CN106244703A - 基于粘性末端‑介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测udg活性的方法 - Google Patents

基于粘性末端‑介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测udg活性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106244703A
CN106244703A CN201610729173.6A CN201610729173A CN106244703A CN 106244703 A CN106244703 A CN 106244703A CN 201610729173 A CN201610729173 A CN 201610729173A CN 106244703 A CN106244703 A CN 106244703A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
udg
activity
hairpin
signal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610729173.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106244703B (zh
Inventor
姜玮
王磊
吴玉姝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN201610729173.6A priority Critical patent/CN106244703B/zh
Publication of CN106244703A publication Critical patent/CN106244703A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106244703B publication Critical patent/CN106244703B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于粘性末端‑介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测UDG活性的方法，当UDG存在时，单链DNA探针中的两个U碱基被移除，得到含有AP错配的单链DNA探针。基于TSDR对少量错配的特异性识别能力，上述含AP错配的单链DNA探针将不能与含粘性末端的发夹探针发生TSDR，从而使单链DNA探针中的引物序列仍能自由存在。随后，该引物序列与信号报道探针发生杂交，进而引发后续的聚合切刻等温扩增反应，实现了对少量U碱基移除的灵敏响应，提高了检测UDG活性的灵敏度。然而，当UDG不存在时，单链DNA探针能与含粘性末端的发夹探针发生TSDR，导致引物序列被封闭，从而不能引发后续的等温扩增反应，降低了阴性信号。本方法能检测低至0.000027U/mL的UDG活性。

Description

基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技 术检测UDG活性的方法
技术领域
本发明涉及一种基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测UDG活性的方法。
背景技术
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)能对DNA中的尿嘧啶(U)损伤进行特异地识别和移除，进而引发U损伤的碱基移除修复过程(Stivers，J.T.；Jiang，Y.L.，A mechanisticperspective on the chemistry of DNA repair glycosylases.Chem.Rev.，2003，103，2729-2759；Parikh，S.S.；Walcher，G.；Jones，G.D.；Slupphaug，G.；Krokan，H.E.；Blackburn，G.M.；Tainer，J.A.，Uracil-DNA glycosylase-DNA substrate and productstructures：conformational strain promotes catalytic efficiency by coupledstereoelectronic effects.PNAS.，2000，97，5083-5088.)。人体中，每天每个细胞的基因组中会出现数百个U损伤，它们一部分来自于胞嘧啶(C)的自发水解脱氨作用，另一部分来自于DNA复制过程中三磷酸脱氧尿苷酸(dUTP)的错误掺入(Sousa，M.M.；Krokan，H.E.；Slupphaug，G.，DNA-uracil and human pathology.Mol.Aspects Med.，2007，28，276-306；Kavli，B.；Sundheim,O.；Akbari，M.；Otterlei，M.；Nilsen，H.；Skorpen,F.；Aas，P.A.；Hagen，L.；Krokan，H.E.；Slupphaug，G.，hUNG2 is the major repair enzyme forremoval of uracil from U：A matches，U：G mismatches，and U in single-strandedDNA，with hSMUG1 as a broad specificity backup.J.Biol.Chem.，2002，277,39926-39936.)。异常活性的UDG将不能对这些U损伤进行修复，从而引起基因突变，干扰基因组的完整性，导致相关疾病的发生(Bulgar，A.D.；Weeks，L.D.；Miao，Y.；Yang，S.；Xu，Y.；Guo，C.；Markowitz,S.；Oleinick，N.；Gerson，S.L.；Liu,L.，Cell Death Dis.，2012，3，e252.)。因此，灵敏检测UDG的活性能为功能研究和临床诊断提供一种有价值的策略。
目前检测UDG活性的常用方法需要放射性的标记或耗时的电泳过程(Ischenko，A.A.；Saparbaev，M.K.，Alternative nucleotide incision repair pathway foroxidative DNA damage.Nature，2002，415，183-187.)。为了实现安全且快速地检测UDG的活性，一些新型的生物传感方法已被发展，包括电化学生物传感法(McWilliams，M.A.；Anka，F.H.；Balkus，K.J.；Slinker，J.D.，Sensitive and selective real-timeelectrochemical monitoring of DNA repair.Biosens，Bioelectron.，2014，54，541-546.)、比色生物传感法(Liu，X.J.；Chen，M.Q.；Hou，T.；Wang，X.Z.；Liu，S.F.；Li，F.，Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity basedon nicking enzyme assisted signal amplification.Biosens，Bioelectron.，2014，54，598-602.；Nie，H.；Wang，W.；Li，W.；Nie，Z.；Yao，S.，A colorimetric and smartphonereadable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex.Analyst，2015，140，2771-2777.)以及荧光生物传感法(Liu，B.；Yang,X.；Wang，K.；Tan,W.；Li，H.；Tang，H.，Real-time monitoring ofuracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energytransfer probes.Anal.Biochem.，2007，366，237-243.)。其中，荧光生物传感法已被广泛用于检测UDG的活性。为了进一步提高检测的灵敏度，信号扩增技术已被用于荧光生物传感方法的构建中。Yu课题组(Zhang，L.L.；Zhao，J.J.；Jiang，J.H.；Yu，R.Q.，A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of baseexcision repair enzyme activity.Chem.Commun.，2012,48,8820-8822.)设计了一种含有多个U碱基的双链DNA探针，当UDG将该双链DNA探针中的多个U碱基移除之后，双链DNA发生解离并释放出DNA酶序列，从而引发DNA酶的自催化信号扩增过程。
申请号为CN201510061929.X的专利公开了一种基于DNA机器的荧光信号扩增方法用于UDG的活性检测，其中DNA机器的引发部分也是一种含有多个U碱基的双链DNA探针，并且只有当该双链DNA探针中的多个U碱基都被UDG移除之后，它才能释放出引物序列来引发DNA机器的运行。在这些信号扩增型的荧光生物传感方法中，它们通过直接杂交模式将信号探针或引物序列封闭在双链DNA中，并把这种含多个U碱基的双链DNA作为UDG的识别探针。然而，当低活性的UDG只能移除探针中的1个或2个U碱基而产生少量无嘌呤/无嘧啶位点(AP)位点时，由于AP位点也是一种错配类型，而直接杂交模式难以辨别少量错配，因此信号探针或引物序列此时仍被封闭在双链DNA中，导致响应减弱，限制了灵敏度的提高。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种检测UDG活性的探针，目的之二是提供一种基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测UDG活性的方法，目的之三是提供一种检测UDG活性的试剂盒。
具体技术方案如下：
一种检测UDG活性的探针，包括单链DNA识别探针UP、发夹探针TP以及信号报道探针RP；
所述单链DNA识别探针包括：引物序列、1个或两个连续的U碱基，所述两个连续的U碱基在单链DNA的端部；
所述发夹探针TP包括，粘性末端、与识别探针UP完全互补的颈部碱基序列；
所述信号报道探针RP，是一种发夹结构，3’端含有悬垂的序列，所述悬垂序列能够与识别探针UP序列杂交，颈部含有G4DNA的互补序列和切刻酶Nt.BstNBI的识别序列。
一种检测UDG活性的方法，基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术，步骤如下：
(1)将发夹探针TP以及信号报道探针RP加热变性降温后备用；
(2)对UDG的识别反应：将识别探针UP与待测的UDG加入到1×ThermoPol缓冲溶液中进行孵育反应，；
(3)TSDR对产物AP错配的特异性识别：向步骤(2)的反应产物中加入发夹探针TP和10×ThermoPol缓冲溶液进行孵育反应；
(4)聚合切刻等温扩增反应：向步骤(3)反应产物中加入1×ThermoPol缓冲溶液，NEB buffer 3，dNTPs，信号报道探针RP，Vent(exo-)DNA聚合酶以及Nt.BstNBI切刻酶混合反应；
(5)向步骤(4)反应产物中加入KCl溶液，NMM溶液，混合反应，对反应产物进行荧光测定，构建荧光强度与UDG浓度之间的线性曲线，对某一样品通过测定样品的荧光强度，代入线性曲线，计算UDG浓度；
所述识别探针UP、发夹探针TP、信号报道探针RP同上所述。
一种基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测UDG活性的方法，步骤如下：
(1)将含有粘性末端的发夹探针TP以及信号报道探针RP加热变性(优选：置于90℃的条件下加热变性5min)，待温度缓慢降至室温，将所得产物保存备用(优选：置于4℃的条件下保存备用)；
(2)将100nM-500nM识别探针UP与待测的UDG加入到1×ThermoPol缓冲溶液(20mMTris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)中，得到混合溶液，并将该溶液混匀后孵育反应(优选：37℃的条件下孵育20min-60min)，以完成对UDG的识别反应；
(3)向步骤(2)的反应产物中加入150nM-1.80μM发夹探针TP和10×ThermoPol缓冲溶液(200mM Tris-HCl，pH 8.8，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，1％TritonX-100)，得到混合溶液，并将该溶液下孵育反应(优选：37℃的条件下反应30min-120min)，以完成TSDR对产物AP错配的特异性识别；
(4)向步骤(3)反应产物中加入1×ThermoPol缓冲溶液，NEB buffer 3，0.05mM-0.50mM的dNTPs，150nM-375nM的信号报道探针RP，0.02U/μL-0.20U/μL的Vent(exo-)DNA聚合酶以及0.05U/μL-0.50U/μL的Nt.BstNBI切刻酶，得到混合溶液，混匀后反应(优选：混匀后将其置于55℃的条件下反应30min-100min)，以进行聚合切刻等温扩增反应；
(5)向步骤(4)反应产物中加入160mM的KCl，1.00μM-10.0μM的NMM至终体积为60μL，并将该混合物反应(优选：37℃条件下孵育10min-60min)，对反应产物进行荧光测定，构建荧光强度与UDG浓度之间的线性曲线，对某一样品通过测定样品的荧光强度，代入线性曲线，计算UDG浓度。
一种检测UDG活性的试剂盒，包括上述的单链DNA识别探针UP、发夹探针TP以及信号报道探针RP。所述的试剂盒，还包括1×ThermoPol缓冲溶液、10×ThermoPol缓冲溶液、NEB buffer 3、Vent(exo-)DNA聚合酶、Nt.BstNBI切刻酶。
上述方法和探针在检测HELA细胞裂解液中的UDG活性中的应用。
基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增方法对UDG活性进行检测的原理：
以TSDR来对少量U碱基的移除进行响应，并结合聚合切刻等温扩增技术，发展了一种荧光信号扩增方法用于灵敏检测UDG的活性，具体的设计原理如图1所示。识别探针UP是一条单链DNA，它含有引物序列和两个U碱基。发夹探针TP的3’端含有粘性末端序列，并且该粘性末端以及与之相连的颈部的序列能与识别探针UP完全互补。另外，信号报道探针RP也是一种发夹结构，它的3’端含有悬垂的序列，颈部含有G4 DNA的互补序列，并且环部还含有切刻酶Nt.BstNBI的识别序列。在UDG的作用下，识别探针UP中的两个U碱基被移出，从而生成一条含有两个AP位点的UP’探针。由于AP错配能抑制UP’与TP中粘性末端的杂交，因此TSDR将不会发生，从而使得单链探针UP’中的引物序列仍能自由存在。随后，该引物序列能与信号报道探针RP中的悬垂序列发生杂交，并在聚合酶Vent(exo-)的作用下引发链延伸反应，得到DNA双链结构。接着，Nt.BstNBI识别并切刻双链DNA中完整的识别位点，产生的切口又能作为聚合酶作用的新位点，进而继续引发链延伸反应。通过循环的聚合-切刻-置换反应，系统释放出大量的G4序列，它们在单价阳离子的存在下能折叠成G4结构，并与NMM发生特异性地结合，产生增强的荧光信号。然而，当UDG不存在时，单链探针UP能与发夹探针TP中的粘性末端发生杂交，进而引发TSDR，导致探针UP中的引物序列被封闭，从而不能引发后续的等温扩增反应。本方法能通过TSDR来对少量U碱基的移除进行响应，并结合聚合切刻等温扩增技术，以实现对UDG活性的灵敏检测。
本发明的有益效果：
本发明以TSDR来对少量U碱基的移除进行响应，并结合聚合切刻等温扩增技术，构建了一种荧光信号扩增方法用于灵敏检测UDG的活性。在本方法中，分别设计了单链DNA识别探针、含有粘性末端的发夹探针以及信号报道探针。当UDG存在时，单链DNA探针中的两个U碱基被移除，得到含有AP错配的单链DNA探针。基于TSDR对少量错配的特异性识别能力，上述含AP错配的单链DNA探针将不能与含粘性末端的发夹探针发生TSDR，从而使单链DNA探针中的引物序列仍能自由存在。随后，该引物序列与信号报道探针发生杂交，进而引发后续的聚合切刻等温扩增反应，实现了对少量U碱基移除的灵敏响应，提高了检测UDG活性的灵敏度。然而，当UDG不存在时，单链DNA探针能与含粘性末端的发夹探针发生TSDR，导致引物序列被封闭，从而不能引发后续的等温扩增反应，降低了阴性信号。本方法能检测低至0.000027U/mL的UDG活性。
附图说明
图1为本发明方法检测UDG活性的原理图；
图2为在不同条件下，传感系统的荧光发射光谱：a：UP+UDG+TP+RP，b：UP+TP+RP，c：UDG+TP+RP，d：UP+UDG+TP；
图3ΔF相对于UDG浓度的标准曲线，内插图为传感系统对低浓度UDG活性的线性响应，误差棒为三次平行实验结果的标准偏差；
图4在不同条件下，考察传感系统的特异性：(1)不含UDG的对照实验，(2)UDG，(3)混合样品(UDG，hOGG1，hAAG和DNase I)，(4)hOGG1，(5)hAAG，(6)DNase I，各酶的浓度均为1.0U/mL。误差棒为三次平行实验结果的标准偏差；
图5传感系统对HeLa细胞裂解液的荧光光谱响应以及UGI对HeLa细胞裂解液中UDG活性的抑制效果。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所用到的实验试剂和仪器如下：
本发明使用的DNA寡核苷酸是由生工(中国，上海)合成和纯化的，(TP探针：TGGCGGAGGCAGGAGTTTTTTTTTTTCTCCTGCCTCCGCCAAATTGT；UP探针：ACAAUUTGGCGGAGGCAGGAG；RP探针：CCCAACCCGCCCTACCCTTTTTGACTCGTAGGGCGGCTCCTGCCTCCGCCA)，其中斜体代表悬垂序列，标灰字母代表尿嘧啶脱氧核糖核苷酸。UDG，8-氧化鸟嘌呤DNA糖化酶(hOGG1)，烷基化腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)，DNA酶I(DNase I)，尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)，Vent(exo-)DNA聚合酶，Nt.BstNBI切刻酶都是购于New England Biolabs(中国，北京)。一单位的UDG是指在1min内催化水解双链DNA中60pmol的U碱基所需要的酶量。一单位的UGI是指在体积为50μL的反应体系中1h内抑制一个单位的UDG所需要的蛋白量。三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)购于Fermentas(中国，北京)。NMM购于Frontier Scientific(美国，犹他州，罗根)。二甲基亚砜(DMSO)是从生工(中国，上海)购得的。所有其它的化学药品都是分析纯的。制备溶液时用到的超纯水都是来自Millipore Milli-Q水净化系统(>18.25MΩ·cm)。
所有的荧光测试都是在日立F-7000荧光分光光度计(日本，日立公司)上进行的。激发波长为399nm，收集的发射波长的范围是560nm-700nm。我们利用618nm处的荧光强度来评价本方法的分析性能。激发狭缝宽度和发射狭缝宽度都被设置为10nm，光电倍增管电压被设置为700V。
实施例1检测UDG的活性
为了得到相应的发夹结构，分别将含有粘性末端的发夹探针TP以及信号报道探针RP置于90℃的条件下加热变性5min，待温度缓慢降至室温，将所得产物置于4℃的条件下保存备用。将100nM-500nM识别探针UP与不同浓度的UDG加入到1×ThermoPol缓冲溶液(20mMTris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)中，得到终体积为20μL的混合溶液，并将该溶液混匀后置于37℃的条件下孵育20min-60min，以完成对UDG的识别反应。接着，向上述反应产物中加入150nM-1.80μM的发夹探针TP和1.0μL 10×ThermoPol缓冲溶液(200mM Tris-HCl，pH 8.8，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，1％TritonX-100)，得到终体积为30μL的混合溶液，并将该溶液置于37℃的条件下反应30min-120min，以完成TSDR对产物AP错配的特异性识别。随后，向上述反应产物中加入1×ThermoPol缓冲溶液，NEB buffer 3，0.05mM-0.50mM的dNTPs，150nM-375nM的信号报道探针RP，0.02U/μL-0.20U/μL的Vent(exo-)DNA聚合酶以及0.05U/μL-0.50U/μL的Nt.BstNBI切刻酶，得到混合溶液的终体积为50μL，混匀后将其置于55℃的条件下反应30min-100min，以进行聚合切刻等温扩增反应。最后，向上述反应产物中加入160mM的KCl，1.00μM-10.0μM的NMM至终体积为60μL，并将该混合物置于37℃条件下孵育10min-60min。
实施例2本发明方法检测Hela细胞裂解液中的UDG活性
制备Hela细胞裂解液：Hela细胞样品通过离心分离(5min，3000rpm，4℃)而被压成丸状，并在冰上通过超声波仪而重新分散在裂解缓冲液(10mM Tris-Hcl,pH 7.0)中。混合溶液随后在4℃下以12,000rpm的速度进行离心分离30min以移除不可溶的物质。收集上清液并通过0.45μm的滤膜过滤，产生粗制的Hela细胞裂解液。
将1.0μL的HeLa细胞裂解液作为待测样品，其中该HeLa细胞裂解液的浓度为每1.0μL细胞裂解液中含1.0×104个细胞。如图5所示，缓冲溶液仅能引起非常低的荧光信号，而HeLa细胞裂解液则能引起明显增强的荧光信号。另外，当向含有HeLa细胞裂解液的系统中加入UDG的抑制剂UGI之后，传感系统的荧光强度仅与缓冲溶液的相当。这表明，传感系统荧光信号的增强是由HeLa细胞裂解液中的UDG引起的。并且，本方法对细胞裂解液中其它组分的干扰具有耐受性。
实施例3对UDG活性进行检测的可行性验证
利用荧光发射光谱验证了本方法用于检测UDG活性的可行性。如图2中的曲线d所示，当传感系统中不含信号报道探针RP时，传感系统表现出非常低的荧光信号。这表明荧光信号的产生离不开探针RP的存在。如图2中的曲线c所示，当系统中不含识别探针UP时，传感系统的荧光信号也非常低。这表明在本方法中，传感系统对UDG的识别离不开UP探针的参与。如图2中的曲线b所示，当UDG不存在时，传感系统仍表现出非常低的荧光信号。这是由于探针UP能够与发夹探针TP发生TSDR，使探针UP中的引物序列被封闭，导致后续的信号扩增及产生过程不能进行。如图2中的曲线a所示，当UDG存在时，传感系统则表现出明显增强的荧光信号。这表明当UDG存在时，探针UP中的U碱基被移除而形成含有AP错配的UP’探针，其中AP错配将抑制UP’与TP探针之间发生TSDR，这使得UP’探针中的引物序列仍能自由存在，该引物序列能引发随后的信号扩增及产生过程。上述结果验证了本方法用于检测UDG活性的可行性。
实施例4检测UDG的活性
为了定量检测UDG的活性，在最优反应条件下对不同浓度的UDG活性进行了检测。图3展示了传感系统的净信号强度ΔF与UDG浓度的标准曲线，并且内插图显示出本方法对UDG活性的线性检测范围是从0.00020U/mL到0.0080U/mL，线性回归方程为ΔF＝30.13+9.936×104CUDG，R2＝0.9993。根据3δ原则，本方法对UDG活性的检测限为0.000027U/mL的，这低于目前文献报道的检测限。
实施例5本发明方法在检测UDG的活性时的精密度和重现性
另外，研究了本方法检测UDG活性的精密度和重现性。为了考察本方法的精密度，在同一天内，对目标样品进行了一系列的三次平行测定。对于UDG浓度分别为0.001U/mL，0.004U/mL和0.006U/mL的样品，得到的相对标准偏差(RSD)分别为4.1％，3.7％和3.1％。另外，为了考察本方法的重现性，在三个不同的日子里，对目标样品进行了一系列的三次平行测定。对于含不同浓度(0.001U/mL，0.004U/mL和0.006U/mL)UDG的样品，RSD值分别为5.8％，5.9％和5.5％。这些结果表明本方法在检测UDG的活性时具有合格的精密度和重现性。
实施例6本发明本方法在检测UDG的活性时的特异性
为了考察本方法的特异性，研究了传感系统对UDG以及其他酶(包括hOGG1，hAAG和DNase I)的荧光响应，结果见图4。只有UDG能引起明显增强的荧光信号，而hOGG1，hAAG和DNase I均不能引起荧光信号的增强。另外，当UDG与hOGG1，hAAG和DNase I混合之后，混合物中的UDG仍能引起荧光信号的增强，并且此时的信号强度与UDG单独存在时引起的信号强度相当。这表明本方法能特异性地检测UDG的活性。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种检测UDG活性的探针，包括单链DNA识别探针UP、发夹探针TP以及信号报道探针RP；
所述单链DNA识别探针包括：引物序列、1个或两个连续的U碱基，所述两个连续的U碱基在单链DNA的端部；
所述发夹探针TP包括，粘性末端、与识别探针UP完全互补的颈部碱基序列；
所述信号报道探针RP，是一种发夹结构，3’端含有悬垂的序列，所述悬垂序列能够与识别探针UP序列杂交，颈部含有G4DNA的互补序列和切刻酶Nt.BstNBI的识别序列。
2.一种检测UDG活性的方法，基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术，其特征是：步骤如下：
(1)将发夹探针TP以及信号报道探针RP加热变性降温后备用；
(2)对UDG的识别反应：将识别探针UP与待测的UDG加入到1×ThermoPol缓冲溶液中进行孵育反应，；
(3)TSDR对产物AP错配的特异性识别：向步骤(2)的反应产物中加入发夹探针TP和10×ThermoPol缓冲溶液进行孵育反应；
(4)聚合切刻等温扩增反应：向步骤(3)反应产物中加入1×ThermoPol缓冲溶液，NEBbuffer 3，dNTPs，信号报道探针RP，Vent(exo-)DNA聚合酶以及Nt.BstNBI切刻酶混合反应；
(5)向步骤(4)反应产物中加入KCl溶液，NMM溶液，混合反应，对反应产物进行荧光测定，构建荧光强度与UDG浓度之间的线性曲线，对某一样品通过测定样品的荧光强度，代入线性曲线，计算UDG浓度；
所述识别探针UP、发夹探针TP、信号报道探针RP同权利要求1中所述。
3.如权利要求2所述方法，其特征是：所述步骤(1)中加热变性具体为置于90℃的条件下加热变性5min。
4.如权利要求2所述方法，其特征是：所述步骤(2)中1×ThermoPol缓冲溶液为20mMTris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100。
5.如权利要求2所述方法，其特征是：所述步骤(3)中10×ThermoPol缓冲溶液为200mMTris-HCl，pH 8.8，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，1％TritonX-100。
6.如权利要求2所述方法，其特征是：所述步骤(4)中混合反应为混匀后置于55℃的条件下反应30min-100min。
7.如权利要求2所述方法，其特征是：所述步骤(5)中混合反应为37℃条件下孵育10min-60min。
8.一种检测UDG活性的试剂盒，其特征是：包括如权利要求1所述的单链DNA识别探针UP、发夹探针TP以及信号报道探针RP。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征是：还包括1×ThermoPol缓冲溶液、10×ThermoPol缓冲溶液、NEB buffer 3、Vent(exo-)DNA聚合酶、Nt.BstNBI切刻酶。
10.权利要求1所述的探针，权利要求2-7所述的方法在检测HELA细胞裂解液中的UDG活性中的应用。
CN201610729173.6A 2016-08-26 2016-08-26 基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测udg活性的方法 Active CN106244703B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610729173.6A CN106244703B (zh) 2016-08-26 2016-08-26 基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测udg活性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610729173.6A CN106244703B (zh) 2016-08-26 2016-08-26 基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测udg活性的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106244703A true CN106244703A (zh) 2016-12-21
CN106244703B CN106244703B (zh) 2019-12-13

Family

ID=57596259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610729173.6A Active CN106244703B (zh) 2016-08-26 2016-08-26 基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测udg活性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106244703B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106929563A (zh) * 2017-02-24 2017-07-07 山东师范大学 基于切除修复由酶介导的两步串联信号放大检测udg活性的方法
CN106947811A (zh) * 2017-03-17 2017-07-14 中国科学技术大学 一种检测miRNAs‑21的方法、探针组及试剂盒
CN106995840A (zh) * 2017-03-20 2017-08-01 山东师范大学 一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法
CN107083437A (zh) * 2017-06-09 2017-08-22 山东师范大学 一种利用固有荧光核苷酸超灵敏同时检测多种dna糖基化酶的方法
CN107119031A (zh) * 2017-06-21 2017-09-01 南京大学 一种新型嗜热四元g四链体dna酶
CN107254550A (zh) * 2017-05-25 2017-10-17 重庆医科大学 一种检测hiv相关基因的spr传感器及其制备与应用
CN108613934A (zh) * 2018-03-19 2018-10-02 安徽师范大学 一种dna传感器及其制备方法、一种检测短链dna的方法
CN114606293A (zh) * 2020-12-09 2022-06-10 重庆医科大学 一种基于双链核酸靶标的高特异性核酸杂交方法
CN114672542A (zh) * 2022-03-28 2022-06-28 中南大学 一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104313133A (zh) * 2014-09-28 2015-01-28 南京诺唯赞生物科技有限公司 一种核酸内切酶ⅷ活性测定方法
KR20150025033A (ko) * 2013-08-28 2015-03-10 주식회사 엔지노믹스 데옥시유리딘을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 udg 표지자로서의 그 용도
CN104630363A (zh) * 2015-02-05 2015-05-20 山东大学 一种基于免标记无酶dna机器荧光放大策略检测尿嘧啶-dna糖基化酶活性的方法
CN105385770A (zh) * 2015-12-18 2016-03-09 山东大学 检测博来霉素的双环发夹探针介导免标记链置换扩增方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150025033A (ko) * 2013-08-28 2015-03-10 주식회사 엔지노믹스 데옥시유리딘을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 udg 표지자로서의 그 용도
CN104313133A (zh) * 2014-09-28 2015-01-28 南京诺唯赞生物科技有限公司 一种核酸内切酶ⅷ活性测定方法
CN104630363A (zh) * 2015-02-05 2015-05-20 山东大学 一种基于免标记无酶dna机器荧光放大策略检测尿嘧啶-dna糖基化酶活性的方法
CN105385770A (zh) * 2015-12-18 2016-03-09 山东大学 检测博来霉素的双环发夹探针介导免标记链置换扩增方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DU YC等: "Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase", 《BIOSENS BIOELECTRON》 *
朱静: "基于链置换反应的分子识别和信号放大技术的建立及生物传感应用", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 *
梁东明: "基于切刻内切酶的核酸信号放大技术用于蛋白及DNA修饰酶的荧光检测", 《中国优秀硕士论文全文数据库基础科学辑》 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106929563A (zh) * 2017-02-24 2017-07-07 山东师范大学 基于切除修复由酶介导的两步串联信号放大检测udg活性的方法
CN106929563B (zh) * 2017-02-24 2018-10-12 山东师范大学 基于切除修复由酶介导的两步串联信号放大检测udg活性的方法
CN106947811A (zh) * 2017-03-17 2017-07-14 中国科学技术大学 一种检测miRNAs‑21的方法、探针组及试剂盒
CN106947811B (zh) * 2017-03-17 2020-03-31 中国科学技术大学 一种检测miRNAs-21的方法、探针组及试剂盒
CN106995840B (zh) * 2017-03-20 2020-05-05 山东师范大学 一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法
CN106995840A (zh) * 2017-03-20 2017-08-01 山东师范大学 一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法
CN107254550A (zh) * 2017-05-25 2017-10-17 重庆医科大学 一种检测hiv相关基因的spr传感器及其制备与应用
CN107254550B (zh) * 2017-05-25 2020-09-04 重庆医科大学 一种检测hiv相关基因的spr传感器及其制备与应用
CN107083437A (zh) * 2017-06-09 2017-08-22 山东师范大学 一种利用固有荧光核苷酸超灵敏同时检测多种dna糖基化酶的方法
CN107119031A (zh) * 2017-06-21 2017-09-01 南京大学 一种新型嗜热四元g四链体dna酶
CN107119031B (zh) * 2017-06-21 2022-12-27 南京大学 一种新型嗜热四元g四链体dna酶
CN108613934A (zh) * 2018-03-19 2018-10-02 安徽师范大学 一种dna传感器及其制备方法、一种检测短链dna的方法
CN108613934B (zh) * 2018-03-19 2021-01-05 安徽师范大学 一种dna传感器及其制备方法、一种检测短链dna的方法
CN114606293A (zh) * 2020-12-09 2022-06-10 重庆医科大学 一种基于双链核酸靶标的高特异性核酸杂交方法
CN114672542A (zh) * 2022-03-28 2022-06-28 中南大学 一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法
CN114672542B (zh) * 2022-03-28 2024-02-06 中南大学 一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106244703B (zh) 2019-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106244703A (zh) 基于粘性末端‑介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测udg活性的方法
EP3414327B1 (en) Detection of nucleic acids
CN103687962B (zh) 核酸扩增
Zhang et al. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity
US20160319354A1 (en) Systems, compositions and methods for detecting and analyzing micro-rna profiles from a biological sample
JP6638122B2 (ja) 標的核酸の検出方法及びキット
CN107109497A (zh) 通过实时PCR从细胞裂解物定量HBV cccDNA的高通量新方法
JP5099920B2 (ja) 核酸試験用対照
HUP0101385A2 (hu) Eljárás nukleinsavak detektálására PCR-módszerrel
CN107937482B (zh) 一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法
DK2801626T3 (en) Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.
Zhang et al. Colorimetric detection of microRNA and RNase H activity in homogeneous solution with cationic polythiophene derivative
CN107513568A (zh) 一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法
CN102643910B (zh) 非对称多色荧光发夹探针链反应在病原菌检测中的应用
JP2017530715A (ja) ロックされた核酸を有する配列変換およびシグナル増幅ｄｎａならびにそれを用いた検出方法
Wang et al. Primer dephosphorylation-initiated circular exponential amplification for ultrasensitive detection of alkaline phosphatase
Yan et al. Integration of the ligase chain reaction with the CRISPR-Cas12a system for homogeneous, ultrasensitive, and visual detection of microRNA
WO2023039491A2 (en) Coronavirus rapid diagnostics
Zhang et al. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) for ultrasensitive multiplexed microRNA detection using ribonucleotide-modified DNA probes
CN113088557A (zh) 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用
CN109988822B (zh) 可控自催化切割介导荧光恢复检测hAAG的传感器及方法
EP2831260B1 (en) Nucleic acids for nucleic acid amplification
Xia et al. Intermolecular and intramolecular priming Co-directed synergistic multi-strand displacement amplification empowers ultrasensitive determination of microRNAs
CN103781908A (zh) 用于核酸杂交的组合物、方法和试剂盒
CN100487432C (zh) 采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant