본 발명의 신규한 아미노민캘릭스아렌 유도체는 하기 화학식 1 내지 4의 구조를 갖는다. 상기 아미노캘릭스아렌 유도체는 연속된 구아닌 기를 가진 올리고유전자 고정화 방법에서 사용하는 자기조립 단분자층에 필수적인 화합물이다.
상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다.
상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH2, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨).
상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다.
상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8 이 동시에 -H인 경우는 제외한다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH2, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨).
본 발명은 또한 상기 화학식 1 내지 4의 아미노캘릭스아렌 유도체 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 화학식 5의 테트라아미노캘릭스[4]아렌은 캘릭스[4]아렌 (calix[4]- arene)을 하기 참고문헌 1의 방법에 따라 테트라니트로캘릭스[4]아렌으로 변환한 뒤 환원반응에 의해서 합성한다 [참고문헌 1: Journal of Organic Chemistry, 1990년 Vol 55, pp 5639-5643; Journal of Organic Chemistry, 1979년 Vol 44, pp 1233-1238].
본 발명의 화학식 1 및 화학식 3의 화합물은 상기 공지된 방법에 의해 합성된 화학식 5의 테트라아미노캘릭스[4]아렌을 출발물질로 하여, 하기 실시예 2의 방법에 따라 화학식 5의 아민 작용기를 벤질클로라이드나 벤질브로마이드 계열의 유도체와 반응시켜 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체를 합성한다. 또 다른 방법으로는 하기 실시예 5의 방법에 따라 화학식 5의 작용기를 방향족알데히드와 반응시킨 뒤 환원제를 사용하여 환원반응을 진행한 뒤 벤질클로라이드나 벤질브로마이드 계열의 유도체와 반응시켜 화학식 1의 아미노캘릭스아렌 유도체를 합성한다.
본 발명의 화학식 2 및 화학식 4의 화합물은 하기 실시예 6 내지 8에 따라 각각 화학식 1 및 화학식 3의 화합물과 말단 기에 할로젠이 부착된 알데히드 등의 작용기를 가진 화합물을 반응시켜 아래 -OH, 즉 알코올 작용기중 1, 3 번째 알코올 작용기를 알킬기 말단에 알데히드 또는 티올이 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체 화학식 2 및 화학식 4의 화합물을 합성한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 2 또는 4의 아미노캘릭스아렌 유도체를 금 기질 또는 아민 등의 다양한 작용기가 부착된 유리 등의 고체기질에 부착함으로써 모든 종류의 올리고유전자를 고밀도로 고정화가 가능한 올리고유전자 단분자층제조를 위한 올리고유전자 칩 기판 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 아민 작용기가 부착되어 있는 유리, 실리콘웨이퍼 및 수정결정으로 이루어진 군에서 선택되는 고체기질에, 상기 화학식 2 또는 화학식 4의 아미노캘릭스아렌 유도체 중 알데히드 작용기가 말단기에 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체를 이용하여 이민결합 및 이를 환원한 아민결합을 통해 부착하여 제조한 자기조립 단분자층 고체기질을 제공한다.
또한, 본 발명은 아민 작용기가 부착되어 있는 유리, 실리콘웨이퍼 및 수정결정으로 이루어진 군에서 선택되는 고체기질에, 상기 화학식 2 또는 화학식 4의 아미노캘릭스아렌 유도체 중 알데히드 작용기가 말단기에 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체를 이용하여 에스테르, 에테르 또는 아미드결합 등에서 선택되는 화학결합을 통해 부착하여 제조한 자기조립 단분자층 고체기질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 올리고유전자 칩 기판에 아무런 조작 없이 연속된 염기를 가진 올리고유전자를 비가역적으로 분자인식에 의해 고정화 하여 올리고유전자 단분자층, 즉 올리고유전자 칩 제조방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 아미노캘릭스아렌 유도체의 유리, 실리콘웨이퍼, 용융 석영(fused silica) 등의 고체기질 기질 위에서의 자기조립 단분자층 제조과정을 개략적으로 나타낸다.
아민 작용기가 부착된 유리기질에 아미노캘릭스아렌 유도체의 자기조립단분자층을 제조하기 위한 구체적인 방법은 다음과 같다.
먼저 사용된 아민 작용기가 부착된 유리기질(유리 슬라이드 글래스)은 하기 참고문헌 2에 기재된 방법에 따라 실라놀(-Si-OH) 작용기가 표면에 풍부한 유리기질의 표면에 화학반응을 통하여 아민 말단기를 가진 유리기질(아민 슬라이드 글래스, 또는 아민 칩)형태로 제조하였다 [참고문헌 2: Langmuir, 1997년, Vol 13, pp 4305-4308; Langmuir, 1996년, Vol 12, pp 5338-5342]. 이렇게 제조된 아민 작용기가 부착된 유리기질을 화학식 2 또는 4의 화합물을 0.1-5mM 농도로 녹인 클로로포름과 THF의 혼합용액(CHCl3 : THF = 9 : 1)에 넣어둔다. 1-5시간 뒤 클로로포름과 아세톤, 에탄올 순으로 세척한 뒤 건조시키면, 도 1과 같은 아미노캘릭스아렌 유도체의 자기조립단분자층, 즉 BMT 유전자칩 기판 A형이 완성된다. 단분자층의 생성은 표면반사 적외선 분광분석법을 이용하여 확인한다. 여기에 사용되는 유리기질은 일반적으로 시판되는 모든 종류의 슬라이드 글래스 또는 유리이다. 결합에 사용되는 이민 결합은 물속에서 장기간 보존하는 경우 결합이 깨어지는 경우가 있으나, 올리고유전자와 같은 생체물질은 대부분 PH가 7-8사이의 완충용액에서 녹여서 제조하기 때문에, 이러한 용도로 사용할 때에는 이민 결합된 형태로 곧바로 사용하여도 문제가 없다는 연구결과를 확인하였다.
제조된 칩 기판을 도 1에서와 같이 BH3-THF 또는 1-5% NaBH4의 환원제가 녹아있는 유기용매에 BMT 유전자칩 기판 A형을 1-10분 정도 담그면, 이민이 더욱 강력한 아민으로 환원되어 장기보관이나 PH가 다른 범위에서 유전자 칩을 제조하는 경우 우수한 안정성을 확보할 수 있다.
도 2는 본 발명의 아미노캘릭스아렌 유도체의 금 기질 위에서의 자기조립 단분자층이 제조되는 과정을 개략적으로 나타낸다.
금 기질에 아미노캘릭스아렌 유도체의 자기조립단분자층을 제조하기 위한 구체적인 방법은 다음과 같다.
클로로포름 (CHCl3) 등의 유기용매에 화학식 2 또는 4의 화합물 중 티올 부착된 화합물을 0.1-5 mM 농도로 녹인 용액을 제조한다. 금 기질을 상기 제조된 용액에 넣어 1-5시간 동안 담근 후 꺼내어 이를 클로로포름 및 아세톤 그리고 물로 각각 세척한 뒤 건조시키면 도 2와 같은 아미노캘릭스아렌 유도체의 자기조립 단분자층이 완성된다. 여기에 사용되는 금 기질은 어떤 종류의 금 박막이라도 가능하나, 일반적으로 유리, 용융 석영, 실리콘 웨이퍼, 플라스틱 기질 등에 크롬(Cr)이나 티타늄(Ti)등을 2-10nm로 진공증착 시킨 후 금을 50-200nm 두께로 진공증착시 킨 기질이 바람직하다. 이렇게 제조된 금 기질은 사용 직전에 피라니아 용액 (Piranha solution; 진한황산:30% 과산화수소수=3:1)에 1분 정도 담근 뒤 정제수에서 씻은 뒤 질소를 불어주며 말려서 사용하는 것이 일반적이다. 단분자층의 생성은 표면반사 적외선 분광분석법을 이용하여 확인한다.
또한, 본 발명은 상기 고체기질에 연속된 구아닌 염기가 부착된 올리고유전자를 다중분자인식에 의해 고정화하여 올리고유전자 칩을 제조하는 방법 및 제조된 올리고유전자 칩을 제공한다.
더욱 상세하게, 본 발명은 상기 아미노캘릭스아렌 유도체의 4 개의 질소원자를 통해 연속된 구아닌 작용기를 분자 인식하여 다중 분자인식에 의한 올리고유전자 고정화 방법을 제공한다.
본 발명의 고정화 방식은 올리고유전자를 이용한 모든 종류의 바이오칩 제조기술을 제공하는 기반기술로서 현재까지는 세계적으로 비슷한 연구결과도 발표된 적이 없는 신규한 발명이다.
도 3 및 도 4은 자발적 분자인식에 의한 고밀도 올리고유전자칩 제조기술에 대한 개략도 및 단분자층을 구성하는 아미노캘릭스아렌 유도체의 개수를 이론적으로 계산하기위한 모식도이다. 추가로 이론적으로 계산된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 고정화 될 수 있는 최대농도의 올리고유전자의 농도를 비교 확인한 실제 실험 결과이다.
이론적인 최대치의 고정화된 올리고유전자의 양은 다음과 같은 방식을 이용 하여 계산하였다. X-선 결정법에 의해 얻어진 아미노캘릭스아렌의 직경은 2.1-2.2nm로 밝혀졌다. 이들이 단분자층으로 표면에 자기조립 될 때 필요한 분자의 개수는 세 개의 아미노캘릭스아렌 유도체의 중심을 연결하는 선으로 구성되는 삼각형 두개의 면적과 동일하므로 다음의 식에 의해 하나의 캘릭스아렌유도체가 표면에서 차지하는 면적을 구할 수 있다.
[식]
2.1 nm x 2.1 nm x sin60°= 3.82 x 10-14 cm2
그러므로 1cm2 당 존재하는 아미노캘릭스아렌 유도체의 개수는, 1/3.82 x 10-14 cm2 = 2.62 x 1013개 = 43.5 pmol/cm2 와 같다. 하나의 올리고유전자가 고정화 되는데 6-7개의 아미노캘릭스아렌 유도체가 결합된 면적을 사용하게 되므로 고정화 최고 올리고유전자 밀도는 43.5/(6~7) pmol/cm2 = 6.2~7.25 pmol/cm2 이다. 고정화용 올리고유전자 5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 4)를 실시예 13의 방법에 따라 최대밀도로 고정화 한 올리고유전자칩에 형광부착된 c-DNA 5'-cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 7)과 교잡반응한 뒤 실시예13의 방법에 따라 씻고 말린 뒤 형광스캐너(GSI, 미국)를 이용하여 형광감도를 측정한 결과가 도 4의 2) 교잡반응 결과에 나타나 있다. 이의 형광감도와 유사한 감도를 교잡반응에 사용된 것과 동일한 c-DNA 5'-cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 7)을 다양한 농도에서 말려서 형광스캐너를 이용하여 유사한 형광감 도를 측정한 결과 이론적 계산치의 절반수준인 3.8pmol/cm2 의 농도로 도포하여 말린 경우에 비슷한 수준의 형광감도를 얻을 수 있었다. 이 결과는 도 4의 1) 형광부착된 올리고유전자를 말린 결과에 나타나 있다. 이 결과는 본 발명에서 개발된 BMT 올리고유전자 칩 기판이 올리고유전자를 거의 이론적 최대치에 가깝게 고정화하여 올리고유전자 칩을 제조할 수 있으며, 동시에 30분의 교잡반응에서도 최대치 형광의 약 50% 수준의 결과를 얻어낼 수 있어서, 초고속 교잡반응을 가능하게 하며 동시에 고밀도 고정화 기술을 구현한 세계최초의 올리고유전자 칩 제조기술이라는 것을 보여주고 있다.
도 5는 최적의 연속된 염기개수를 파악하기 위해 구아닌 염기가 연속적으로 부착된 동일한 염기서열을 가진 올리고유전자를 이용하여 실시예 11에 따라 5배 농도의 올리고유전자(6.75nmol/mL, 1nL)고정화시키고, 실시예 11에 따라 교잡반응을 수행한 뒤 씻고 건조한 뒤 형광스캐너(GSI, 미국)을 이용하여 분석한 결과이다. 도 5의 실험에는 표 2에 나타난 염기서열을 가진 유전자가 사용되었으며 교잡반응에는 표 2의 형광부착된 c-DNA가 사용되었다.
실제 실험결과는 도 5의 중간에 보이는 6x6으로 결과가 보이는 스캔데이터이며, 이 형광을 수치로 분석하여 막대그래프로 나타낸 결과가 도 5의 아래에 보이는 도표이다. 연속된 구아닌 염기서열이 1 또는 4개 정도일 때는 거의 표면 고정화가 이루어지지 않는 결과를 보여주고 있으며, 7개의 연속된 구아닌을 가질 때부터 형광이 강하게 나타나기 시작하며 9개에서 7개의 두배 수준의 형광을 나타내는 결과를 보여주고 있다. 이때 9개 보다 길이가 더욱 긴 12개와 15개의 연속된 구아닌 염기를 가진 올리고유전자를 사용하여 고정화 한 경우에는 9개에서 보다 1/2, 1/3 수준의 감소된 형광감도를 보여주고 있다. 이는 9개의 구아닌 염기가 분자인식에 의한 고정화에 충분한 수준이며, 길이가 더 긴 구아닌 염기를 이용하게 되면 이론적으로 12개인 경우 길이가 9개인 올리고유전자 고정화에 필요한 공간보다 더 넓은 공간을 필요로 하여 결과적으로 형광감도가 1/2 수준으로 감소하는 결과를 나타내고 있다. 15G 인 경우에는 고정화에 필요한 공간이 9G보다 2/3 수준을 더 필요로 하여 고정화되는 올리고유전자의 양이 30%수준으로 감소하게 되어 형광감도가 9G에 비해 약 1/3수준으로 감소한 결과를 보여주고 있다. 종합하면 고정화에 최적의 연속된 구아닌은 9개인 것을 알 수 있고, 그 이하인 경우 충분한 수준의 분자인식에 의한 비가역적인 올리고유전자 고정화가 일어나지 않음을 알 수 있으며, 9G보다 많은 수의 연속된 구아닌 염기를 가지는 경우에는 고정화에 필요한 면적인 9G보다 넓어서 실제로 고정화 되는 올리고유전자의 개수가 감소되는 결과로 판단된다.
도 6는 올리고유전자 고정화시에 연속된 염기에 의해 적절한 공간을 확보하여 고정화된 올리고유전자들 사이에 확보된 공간을 통해 c-DNA가 칩의 바닥까지 접근이 가능하며 초고속으로 드나들 수 있게 충분한 수준의 공간을 유지하고 있다는 것을 보여주는 모식도이다. 동시에 올리고유전자가 고정화될 때 실제로 6-7개의 아미노캘릭스아렌 유도체가 고정화되어있는 표면적을 이용한다는 것을 나타내는 모식도이다.
도 7 및 도 8은 실제로 표 3에 나타나 있는 각각 하나씩의 염기서열이 다른 A,C,G,T형 올리고유전자를 실시예 12에 따라 고정화 시켰다. 그 후, 실시예 12의 형광이 부착된 DNA(Cy3-DNA)를 검출하기 위한 C-DNA와의 교잡반응에 따라 이들과 각각 결합할 수 있는 상보적인 c-DNA를 실시예 12에 따라 교잡반응을 수행한 뒤, 표 3의 형광 부착된 올리고유전자를 사용하여 실시예 12에 따라 형광부착시켰다. 그 후, 씻고 건조시켜 형광스캐너(GSI, 미국)을 이용하여 형광감도를 분석하였다. 도 7 및 도 8은 30분 정도의 짧은 교잡반응 시간에도 단일염기변이 차이를 On-Off 수준으로 형광감도를 차별화하여 분석할 수 있는 초고속 교잡반응이 가능하면서 SNP 의 차별화가 On-Off 수준으로 진행이 되는 올리고유전자 칩 기판임을 보여주는 결과이다. 또한, 본 발명에서 제안된 올리고유전자 칩 제조기술이 초고속 교잡반응을 가능하게 하며 단일염기변이(SNP)를 간편하면서 재현성 높게 분석할 수 있게 하는 신기술임을 보여주는 결과이다.
도 9은 고정화에 다른 염기보다 구아닌 염기만이 선택적으로 고속고정화를 수행한다는 실제 경쟁반응 결과이다. 실시예 14에 따라 표 4 에 있는 형광부착된 올리고유전자와 결합되지 않는 9G가 부착된 올리고유전자(9G-1)를 동일한 농도로 사용하면서, 형광부착된 올리고유전자(Cy-3-DNA)와 상보적인 염기서열을 가지면서 9A, 9G, 9T, 9C가 부착된 네 가지의 올리고유전자를 올리고유전자(9G-1)의 1배, 2배, 4배농도로 섞은 혼합물을 도 9와 같은 순서로 도포하여 유전자를 고정화 하였다. 이때 9A, 9C, 9T, 9G가 동일한 농도로 섞여있는 9G가 부착된 올리고유전자(9G-1)보다 더 빠르게 고정화 된다면, 실시예 14에 따라 진행된 교잡반응에서 형광 부착된 올리고유전자와 결합하게 되어 형광이 나타나게 되고, 9G가 부착된 올리고유전자(9G-1)가 더 빠르게 고정화가 된다면 물론 형광은 나타나지 않을 것으로 예측된다. 도 9의 실제 실험결과에 따르면 9G를 고정화 한 위치에서는 고정화시의 올리고유전자 농도가 증가함에 따라 형광감도가 점점 증가하여 9G-1 : 9G = 1:1에서 약 50%의 형광감도를, 그리고 1:4에서는 80% 수준의 형광감도를 보여주는 것을 확인할 수 있다. 9T, 9C에서는 형광감도가 아주 미약하게 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 9A인 경우에도 9G 양의 4배 수준에서야 약간의 형광감도를 나타내는 것으로 확인되어 실제 고정화시 9G가 부착된 올리고유전자를 이용한다면 교잡반응에서 사용되어야 할, 즉 c-DNA와 결합 시에 사용되어야 할 염기들이 있는 부분이 고정화 에는 참여하지 않는다는, 즉 선택적으로 9G가 부착된 위치만 본 발명에서 제안된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에 최고밀도로 결합되어 재현성 있는 올리고유전자 칩을 제조할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명에서 개발된 아미노캘릭스아렌 유도체 자기조립단분자층이 연속된 구아닌 염기를 다중 분자인식하여 비가역적으로 올리고유전자를 단분자층 표면에 고정화하여 올리고유전자 칩을 제조할 수 있으며, 형광분석에 의해 나타난 고정화된 올리고유전자의 양이 이론적 최고 밀도에 가깝게 항상 고정화가 가능하여 재현성 있는 올리고유전자 칩 제조를 위한 기반기술임을 보여주는 결과이다.
추가로 본 발명은 연속된 구아닌 염기가 단분자층의 표면에 고정화 되면서 도 6에서 보여지는 것처럼 고정화된 올리고유전자가 연속된 염기길이 만큼의 공간 을 확보하며 배열된다. 이 공간은 진단이나 연구목적 등으로 특정염기서열을 가진 유전자를 분석할 때 수십-수백개 이상의 염기서열을 가진 c-DNA가 자유롭게 초고속으로 칩기판의 표면까지 쉽게 접근이 가능하게하여 최대치의 염기가 상보적으로 결합되어 10분-1시간의 짧은 시간 내에 초고속 교잡반응을 가능하게 한다. 동시에 단일염기변이까지도 간편하게 진단해 낼 수 있는 고정화된 유전자간의 공간을 충분하게 확보하는 기술이 접목된 올리고유전자 단분자층 제조기술, 즉 올리고유전자 칩을 제조하는 기반기술을 제안하는 발명이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
5,11,17,23-테트라아미노캘릭스[4]아렌의 합성
5,11,17,23-테트라니트로캘릭스[4]아렌(TNCA; tetranitrocalix[4]arene)을 출발물질로 사용하여 하기 참고문헌 3에 제시된 합성방법으로 합성하여 연한황색의 고체 생성물 5,11,17,23-테트라아미노캘릭스[4]아렌 (TACA; tetraaminocalix[4]-arene)을 75% 수율로 얻었다.
[참고문헌 3: Van Wagenigen, A. M. A.; Snip, E.; Verboom. W.; Reinhoudt, D. N.; Boerrigter, H.; Liebigs Ann/Recueil 1997년. pp 2235-2245]
실시예 2
5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸)디벤질아미노캘릭스[4]아렌의 합성
건조된 둥근바닥 플라스크에 마그네틱 바와 TACA (1.0 g, 2.05mmol)과 요오드화 나트륨 (3.0g, 20.5mmol)을 넣고 감압 건조시켰다. 건조 후 무수 아세토니트릴 50ml 를 넣어 준 뒤 질소 교류 하에 가열기에서 교반시켰다. 5분 뒤 2,4-디메틸벤질브로마이드 (16.2 g, 82mmol)를 반응용기에 넣어준 후, 온도를 올려 교류교반 시키면서 피리딘 (6.62 ml, 82mmol)을 넣어주고 6시간 동안 반응시켰다. 반응 후 반응용기는 상온으로 식혀준 후 용매는 감압 하에 제거한 후 CH2Cl2 150ml 에 녹인 후 물로 2번 유기 층을 닦아주었다. 유기 층을 건조시킨 후 감압 하에 여과하여 여과액은 감압제거한 후 CH2Cl2/MeOH로 재결정하여 연회색의 고체생성물 5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸)디벤질아미노캘릭스[4]아렌 (2,4-DMTDBACA) 2.1 g (수율 80% )을 얻었다.
1H NMR (300MHz, CDCl3); δ 10.14(s, 4H, ArOH), 7.28 7.12(m, 24H, ArH), 6.03(s, 8H, ArH), 4.24(s, 16H, ArNCH2), 4.11(d, 4H, ArCH2Ar, 13Hz), 3.10(d, 4H, ArCH2Ar, 13Hz), 2.43(s, 12H, ArCH3), 2.28(s, 12H, ArCH3)
실시예 3
5,11,17,23-(2,4-디메틸)벤질이민캘릭스[4]아렌의 합성
건조된 둥근바닥 플라스크에 TACA(100 mg, 0.2mmol)과 마그네틱 바를 넣고 준비하였다. 반응용기에 15ml 의 아세토니트릴을 넣어준 뒤 교반시켰다. 2,4-디메틸벤즈알데히드 (322 mg, 2.4mmol)을 넣어준 뒤 질소 교류 하에서 2시간 동안 상온에서 교반 반응시켰다. 반응 후 감압 여과하여 감압 하에 용매를 제거 한 뒤 반응물을 적정량의 CH2Cl2 에 녹여준 뒤 n-헥산 15ml을 부어 주어 연갈색의 고체 생성물을 얻었다. 생성물은 다시 한번 3ml의 CH2Cl2 에 녹여준 뒤 n-헥산 15ml을 가하여 밝은 연갈색의 고체 생성물 5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸)벤질이민캘릭스[4]아렌 (2,4-DMICA) 155 mg(수율 81 %)을 얻었다.
1H NMR (300MHz, CDCl3); δ 10.19(s, 4H, ArOH), 8.54(s, 8H, N=CH), 7.79(d, 4H, ArH), 7.02(s, 4H, ArH), 7.01(d, 4H, ArH), 6.96(s, 8H, ArH), 4.30(d, 4H, ArCH2Ar, 13Hz), 3.61(s, 4H, ArCH2Ar, 13Hz), 2.43(s, 12H, ArCH3), 2.30(s, 12H, ArCH3)
실시예 4
5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸)벤질아미노캘릭스[4]아렌의 합성
건조된 둥근바닥 플라스크에 2,4-DMICA(100 mg, 0.1mmol)과 마그네틱 바를 넣고 감압 건조시킨 후에 질소 교류하에서 무수 THF 20ml 를 넣고 교반시켰다. 10분 뒤에 BH3/THF 1.0M 용액 (0.8 ml, 0.8mmol)을 넣은 후에 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 후에 용매는 감압하에 제거하고 플라스크에 남아있는 생성물은 CH2Cl2 에 녹인 후 0.1 M HCl 수용액으로 각각 2번 닦아준 후 증류수로 2번 닦아주었다. 유기 층을 분리한 후 건조시킨 후 감압여과하여 여과액을 감압제거 시킨 후에 CH2Cl2/헥산으로 재결정하여 연황색의 고체 생성물 5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸)벤질아미노캘릭스[4]아렌(2,4-TDMBACA) 72 mg(수율75%)을 얻었다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) ; δ 9.86(s, 4H, ArOH), 7.33-7.18(m, 12H, ArH), 6.21(s, 8H, ArH), 4.21-4.09(m, 16H, ArCH2Ar, ArNHCH2), 3.58(s, 4H, NH), 3.22(d, 4H, ArCH2Ar), 2.43(s, 12H, ArCH3), 2.28(s, 12H, ArCH3)
실시예 5
5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸테트라벤질)벤질아미노캘릭스[4]아렌의 합성
건조된 둥근바닥 플라스크에 마그네틱 바와 2,4-TDMBACA (500 mg, 0.5mmol) 과 요오드화 나트륨(80 mg, 0.5mmol)을 넣고 감압 건조시켰다. 건조후 무수 아세토니트릴 50ml 를 넣어 준 뒤 질소 교류하에 가열기에서 교반시켰다. 5분 뒤 벤질브로마이드(1.1 ml, 10mmol)를 반응 용기에 넣어주고 나서 교류 교반켰다. 반응용기에 피리딘(0.8 ml, 10mmol)을 넣어주고 6시간 동안 반응시켰다. 반응 후 반응용기는 상온으로 식혀준 후 용매는 감압제거한 후 CH2Cl2 60ml에 녹인 후 물로 닦아준다음 유기층을 건조시키고 감압여과하여 여과액은 감압제거한 후 CH2Cl2/MeOH 로 재결정하여 연회색의 고체생성물 5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸테트라벤질)벤질아미노캘릭스[4]아렌(TB(2,4-DMTB)ACA) 521 mg (수율 79% )을 얻었다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 10.01(s, 4H, ArOH), 7.35-7.10(m, 34H, ArH), 6.20-6.06(br, 8H, ArH), 4.31-4.01(m, 16H, ArCH2Ar, ArNHCH2), 3.14(d, 4H, ArCH2Ar), 2.45(s, 12H, ArCH3), 2.27(s, 12H, ArCH3)
실시예 6
5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸)디벤질아미노캘릭스[4]아렌-1,3-헥산알의 합성
건조된 둥근바닥 플라스크에 마그네틱 바와 2,4-DMTDBACA(500 mg, 0.35mmol), K2CO3 (487 mg, 3.5mmol), 요오드화 나트륨(473mg, 3.15mmol)를 차례로 넣어준 뒤 무수 아세토니트릴 130ml를 질소교류 하에서 반응 용기에 넣어준 뒤 가열기에서 교반시켰다. 6-브로모헥산알 (376 mg, 2.1mmol)을 넣어준 뒤 16시간 동안 교류 교반시켰다. 반응 후 반응물을 상온으로 식혀준 뒤 감압 하에서 용 매를 제거한다. 130ml의 CH2Cl2로 반응물을 녹인 뒤에 감압여과하고 여과된 여과액은 감압제거한 뒤, MeOH/CH2Cl2로 재결정하고 감압여과하여 연 노란색의 고체 생성물 5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸)디벤질아미노캘릭스[4]아렌-1,3-헥산알데하이드 (2,4-DMTDBACAHA) 432 mg(수율 76 %)을 얻었다.
1H NMR (300MHz, CDCl3); δ 9.78(s, 2H, CHO), 7.31 7.04(m, 12H, ArH), 6.11-6.02(br, 8H, ArH), 4.41-4.13(m, 20H, ArNCH2, ArCH2Ar), 3.89(t, 4H, OCH2), 3.05(d, 4H, ArCH2Ar, 13Hz), 2.57-2.49(t, 4H, CHOCH2), 2.45-2.39(m, 12H, ArCH3), 2.31-2.25(m, 12H, ArCH3), 2.12-1.98(t, OCH2CH2), 1.78-1.62(m, 8H, CH2CH2)
실시예 7
5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸테트라벤질)벤질아미노브로모부톡시캘릭스[4]아렌의 합성
건조된 둥근바닥 플라스크에 2,4-TDMBACA(500 mg, 0.5mmol)과 무수 K2CO3 (619mg, 5.0mmol)와 요오드화 나트륨 (674 mg, 4.5mmol)를 넣고 무수 아세토니트릴 160ml를 넣어주어 상온에서 15분간 교반시켰다. 반응용기에 1,4-디브로모부탄(1.03 g, 0.6ml, 5.0mmol)을 넣어주고 20시간 동안 교류교반시켰다. 반응용기를 상온으로 식힌 뒤 용매는 감압제거하고 CH2Cl2 로 녹인뒤 감압 여과하여 여과액은 감압제거한 뒤 EA/헥산으로 재결정시킨 뒤, 감압 여과하여 연갈색의 고체생성물 5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸테트라벤질)벤질아미노브로모부톡시캘릭스[4]아렌(TB(2,4-DMTB)ABCA) 610 mg(수율 77%)을 얻었다.
1H NMR (300MHz, CDCl3); δ 7.81(s, 2H, ArOH), 7.29 7.04(m, 34H, ArH), 6.06-6.02(d, 8H, ArH), 4.38-4.11(m, 20H, ArNCH2, ArCH2Ar), 3.89(t, 4H, OCH2), 3.04(d, 4H, ArCH2Ar, 13Hz), 2.46-2.43(m, 12H, ArCH3), 2.41-2.40(m, 12H, ArCH3) 2.31-2.27(t, 4H, BrCH2), 2.16-2.06(m, 8H, CH2CH2)
실시예 8
5,11,17,23-테트라(2,4-디메틸테트라벤질)벤질아미노메르캅토부톡시캘릭스[4]아렌의 합성
건조된 둥근바닥 플라스크에 TB(2,4-DMTB)ABCA(500 mg, 0.31mmol)과 포테슘 티오아세테이트 (212 mg, 1.86mmol)을 넣고 무수 아세톤 60ml 에 녹여서 질소 교류 하에서 90분 동안 상온에서 소닉반응시켰다. 반응 후 용매를 감압제거한 후 30ml CH2Cl2으로 녹이고 감압 여과한 뒤 여과액을 물로 2번 닦아주고 유기층을 분리하여 건조시켰다. 유기층을 감압 여과하고 여과액을 감압 건조시킨 뒤 얻어진 고체를 EA/n-헥산을 이용하여 재결정하고 감압 여과하여 연한 황색의 고체 결정을 얻었다. 얻어낸 고체결정을 둥근바닥 플라스크에 넣고 CH2Cl2 : 메탄올 = 5 : 1 비율의 혼합용액에 녹이고 상온에서 질소 교류 하에서 소닉 반응시켰다. 1분 뒤 1.0 M KOH (1.5ml, 1.5mmol)을 넣고 30분간 소닉반응시켰다. 반응 후 용매를 감압제거한 뒤 CH2Cl2에 녹여서 0.1M HCl 수용액으로 닦아주었다. 유기층을 분리한 뒤 건조시키고 감압 여과하여 여과액은 감압 하에 용매를 제거하여 CH2Cl2/MeOH를 이용하여 재결정하면 연한 노란색의 5,11,17,23-테트라(2,4-메톡시)벤질아미노머캅토부톡시캘릭스[4]아렌(TB(2,4-DMTB)AMBCA)을 320mg(수율 73%)을 얻었다.
1H NMR (300MHz, CDCl3); δ 7.84(s, 2H, ArOH), 7.29 7.01(m, 34H, ArH), 6.25-6.19(br, 8H, ArH), 4.36-4.11(m, 20H, ArNCH2, ArCH2Ar), 3.90(t, 4H, OCH2), 3.05(d, 4H, ArCH2Ar, 13Hz), 2.30(t, 4H, SHCH2), 2.45-2.39(m, 12H, ArCH3), 2.31-2.25(m, 12H, ArCH3) 2.05-2.02(m, CH2CH2)
실시예 9
도 1과 같은 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 제조
CHCl3 등의 유기용매에 실시예 6에서 합성된 2,4-DMTDBACAHA 를 0.1-5mM 농 도로 녹인 용액을 제조하였다. 도 1과 같이 아민작용기가 부착된 슬라이드글라스(아민칩)을 제조된 용액에 1-24시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름과 아세톤 그리고 물로 각각 세척한 뒤 건조시키면, 도 1에 있는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층(BMT 올리고유전자 칩 A형)이 제조된다. 전술한 A형을 BH3-THF 나 NaBH4 in MeOH 환원제 속에 1-10분동안 넣어둔 뒤 물(DI water)로 세 번 세척하고 질소분위기 하에서 건조시켜 도 1에 있는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층(BMT 올리고유전자 칩 B형)을 제조한다.
실시예 10
도 2와 같은 금 기질에서의 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 제조
CHCl3 등의 유기용매에 실시예 8에서 합성된 TB(2,4-DMTB)AMBCA를 0.1-5mM 농도로 녹인 용액을 제조하였다. 도 2와 같이 금 기질을 제조된 용액에 1-24시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름과 아세톤 그리고 물로 각각 세척한 뒤 건조시키면, 도 2에 있는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층이 제조된다. 아미노캘릭스아렌의 다른 유도체도 동일한 방법에 따라 단분자층이 제조된다. 여기에 사용되는 금 기질은 여러 가지 형태로 사용될 수 있으나, 일반적으로 유리, 용융석영(fused silica), 실리콘웨이퍼, 플라스틱 등에 크롬(Cr)이나 티타늄(Ti)등을 2-10nm로 진공증착 시킨 후 금을 50-200nm 두께로 진공증착시킨 기질이 바람직하다. 이렇게 제조된 금 기질은 사용직전에 피라니아 용액 (진한황산: 30% 과산화수소수 = 3:1로 섞은 혼합용액)에 10초-1분정도 담근 후 물로 세척하고 질소교류하에 건조시켜 곧바로 사용한다. 단분자층의 생성은 표면반사적외선분광분석법(FTIR-ERS)을 이용하여 분석한다.
실시예 11 내지 14에 사용된 용액과 올리고유전자, 형광부착된 올리고유전자, 및 C-DNA 염기서열
실시예 11 내지 14에 사용된 용액
BMT 스폿팅 용액1 |
4xSSC, 15% 글리세롤, 1xPBS |
BMT 스폿팅 용액2 |
600 mM NH4Cl, 15% 글리세롤, 1xPBS |
BMT 스폿팅 용액3 |
500 mM KCl, 15% 글리세롤, 1xPBS |
BMT Wa-A-1 |
2xSSC, 0.1% SDS |
BMT Wa-A-2 |
0.1xSSC |
BMT 블록킹 용액 |
밀크카제인 5% 수용액 |
BMT hyb-mix A |
4xSSC, 0.002% SDS, 50% 글리세롤, 1xPBS |
BMT Wa-B-1 |
4xSSC, 0.1% SDS |
BMT Wa-B-2 |
4xSSC |
최적 염기개수
|
서열 |
설명 |
1G |
5'-GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 1) |
프로브 |
4G |
5'-GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 2) |
7G |
5'-GGG GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 3) |
9G |
5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 4) |
12G |
5'-GGG GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 5) |
15G |
5'-GGG GGG GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 6) |
Cy3-DNA |
5'-cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 7) |
표적 |
SNP 실험용
|
서열 |
설명 |
SNP-A |
5'-GGG GGG GGG TTT AC ATA GCA T A T CGA GGT GGG-3' (서열번호 12) |
프로브 |
SNP-T |
5'-GGG GGG GGG TTT AC ATA GCA T T T CGA GGT GGG-3' (서열번호 13) |
SNP-G |
5'-GGG GGG GGG TTT AC ATA GCA T G T CGA GGT GGG-3' (서열번호 14) |
SNP-C |
5'-GGG GGG GGG TTT AC ATA GCA T C T CGA GGT GGG-3' (서열번호 15) |
CN-A |
5'-A ATC AAC CCA CAG CTG AAA AAA CCC ACC TCG A A A TGC TAT GTG GAC-3' (서열번호 16) |
형광 검출용 표적 |
CN-T |
5'-A ATC AAC CCA CAG CTG AAA AAA CCC ACC TCG A T A TGC TAT GTG GAC-3' (서열번호 17) |
CN-G |
5'-A ATC AAC CCA CAG CTG AAA AAA CCC ACC TCG A G A TGC TAT GTG GAC-3' (서열번호 18) |
CN-C |
5'-A ATC AAC CCA CAG CTG AAA AAA CCC ACC TCG A C A TGC TAT GTG GAC-3' (서열번호 19) |
Cy3-DNA |
5'-cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 7) |
표적 |
경쟁반응용
|
서열 |
설명 |
9A |
5'-AAA AAA AAA GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 8) |
프로브 |
9T |
5'-TTT TTT TTT GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 9) |
9C |
5'-CCC CCC CCC GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 10) |
9G |
5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 4) |
9G-1 |
5'-GGG GGG GGG AAA TCG CAC GTC TGT AGG-3' (서열번호 11) |
Cy3-DNA |
5'-cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 7) |
표적 |
최고밀도 실험용
|
서열 |
설명 |
9G |
5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 4) |
프로브 |
Cy3-DNA |
5'-cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 7) |
표적 |
경쟁반응용 용액 조성 (ul)
|
1:0 |
1:1 |
1:2 |
1:4 |
9G-1 (100pmol/ul) |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
9A, 9T, 9C, 9G 각각 |
0 |
1.5 |
3.0 |
6.0 |
2M NH4Cl |
30 |
30 |
30 |
30 |
90% 글리세롤 |
17 |
17 |
17 |
17 |
증류수 |
51.5 |
50 |
48.5 |
45.5 |
총계 |
100 ul |
100 ul |
100 ul |
100 ul |
실시예 11
도 5의 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 다중분자인식에 의해 비가역적으로 고정화되는 구아닌 염기 최적개수 판별
- 다중분자인식에 의한 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 올리고유전자의 고정화
아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 다중분자인식에 적합한 구아닌 개수의 결정을 위해 사용되는 샘플용액 및 농도 조성 등은 표 1 과 같다. 먼저 올리고유전자의 고정화를 위하여 준비된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 하기 표 2의 1G, 4G, 7G, 9G, 12G, 15G개의 연속된 구아닌 염기를 가진 각각의 올리고유전자(100pmol/ul) 10ul 와 BMT 스폿팅 용액3 148ul 의 혼합용액을 마이크로어레이어(microarrayer)(Genetix Qarray2)를 이용하여 1-5nl씩 도포하여 직경이 150-180um 의 크기로 상온에서 시간별로 1시간, 2시간, 4시간 동안 각각을 고정화용 챔버에서 고정화 하였다. 고정화 후에 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층은 여분의 올리고유전자를 제거하기 위하여 BMT Wa-A-1 (2xSSC, 0.1% SDS)으로 상온에서 1분 동안 세척한 후 BMT Wa-A-2 (0.1x SSC)로 세척하여 BMT 블록킹 용액 (밀크카제인 5% 수용액)으로 상온에서 30분 동안 블로킹(blocking) 하였다. 처리된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층은 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)으로 상온에서 3분 동안 세척하여 준 후 BMT Wa-A-2 (0.1x SSC) 씻기병으로 세척하고 건조하였다.
- 형광이 부착된 DNA(Cy3-DNA)와의 교잡반응
올리고유전자의 고정화 후에 건조된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층은 형광이 부착된 Cy3-DNA와 교잡반응을 위해 먼저 교잡반응용 챔버를 단분자층위에 부착한 후에, 표 2에 명시되어 있는 Cy3-DNA(5nmol/ml) 2ul를 BMT hyb-mixA (4xSSC, 0.002% SDS, 50% 글리세롤, 1x PBS) 58ul 와 혼합하여 100 ℃ 물에서 3분간 가열하고, 얼음 위에서 3분간 방치한 후 마이크로피펫을 이용하여 60ul씩 도포한 후 습도가 유지되는 항온 인큐베이터에서 50℃로 30분 동안 교잡반응시켰다. 교잡반응 후 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층의 세척을 위해 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)으로 30℃ 에서 2분 동안 세척해 준 후, BMT Wa-B-2 (4xSSC)으로 상온에서 2분간 세척을 2회 반복하여 건조시켜 형광스캐너(GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 나타나는 형광 감도를 분석하였다. 실제 결과는 도 5와 같다. 상기결과는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 다중분자인식으로 올리고유전자가 고정화될 때 최소 7개 이상의 구아닌 염기가 필요하며 9개의 구아닌 염기가 가장 고밀도로 고정화되는 것을 보여주는 결과이다.
실시예 12
도 7 및 도 8의 최적의 공간배열에 의한 단일염기변이 (SNP; Single Nucleotide Polymorphism) 차별화 확인 실험
- 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에서의 SNP 확인
아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에서의 SNP 확인을 위한 실험은 먼저 올리고유전자의 고정화를 위하여 준비된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 표 4의 염기서열이 같은 위치에서 하나씩만 다른 각각의 올리고유전자(100pmol/ul) 9.1ul와 BMT 스폿팅 용액 1을 35.9ul로 혼합한 혼합용액을 마이크로어레이어(Genetix Qarray2)를 이용하여 1-5nl씩 150-180um의 크기로 도포한 후에 상온에서 3시간 동안 고정화용 챔버에서 고정화하였다. 고정화 후에 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층은 여분의 올리고유전자를 제거하기 위하여 BMT Wa-A-1 (2xSSC, 0.1% SDS)으로 상온에서 1분 동안 세척한 후, BMT Wa-A-2 (0.1x SSC)로 세척하여 BMT 블록킹 용액 (밀크카제인 5% 수용액)으로 상온에서 30분 동안 블로킹하였다. 처리된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층은 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)으로 상온에서 3분 동안 세척하여 준 후 BMT Wa-A-2 (0.1x SSC) 씻기병으로 세척하여 준 후 건조하였다.
- 형광이 부착된 DNA(Cy3-DNA)를 검출하기 위한 C-DNA와의 교잡반응
교잡반응을 위해 먼저 교잡반응용 챔버를 단분자층 위에 부착한 후에 표 4에 명시되어 있는 각각의 C-DNA(5nmol/ul) 2ul 를 BMT hyb-mixA (4xSSC, 0.002% SDS, 50% 글리세롤, 1x PBS) 28ul 와 혼합하여 100 ℃ 물에서 가열하고 얼음에서 3분간 방치하여 식힌 후, 마이크로피펫을 이용하여 30ul 씩 도포해준 뒤 55℃ 항온 인큐베이터에서 30분 동안 교잡반응시켰다. 교잡반응 후 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층의 세척을 위해 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)으로 30℃ 에서 2분 동안 세척해준 후, BMT Wa-B-2 (4xSSC)으로 상온에서 2분간 세척을 2회 반복하여 건조하여 형광이 부착된 DNA(Cy3-DNA)와 교잡반응이 가능한 올리고유전자 단분자층을 준비하였다.
- C-DNA와 형광이 부착된 Cy3-DNA와의 교잡반응
C-DNA와의 교잡반응을 마친 단분자층위에 형광이 부착된 Cy3-DNA와 교잡반응을 위해 먼저 교잡반응용 챔버를 부착한 후에 표 4의 Cy3-DNA(5nmol/ml) 2ul를 BMT hyb-mixA (4xSSC, 0.002% SDS, 50% 글리세롤, 1x PBS) 28ul 와 혼합하여 100 ℃ 물에서 3분간 가열한 후 얼음에서 3분간 방치하여 식힌 후 마이크로피펫을 이용하여 30ul씩 도포해준 후 항습 인큐베이터에서 45℃로 30분 동안 교잡반응시켰다. 교잡반응 후 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층의 세척을 위해 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)으로 30℃ 에서 2분 동안 세척해준 후, BMT Wa-B-2 (4xSSC)으로 상온에서 2분간 세척을 2회 반복하여 건조시켜 형광스캐너(GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 SNP차별화 여부를 형광감도로 확인하였다. 결과는 도 7 및 도 8과 같이 나타났으며 하나의 차이가 있는 어떤 올리고유전자가 고정화된 곳에도 교잡반응에서 다른 유전자는 결합되지 않는다는 결과를 보여주어, 본 발명에서 개발된 기술이 고정화되는 올리고유전자를 적절한 수준의 공간을 확보하며 배열되어 최적의 올리고유전자간 공간배열에 의해 신속하고 정확하게 SNP 차별화를 구현할 수 있다는 결과를 보여준다.
실시예 13
도 3 및 도 4의 최고밀도 고정화 실험
- 올리고유전자 고정화
아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 올리고유전자를 고정화하는 방법은 먼저 올리고유전자의 고정화를 위하여 준비된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 표 5의 올리고유전자(100pmol/ul) 9.1ul 와 BMT 스폿팅 용액1 35.9ul의 혼합용액을 마이크로어레이어(Genetix Qarray2)를 이용하여 1-5nl씩 도포한 후에 상온에서 3시간 동안 고정화용 챔버에서 고정화 하였다. 고정화 후에 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층은 여분의 올리고유전자를 제거하기 위하여 BMT Wa-A-1 (2xSSC, 0.1% SDS)으로 상온에서 1분 동안 세척한 후, BMT Wa-A-2 (0.1x SSC)로 세척하여 BMT 블록킹 용액 (밀크카제인 5% 수용액)으로 상온에서 30분 동안 블로킹 해준다. 처리된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층은 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)으로 상온에서 3분 동안 세척하여 준 후 BMT Wa-A-2 (0.1x SSC) 씻기병으로 세척하여 준 후 건조하였다.
- 형광이 부착된 Cy3-DNA와의 교잡반응
형광이 부착된 Cy3-DNA와 교잡반응을 위해 먼저 교잡반응용 챔버를 부착한 후에 표 5의 Cy3-DNA(5nmol/ml) 2ul를 BMT hyb-mixA (4xSSC, 0.002% SDS, 50% 글리세롤, 1x PBS) 28ul 와 혼합하여 100 ℃ 물에서 가열하고 얼음에서 3분간 방치하여 식힌 후 마이크로피펫을 이용하여 30ul씩 도포해준 후 50℃ 인큐베이터에서 30분 동안 교잡반응 시켰다. 교잡반응 후 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층의 세척을 위해 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)으로 30℃ 에서 2분 동안 세척해준 후, BMT Wa-B-2 (4xSSC)으로 상온에서 2분간 세척을 2회 반복하여 건조시켜 형광스캐너를 이용하여 나타나는 형광감도를 확인하여 이론적인 형광 감도와 비교 분석하였다.
- 형광부착된 c-DNA의 양을 칩기판에 건조시켜 이론적 최대치 양과 비교분석
아미노캘릭스아렌 유도체 위에서 표 5의 형광이 부착된 Cy3-DNA를 이론적 최대치의 1/2 (0.675fmol/nl) 1-5nl 를 마이크로어레이어(Genetix Qarray2)를 이용하여 도포한 후에 건조한 후에 형광 스캐너를 이용하여 분석하였다. 이론적 형광감도와 실험적 형광 감도를 비교한 결과는 도 3 및 도 4에 나타나 있으며 이론적 최대치의 1/2 수준의 형광부착된 Cy3-DNA를 이용한 결과가 교잡반응을 통해 고정화된 올리고유전자에서 나타나는 결과와 동일하게 나타나서 이론적 최대치에 가까운 수준의 올리고유전자가 고정화 되어 있음을 보여주는 결과이다.
실시예 14
도 9의 9A, 9T, 9G, 9C-DNA와의 경쟁반응을 이용한 9개의 구아닌 염기만의 비가역적 고정화 확인 실험
경쟁반응을 위한 올리고유전자의 준비는 표 7과 같은 조성으로 준비하였다. 이때 경쟁반응에 사용된 다른 DNA는 표 6에 명시되어 있으며 농도는 0배, 1배, 2배, 4배로 포함되도록 하였다. 올리고유전자의 고정화는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 표 7과 같은 방법으로 제조된 각각의 올리고유전자 혼합용액을 마이크로피펫으로 1ul씩 2mm 크기로 스폿팅(spotting) 하고 상온에서 1시간 동안 고정화용 챔버에서 고정화하였다. 고정화 후에 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층은 여분의 올리고유전자를 제거하기 위하여 BMT Wa-A-1 (2xSSC, 0.1% SDS)으로 상온에서 1분 동안 세척한 후, BMT Wa-A-2 (0.1x SSC)로 세척하여 BMT 블록킹 용액 (밀크카제인 5% 수용액)으로 상온에서 30분 동안 블로킹해 준다. 처리된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층은 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)으로 상온에서 3분 동안 세척하여 준 후 BMT Wa-A-2 (0.1x SSC) 씻기병으로 세척하여 준 후 건조하였다.
-형광이 부착된 Cy3-DNA 와의 교잡반응
형광이 부착된 Cy3-DNA와 교잡반응을 위해 먼저 교잡반응용 챔버를 부착한 후에 표 6의 Cy3-DNA(10nmol/ml) 10ul를 BMT hyb-mixA (4xSSC, 0.002% SDS, 50% 글리세롤, 1x PBS) 590ul 와 혼합하여 마이크로피펫을 이용하여 600ul씩 도포해준 후 50 ℃ 인큐베이터에서 30분 동안 교잡반응 시켰다. 교잡반응 후 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층의 세척을 위해 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)으로 30℃ 에서 2분 동안 세척해준 후, BMT Wa-B-2 (4xSSC)으로 상온에서 2분간 세척을 2회 반복하여 건조시켜 형광스캐너(GSI)를 이용하여 나타나는 형광감도를 확인하였다. 상기결과는 도 9에 나타나 있으며, 이 결과는 9개의 구아닌만이 비가역적인 다중분자인식에 의해서 고정화되며 실제로 다른 염기들은 연속되던 되지 않던 고정화에 큰 영향을 미치지 않음을 보여주는 결과이다. 이 결과는 교잡반응에 이용되어야 할 염기들이 고정화에 참여하지 않고 연속된 특정염기서열만이 고정화에 참여하여 교잡반응에 필수적인 염기가 항상 일정한 수를 유지하고 재현성 있는 교잡반응 결과를 얻을 수 있는 올리고유전자 칩 제조기술을 보여주는 실제 실험 결과이다.