KR102661539B1 - Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물 - Google Patents

Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 Btk IMBL-B9(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IMBL-B9)를 대상으로 캡슐화된 분무건조 제제를 제조하였을 때, 캡슐화되지 않은 분무건조 제제에 비해 포자-결정 복합체 안정성을 향상시켜, 포자 생존율을 높이고 저장 안정성을 증진시킨다. 또한, 캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무 건조 제제의 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 및 배추좀나방(Plutella xylostella)에 대하여 매우 우수한 살충활성을 검증하였으며, 상기 해충 등을 예방하거나 방제하는데 더욱 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물{Composition for controlling pest comprising microencapsulation-based spray drying formulation of Btk IMBL-B9 as effective component}
본 발명은 Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물에 관한 것이다.
효과적인 해충 방제 전략은 작물 손실 감소에 따른 수확량 증가, 식품 품질 개선과 같이 농업의 발전 및 식량 생산량을 늘려 식량 안보에 기여하는 등 단순한 작물보호를 넘어서 매우 중요하다. 해충 방제를 위한 화학 약제의 사용은 농업 생태계 교란, 환경오염, 인축 독성 등의 문제를 일으키고 있어 생물학적 제제를 활용한 환경 친화적인 해충 방제를 통해 유해한 화학 물질과 살충제 사용을 줄이고자 생물학적 해충 방제제 연구 개발이 활발히 진행되고 있으며, 미생물 기반 살충제를 비롯한 새로운 생물학적 방제제 제품이 시장에 등장하였다. 이러한 미생물 생물농약 중 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis, 이하 Bt로 약칭)는 포자를 형성하는 그람 양성 세균으로 곤충에 독성을 보이는 내독소 단백질인 cry, cyt 및 vip 유전자에 의해 각각 암호화되는 Cry, Cyt 및 Vip를 포함 살충활성 결정 단백질을 생산하고, 이 내독소 단백질은 표적 해충의 중장에서 용해 및 분해과정을 거쳐 활성화되어 해충의 중장 막을 파괴하는 활성 독소로 작용하여 궁극적으로 해충 사망을 유발한다. 이 내독소 단백질은 표적 해충 외에 독성이 없기 때문에 오래 전부터 다양한 연구개발이 이루어져 왔으며 현재 세계 많은 국가들이 농업 및 위생해충 방제를 위한 미생물 농약으로 개발하여 판매하고 있다.
Bt 기반 생물 살충제는 1920년대 후반부터 프랑스를 시작으로 농가에서 나비목 해충을 방제하기 위하여 사용하였으며, 차후 1938년 프랑스에서 Sporeine으로 상업용 제품으로 생산되었고, 1958년 미국에서 Bt 살충제 제품이 등록되어 1960년 이후 미국에서 미생물 살충제가 시판되기 시작하였다. 당시 나비목, 파리목 및 딱정벌레목 해충 방제를 위해 다양한 Bt 살충제가 개발되었으며 전 세계적으로 매년 Bt 살충제 판매는 계속적으로 증가하고 있다.
하지만, Bt 기반 생물 살충제는 좁은 기주 스펙트럼으로 특정 해충만 방제하고, 지속적으로 동일한 제품을 장기간 사용하면 저항성 해충이 발생해 약효가 떨어지며, 유통기한이 짧은 단점을 가지고 있다. 연구자들은 이를 해결하기 위해 전 세계 다양한 곳에서 Bt 미생물 균주를 분리·확보하고, 광범위한 기주 스펙트럼과 높은 살충 활성을 가지는 새로운 Bt 균주를 선발하기 위해 노력하고 있지만 우수한 신규 Bt 균주를 발견하기는 것은 매우 어렵다.
2021년, 국내에서 다양한 Bt 균주를 분리·확보하고, 다식성 해충인 밤나방과(Noctuidae)에 속하는 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 및 파밤나방(Spodoptera exigua)과 좀나방과(Plutellidae)에 속하는 배추좀나방(Plutella xylostella)에 대하여 우수한 살충활성을 나타내는 생물학적 방제제 개발 가능성이 높은 Bt subsp. kurstaki IMBL-B9(Btk IMBL-B9) 균주를 선발하였다(Park et al., 2022, Pest Manag. Sci. 78, 2976-2984).
선발된 Btk IMBL-B9 균주는 총 8개 살충활성 결정 단백질 유전자 cry1Aa, cry1Ac, cry1Be, cry1Ha, cry2Aa, cry2Ab, cry2Ah, cry1Ea를 포함하여 하나의 식물성 살충 단백질 유전자 vip3Aa를 보유하고 있다. 새로운 Btk IMBL-B9 균주는 밤나방과 및 좀나방과를 포함 넓은 기주 나비목 해충에 대해 매우 우수한 살충 활성을 나타냈으며, 기존에 Bt 제품으로 개발되어 판매되고 있는 제품의 유효 미생물인 Bt subsp. aizawai NT0423(Bta NT0423) 및 Bt subsp. kurstaki HD-1(Btk HD-1) 균주와 살충활성을 비교한 연구 결과, Btk IMBL-B9 균주가 Bta NT0423 균주보다 LC50 값(105 CFU/mL)이 열대거세미나방, 파밤나방 및 배추좀나방에 대해 각각 4.9배, 5.6배 및 34.7배 낮았고, Btk HD-1 균주보다 각각 19.3배, 21.8배 및 1.4배 낮았다. 상기 결과를 토대로 Btk IMBL-B9 균주는 광범위한 나비목 해충을 방제할 수 있는 Bt 살충제 개발 가능성이 높음을 시사한다.
Bt 살충제는 살충활성 결정 단백질인 내독소 단백질이 표적 해충의 중장 막 파괴를 통해 해충을 방제하는 기작을 가지고 있어 농업현장 적용 시에 살충활성 결정 단백질의 안정성 및 지속성이 매우 중요하다. 따라서 Bt 살충제 개발을 위해서는 환경 영향을 극복할 수 있는 살충활성 결정 단백질 안정화를 위한 제제 개발이 필수적으로 요구된다.
본 발명은 밤나방과 및 좀나방과를 포함 넓은 기주 나비목 해충에 대해 매우 우수한 살충 활성을 나타낸 Btk IMBL-B9 균주의 살충활성 결정 단백질 안정화를 위하여 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제공정 개발을 시도하였다. 본 발명의 목적은 1) 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린의 혼합물을 사용하여 Bkt IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 개발하고, 2) 상기 제제의 포자 생존율 및 저장 안정성을 조사하고, 3) 시험관내에서 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충에 대한 제제의 살충 활성을 조사하고, 4) 온실 조건 하에서 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 및 배추좀나방(Plutella xylostella) 해충에 대한 제제방제 효능을 평가하기 위한 것이다.
해충 방제 관련 선행기술로는 한국등록특허 제2389895호에 '사카린, 사카린염 또는 사카린산을 포함하는 해충 방제용 조성물'이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제2207732호에 '메타리지움 아니소플리애 FT319 균주 또는 이를 함유하는 배추좀나방 유충 방제용 미생물제제'가 개시되어 있다. 하지만, 본 발명의 'Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물을 제공하고, 상세하게는 Btk IMBL-B9(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IMBL-B9)를 대상으로 캡슐화된 분무건조 제제를 제조하였을 때, 캡슐화되지 않은 분무건조 제제에 비해 포자 생존율이 높게 유지되고 저장 안정성이 우수하며, 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 및 배추좀나방(Plutella xylostella)에 대해 살충 활성이 우수한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)에 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린으로 이루어진 코팅 혼합물을 첨가하고 교반한 후 분무건조하여 제조한 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 해충 방제용 조성물의 유효량을 식물, 식물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 해충 방제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 바실러스 투린지엔시스 균주를 발효하여 발효액을 얻은 후, 발효액으로부터 포자-결정 복합체(spore-crystal complex)를 수집하여 농축하는 단계; (2) 상기 농축된 포자-결정 복합체에 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린이 0.5~10.0:0.5~10.0:0.5~10.0의 중량비로 혼합된 코팅 혼합물을 첨가하고 교반하는 단계; 및 (3) 상기 교반 후, 분무건조 장비를 이용하여 입구 온도 130~150℃, 출구 온도 80~90℃에서 분무건조하는 단계를 포함하는 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 Btk IMBL-B9(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IMBL-B9)를 대상으로 캡슐화된 분무건조 제제를 제조하였을 때, 캡슐화되지 않은 분무건조 제제에 비해 포자 생존율이 높게 유지되고 저장 안정성이 우수하며, 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 및 배추좀나방(Plutella xylostella)에 대해 살충 활성이 우수한 특징이 있다.
도 1은 전계방출주사전자현미경(FE-SEM; Field Emission Scanning Electron Microscope)을 이용하여 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제 입자를 촬영한 사진이다.
도 2는 마이크로캡슐화 기반 분무건조를 통한 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 포자 생존율을 확인한 결과이다. a, b는 비캡슐화된(Non-encapsulated) Btk IMBL-B9 분무건조 제제 및 캡슐화된(Encapsulated) Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 포자 생존율이 통계적으로 유의한 차이가 있다는 것으로 p<0.05임을 의미한다.
도 3은 마이크로캡슐화 기반 분무건조를 통한 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 포자 생존율을 확인한 결과이다. XenTari®는 상업용 Bt 살충제 제품을 처리한 양성대조군이다.
도 4는 마이크로캡슐화 기반 분무건조를 통한 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 살충활성 결정 단백질에 대한 SDS-PAGE 겔 사진을 나타낸 것이다. M은 단백질 사이즈 마커이고, 레인 0~6은 54±2℃에서 저장 주수(storage weeks)를 의미한다.
도 5는 54±2℃에서 6주 동안 저장된 Btk IMBL-B9의 캡슐화 및 비캡슐화 분무건조 제제를 1/100,000 및 1/200,000로 희석한 희석액에서 배추좀나방(P. xylostella) 3령 유충에 대한 살충 활성을 확인한 결과이다. Control은 증류수를 처리한 대조군이고, XenTari®는 상업용 Bt 살충제 제품을 처리한 양성대조군이다. a 내지 e는 비캡슐화된 Btk IMBL-B9 및 캡슐화된 Btk IMBL-B9의 살충 활성이 통계적으로 유의한 차이가 있다는 것으로 p<0.005임을 의미한다.
도 6은 본 발명의 Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 처리한 후 7일째에 배추좀나방(P. xylostella) 및 열대거세미나방(S. frugiperda)의 3령 유충에 감염된 배추 식물의 상태를 확인한 결과이다. Control은 증류수를 처리한 대조군이고, XenTari®는 상업용 Bt 살충제 제품을 처리한 양성대조군이다.
도 7은 본 발명의 Btk IMBL-B9의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 처리한 후 7일째에 열대거세미나방(S. frugiperda)의 3령 유충으로 감염된 오이 식물의 상태를 확인한 결과이다. Control은 증류수를 처리한 대조군이고, XenTari®는 상업용 Bt 살충제 제품을 처리한 양성대조군이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)에 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린으로 이루어진 코팅 혼합물을 첨가하고 교반한 후 분무건조하여 제조한 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 제공한다.
상기 바실러스 투린지엔시스는 Btk IMBL-B9(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IMBL-B9)인 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다.
상기 바실러스 투린지엔시스는 바실러스 투린지엔시스 균주를 발효하여 발효액을 얻은 후, 발효액으로부터 포자-결정 복합체(spore-crystal complex)를 수집하여 농축한 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다.
상기 코팅 혼합물은 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린이 0.5~10.0:0.5~10.0:0.5~10.0의 중량비로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1:1:1의 중량비로 혼합될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 분무건조는 분무건조 장비를 이용하여 입구 온도 130~150℃, 출구 온도 80~90℃에서 건조를 수행할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 조성물을 제공한다.
상기 해충은 나비목(Lepidoptera) 해충일 수 있으며, 바람직하게는 밤나방과(Noctuidae), 좀나방과(Plutellidae), 풀명나방과(Crambidae), 명나방과(Pyraloidea), 뿔나방과(Gelechiidae), 태극나방과(Erebidae), 굴벌레나방과(Cossoidae), 유리나방과(Sesildae) 박쥐나방과(Hepialidae), 팔랑나비과(Hesperiidae) 및 흰나비과(Pieridae)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 더 바람직하게는 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella), 도둑나방(Noctua albidilinea), 멸강나방(Mythimna separata), 담배나방(Heliothis assulta), 복숭아명나방(Conogethes punctiferalis), 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis), 목화바둑명나방(Palpita indica), 이화명나방(Chilo suppressalis), 퉁퉁마디뿔나방(Scrobipalpa salinella), 미국흰불나방(Hyphantria cunea), 복숭아유리나방(Synanthedon bicingulata), 박쥐나방(Endoclyta excrescens), 줄점팔랑나비(Parnara guttatus) 및 배추흰나비(Pieris rapae)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda), 파밤나방(Spodoptera exigua) 또는 배추좀나방(Plutella xylostella)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 해충 방제용 조성물은 사용 목적 또는 사용 용도에 따라 고상제, 입제, 산제, 액제, 에어로졸제, 스프레이제, 엑스제, 페이스트제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 캡슐제, 액상수화제, 과립수화제, 수화제, 분제, 미립제, 오일제, 젤형제제, 훈연제, 훈증제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 방제 조성물은 다른 살곤충제, 살선충제, 살진드기제, 살세균제, 살진균제, 제초제, 식물 성장 조절제, 시너지스트, 비료, 토양 컨디셔너 등과 함께, 혹은 그것들과 별도로 하되 동시에 사용될 수 있다.
본 발명의 해충 방제용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 단독으로 사용할 수 있으나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니며, 상기 조성물의 제형 및/또는 사용 목적에 따라 적절한 희석제 또는 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 부형제는 제형에 따라 통상의 물질을 사용할 수 있으며, 제제화할 경우 충진제, 증량제, 유화제, 분산제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제 등을 사용할 수 있다. 대표적으로 사용되는 희석제 또는 부형제로는 물, 포타슘 올레이트(Potassium oleate), 포타슘 바이카보네이트(Potassium bicarbonate), 페네틸 벤조에이트(Phenethyl benzoate), 페네틸 프로피오네이트(Phenethyl propionate), 덱스트린, 락토스, 프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리비닐피로리돈(Polyvinylpyrrolidone), 리그노술폰산나트륨(Sodium lignosulfonate), Tween 80, 올레익 엑시드(Oleic acid), 소르빅 엑시드(Sorbic acid) 리퀴드 파라핀, 생리식염수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 해충 방제용 조성물의 유효량을 식물, 식물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 해충 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 해충 방제 방법에 있어서, 상기 조성물은 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 조성물이다. 상기 바실러스 투린지엔시스 균주는 전술한 바와 같다.
또한, 상기 처리는 해충을 방제하기 위해 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제의 유효량을 포함하는 조성물을 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 식물에 직접 살포하거나, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제의 유효량을 포함하는 조성물을 식물이나 식물의 종자에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 조성물을 식물 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 조성물에 담가둘 수 있다. 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 '유효량'은 재배 식물 상에서 해충을 방제하는 데 충분하거나, 처리된 식물에 실질적인 손상을 초래하지 않는 조성물의 양을 의미한다. 이러한 양은 넓은 범위 내에서 달라질 수 있고, 다양한 인자, 처리된 재배 식물의 구체적 종류 및 상태, 서식 장소, 또는 기후 조건 등에 따라 좌우된다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 해충 방제용 조성물과 해충은 전술한 바와 같다.
상기 식물은 나비목(Lepidoptera) 해충이 서식할 수 있는 식물종(species)을 의미한다. 상기 나비목 해충은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은
(1) 바실러스 투린지엔시스 균주를 발효하여 발효액을 얻은 후, 발효액으로부터 포자-결정 복합체(spore-crystal complex)를 수집하여 농축하는 단계;
(2) 상기 농축된 포자-결정 복합체에 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린이 0.5~10.0:0.5~10.0:0.5~10.0의 중량비로 혼합된 코팅 혼합물을 첨가하고 교반하는 단계; 및
(3) 상기 교반 후, 분무건조 장비를 이용하여 입구 온도 130~150℃, 출구 온도 80~90℃에서 분무건조하는 단계를 포함하는 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제의 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 (1)의 바실러스 투린지엔시스 균주는 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[재료 및 방법]
1. Btk IMBL-B9의 발효
Btk IMBL-B9(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IMBL-B9)의 단일 콜로니를 멸균된 TSB(Tryptic Soy Broth, Becton Dickinson and Company, ML, USA) 배지 50㎖가 들어 있는 250㎖의 삼각 플라스크에 접종한 다음 30℃, 220rpm에서 24시간 진탕 배양하여 종균 배양물을 확보하였다. 50ℓ 발효기에 멸균한 12ℓ 배지 B(포도당 15g, 대두박 10g, 효모 추출물 2g, 펩톤 2g, MgSO4·7H2O 0.3g, ZnSO4·7H2O 0.02g, FeSO4·7H2O 0.02g, 증류수 1ℓ)는 1%(v/v) 종균 배양물을 접종하였고, 30℃, 500rpm, 통기량 1vvm, Antifoam 204(Sigma-Aldrich, SEOUL, Korea) 0.7% 농도의 조건으로 포자 및 살충활성 결정 단백질 형성을 위해 96시간 동안 배치 모드(batch mode)로 발효를 진행하였다.
2. Btk IMBL-B9 포자-결정 복합체의 제조
상기 획득한 발효액을 관형 분리기 원심분리기(A/T1250, Hanin Sci-Med Co., Ltd, 대한민국 대전)를 사용하여 14,000rpm에서 원심분리한 후, 10배 농축한 포자-결정 복합체(spore-crystal complex)를 확보하였다. 1ℓ 포자-결정 복합체(1010 CFU/g)에 15%의 코팅 물질 혼합물(아라비아검:말토덱스트린:전분=1:1:1)을 첨가하고, 교반기(MS5050D; Misung S&I, Daejeon, Republic of Korea)를 사용하여 300rpm, 20분간 교반하였다.
3. 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제(Microencapsulation-based spray drying formulation)
마이크로캡슐화를 위한 코팅 물질이 포함된 포자-결정 복합체 현탁액의 혼합물과 비캡슐화를 위한 코팅 물질이 없는 포자-결정 복합체 현탁액은 실험실 분무건조 장비(KLSD-1500, Koreamedi Co., Ltd, 대한민국 대구)를 사용하여 입구 온도 140℃, 출구 온도 80~90℃에서 7㎖/min의 유속으로 각각 분무건조 하였다. 마이크로캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 비캡슐화 분무건조 제제를 사이클론에서 수집하고 밀폐 용기로 옮긴 다음 추가 분석을 위해 보관하였다.
4. 전계방출주사전자현미경(FE-SEM)
FE-SEM(FESEM HITACHI S-4800)을 이용하여 마이크로캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 비캡슐화 분무건조 제제 분말 샘플을 끈끈한 탄소 종이를 사용하여 스터브에 고정하고 백금으로 코팅하고, 분말의 외관을 현미경으로 관찰하였다.
5. 분무건조 후 포자 생존율
포자 생존율은 분무건조 전의 생존 가능한 포자 수에 대한 분무건조 후의 생존 가능한 포자 수의 비율로 결정하였다. 포자 생존율은 다음 식을 사용하여 표시하였다.
(식 중, N은 분무건조 공정 후 CFU/g의 로그를 나타내고, N0는 분무건조 공정 전 CFU/g의 로그를 나타낸다).
6. 저장 안정성
마이크로캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 비캡슐화 분무건조 제제 각각 샘플과 양성대조군으로 상업용 Bt 살충제 제품인 XenTari®를 54±2℃에서 6주 동안 저장하였고, 0주, 2주, 4주 및 6주 동안 저장한 샘플을 이용하였다. 포자 생존율은 각각 다른 시간 동안 저장된 마이크로캡슐화 및 비캡슐화된 분무건조 제제와 XenTari® 샘플 1g을 9㎖의 인산염 완충 식염수(PBS) 용액에 넣어 3분간 볼텍싱하여 교반하여 희석하였다. 그 후, 용액을 사용하여 연속 희석액을 만든 다음 멸균된 1/2 NA(Nutrient agar; Becton, Dickinson and Company) 배지에 도말하고 24시간 정치 배양한 후 단일 콜로니를 계수하고, 상기의 포자 생존율 식을 이용하여 상기 제제들의 저장 안정성을 평가하였다.
7. SDS-PAGE 분석
마이크로캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 살충활성 결정 단백질 함량을 상업용 Bt 살충제 제품인 XenTari®(Bt aizawai ABTS-1857를 유효미생물로 개발한 생물 살충제)제품과 비교하기 위해, 각각 10 ㎎을 취하여 10㎖의 1X PBS 용액에 넣어, 1분간 볼텍싱하여 희석하였다. 각 희석액을 Laemmli 샘플 완충액과 혼합하고 5분간 끓이고, 12-15% SDS-PAGE 겔에 로딩하여 전기영동한 후, 살충활성 결정 단백질을 분석하였다.
8. 곤충 나방사육
배추좀나방(P. xylostella)은 전라남도 농업기술원 친환경농업연구소(대한민국 나주시)를 통해 입수하였으며, 유충의 먹이 및 성충의 번식을 위한 기주식물로 유채(Brassica napus)를 이용하였다. 열대거세미나방(S. frugiperda)은 전북대학교를 통해 입수하였으며, 기존에 보고된 참고문헌(Park et al., 2022, Pest Manag. Sci. 78, 2976-2984)에 기재된 바와 같이 두 나방은 인공 식이로 번식이 가능하다. 본 발명에 사용된 모든 유충은 25℃, 상대습도 70%, 16시간 명/8시간 암주기의 곤충 사육실에서 사육하였다.
9. 실내 살충활성 생물검정
54±2℃에서 6주 동안 저장한 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 비캡슐화된 분무건조 제제, 그리고 양성대조군으로 상업용 Bt 살충제 제품인 XenTari®를 사용하여 배추좀나방(P. xylostella)의 3령 유충에 대하여 살충 활성을 조사하였다. 마이크로캡슐화 및 비캡슐화 분무건조 제제, 그리고 XenTari®를 각각 1/100,000 및 1/200,000배 희석액으로 제조하고 직경 5cm 배추 잎을 희석액에 침지한 후, 건조하고 브리딩 디쉬에 넣고, 배추좀나방 3령 유충 10마리를 넣은 후 48시간 후에 유충 사망률을 기록하였다, 무처리구는 배추 잎을 증류수에 침지하였다. 모든 처리구는 독립적으로 3회 반복 수행하였다.
10. 온실 연구
통제된 온실 실험은 농촌진흥청에서 6엽기 배추와 4엽기 오이 식물체 포트를 사용하여 수행하였다. 처리구당 3개의 식물체 포트를 사용하여 2반복으로 완전 무작위 설계로 수행하였다. 6엽기 배추 식물체 포트에 마이크로캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 양성대조군 상업용 생물 살충제 XenTari® 1/1,000배 희석액을 1차 엽면분무 처리하고, 배추좀나방(P. xylostella)과 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 3령 유충을 포트당 각각 20마리 접종하였다. 3일 후에 마이크로캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 XenTari® 1/1,000배 희석액을 2차 엽면분무 처리하였다. 4엽기 오이 식물체 포트도 상기와 동일한 방법으로 1차 약제를 처리하였고, 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 3령 유충만 포트당 20마리 접종하고, 3일 후에 2차 약제를 처리하였다. 온실 실험 결과는 1차 약제처리 7일 후 관찰하였다.
11. 통계 분석
통계 분석은 SPSS Statistics 버전 20(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 수행하였다. Scheffe's method의 방법을 사용하여 사후 테스트를 통해 평균값의 다중 비교를 계산하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1. 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제화
본 발명에서는 높은 온도에서 분무건조하여 Btk IMBL-B9 제제공정을 개발하기 위하여 Btk IMBL-B9 포자의 생존력과 포자-결정 복합체의 안정성을 보호 및/또는 증가시키기 위하여 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린 코팅재료를 사용하여 캡슐화하였다. 그리고, 캡슐화된 Btk IMBL-B9의 분무건조 제제의 분말 입자를 전계방출주사전자현미경(FE-SEM)으로 분석하였다.
그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이, 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 분말 입자는 5~7μm 크기의 부분적으로 붕괴된 작은 구형 모양을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 2. 마이크로캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 안정성 확인
마이크로캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제 및 비캡슐화 분무건조 시료들을 대상으로 캡슐화에 따른 포자의 생존율을 평가하였다.
그 결과, 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린의 혼합물에 코팅하여 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 분무건조 공정 후 유효균수는 2.02×1010 CFU/g으로 생존율은 95%임을 확인하였다. 이에 비해, 비캡슐화된 분무건조 제제의 경우 분무건조 공정 후 유효균수는 2.23×1010 CFU/g으로 포자 생존율은 61%임을 확인하였다(도 2). 이 결과를 토대로 포자-결정 복합체를 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린의 혼합물로 코팅처리를 한 후, 분무건조를 하는 방법이 마이크로캡슐화를 통해 고온의 영향을 줄일 수 있어 Btk IMBL-B9의 내생포자의 안정성이 증가한다는 것을 확인하였다.
캡슐화 및 비캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 상업용 생물 살충제 XenTari® 의 54±2℃에서 저장 기간에 따른 제제의 안정성 평가
Storage period
(weeks at 54±2℃)		 Colony forming units(CFU g-1)
Non-encapsulated
BtK IMBL-B9		 Encapsulated
BtK IMBL-B9		 XenTari®
0 2.23×1010c 2.02×1010c 6.90×1010a
2 1.58×1010b 1.78×1010bc 6.31×1010a
4 3.78×109a 1.67×1010bc 5.95×1010a
6 2.72×109a 1.16×1010a 4.26×1010a
상이한 소문자 위첨자를 갖는 각 칼럼의 평균은 통계적으로 유의한 것을 의미한다(p<0.05).
또한, 마이크로캡슐화의 영향에 의한 경시안정성을 조사하기 위하여 캡슐화와 비캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 양성대조군인 상업용 Bt 살충제 XenTari®를 54±2℃에서 6주간 저장하고, 0, 2, 4, 6주 저장 간격으로 포자 생존율을 조사하였다. 6주 저장 후, 캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 포자 생존율은 57.6%로 확인되었으며 이는 양성대조군인 상업용 Bt 살충제 XenTari®의 포자 생존율 61.7% 값과 유사하였다. 이와 대조적으로, 비캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제는 12.2%의 매우 낮은 포자 생존율을 나타내었다(표 1 및 도 3).
한편, 상기의 54±2℃에서 0, 2, 4, 6주 저장한 캡슐화와 비캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 양성대조군인 상업용 Bt 살충제 XenTari®의 살충활성 결정 단백질인 Cry 함량을 SDS-PAGE 분석하였다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 본 발명의 캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제는 0~6주 저장 로딩 샘플 모두 분자량 130 및 65 kDa에 해당하는 살충활성 결정 단백질의 밴드가 고농도로 확인되었고, 양성대조군인 XenTari®의 결과도 유사하였다. 반면, 비캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제는 저장 기간이 긴 6주 저장 로딩 샘플로 갈수로 살충활성 결정 단백질의 농도가 점점 낮아지는 것을 확인하였다
실시예 3. 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 생물학적 검정
54±2℃에서 6주 동안 저장한 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제와 비캡슐화 분무건조 제제, 그리고 양성대조군으로 상업용 Bt 살충제 XenTari® 각각 1/100,000 및 1/200,000배 희석액을 배추좀나방(P. xylostella)의 3령 유충에 대하여 살충 활성을 조사한 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제 1/100,000 및 1/200,000배 희석액은 각각 100% 및 95%의 높은 치사율을 나타내었고, 양성대조군인 XenTari®도 100% 살충 활성을 나타내었다. 반면, 비캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조는 매우 낮은 치사율을 나타내었다.
실시예 4. 온실에서 마이크로캡슐화 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 나방 방제효능 평가
실제 농업환경에서 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 살충 활성을 평가하기 위하여 다식성 해충인 배추좀나방(P. xylostella) 및 열대거세미나방(S. frugiperda)을 방제 대상으로 배추와 오이 식물체 포트를 사용하여 온실 실험을 수행하였다. 배추 식물체 포트를 이용한 배추좀나방과 열대거세미나방 방제효능 평가 실험 결과, 도 6에 개시한 바와 같이 무처리구 및 양성대조군인 XenTari® 처리구에서 80% 이상 잎의 피해를 보인 것을 확인하였다. 반면, 본 발명의 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 제제 처리구는 잎에 피해가 거의 확인되지 않아 양성대조군인 XenTari®에 비하여 배추좀나방과 열대거세미나방의 복합해충 방제효능이 매우 우수한 것을 입증하였다.
또한, 오이 식물체 포트를 이용한 열대거세미나방 방제효능 평가 실험 결과, 도 7에 개시한 바와 같이 무처리구 및 양성대조군인 XenTari® 처리구에서는 열대거세미나방이 지속적으로 잎을 가해하여 식흔이 관찰되었으나 본 발명의 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 제제 처리구는 열대거세미나방 살충율 100%로 잎의 피해를 전혀 관찰할 수 없어 양성대조군인 XenTari®에 비하여 열대거세미나방의 단일해충 방제효능이 우수한 것을 입증하여 마이크로캡슐화된 Btk IMBL-B9 분무건조 제제의 나방 방제효능이 매우 우수한 것을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 바실러스 투린지엔시스 아종 쿠르스타키 IMBL-B9(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IMBL-B9) 균주를 발효하여 발효액을 얻은 후, 발효액으로부터 포자-결정 복합체(spore-crystal complex)를 수집하여 농축한 것에 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린으로 이루어진 코팅 혼합물을 첨가하고 교반한 후 분무건조하여 제조한, 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 코팅 혼합물은 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린이 0.5~10.0:0.5~10.0:0.5~10.0의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 분무건조는 분무건조 장비를 이용하여 입구 온도 130~150℃, 출구 온도 80~90℃에서 건조를 수행하는 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제.
  6. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제를 유효성분으로 함유하는 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 또는 배추좀나방(Plutella xylostella) 방제용 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제6항의 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 또는 배추좀나방(Plutella xylostella) 방제용 조성물의 유효량을 식물, 식물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda) 또는 배추좀나방(Plutella xylostella) 방제 방법.
  11. (1) 바실러스 투린지엔시스 아종 쿠르스타키 IMBL-B9 균주를 발효하여 발효액을 얻은 후, 발효액으로부터 포자-결정 복합체(spore-crystal complex)를 수집하여 농축하는 단계;
    (2) 상기 농축된 포자-결정 복합체에 아라비아검, 전분 및 말토덱스트린이 0.5~10.0:0.5~10.0:0.5~10.0의 중량비로 혼합된 코팅 혼합물을 첨가하고 교반하는 단계; 및
    (3) 상기 교반 후, 분무건조 장비를 이용하여 입구 온도 130~150℃, 출구 온도 80~90℃에서 분무건조하는 단계를 포함하는 마이크로캡슐화 기반 분무건조 제제의 제조 방법.
  12. 삭제
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