KR100475131B1

KR100475131B1 - 신규한 패실로마이세스 속 미생물 및 그를 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충제

Info

Publication number: KR100475131B1
Application number: KR10-2001-0068127A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 손광희; 서은영; 김기덕; 신동하
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2001-11-02
Filing date: 2001-11-02
Publication date: 2005-03-08
Also published as: US20050008619A1; KR20030035708A; WO2003038066A1; US7435411B2

Abstract

본 발명은 패실로마이세스(Paecilomyces) 속 미생물 및 그를 이용한 토양해충 방제용 미생물 살충제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 토양해충에 대한 살충활성을 갖는 패실로마이세스 속 미생물, 상기 패실로마이세스 속 미생물을 대량 생산하기 위한 배지 및 상기 패실로마이세스 속 미생물을 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충제에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 살충제는 농경작물에 해를 끼치는 토양해충에 탁월한 살충효과를 나타냄으로서 환경친화적 해충방제에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 패실로마이세스 속 미생물 및 그를 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충제{The novel Paecilomyces genus microorganism and microbial insectcide for controlling soil pests containing the same}

본 발명은 패실로마이세스(Paecilomyces) 속 미생물 및 그를 이용한 토양해충 방제용 미생물 살충제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 토양해충에 대한 살충활성을 갖는 패실로마이세스 속 미생물, 상기 패실로마이세스 속 미생물을 대량 생산하기 위한 배지 및 상기 패실로마이세스 속 미생물을 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충제에 관한 것이다.

곤충은 환경에 대한 적응력이 뛰어나며 현재 지구상의 생물 중에서 가장 많은 종을 차지하고 있다(Wilson, O. and F.N. Peter., Biodiversity., 1989, Washington, D.C. Natl. Acad. Press). 이러한 곤충들 중에서 일부는 상업적으로 중요한 다양한 농경 작물에 많은 손실을 일으키고 있으며, 이러한 해충을 방제하기 위해서 예전부터 화학살충제가 많이 사용되어 왔으나, 화학살충제는 광범위한 스펙트럼으로 인해서 이로운 익충 및 해충에 있는 기생충과 같은 비목적 미생물도 박멸하였다. 또한, 화학살충제를 자주 사용하는 경우에 상기 화학살충제에 반복적으로 노출된 목적 해충이 화학살충제에 대한 내성을 가질 수 있으며, 아울러 화학살충제 성분은 인체에 해로운 단점을 가지고 있다.

한편, 골프장은 넓은 면적의 잔디와 각종 목본류 및 초본류로 이루어져 있어 해충발생의 양상이 다를 뿐만 아니라 이러한 특수한 생태계에 적응하는 해충들이 해마다 증가하고 있는 추세이다. 이들 중 풍뎅이류는 장미과(Rossaceae)나 버드나무과(Salicaceae), 참나무과(Fagaceae), 자작나무과(Betulaceae), 단풍나무과(Aceraceae)의 수종 등 42과 186 종류의 식물을 가해하는 광식성 해충인데, 성충은 수목이나 작물의 잎을 가해하고, 유충은 잔디의 뿌리를 가해하여 골프장의 주요 해충으로 인식되고 있다. 그 외에도 성충이 야간에 그린에 잠입 후 탈출하면서 토사를 배출시켜 골프공의 흐름을 방해하는 간접적인 문제도 야기한다(이 등. 1997. 주둥무늬차색풍뎅이의 기주식물과 기주선호도. 한응곤지. 36(2): 156-165; 이동운. 2000. 골프장에서 주둥무늬차색풍뎅이, Adoretus tenuimaculatus)와 기주식물간의 상호관계에 관한 연구; 박사학위논문). 잔디를 비롯한 상업적으로 중요한 다양한 농경 작물에 해를 입히는 풍뎅이류를 비롯한 토양해충은 뿌리를 가해하는 유충이 문제가 되고 있는 실정이다. 골프장 잔디에서 발생하여 서식하고 있는 풍뎅이 유충은 직접적으로 잔디 뿌리를 가해함으로서 잔디를 고사시킬 뿐 만 아니라 간접적으로 이 해충의 유충을 먹이로 하는 조류로 인해 잔디가 파헤쳐짐으로서 잔디의 품질 보존에 나쁜 영향을 미치고 있다.

현재 풍뎅이류의 해충을 방제하기 위한 잔디용으로 품목 고시되어 있는 유기인계 살충제로는 메프유제, 그로메유제 및 에토프입제 등이 있으나, 상기 농약들은 난 부화기(1령기)에 처리해야 하므로 1령기의 방제시기를 놓칠 경우 방제가 잘 되지 않으며, 잔디 토양 내 농약침투를 용이하게 하기 위해서 토양 관주식으로 처리함으로서 농약에 의해 잔디가 약해지고, 농약의 잦은 사용에 의한 농약사용량의 증가 등의 문제점이 있다(대한민국 특허출원 1999-0015472).

토양해충 방제를 위해서 우리나라에선 골프장 잔디 및 인삼밭을 가해하는 풍뎅이 유충 뿐만 아니라, 온실가루이, 배추좀나방, 거세미나방 및 벼멸구 등의 방제에 많은 노력을 하고 있으나, 방제를 위해서는 많은 비용이 들고 화학살충제로 인한 환경 오염의 문제 등으로 인해서 어려운 점을 겪고 있다. 이에, 종래에 사용되고 있는 화학살충제에 의한 토양 및 수질오염, 인체에 대한 독성 및 환경호르몬 피해, 저항성 해충 출현, 유용천적의 감소 등으로 인한 피해를 최소화하기 위한 환경친화적 해충방제의 필요성이 증대되고 있다.

환경친화적 해충방제로서 곤충병원성 미생물(insect pathogenic microorganism)을 사용하는 방법이 있는데, 이러한 곤충병원성 미생물은 곤충에만 특이적인 살충력을 가지고 있으며 사람이나 가축, 식물에는 전혀 해가 없으면서 대상해충을 효과적으로 방제할 수 있는 특성이 있다.

한편, 토양해충 방제용 미생물을 개발하였을 경우 미생물의 대량 배양을 위한 배지의 조성 및 인자의 결정이 중요한데, 화학농약에 비해 저렴한 가격의 생물 농약을 공급하기 위해서는 필수적인 조건으로 손쉽게 구할 수 있는 배지 및 저렴한 가격의 배지를 조성하여야 한다. 그러나, 미생물의 생장속도 및 생장시간을 고려하여 배지를 조성하고 그것을 바탕으로 대량 생산하기 위해선 생물학, 화학적 및 물리학적 인자를 고려해야 하는 어려운 점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상업적으로 중요한 다양한 농경 작물에 해를 입히는 토양해충을 방제하기 위한, 곤충병원성 미생물을 탐색하던 중 패실로마이세스 속(Paecilomyces sp.) 곰팡이가 풍뎅이 유충을 비롯한 토양해충을 치사시킴을 발견하고, 상기 패실로마이세스 속 곰팡이를 대량으로 생산하기 위한 배지 및 패실로마이세스 속 곰팡이를 함유하는 토양해충 방제용 미생물 살충제를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 토양해충에 대해 살충활성을 갖는 패실로마이세스 속 미생물, 상기 패실로마이세스 속 미생물을 대량으로 생산할 수 있는 배지, 상기 패실로마이세스 속 미생물을 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충제 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토양해충에 대해 살충활성을 갖는 패실로마이세스(Paecilomyces) 속 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 패실로마이세스 속 미생물을 대량으로 생산하기 위한 배지를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 패실로마이세스 속 미생물을 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충제 및 그의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 토양해충에 대해 살충활성을 갖는 패실로마이세스(Paecilomyces) 속 미생물을 제공한다.

본 발명에서는 곤충병원성 미생물(insect pathogenic microorganism)에 감염되어 죽은 곤충 또는 토양해충이 서식하는 토양 시료로부터 토양해충에 대한 살충효과를 가지는 미생물을 선별하고, 토양해충에 대한 우수한 살충 효과를 나타내는 미생물을 선별하였고, 상기 미생물을 패실로마이세스 리라시너스로 동정하였다. 본 발명자들은 상기 미생물을 "패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) HY-4"라 명명하고, 이를 1997년 10월 27일부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0395BP).

본 발명의 패실로마이세스 속 미생물의 살충 효과를 충체 침지법에 의해 알아본 결과, 1령에서 3령까지의 유충에서는 50% 이상의 탁월한 살충효과를 나타냈고, 시간이 경과됨에 따라 본 발명의 패실로마이세스 속 미생물에 감염된 유충이 증가하여 토양해충에 대한 높은 살충효과를 나타내었다(도 3 및 도 4 참조)

또한, 본 발명은 패실로마이세스 속 미생물을 대량 생산하기 위한 배지를 제공한다.

본 발명은 패실로마이세스 속 미생물을 경제적으로 대량 생산하기 위하여, 밀기울과 물을 혼합한 기본배지를 제공한다. 상기 배지는 쌀겨, 포도당, 효모추출물, 면실박, KNO₃, 인산염 및 제오라이트(zeolite)로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 추가로 포함할 수 있다.

고체 배양에서 미생물 배양에 가장 많은 영향을 주는 것은 수분함량으로 수분함량이 높을수록 균체의 생산량도 향상되고, 배지의 소모속도도 빠르고, 생산된 생균수도 많아진다. 상기 첨가제 중에서 쌀겨는 통기성 증진 및 고체배지의 물성 개선을 위한 보조제로 사용되며, 포도당은 초기 생육인자로, 효모추출물은 질소원 및 미량성분의 공급원으로, 면실박은 절명한 질소원으로, KNO₃는 무기질소원으로, 인산염은 pH 완충제로, 제오라이트는 금속원소 및 인산염의 서방성 기능을 갖는 흡착성 무기첨가제로 사용된다.

본 발명의 패실로마이세스 속 미생물을 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충제는 상기 균주의 안정적인 제제화를 목적으로 수화제, 입제 또는 캡슐화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 패실로마이세스 속 미생물을 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충 수화제는 패실로마이세스 속 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제 및 증량제/영양제를 첨가하여 혼합하여 제조된다.

상기에서 계면활성제로는 폴리카르복실레이트(polycarboxylate, 한농화성), 소듐 리그노설포네이트(sodium lignosulfonate), 칼슘 리그노설포네이트 소듐 다이알킬 설포석시네이트(sodium dialkyl sulfosuccinate), 소듐 알킬 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트(sodium tripolyphosphate, 한농화성), 소듐 알킬 아릴 설포네이트(sodium alkyl aryl sulfonate), 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르(polyoxyethylene alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르(polyoxyethylene aryl phosphoric ester), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르(polyoxyethylene alkyl aryl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머(polyoxyethylene alkyl aryl polymer), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머 스페셜, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르(polyoxyalkylone alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르(polyoxyethylene nonyl phenyl ether), 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드(sodium sulfonate naphthalene formaldehyde), 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린(dextrin), 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용한다.

또한, 패실로마이세스 속 미생물을 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충 입제는 상기 패실로마이세스 속 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량제/영양제 및 붕해제를 첨가하여 제조된다.

본 발명의 토양해충 방제용 미생물 살충제의 입제는 메타지움 속 미생물 포자 분쇄분 30-83 중량부, 계면활성제 2-30 중량부, 증량제 5-20 중량부, 붕해제 10-40 중량부를 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

상기에서 계면활성제로는 폴리카르복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머 스페셜, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용한다.

또한, 본 발명의 입제에 표면 활성제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 및 흐름제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 것을 추가로 첨가하여 제조될 수 있다.

본 발명의 미생물 살충제 수화제의 제조방법은

1) 패실로마이세스 리라시너스 HY-4를 접종한 고체배지를 건조시킨 후 분쇄하는 단계; 및

2) 단계 1의 분쇄물에 계면활성제와 증량제를 첨가한 후 분쇄하는 단계로 구성된다(도 1 참조).

또한, 본 발명의 미생물 살충제 입제의 제조방법은

1) 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주를 접종한 고체배지를 건조시킨 후 분쇄하는 단계;

2) 단계 1의 분쇄물에 계면활성제, 보조제 및 증량제를 첨가한 후 물로 반죽하는 단계; 및

3) 단계 2의 반죽을 입제화시킨 후 건조시키는 단계로 구성된다(도 2 참조).

상기 패실로마이세스 속 미생물을 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충제를 이용하여 풍뎅이류의 유충에 대한 살충효과를 살펴본 결과, 50% 이상의 높은 살충 효과를 나타내었고, 시간이 지남에 따라 패실로마이세스 속 미생물에 감염되는 확률이 높아졌다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 미생물의 분리 및 동정

본 발명자들은 토양해충에 대해 살충력을 갖는 미생물을 분리하기 위하여, 야외에서 병원미생물에 의해 감염되어 죽은 곤충들을 채집하는 방법과 토양해충 서식 토양 시료로부터 분리하는 방법을 병행하였다. 구체적으로, 감염되어 죽은 토양해충은 멸균수에 희석하여 현탁액 중 0.1 ㎖를 취하여 표 1과 같은 미생물검정배지(DTM 배지; Dermatophyte 검정배지)에 도말하였다. 그리고 토양 시료로부터 미생물 균주를 분리하기 위하여 채취된 토양시료 0.1 g을 5 ㎖ 멸균수에 현탁시킨 후 미생물검정배지에 도말하였다. 이를 30℃에서 5일간 배양시킨 후, 선별 분리하여 새 미생물검정배지에 접종하여 동일조건에서 배양하였다.

성분	양 (%)
포도당(Glucose)	2
소이톤(Soytone)	1
페놀 레드(Phenol Red)	0.02
사이클로헥시미드(Cycloheximide)	0.05
클로헥시미드(Chloheximide)	0.01
겐타마이신(Gentamycine)	0.01
한천(Agar)	1.5
아세톤(Acetone) (w/w)	2

그 결과, 토양해충에 대해 살충력을 갖는 곤충병원성 미생물을 선별하였고, 상기 미생물을 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus)로 동정하였다. 본 발명자들은 상기에서 분리한 곤충병원 미생물을 "패실로마이세스 리라시너스 HY-4"라 명명하였고, 이를 1997년 10월 27일자로 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 0395BP).

<실시예 2> 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주의 보관 및 배양

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주를 보관하고, 상기 균주를 대량으로 배양하기 위한 전배양을 위해서 하기 표 2에 표기한 것과 같은 ME 배지를 사용하였다.

성분	양 (%)
말트 추출물(Malt extract)	2
포도당(Glucose)	2
펩톤(Peptone)	0.1

미생물은 2% 한천(agar)을 함유한 ME 평판 배지를 이용하여 보관하였다. 26℃에서 포자가 형성할 때까지 15일 정도를 배양한 다음, 증류수에 0.05% 트윈(tween)-80을 혼합한 용액 3 ㎖ 정도를 ME 한천 배지에 첨가하고 스크래퍼(scraper)를 이용하여 포자를 수집하였다. 포자수집액을 15% 글리세롤(glycerol) 용액에 넣어 현탁시킨 후 용기에 1 ㎖씩 분주하여 -70℃의 저온고에 보관하였다.

미생물의 배양은 ME 배지를 121℃에서 20분간 고압멸균한 후, 균을 접종하고 26℃에서 4일간 180 rpm으로 진탕 배양하였다.

<실시예 3> 고체 배지의 제조 및 배양 조건 조사

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주를 대량 생산할 수 있는 고체 배지를 제조하고, 배양 조건을 조사하였다. 구체적으로, 고체 배지는 밀기울 330 g, 쌀겨 170 g 및 물 250 g을 혼합한 후, 통기성 증진을 위한 여과막(filter membrane; 7x7 ㎠, 유효면적직경 3.5 ㎝)이 2장 부착된 고압 살균용 비닐 팩(Polypropylene bag, 50x22x10 cm²)에 넣고 봉인(sealing)한 후, 121℃에서 30 분간 고압 멸균하여 제조하였다.

미생물의 배양은 배지가 충분히 식은 후 전배양을 한 액체 배지 0.01-1%를 접종한 후, 27℃, 40 W X 2 X 1.5 광량, 상대습도 40-70%로 조성된 배양실에서 3-4주간 숙성 배양하여 사용하였다.

최소배지에서 배양된 액체 배양물과 평판 배양물을 통해 회수된 포자분말을 비교해 본 결과, 배양속도, 운영중 오염균 발생여부 및 배양 만료 후 포자 숙성도를 기준으로 볼 때 액체배지에서의 종균 생산이 유리하였다. 종균 배지로는 표 3에 기재한 CYA 배지와 표 4에 기재한 PDB 배지를 사용하여 26℃에서 3일간 배양하였으며, 액체배양된 종균액을 건조중량 기준 500 g의 고체배지에 각각 1 ㎖, 5 ㎖ 및 10 ㎖ 씩의 3가지 크기로 접종하였다.

성분		양 (%)
자팩(Czapek-Dox broth)	박토 사카로스(Bacto saccharose)	3
	질산 나트륨(Sodium nitrate, NaNO₃)	0.3
	인산 이칼륨(Dipotassium phosphate, K₂HPO₄)	0.1
	황산 마그네슘(Mangnessium sulfate, MgSO₄)	0.05
	염화 칼륨(Potassium chloride, KCl)	0.05
	황산 제1철(Ferrious sulfate, FeSO₄)	0.001
효모 추출물(Yeast extract)		0.5

성분		양 (%)
PDB(Potato Dextrose Broth)	감자(Potato, Infusion from)	2
	박토 덱스트로스(Bacto Dextrose)	0.2
효모 추출액(Yeast extract)		0.5

상기 실시예 2에서 배양한 패실로마이세스 균주를 CYA 평판배지와 PDA 평판배지에 도말한 후 26℃에서 균체가 형성될 때까지 7-10일 동안 배양하였다. 그 후 각각의 고체 평판배지에서 형성된 콜로니(colony) 중에서 아가 블록(agar block)으로 2-3개를 떼어 표 3의 CAY 및 표 4의 PDB 액체배지가 각각 200 ㎖ 담긴 1 ℓ 삼각플라스크에 넣고 26℃의 진탕배양기에서 180 rpm으로 3일간 종균배양을 하였다.

밀기울:쌀겨:물의 비율을 4:2:1로 혼합하여 준비한 고체배지 각각의 무게를 측량하고 125 ㎖의 삼각 플라스크에 넣은 뒤 액체배지에서 3일간 배양한 균주를 접종한 후 배양온도 26℃, 상대습도(RH) 70%에서 6주간 배양하면서 균주의 성장을 조사하였다. 균주 성장 조사는 생균수(cfu/g)와 헤모사이토메타 측정(Hemacytometer counting; No. of spore/g)을 이용하여 생균수와 분생자(conidia)의 수를 각각 측정하였다. 고체 배지에서 시료를 획득하여 그 무게를 달고, 0.05% 트윈(tween) 80 용액 20 ㎖에 현탁하여 순차적으로 희석하였다. 이를 현미경으로 관찰하여 분생자 수를 계산하였고, 희석액을 평판 배지에 0.1 ㎖씩 도말하고 26℃에서 2-4일간 배양한 후 균총을 조사하였다. 또한, 미생물의 농도는 채취한 일부 시료를 가지고 현미경하에서 헤모사이토메타(hemacytometer)로 분생자를 세어 측정하였다. 측정된 세포 성장에 의해 증가된 분생자의 농도에 대해서 성장 속도(specific growth rate)를 측정하였다. 성장 속도는 성장 후의 분생자 농도에서 초기 분생자 농도를 빼서 로그값(log)값으로 환산 한 것에 성장후의 시간에서 초기 시간을 빼준 것으로 시간당 성장하는 분생자의 증가률을 보았다.

그 결과, CAY 배지에서의 패실로마이세스 리라시너스 HY-4의 성장속도는 접종 후 1주일 사이에서 0.04hr^-1(1 ㎖ 접종시), 0.034hr^-1(5 ㎖ 접종시), 0.033hr^-1(10 ㎖ 접종시)의 시간당 증가하는 성장속도를 보여 종균량에 상관없이 비슷한 속도를 보였는데, 이로 보아 CY 배지를 종균배지로 하는 경우 접종량은 큰 영향이 없음을 확인하였다(표 5).

종균배지	접종량	배양일수에 따른 분생자(conidia) 농도 (개/g-고체배지)
종균배지	접종량	0	1주	2주	3주	6주
CY	1 ㎖	1.4 X 10⁶	1.5 X 10⁹	6.2 X 10⁹	7.2 X 10⁹	3.9 X 10⁹
	5 ㎖	6.9 X 10⁶	2.2 X 10⁹	6.9 X 10⁹	4.7 X 10⁹	2.6 X 10⁹
	10 ㎖	1.4 X 10⁷	3.7 X 10⁹	2.9 X 10⁹	4.2 X 10⁹	3.9 X 10⁹
PDB	1 ㎖	2.2 X 10⁵	1.3 X 10⁹	5.2 X 10⁹	4.9 X 10⁹	7.2 X 10⁹
	5 ㎖	1.1 X 10⁶	2.0 X 10⁹	4.3 X 10⁹	5.7 X 10⁹	4.4 X 10⁹
	10 ㎖	2.2 X 10⁶	1.9 X 10⁹	6.2 X 10⁹	4.6 X 10⁹	3.2 X 10⁹

종균배지가 PD 배지일 때도 비슷한 양상을 보였으며(각각 0.051, 0.044, 0.040hr^-1), 배양 2주 후에는 배지 단위 무게 당 10⁹ 이상의 분생자(conidia)를 유지하였고, 분생자수는 6주 동안 배양하여도 거의 동일하였다.

상기의 결과로부터 패실로마이세스 리라시너스 HY-4는 밀기울 배지에서 2주간의 고체배양을 통해 배지 단위 무게당 10⁹ 이상의 포자를 생산할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 4> 고체배양에서 생균수의 측정

실제 살아서 살충력을 발휘할 생균수가 생물학적 방제제로서의 가치 기준으로 더 적합하므로 시료를 CY 한천 배지에 도말하여, 생균농도를 측정하였다. 생균수 측정은 항생제가 포함되어 있는 항생배지와 일반배지에 증류수로 현탁한 멸균한 0.05%의 트윈 80 용액을 이용하여 10^-3내지 10^-7으로 희석한 후, 100 ㎕를 접종하여 26℃에서 다음날부터 균수를 측정한다. 항생배지는 자팩 한천배지(Czapck-Dox agar, DIFCO 사)에 1.5%/ℓ의 생육억제제인 옥시갈(Oxygall)을 넣고 표 6과 같이 항생제와 생육저해제를 넣어 제조하였다.

성분	양 (㎎/㎖)
앰피실린(Ampicilin)	50
나키딕스 산(Nakidix acid)	10
로즈 벤갈(Rose Bengal)	50

일반배지에서는 일반적인 오염도를 확인하며, 항생제를 포함한 미생물검정배지에서는 실질적인 오염균과 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주와의 수를 측정하였다.

그 결과, 패실로미세스 리라시너스 HY-4 균주같은 경우에는 박테리아를 포함한 오염균보다 느리게 자라며 2-3일 정도 시간이 지난 후에 확인할 수 있었다. 상기의 결과와 마찬가지로 배양 2주일 째에 최대의 세포농도를 보여서 고체배지 단위 g당 10¹²까지의 CFU(colony forming unit)를 보였는데 실시예 3의 결과와 비교해 보면 다량의 균사체가 형성되어 있음을 알 수 있었다(표 7).

종균배지	접종량	배양일수에 따른 분생자 농도 (개/g-고체배지)
종균배지	접종량	0	1주	2주	3주	6주
CY	1 ㎖	2.8 X 10⁶	2.0 X 10¹⁰	8.1 X 10¹²	1.0 X 10¹⁰	3.9 X 10⁵
	5 ㎖	1.4 X 10⁷	1.7 X 10¹⁰	4.8 X 10¹²	8.7 X 10⁹	8.2 X 10⁵
	10 ㎖	2.8 X 10⁷	4.4 X 10¹⁰	7.0 X 10¹²	6.5 X 10⁹	2.7 X 10⁶
PDB	1 ㎖	1.3 X 10⁵	1.1 X 10¹⁰	6.0 X 10¹²	1.3 X 10¹¹	1.8 X 10⁶
	5 ㎖	6.7 X 10⁵	1.4 X 10¹⁰	1.7 X 10¹²	4.3 X 10¹¹	5.5 X 10⁵
	10 ㎖	1.3 X 10⁶	1.4 X 10¹⁰	6.1 X 10¹¹	4.4 X 10¹⁰	9.6 X 10⁵

배양 3주 이후에는 생균수가 감소되어 있으며 6주일 후에는 배양을 시작할 시점만큼 감소되어 있어서 생균수가 최적이 되는 시점은 고체 배양 후 2주일로 확인되었다. 특히 배양 2주 이후의 균체는 대부분이 포자화된 상태로 숙성도가 높아서 곤충병원 미생물로서의 고활성이 기대된다.

생균농도로 조사한 바에 따르면, CYA 종균배지로 접종한 경우 초기 1주일간의 생육속도는 접종량에 따라 각각 0.052hr^-1, 0.043hr^-1, 0.042hr^-1이었고, PD 종균배지로 접종한 경우는 또한 0.067hr^-1, 0.059hr^-1, 0.055hr^-1의 성장 속도를 보였다. 결과적으로 종균배양 배지 및 접종량에 따른 패실로미세스 리라시너스 HY-4의 고체배양 수율은 각 조건에 따른 변화는 무시할 만큼 작았으며, 또한 이를 통해서 패실로미세스 리라시너스 HY-4의 대량배양을 위한 고체 배양의 기본 조건을 확립 할 수 있었다.

<실시예 5> 배양 인자 분석을 통한 패실로마이세스 리라시너스 HY-4의 대량 고체배양 조건 조사

기본배지로 밀기울과 물을 2:1로 혼합하여 사용하였고 다음의 각 배지조건을 배양인자로 활용하여 대량의 고체배양 수율에 유리한 인자를 도출하였다. 쌀겨는 통기성 증진 및 고체배지의 물성 개선을 위한 보조재로 사용하였으며, 포도당은 초기 생육인자로, 효모추출물은 질소원 및 미량성분의 공급원으로, 면실박은 절명한 질소원으로, KNO₃는 무기질소원으로, 인산염은 pH 완충제로, 제오라이트(zeolite)는 금속원소 및 인산염의 서방성 기능을 갖는 흡착성 무기첨가제로 사용하였으며 마지막으로 수분함량을 배양인자로 조사하였다. 통계적 처리는 부분적 계승(factorial) 법의 일종인 플라케트-부르만(Plackett-Burman)에 의해서 t-값(t-value) 및 유의도(%)로 표시하였다. 균체 생산에 대한 각 변수의 효과는 상위값 및 하위값의 변수에 따른 실험 결과치의 차이를 계산하여 결정하였다. 실험오차는 가매개(dummy) 변수에서 계산되며, 실험구간 범위 내에서의 추정되는 변이 정도로 나타냈다. 변수의 효과 분산(Veff)과 표준변차(S.E.)는 다음과 같이 계산하였다. Veff=(Ed)²/n = (S.E.)². 여기서 Ed는 각 가매개(dummy) 효과이며 n은 가매개 변수의 개수이다. 각 변수 효과의 유의 수준(Ex)은 슈트던트 t 검정(Student's t test; t = Ex / S.E.)으로 계산된다. 실험의 기본 설계는 하기 표 8과 같이 하였다.

발효인자	쌀겨	가매개	제오라이트	수분	포도당	가매개	효모추출액	가매개	면실박	KNO₃	K₂HPO₄
상위값	2g		1g	45.8	1%		1%		1%	0.5%	0.1%
하위값	0		0	38.9	0		0		0	0	0
실험구1	+	+	-	+	+	+	-	-	-	+	-
실험구2	+	-	+	+	+	-	-	-	+	-	+
실험구3	-	+	+	+	-	-	-	+	-	+	+
실험구4	+	+	+	-	-	-	+	-	+	+	-
실험구5	+	+	-	-	-	+	-	+	+	-	+
실험구6	+	-	-	-	+	-	+	+	-	+	+
실험구7	-	-	-	+	-	+	+	-	+	+	+
실험구8	-	-	+	-	+	+	-	+	+	+	-
실험구9	-	+	-	+	+	-	+	+	+	-	-
실험구10	+	-	+	+	-	+	+	+	-	-	-
실험구11	-	+	+	-	+	+	+	-	-	-	+
실험구12	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

상기 실험에서 이들 인자가 각각 어느 정도의 통계적 유의성을 갖고 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 생산에 영향을 주는지의 결과를 하기 표 9에 요약하였다.

첨가제(Additives)			반응, t-값 / 유의성(퍼센트)
인자(Factors)	최고	최저	세포 양 (NAcGa)	배지 소모	생균수	배지 pH
쌀겨	2.0g	0	-0.78	-1.29	-0.35	-1.71(-90%)
제오라이트	1.0g	0	4.15(97.5%)	-0.23	-2.89(-97.5%)	5.96(99.5%)
수분	38.9%	5.8%	42.47(99.95%)	1.52	1.12	4.90(99%)
포도당	1.0%	0	-4.70(-99.5%)	-1.58	-0.01	1.38
효모 추출물	1.0%	0	0.51	0.50	-0.50	0.52
면실박	1.0%	0	-5.65(-99%)	-0.78	1.27	0.52
KNO₃	0.5%	0	-14.63(-99.95%)	-1.63	-1.55	3.13(95%)
K₂HPO₄	0.1%	0	-6.76(-99.5%)	-0.29	-0.51	-1.86(-90%)

가장 유의성이 큰 인자는 배지의 수분함량으로 나타났는데, 모든 검사항목에 대해 모두 (+)인자로 밝혀져서 수분함량이 높을수록 균체의 생산량도 향상되고, 배지의 소모속도도 빠르고, 생산된 생균 수도 많아지는 것을 기대할 수 있었으며 이때의 통계적 유의성은 99.95%이다.

대표적인 (-)인자는 인산염으로 이것의 첨가가 균체 생육에는 도리어 불리함을 알 수 있었다. 한편, 쌀겨 및 포도당도 (+)인자로 밝혀졌는데 쌀겨 중의 전분 입자나 포도당은 패실로미세스 리라시너스 HY-4에는 바람직한 배지성분이 아닌 것으로 보인다. 특히 통기성이 개대되는 쌀겨는 배지의 건조를 촉진시켜 배지의 수분함량을 빠르게 저하시키는 것으로 보여 포자 숙성에는 유리하지만 초기의 균체 생산에는 불리한 것으로 판명되었다.

또한, 제오라이트(zeolite)는 균체 생산을 촉진하는 배양인자로 나타났는데, 제오라이트가 인산염을 흡착하여 이를 서서히 방출시키는 기능을 가져서 인산염에 의한 생육 저해효과를 완화시킨 것으로 해석되었다. 따라서 포도당이나 니트레이트(nitrate)처럼 균체가 빠르게 이용할 수 있는 배지성분 보다는 이들 성분을 흡착하여 배지중의 농도를 낮게 유지시키는 흡착제인 제오라이트가 균체 생산에 유리한 배양인자로 판명되었다.

<실시예 6> 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주를 포함한 토양해충 방제용 미생물 살충제의 제조

<6-1> 미생물 살충 수화제의 제조

패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주의 원분의 안정적인 제제화를 목적으로 분상으로서 물에 희석하였을 때 수화되는 수화제(WP)를 제조하였다. 수화제는 고체배지를 가온, 건조한 후 계면활성제 및 증량제를 첨가하여 분쇄하였다. 즉, 원분을 70℃의 건조기 내에서 2시간 가량 건조하여 분쇄하였다. 그 다음에 조분쇄물, 계면활성제, 증량제를 골고루 섞어 혼합하였다. 혼합물을 제트-오-밀(Jet-O-mill; Aljet 사 제품)을 통과시켜 분쇄하고 분쇄분은 수화성을 검사한 후 미생물 살충 수화제를 제조하였다(도 1).

또한, 상기에서 제조한 토양해충 방제용 미생물 살충제의 안정성을 확인하기 위하여, 본 발명의 입제에 대한 보존 시험을 실시하였다. 그 결과 2.10 X 10⁷ CFU/g 으로 38% 정도가 되었다.

<6-2> 미생물 살충 입제의 제조 1 - 13

패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주의 원분의 안정적인 제제화를 목적으로 입상으로 원상태대로 사용할 수 있는 입제(GR)를 제조하였다. 입제는 원분을 70℃의 건조기 내에서 2시간 가량 건조하여 분쇄하였다. 분쇄분은 제트-O-밀(Jet-O-mil)을 통과시켜 분쇄한 다음, 미생물 분쇄분, 계면활성제, 증량제/영양제 및 붕해제를 하기 표 10과 같은 구성으로 혼합하여 혼합분의 전체 분체량의 35% 정도로 가수하고 반죽을 하였다. 반죽이 끝난 후 조립기(Basket type extruder, 후지파우다 사)를 이용하여 입제화(지름 1mm, 길이 1-5mm)하고 70℃의 건조기 내에서 건조하였다. 건조물은 16-30 메쉬(mesh) 체를 통과 시켜 분제를 제거한 후 미생물 살충 입제를 제조하였다(도 2).

입제 제조	조성
입제 제조	분쇄분	계면활성제	증량제 /영양제	붕해제
<6-2-1> 제조 1	HY-4 균주의 포자 50%	소듐트리폴리포스페이트15%폴리카르복실레이트 15%		탈크 20%
<6-2-2> 제조 2	HY-4 균주의 포자 50%	폴리카르복실레이트 3%소듐리그노설포네이트 3%소듐 다이알킬 설포석시네이트 1%	포도당10%	벤토나이트 20%칼슘카보네이트 13%
<6-2-3> 제조 3	HY-4 균주의 포자 50%	소듐 알킬 아릴 설포네이트 5%폴리옥시에틸렌 알킬 페닐에테르 1%소듐 다이알킬 설포석시네이트 1%	전분 10%	탈크 30%다이아라이트 3%
<6-2-4> 제조 4	HY-4 균주의 포자 50%	폴리카르복실레이트 3%폴리옥시에틸렌 알킬 페닐에테르 1%칼슘 리그노설포네이트 3%	전분 10%	벤토나이트20%탈크 13%
<6-2-5> 제조 5	HY-4 균주의 포자 50%	폴리옥시에틸렌 알킬 아릴포스포릭 에스테르 5%폴리옥시에틸렌 알킬 아릴에테르와폴리옥시에틸렌 알킬 아릴폴리머 3%	포도당10%	벤토나이트20%탈크 12%
<6-2-6> 제조 6	HY-4 균주의 포자 50%	폴리옥시에틸렌 알킬 페닐에테르 1%소듐프리폴리포스페이트 3%	전분 10%	벤토나이트20%탈크 16%
<6-2-7> 제조 7	HY-4 균주의 포자 50%	폴리카르복실레이트 3%폴리옥시에틸렌 알킬 아릴에테르와 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머 5%	전분 10%	벤토나이트20%카올린 12%

<6-2-8> 제조 8	HY-4 균주의 포자 50%	폴리카르복실레이트 3%소듐 알킬 아릴 설포네이트 5%소듐 다이알킬 설포석시네이트 1%	전분 10%	다이아라이트 20%칼슘카보네이트 11%
<6-2-9> 제조 9	HY-4 균주의 포자 50%	소듐트리폴리포스페이트 3%폴리옥시에틸렌 알킬 아릴포스포릭 에스테르 5%	전분 10%덱스트린 10%	벤토나이트 10%다이아라이트 12%
<6-2-10> 제조 10	HY-4 균주의 포자 50%	폴리옥시에틸렌 알킬 아릴폴리머 스페셜 5%칼슘 리그노설포네이트 5%폴리카르복실레이트 3%	덱스트린 5%	벤토나이트 20%탈크 12%
<6-2-11> 제조 11	HY-4 균주의 포자 50%	폴리옥시알킬온 알킬 페닐에테르 3%소듐 트리폴리포스페이트 3%소듐 다이알킬 설포석시네이트 1%	덱스트린 5%전분 10%	칼슘카보네이트 28%
<6-2-12> 제조 12	HY-4 균주의 포자 50%	소듐 리그노설포네이트 3%폴리옥시에틸렌 알킬 아릴에테르 폴리머 3%	포도당10%	카올린 20% 탈크 14%
<6-2-13> 제조 13	HY-4 균주의 포자 50%	폴리옥시에틸렌 노닐 페닐에테르 3%소듐 설포네이트 나프탈렌포름알데히드 2%소듐 다이알킬 설포석시네이트 1%	덱스트린 5%	카올린 20%다이아라이트 19%

상기에서 제조한 토양해충 방제용 미생물 살충제의 안정성을 확인하기 위하여, 본 발명의 입제에 대한 보존 시험을 실시하였다. 그 결과 3.40 X 10⁷ CFU/g으로 52% 정도가 되었다.

<6-3> 미생물 살충 캡슐화 제형의 제조

상기 실시예 6과 동일한 효과를 나타내는 토양해충 방제용 캡슐화 제형을 만들기 위하여, 다음의 방법을 사용하였다.

콩가루 11%, 녹두 6%, 쌀가루 4%, 감자전분 4%, 호밀가루 4%, 황토흙 3%을 섞어 121℃에서 20분간 가압멸균을 하고 난 다음 식기 전에 다시 완전히 섞어 찬물에서 냉각시켰다. 교반기에서 (d=5cm, 200 rpm 이상) 10분 이상 완전히 섞어준 후, 교반이 계속되는 상태에서 첨가제와 패실로마이세스 리라시너스(수탁번호 :KCTC 0395BP) 포자를 넣고 완전히 섞어 미생물 살충 캡슐화 제형을 제조하였다.

<실시예 7> 공시 곤충의 확보

골프장이나 공원지 등에서 문제가 되고 있는 해충인 풍뎅이류 중 주둥무늬차색풍뎅이(Adoretus tenuinaculatus)를 공시충으로 사용하였다. 성충은 대전의 유성컨트리클럽에서 채집하였으며 기주작물로는 밤나무를 이용하였고 누대사육을 하면서 2-4세대 내에 실험을 실시하였으며 유충은 인공사료(톱밥: 상토: 수분 = 5:3:2)로 사육하였다. 공시충의 성·유충은 사육상자(30 ㎝ X 30 ㎝ X 50 ㎝)에서 사육하였으며 사육온도는 25±2℃, 상대습도 60-70%로 유지하면서 사육하였다.

<실시예 8> 액체 배양된 포자를 이용한 충체 침지법에 의한 생물검정

패실로미세스 리라시너스 HY-4 균주를 ME 배지에서 3일간, 26℃, 180rpm의 조건에서 진탕배양을 한 다음 포자 농도를 헤모사이토메터(hemacytometer)으로 측정하여 증류수에 혼합한 0.05% 트윈(Tween)-80용액을 이용하여 1X10⁸ 스포어(spore/㎖의 농도가 되도록 하였다.

주둥무늬차색풍뎅이 유충(1령, 2령, 3령) 10마리를 포자현탁액에 10초간 침지한 후 인공사료(톱밥: 상토: 수분 = 5:3:2)에 옮겨 통풍을 고려하여 두꺼운 거즈를 씌워 26∼28℃ 암조건으로 배양, 사육하였으며 15일 동안 습도를 유지하며 병원성을 조사하였다. 충체 외부로 곰팡이의 균사가 생성된 것을 사충으로 다음령으로 성장된 충을 생충으로 간주하였으며 그 수를 셈하여 백분율로 나타내었다. 모든 실험은 5반복으로 수행하였으며 대조구로는 증류수에 0.05% 트윈-80의 혼합액을 사용하였다.

그 결과, 1령에서 3령까지 대조구에서는 13∼26%의 살충효과가 있는 반면에 메패실로미세스 리라시너스 HY-4는 52∼56%의 살충효과를 보였다(도 3). 또한, 시간이 흐름에 따라서 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주에 감염된 주둥무늬차색풍뎅이 유충을 확인할 수 있었다(도 4).

<실시예 9> 고체 배양된 포자를 이용한 접촉독성에 의한 생물검정

패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주를 ME 배지에서 3일간, 26℃, 180rpm의 조건에서 진탕배양을 한 다음 통기성 증진을 위한 여과막(filter membrane; 7x7 cm², 유효면적직경 3.5cm)이 2장 부착된 폴리프로필렌 백(polypropylen bag; 50x22x10Cm²)에 고체배지(밀기울 : 쌀겨 : 물 = 4:2:3) 750g을 넣고 밀봉한 후 121℃에서 30분간 고압살균을 하였다. 준비된 고체배지에 액제 배양액을 9-10mL 접종하여 27℃, 40W X 2 X 1.5의 광량, 상대습도 40-70%로 조성된 배양실에서 3-4주간 숙성 배양하여 사용하였다. 고체배양물의 포자 농도는 헤모사이토메터(hemacytometer)으로 측정하였다. 고체배양물을 분쇄한 후 가습된 인공사료(톱밥 : 상토 : 수분 = 5: 3: 2)에 최종농도 1X 10⁸ 스포어(spore)/㎖ 이 되도록 살포하였다. 통풍을 고려하여 두껍게 거즈를 씌워 26-28℃ 암조건으로 배양, 사육하였으며 15일 동안 습도를 유지하면서 병원성을 조사하였다. 충체 외부로 곰팡이이의 균사가 생성된 것을 사충으로 다음 령으로 성장된 충을 생충으로 간주하여 그 수를 백분율로 나타내었다. 모든 실험은 5반복을 하였으며 대조구로는 증류수에 0.05% 트윈-80의 혼합액을 사용하였다(도 5).

그 결과, 1령에서 3령까지 대조구에서는 20∼27%의 살충효과가 있는 반면에 패실로마이세스 리라시너스 HY-4는 53∼60%의 살충효과를 보였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 토양해충에 대해 살충활성을 갖는 패실로마이세스 속 미생물을 포함하는 미생물 살충제는 농경작물에 해를 끼치는 토양해충의 일종인 풍뎅이 유충을 포함한 토양해충에 탁월한 살충효과를 나타냄으로 환경친화적 해충방제 수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) HY-4 균주를 포함하는 토양해충방제용 미생물 살충제의 수화제 제조 공정도를 나타낸 것이고,

도 2는 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주를 포함한 토양해충방제용 미생물 살충제의 입제 제조 공정도를 나타낸 것이고,

도 3은 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주를 액체배양한 후 침지법에 의한 살충효과 실험을 나타낸 그래프이고,

도 4는 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주에 감염 치사된 주둥무늬차색풍뎅이 유충을 나타낸 사진도이고,

도 5는 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 균주를 고체배양한 후 접촉독성법에 의한 살충효과 실험을 나타낸 그래프이다.

Claims

삭제
토양해충에 대해 살충 활성을 갖는 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) HY-4 미생물(수탁번호: KCTC 0395BP).
삭제
삭제
제 2항의 패실로마이세스 리라시너스 HY-4 미생물을 포함하는 토양해충 방제용 미생물 살충제.
제 5항에 있어서, 미생물 살충제는 수화제, 입제 또는 캡슐화 제제인 것을 특징으로 하는 미생물 살충제.
제 6항에 있어서, 상기 수화제는 제 2항의 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면 활성제 및 증량제/영양제를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 살충제.
제 6항에 있어서, 상기 입제는 제 2항의 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면 활성제, 증량제/영양제 및 붕해제를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 미생물 살충제.
제 8항에 있어서, 상기 입제는 미생물 포자 분쇄분 30-83 중량부, 계면활성제 2-30 중량부, 증량제 5-20 중량부, 붕해제 10-40 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 살충제.
제 8항에 있어서, 상기 입제는 표면 활성제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 및 흐름제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 미생물 살충제.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 계면 활성제는 폴리카르복실레이트(polycarboxylate, 한농화성), 소듐 리그노설포네이트(sodium lignosulfonate), 칼슘 리그노설포네이트 소듐 다이알킬 설포석시네이트(sodium dialkyl sulfosuccinate), 소듐 알킬 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트(sodium tripolyphosphate, 한농화성), 소듐 알킬 아릴 설포네이트(sodium alkyl aryl sulfonate), 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르(polyoxyethylene alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르(polyoxyethylene aryl phosphoric ester), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르(polyoxyethylene alkyl aryl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머(polyoxyethylene alkyl aryl polymer), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머 스페셜, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르(polyoxyalkylone alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르(polyoxyethylene nonyl phenyl ether), 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드(sodium sulfonate naphthalene formaldehyde), 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 살충제.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 증량제 및 영양제는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 살충제.
제 8항에 있어서, 붕해제는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 살충제.