CN102286498A - 双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法，是通过设计特异性片段扩增和RACE扩增的方法，从双齿围沙蚕体壁肌肉总RNA中克隆得到了双齿围沙蚕的细胞色素氧化酶基因，可利用实时荧光定量PCR技术检测双齿围沙蚕在受到持久性有机污染物胁迫下细胞色素氧化酶基因表达的规律，为探讨重金属对沙蚕细胞色素氧化酶基因表达、调控的作用机理提供依据，亦为筛选海洋沉积环境污染早期生态风险预测的分子生物标志物奠定基础，利于成本低、来源丰富的双齿围沙蚕在环境保护中广泛应用。

Description

双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因（CYP4）的克隆方法。

背景技术

多毛类隶属于环节动物门，是广泛分布于海洋近岸和河口潮滩的优势底栖动物，也是海洋生态系统能量流动和物质循环的重要环节。由于其具有体型大、生命周期长、行动缓慢、分布广泛，对许多持久性污染物具有较强的耐受性和生物利用性，因此一直作为海洋沉积环境污染评价的指示生物和毒理研究的模型动物。如沙蚕种群分布的生活环境常有石油烃等污染，一些沙蚕种群对石油烃（PHs）表现出较高的耐受能力并有一定的降解能力，Christensen等研究了沙蚕在芘暴露试验结束时，体内50%的芘发生代谢转化成水溶性物质，沙蚕暴露于杀虫剂类溴氰菊酯（DM）中的表现也极其敏感。

双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)在辽东湾潮间带底栖生物中为优势种，其细胞色素氧化酶基因序列在GenBank中已有记载，全长1857个碱基，其中，开放阅读框为1446个碱基，序列如下：

编码481个氨基酸，序列如下：

MYRTWFIIGKAVNKFPGEPVEWPYGNLHQSPGFNEKLILHMKEMATKFNRAWRQWFGPFVPFITLCHPDTVKILAKTEEPKFTEGNSAYLLAQPWLGDGLLLTSGRKWKRNRRLLTPAFHFDILKSYISVYNEQSEILMKKWTEKCSKGESFDIQTDVCLCTLSIILQCAFSYGENIQEAGKRHPYAAAVLELSHLMVKRALNPLVRMSKFLYGLTSDGRLFFKHCDYVHEVAKNVISHRRQALQENPEALKDKKYFDFLDILLQARDQDGTGLTDLEIRDEVDTFLFEGHDTTASGISWTLYSLAKHPEFQKKAQQELDELLADRPNKWILWEDLNQLPYLTMCIKESMRLWCPVPLISRQLSQPITIEGVTLPPHTIIDINIVALHHNPTVWGEDHDEYKPDRFLPENINKMDNFAFLPFSAGPRNCIGQNFAMNEQKVTIARIIQRFDLSVDESHPVQPRPELVTRAIQGIKLFMKPR

目前，在多毛类中已克隆出4种细胞色素氧化酶基因，包括2004年克隆出绿沙蚕(Nereis virens)CYP4家族CYP342A1及其亚家族成员CYP4BB1，2005年公布的小头虫(Capitella capitate)CYP4AT1和CYP331。但是迄今为止，还未有关于克隆双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的报道，以至于无法深入研究双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因在石油烃等污染下分子水平转录机制及抗药性中的作用等，影响双齿围沙蚕在环境保护中的广泛应用。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法。

本发明的技术解决方案是：一种双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法，其特征在于按下列步骤进行：

a.  提取及纯化双齿围沙蚕总RNA，合成cDNA第一链；

b.  应用一对引物通过聚合酶链式反应对双齿围沙蚕cDNA第一链进行扩增：

所述正向引物：5′-ATGTTTGARGGDCAWGAMAC-3′，

所述反向引物：5′-AATNTTGNCCHATRCARTT-3′；

c.  应用5′ RACE PCR引物对聚合酶链式反应产物，进行5′ RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA5′端序列；

所述5′ RACE PCR正向引物：5′-GATTAGGGGCACTGGACACC-3′；

所述5′ RACE PCR反向引物：5′-CCGCCAGCAACTCGTCAAGT-3′； 

d. 应用3′ RACE PCR引物对聚合酶链式反应产物，进行3′ RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA3′端序列；

所述3′ RACE PCR正向引物：5′-GCCCCTAATCAGCCGACAAC-3′；

所述3′ RACE PCR反向引物：5′-GGGGGAAGACCATGATGAAT-3′；

e. 将双齿围沙蚕cDNA5′端序列与双齿围沙蚕cDNA3′端序列拼接，即获得双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因。

本发明首次从双齿围沙蚕中克隆到细胞色素氧化酶（CYP4）基因，可利用实时荧光定量PCR技术检测双齿围沙蚕在受到持久性有机污染物胁迫下细胞色素氧化酶基因表达的规律，为探讨重金属对沙蚕细胞色素氧化酶基因表达、调控的作用机理提供依据，亦为筛选海洋沉积环境污染早期生态风险预测的分子生物标志物奠定基础，利于成本低、来源丰富的双齿围沙蚕在环境保护中广泛应用。

附图说明

图1为本发明实施例双齿围沙蚕总RNA纯化后的电泳图。

图2为本发明实施例双齿围沙蚕细胞色素氧化酶部分基因片段的扩增电泳图。

图3为本发明实施例双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因3′端快速扩增片段的电泳图。

图4为本发明实施例双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因5′端快速扩增片段的电泳图。

具体实施方式

实施例1：

双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法如下：

一．提取及纯化双齿围沙蚕总RNA，合成cDNA第一链；

1．总RNA的提取及纯化：利用宝生物工程（大连）有限公司的RNAiso Pius。所提取及纯化后的总RNA电泳图如图1所示。其中，M为分子量标记，1、2、3为纯化后的总RNA。

2．cDNA第一链合成：利用宝生物公司RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0试剂盒，将下列试剂混合：

        Mgcl₂                                    2 μl

10×反转录缓冲液                        1 μl

Rnase Free dH₂O                       3.75 μl

dNTP                                            1 μl

RNA酶抑制剂                         0.25 μl

AMV逆转录酶                          0.5 μl

接头引物Oligo dT                     0.5 μl

总RNA                                        1 μl

总体积                                       10 μl

反转录反应条件：30℃ 10分钟，42℃ 30分钟，99℃ 5分钟，5℃ 5分钟终止反应。

二．应用一对引物通过聚合酶链式反应对双齿围沙蚕cDNA第一链进行扩增：

根据已知近源物种绿沙蚕（Nereis virens）CYP342A1cDNA设计并合成引物为：

正向引物：5′-ATGTTTGARGGDCAWGAMAC-3′，

反向引物：5′-AATNTTGNCCHATRCARTT-3′；

链式聚合酶链式反应试剂与条件：

将下列试剂混合：

5×PCR反应缓冲液                    10 μl

dH₂O                                      28.75 μl

Ex TaqHS                                 0.25 μl

正向引物                                  0.5 μl

反向引物                                   0.5 μl

cDNA                                        10 μl

总体积                                       50 μl

PCR反应条件为：94℃ 2分钟；然后30循环，94℃ 30秒，47℃ 30秒，72℃ 30秒；72℃ 10分钟。

序列测定与同源检索：PCR产物送由宝生物工程（大连）有限公司测序，将所得序列与GenBank中的序列比较，两者相同。所合成的cDNA第一链扩增电泳图如图2所示。其中：M：分子量标记，1-2为扩增的部分片段，3-4为阴性对照。

三．设计并合成5′ RACE PCR引物，应用5′ RACE PCR引物对聚合酶链式反

应产物（cDNA），进行5′ RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA5′端序列；

5′ RACE PCR正向引物：5′-GATTAGGGGCACTGGACACC-3′；

5′ RACE PCR反向引物：5′-CCGCCAGCAACTCGTCAAGT-3′；

将下列反应试剂混合：

第一PCR反应体系：

cDNA                                                    2 μl

1× cDNA Dilution Buffer II                 8 μl

正向引物                                              1 μl

5′ RACE outer primer                        2 μl

2× GC Buffer I                                 25 μl

LA Taq                                              0.5 μl

dH₂O                                               11.5 μl

总体积                                              50 μl

第二PCR反应体系：

cDNA                                               1 μl

dNTP                                                8 μl

反向引物                                          1 μl

5′ RACE inner primer                    2 μl

2× GC Buffer I                              25 μl

LA Taq                                            0.5 μl

dH₂O                                             12.5 μl

总体积                                             50 μl

5′端PCR反应条件为：

第一 PCR反应条件：94℃ 3分钟；然后35循环，94℃ 30秒，53℃ 30秒，72℃ 1分钟；72℃ 10分钟。

第二 PCR反应条件：94℃ 3分钟；然后30循环，94℃ 30秒，53℃ 30秒，72℃ 1分钟；72℃ 10分钟。

序列测定与同源检索：5′ RACE PCR产物送由宝生物工程（大连）有限公司测序，将所得序列与GenBank中的序列比较，两者相同。双齿围沙蚕cDNA5′端快速扩增片段的电泳图如图4所示。其中：M：分子量标记，1为5′端扩增的片段，2为阴性对照。

四．设计并合成3′ RACE PCR引物，应用3′ RACE PCR引物对聚合酶链式反

应产物（cDNA），进行3′ RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA3′端序列；

3′ RACE PCR正向引物：5′-GCCCCTAATCAGCCGACAAC-3′；

3′ RACE PCR反向引物：5′-GGGGGAAGACCATGATGAAT-3′；

将下列反应试剂混合：

第一 PCR反应体系：

dH₂O                                                   35 μl

10×Adantage 2 PCR Buffer                   5 μl

dNTP                                                     1 μl

50×Adantage 2 Polymerase Mix            1 μl

cDNA                                                2.5 μl

通用引物（UPM）                              5 μl

正向引物                                           0.5 μl

总体积                                                50 μl

第二 PCR反应体系：

dH₂O                                                      36.5 μl

10×Adantage 2 PCR Buffer                       5 μl

dNTP                                                          1 μl

50×Adantage 2 Polymerase Mix                  1 μl

TE缓冲液稀释50倍的第一PCR产物       5 μl

巢式通用引物（NUP）                              1 μl

 反向引物                                                 0.5 μl

总体积                                                       50 μl

3′端PCR反应条件为：

第一 PCR反应条件：94℃ 30秒，72℃ 3分钟，5循环；然后5循环，94℃ 30秒，70℃ 30秒，72℃ 3分钟；最后25循环，94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 3分钟。

第二 PCR反应条件：94℃ 3分钟；然后25循环，94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 3分钟。

序列测定与同源检索：3′ RACE PCR产物送由宝生物工程（大连）有限公司测序，将所得序列与GenBank中的序列比较，两者相同。双齿围沙蚕cDNA3′端快速扩增片段的电泳图如图3所示。其中，M：分子量标记，1-2为3′端扩增的片段，3为阴性对照。

五．将双齿围沙蚕cDNA5′端序列与双齿围沙蚕cDNA3′端序列拼接，即获得基因表中已有记载的双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因全长核苷酸序列，全长1857个碱基，其中，开放阅读框为1446个碱基，编码481个氨基酸。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法

<160> 6

 

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成的引物

<400> 1

ATGTTTGARGGDCAWGAMAC                    20

　

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成的引物

<400> 2

AATNTTGNCCHATRCARTT                         19

 

 

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成的引物

<400> 3

GATTAGGGGCACTGGACACC                     20

 

<210> 4

<211> 20

<212> DNA 

<213> 合成的引物

<400>4

CCGCCAGCAACTCGTCAAGT                      20

 

<210> 5

<211> 20

<212> DNA 

<213> 合成的引物

<400> 5

GCCCCTAATCAGCCGACAAC                      20

 

<210>6

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成的引物

<400> 6

GGGGGAAGACCATGATGAAT                       20

Claims (1)

1.一种双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法，其特征在于按下列步骤进行：

a. 提取及纯化双齿围沙蚕总RNA，合成cDNA第一链；

b. 应用一对引物通过聚合酶链式反应对双齿围沙蚕cDNA第一链进行扩增：

所述正向引物：5′-ATGTTTGARGGDCAWGAMAC-3′，

所述反向引物：5′-AATNTTGNCCHATRCARTT-3′；

c. 应用5′ RACE PCR引物对聚合酶链式反应产物，进行5′ RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA5′端序列；

所述5′ RACE PCR正向引物：5′-GATTAGGGGCACTGGACACC-3′；

所述5′ RACE PCR反向引物：5′-CCGCCAGCAACTCGTCAAGT-3′； 

d. 应用3′ RACE PCR引物对聚合酶链式反应产物，进行3′ RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA3′端序列；

所述3′ RACE PCR正向引物：5′-GCCCCTAATCAGCCGACAAC-3′；

所述3′ RACE PCR反向引物：5′-GGGGGAAGACCATGATGAAT-3′；

e. 将双齿围沙蚕cDNA5′端序列与双齿围沙蚕cDNA3′端序列拼接，即获得双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因。

Images