圧縮固定化され
る一種のカプセル状態が形成され、その結果はざま水が
難凍状態となって、次工程での過冷却が容易になる。

（２）過冷却工程 以上のようにして予備冷却された食品を急冷し、食品中
の水分を未凍結状態としたまま、中心温度が一１０℃以
下、好ましくは一１５°Ｃ以下になる迄急冷する工程で
ある。−１０℃前後は、前述の細胞内液凍結温度帯であ
り、この温度”Ｆｒおよび最大氷結晶生成体を食品中の
水分を未凍結状態に保持したまま急冷し、過冷却状態を
作り出す、この温度体を過冷却状態で通過させることは
、氷結晶を成長させないために、重要である。

この過冷却は、具体的には、例えば−２０°Ｃ〜−６０
℃程度に温度設定されたブライン液中に食品を１０〜９
０分間浸漬することにより、達成される。

ブライン液中に浸漬することにより、食品は外周より加
圧され、はざま水が固定圧迫される一種のカプセル状態
を形成し、難凍状態（未凍結状態）を造り出すのが容易
になる。

なおこの予備冷却工程および過冷却工程にあいで、食品
をプライン中に浸漬する場合には、前述のようにフィル
ム中に空気または不活性ガスとともに食品を封入して、
食品外周に温度伝達鈍化層を設け、プラインの温度を均
一化して食品に与え、所定の冷却速度を得ることが望ま
しい。

（３）ショック凍結工程 中心温度−１０°Ｃ以下、かつ過冷却状態で未凍結状態
にある食品をブライン液中より取り出し、温度ショック
または振動等の機械的ショックを与えることにより、食
品中の凍結対象水（自由水）を−挙に凍結する工程であ
る。このショック凍結は、前工程まで過冷却状態を保持
していた食品（こ急激な温度変化またはＩｊ！械的ショ
・ンクを与え、これによって−挙に凍結させるものであ
る。具体的には、温度ショックの場合、例えば食品を水
中、好ましくは３〜１８°Ｃの水中に５秒〜２分程度浸
漬するか、加圧シャワーヲ１０秒〜３分程度吹き付ける
とよい０機械的ショックは例えばバイブレータを用いる
ことかできる。

このショック凍結によって凍結された食品中の水分の氷
結晶は、通常の凍結によって起こる食品の外周部の氷結
晶径か３００〜９００Ｌ１ｍであるのに対し、これより
はるかに微細なＩＯｕｍ程度の大きざになる。しかも細
胞膜内外で同時凍結が完了するため、従来の凍結法のよ
うな浸透圧の差による自由水の移動か起こらす、細胞内
のホメオスタシス復元の条件が崩されることなく保存で
きるという特徴がある。

（４）結氷固定化工程 前工程で形成された微細氷結晶の安定化を図るとともに
、室温で行なわれる前工程で解凍状態になった食品の外
周部に再び氷結カプセルを形成する工程である。氷結カ
プセルは、食品がフィルム中にと封されでいると否とを
問わず、食品外周に形成されて該食品と空気とを連断し
、保存中における食品の酸化を防止するとともに、水分
の蒸発を防ぐ。

この工程では、最初に一１５℃以下の冷凍庫で１〜８時
間冷却して、解凍状態になった食品の外周（こ迅速に氷
結カプセルを形成し、その復、　−１０℃〜−７５℃程
度、好ましくは一り５℃〜−７５℃程度の冷凍庫で保管
することか好ましい、氷結カプセルを形成するのは、低
温で単時間で行なうのが好ましく、反面、氷結晶は前工
程で微細化されているため、−１０°Ｃ以下の温度でも
、その氷結晶をそのまま安定させることができるからで
ある。もっとも理想的には、−１５℃以下として、−１
０℃前後の細胞内液凍結温度体から離しでおくのがよい
。また保存温度が一７５℃より低い温度では、−８０℃
前後で凍る水も凍ってしまうため、解凍時に生体細胞の
復元をみることができない。

「発明の実施例」 以下実施例についで本発明を説明する。

「実施例１」 ５ｃｍ　Ｘ２０ｃｍｘ　３ｃｍ、３００９の牛肉ステー
キ５個をそれぞれ１個ずつ、ナイロンポリエチレンのラ
ミネートフィルム（厚ざ４０ｕｍ、幅１０ｃｍＸ長ざ３
０ｃｍ２枚）の三方熱シールした中に入れ、内部に一定
量の空気を残したまま入口を熱シールして密封した。

一方でＩｍＸ　Ｉｍｘ　１ｍのステンレスプライン用容
器を二層用意し、第一層に塩化カルシウムの溶融した濃
度３５％比重１．４の溶液を冷凍機に循環して、−１０
℃の低温ブライン液をつくり、フィルムにと封された牛
肉ステーキを金網の簡の中に入れ、ブライン液の中に１
０分間沈め中心温度か３°Ｃになるようにセットし、そ
の後ブライン液から取出し次の第二層の一４０℃の塩カ
ルブライン液の中に籠と共に４０分間沈めて中心温度は
一２０°Ｃとなるようにセットした。

当該食品を第一層に沈めたところ、比重１．４の加圧に
より、フィルムは圧迫されたが、内部の空気層が、ブラ
イン浸漬深度の差（加圧力の差）による食品への熱伝達
率の極端な変！７］ヲ防止していることが確認された。

中心温度２℃になつ１．：ところで金網寵を取出し次の
第二層のブライン液に沈め、中心温度が一１８°Ｃとな
ったとき取出してその中の１個を取出しで検査したとこ
ろ、細胞内の水分は完全に過冷却の状態にあり、他の肉
量にある水分もほぼ過冷却状態であった。

残りの４個を常温１５°Ｃ下に取出し３０ｃｍｘ　５０
ｃｍＸ４５ｃｍの水槽の水温１３℃の中に１０秒間入れ
たのち取出し、３個を一２０°Ｃの冷凍室の中に入れて
、３時間保管した。残りの１個を検査したところ、細胞
質内水溶液と細胞分水はＩＯｕｍ台の微細結晶がまんべ
んなく均一に出来ていた。冷凍室に保管した牛肉ステー
キの中心温度が一２０°Ｃになったのち、−１８℃の通
常の冷凍庫に移して６ケ月保存した。

別に同量の牛肉ステーキ３個ずつを一３５℃のエアフリ
ージング、エアブラストフリージング、コンタクトフリ
ージングで２４時間処理後ポリエチレンフィルムの袋に
入れ一１８°Ｃの通常の冷凍庫に保管して対照区とした
。

本発明および対照区の冷凍肉ヲ１５℃の常温下で２時間
放置して自然解凍し、解凍時のドリップ、肉色、肉の柔
軟度、凍結切片による細胞の破壊度を顕微鏡下で観察し
、ざらにフライパンで焼いで風味試験に供し表１の試験
結果を得た６本発明方法による冷凍保存肉は冷凍６ケ月
後驚異的な細胞復元をなし食品の品質としてはすぐれた
保存効果を示した。

「実施例２」 ７ｃｍｘ　３ｃｍｘ　２０ｃｍ、２５０９平均のハマチ
片身フィレー５個と、長ざ５ｃｍ位、重さ９００ｇ程度
の小姑を用意し、それぞれハマチ肉１個ずつ小姑３００
９ずつをナイロンポリエチレンのラミネートフィルム（
厚ざ４０ｕｍ、幅１０ｃｍＸ長ざ３０ｃｍ、２枚）を三
方熱シールした袋の中に入れ、内部に一定量の空気を残
したまま入口を熱シールしてと封した。これを業務用冷
蔵庫内を０℃にセットし５時間保管、中心温度が０″Ｃ
になったものを取り出した。

一方１ｍＸ　ＩｍＸ　１ｍのステンレスプライン冷却用
ボックスの中に比重１．４濃度３５％の塩カルブライン
溶液を０．８ｒｎ’入れ冷凍機を運転してブライン温度
−３５℃にセットし、フィルムに封入されたハマチと小
姑を金網の籠の中に入れてブライン液に浸漬し、４０分
後に室温１５°Ｃの常温下に取り出したところ中心温度
は一２８℃であった。このハマチ１個をテストすると同
時に残りのハマチ４個、小姑３袋を水槽（水温１５℃）
に１０秒間入れた後直ちに取り出し、ハマチ１個をテス
トし、残りのハマチ３個、小姑３袋を一２０°Ｃの冷凍
室に３時間保管した。

ハマチ肉は牛肉ステーキと同様、第２工程で過冷却、第
３工程でＩＯｕｍ程度の氷の均一結晶がみられ、タンパ
ク質その他生体高分子は未凍結であることが確認された
。冷凍室に保管したハマチフィレーと小姑が中心温度−
２０℃となったのち通常の冷凍庫−１８°Ｃの中に６ケ
月保存した。

別に同様のハマチ肉片３個と小姑９０ｈ！ステンレスの
皿にのせ一３５°Ｃのエアフリージング、エアプラスト
フリージング、コンタクトフリージングの冷凍機で２４
時間Ｘ！結処理後ポリエチレンフィルムの袋に入れ一１
８℃の通常の冷凍庫に入れ保管対照区とした。

次に本発明および対照区のハマチ肉片と小姑を１５℃の
常温下で２時間放言して自然解凍し、解凍時のドリップ
、肉色、肉の柔軟度、凍結切片による細胞の破壊度を顕
微鏡下で観察し、ざらにハマチ肉は刺身、小姑はしょう
ゆを添加して煮付けで風味試験に供し、表２の試験結果
を得た０本発明のハマチ肉片および小姑とも、＾ＴＰの
減少が少なく、解凍後型くして死後硬直が始まり、生鮮
品と区別がつかない程の高品質を保っていた。

「実施例３」 スキセキ用薄切牛肉２００９ずつ５個、鶏モモ肉２００
９ずつ５個を業務用冷蔵庫に５時間保存し、中心温度０
℃になったものをナイロンポリエチレンのラミネートフ
ィルム（厚ざ４０ｕｍ、幅１０ｃｍＸ長ざ３０ｃｍ２枚
）を三方熱シールした袋の中に入れ、内部に一定量の空
気を残したまま入口を熱シールしてと封した。これを冷
蔵庫で５時間保管したところ、中心温度は０℃になった
。

一方１ｍＸ　ＩｍＸ　１ｍのステンレスプライン冷却用
ボックスの中に比重１．４、濃度３５％の塩カルブライ
ン液０．８ホを入れ、冷凍機に循環させてプライン温度
−３５℃にセットし、真空バックされた牛肉と鶏肉を金
網の籠の中に入れ、２０分間浸漬したところ中心温度−
３５℃になった。これを取り出しで１個をテストすると
同時に残りの４個ヲ１５℃の常温下で１５℃の水の高圧
シャワースプレーで３０秒間噴射し、１個をテストに用
い、残りの３個を一２０°Ｃの冷凍室に３時間保管した
。スキャキ用薄切牛肉と鶏肉も牛肉ステーキと同様第２
工程で過冷却、第３工程で約１０μｍの氷の均一結晶が
見られ、タンパク賃その他の主体高分子は未凍結である
ことが確認された。

冷凍室に保管したスキャキ用薄切牛肉と鶏モモ肉の中心
温度が一２０℃になったのち、通常の冷凍庫で一１８℃
の雰囲気下に６ケ月保存した。

別に同量のスキャキ用薄切牛肉２００９３個、鶏モモ肉
２００９３個をステンレス皿に乗せ、−３５℃のエアフ
リージング、エアブラストフ１ノージング、コンタクト
フリージングのそれぞれの冷凍機で２４時間凍結処理を
行なったのち、ポリエチレンフィルムの袋に入れ、−１
８℃の通常の冷凍庫に入れ保管対照区とした。

次に本発明および対照区のスキャキ用薄切牛肉と鶏モモ
肉を１５°Ｃの常温下で２時間放言して自然解凍し、解
凍時のド１ノツプ、肉色、肉の柔軟度、凍結切片による
細胞の破壊度を顕微鏡下で観察し、フライパンで焼いで
風味試験に供し、表３の結果を得た０本発明のスキャキ
用薄切牛肉は、冷凍工程を通って保存されたものとは思
えない程の復元状態であった。また鶏のモモ肉でも熟成
のための時間を置く必要がある程の新鮮さであった。

「実施例４」 マグロのにぎりずしく４０にｌ）およびのりまきすしく
４０９）各３個ずつをナイロンポリエチレンのラミネー
トフィルム（厚ざ４０ｕｍ、幅１０ｃｍ　Ｘ長ざ２０ｃ
ｍ、２枚）を三方熱シールした袋の中に入れ、内部に一
定量の空気を残したまま入口を熱シールしてと封した。

一方でＩｍＸ　Ｉｍｘ　１ｍのステンレスプライン容器
を用意し、比重１．４、濃度３５％の塩カルブライン溶
液を０．８ｒｎ’入れ、冷凍機を運転してブライン温度
−３５℃にセットし、フィルム中に封入されたすしを金
網の籠の中に入れ、１０分間ブライン液の中に浸漬し、
引続き３０分間急冷却し、中心温度−３０℃になったと
ころで、室温１５℃の常温下に取り出し、１０秒間水槽
の水の中に浸漬、すぐざま−２０℃の冷凍室に３時間保
管した。その後通常の一１８℃冷凍庫の中に６ケ月保存
した。

別に同量のマグロすしとのりまきすしをステンレス皿の
上に乗せ、−３５°Ｃのエアフリージング、エアブラス
トフリージング、コンタクトフリージングの冷凍機で２
４時間凍結処理した復、ポリエチレンの袋に入れ、−１
８℃の通常の冷凍庫に入れ保管対照区とした。

次に本発明および対照区の冷凍ずしを室温１５°Ｃて２
時間放言して自然解凍し、指先で押ざえたときの形状の
くずれ（でんぷんの老化（β化）による脆さに起因）、
米粒間の粘着性、米飯のグルコアミラーセ法による糊化
度（α化度）の維持、食べたときの食感、すしの色調な
どから品質保持性を試験し、表４の結果を得た。この結
果により、本発明方法によって保存されたすしは、６ケ
月後、生鮮品とほとんど見分けができない品質を維持し
ていた。

（以下余白） ＜　…　０口　国 「発明の効果」 以上のように本発明の冷凍保存方法は、食品中の水には
、−１０℃前後で凍る水と、−８０°Ｃ前堵で凍る木と
の二種類があるとの発見に基づき、最大氷結晶生成帯の
みならす、特に−１０°Ｃ前後の細胞内液凍結温度体を
過冷却状態で通過させ、その後これにショックを与えて
自由水を一挙に凍結させるものであるから、食品の細胞
内の氷結晶を極めて微細に保持することができる。そし
て−８０℃前後で凍る水は未凍結のまま保持するから、
凍結保存中におけるタンパク賃のペプチド結合の継手の
切断を防ぎ、解凍時における細胞の可逆的変化が可能と
なり、生体細胞の復元をみることができる。

特許出願人　　ジブコム株式会社 同代理人　　　　三　浦　邦　夫 同　　　松井　茂 手続ネ甫正１（（自発） 昭和６１年　５月３０１

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）保存すべき食品の中心温度を０〜３℃に冷却する
   予備冷却工程；続いて最大氷結晶生成帯および−１０℃
   前後の細胞内液凍結温度帯を過冷却状態で通過させ、食
   品の中心温度を−１０℃以下にする過冷却工程；この過
   冷却状態の食品に温度を急上昇させる温度ショックまた
   は機械的なショックを与え、食品内の自由水を凍結させ
   るショック凍結工程；凍結された食品を−１０℃〜−７
   ５℃の温度雰囲気で保存する結氷固定化工程とを含む食
   品の冷凍保存方法。
2. （２）特許請求の範囲第１項において、食品は、フィル
   ム中に一定の空気または不活性ガスとともに封入されて
   いて、食品外周にこれら空気または不活性ガスによる温
   度伝達鈍化層が介在している食品の冷凍保存方法。