CN114672542B

CN114672542B - 一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法

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Publication number: CN114672542B
Application number: CN202210313487.3A
Authority: CN
Inventors: 王建秀; 陈文潮; 胡盛强
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114672542A

Abstract

本发明公开了一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，该方法属于生物传感技术领域。大多数光控粘性末端介导的链取代反应(TSDR)需要在DNA结构上修饰光敏基团或加入额外的光响应试剂，导致分子设计复杂化并带来较高的成本。嘧啶碱基对紫外光辐射具有很高的敏感性，而嘌呤碱基则是光惰性的，此外，光损伤的嘧啶碱基失去了与互补的嘌呤碱基杂交配对的能力。基于此，本方法采用互补DNA链阻断粘性末端以形成双链DNA，随后通过紫外光损伤使双链DNA发生解旋而暴露粘性末端，最后由目标DNA链触发TSDR。本发明提出的方法不涉及额外的光响应试剂，也不需要对DNA进行特殊的修饰，具有简单、经济和时空选择性的特点，在生物传感、药物传递等生物医药领域具有较大的应用潜力。

Description

一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，涉及一种光控制生物识别反应的方法，特别涉及一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法。

背景技术

由于腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)之间的Watson-Crick碱基互补配对特性，DNA分子可折叠成各种形状和功能的纳米结构，如分子信标、i-motif、G-四链体、DNA四面体和折纸等，这些精确设计的DNA纳米结构在生物传感、药物传递等生物医药领域具有巨大的应用潜力。为了实现功能性DNA对特定刺激的特异性响应，可控生物识别反应的设计至关重要。其中，粘性末端介导的链取代反应(toehold-mediated stranddisplacement reaction,TSDR)作为一种有效的生物识别手段，已广泛应用于生物分析，其基本原理为：侵入链识别预杂交形成双链中的悬空粘性末端并引发链取代反应，将预杂交双链中的短链置换下来形成新的互补DNA双链。然而，“始终活性”的响应模式往往导致较低的信噪比和有限的时空选择性。因此，可控TSDR由于精确响应和高时空分辨率，是目标物检测的首选方法。

光是操纵生物识别反应的理想选择，其不仅能提供有效的能量输入，还能以高时空精度进行无创传输。迄今为止，光激活是调控TSDR的常用策略，即首先用互补DNA链阻断粘性末端以形成双链DNA，随后通过光控的双链解旋反应以释放出粘性末端，并用于后续靶点序列的分析。如图1所示，目前已开发出三种光控TSDR的方法：

(1)引入光热试剂来介导光-热转换过程，从而诱导双链DNA在高于其熔解温度时发生解旋反应(图1上)。光热试剂在受到特定波长的光照时会使溶液的局部温度升高，当温度超过双链DNA的熔解温度时，双链DNA发生解旋反应从而导致粘性末端释放出来。该方法需要在体系中引入光热试剂，且不能实现序列特异性的双链解旋反应。

(2)构建光敏构象开关，将光切割基团共价修饰到DNA结构中(图1中)。在光照时DNA链被切割从而暴露出粘性末端。该方法虽然具有特异性切割双链DNA的能力，但需要对DNA结构进行功能化修饰，会带来难度和较高成本。

(3)光诱导产生活性氧物质(ROS)对DNA序列进行特异性切割(图1下)。手性半胱氨酸包封的CdTe纳米颗粒在光诱导下产生ROS并在碱基T和A之间进行特异性切割，从而释放出粘性末端。光诱导生成的ROS是具有切割活性的关键，而且其序列选择性来自于半胱氨酸和特定DNA构象之间的亲和作用。

上述三种光控的双链DNA解旋过程需要在DNA分子中修饰光敏基团或引入额外的光响应剂，这不可避免地导致分子设计复杂化并带来较高的成本。本发明的研究表明，DNA在过度暴露于深紫外线(UVC,100～280nm)时会受到不可逆的光损伤，嘧啶碱基对UVC辐射具有很高的敏感性，而嘌呤碱基则是光惰性的。光损伤后的DNA失去了与互补序列配对杂交的能力，这种依赖于嘧啶碱基的光损伤为调控双链DNA的解旋过程及光控生物识别反应的设计提供了一种极好的替代方法。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提出一种新颖的紫外光损伤介导的双链DNA解旋反应，实现无需光响应剂辅助的、具有特异性的光控TSDR。该方法通过研究DNA碱基对紫外光辐射的光敏性质，特别是UVC辐射下双链DNA的构象变化，来构建一种简单、具有特异性、经济的光控TSDR方法，实现基于UVC诱导的DNA损伤过程来提升生物识别反应的时空分辨率。

本发明这种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，包括以下步骤：

(1)根据紫外光辐射损伤实验，得出紫外光辐射对连续的T碱基序列的损伤比例最大；

(2)基于步骤(1)得到的紫外光辐射对连续的T碱基序列的损伤比例最大的结果，在根据目标DNA链，设计L链时，L链中需要包含有连续的T碱基序列；然后再根据目标DNA链和L链，设计H链和P链；

(3)用磷酸盐缓冲液将步骤(2)中所设计的H链、L链、P链以及目标DNA链在离心管中分别配制成溶液，并将H链、L链、P链溶液混匀得到混合液，目标DNA链溶液待用；

(4)将步骤(3)中得到的混合液置于水浴锅中恒温孵育，孵育完毕后，冷却，得到HLP杂交链溶液；

(5)取步骤(4)中得到的HLP杂交链溶液，向其中加入步骤(3)中配制的目标DNA链溶液，混匀，将混合液置于暗箱式紫外分析仪中进行辐射损伤；然后将其置于恒温水浴条件下，由目标DNA链触发TSDR，反应完全后，将混合液进行荧光光谱测定；

(6)其他条件不变，采用一系列不同浓度的目标DNA链溶液重复实验步骤(3)、(4)、(5)，测定不同浓度目标DNA链时的荧光光谱，确定不同浓度目标DNA链存在时TSDR进行的程度。

所述步骤(1)中，紫外光辐射损伤实验的具体步骤为：用磷酸盐缓冲液配制含有15个T碱基的T₁₅溶液，取三等份将其分别置于暗箱式紫外分析仪中照射不同时间，利用紫外-可见分光光度计测定其吸收光谱；其他条件不变，将T₁₅替换成含有15个A碱基的A₁₅、含有15个C碱基的C₁₅以及含有15个G碱基的G₁₅重复上述实验，通过损伤前后吸光度的变化值计算四种DNA序列的损伤比例，损伤比例为吸光度变化值除以未损伤时吸光度，根据测试结果，得出不同碱基的辐射损伤比例为：T＞C＞G＝A。

所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0～7.5，由5～10mmol/L磷酸盐、50～150mmol/L氯化钠和10～30mmol/L氯化镁组成；T₁₅溶液的浓度为0.5～1.5μmol/L；紫外光照射时间为0～3h。

本发明中，由于连续G碱基序列合成的困难性，可采用1～3个A碱基来替代G碱基，如GGGGAGGGGGAGGGG。

所述步骤(2)中，设计H链，其5′端采用荧光分子标记，荧光分子为FAM、Cy3、Cy5和TAMRA荧光分子中的一种，3′端连续A碱基的数量与L链5′端连续T碱基的数量相等；所述L链5′端连续T碱基的数量为6～15个；设计P链时，其3′端采用猝灭剂修饰，其中猝灭剂与H链上修饰的荧光基团相对应，猝灭剂为BHQ1和BHQ2中的一种。

紫外辐射对DNA的损伤主要集中在L链上的T碱基，可根据需要参考步骤(1)中DNA损伤水平实验，来调整T碱基的数量和损伤时间。

所述步骤(2)中，假设目标DNA链的碱基序列为CGTGCACGTACATGCG(5′-3′)，如序列1所示，则可设计H链的碱基序列为FAM-CGCATGTACGTGCACGAAAAAAAAAA(5′-3′)，如序列2所示，L链的碱基序列为TTTTTTTTTTCGTGC(5′-3′)，如序列3所示，P链的碱基序列为ACGTACATGCG-BHQ1(5′-3′)，如序列4所示。

所述步骤(3)中，磷酸盐缓冲液的pH为7.0～7.5，由5～10mmol/L磷酸盐、50～150mmol/L氯化钠和10～30mmol/L氯化镁组成；H链溶液的浓度为1.5～2.5μmol/L，L链溶液的浓度为3.5～4.5μmol/L，P链溶液的浓度为3.5～4.5μmol/L，目标DNA链溶液的浓度为0.25～10μmol/L；DNA序列浓度比为H链:L链:P链＝1:2:2。

所述步骤(4)中，恒温的温度为90～95℃，孵育时间为3～10min，冷却的具体操作为：自然冷却2～3h后转移至4℃冰箱中继续冷却0.5～1h。

H、L、P链的杂交过程中，自然冷却后转移至4℃冰箱中继续冷却0.5～1h以提高杂交效率，如果荧光基团的荧光基本被猝灭基团猝灭，则说明H链与L链、P链杂交效率较高。

所述步骤(5)中，辐射损伤时间为2～3h；恒温温度为35～40℃，TSDR时间为1.5～2.5h。

所述步骤(1)中的紫外光辐射损伤实验和步骤(5)中的辐射损伤均采用的紫外辐射波长为255～265nm。

紫外辐射波长的选择应考虑DNA的最大吸收波长，越接近其最大吸收波长，损伤效果越好。

所使用的暗箱式紫外分析仪中紫外灯的功率为5～10W。

本发明的原理：DNA在过度暴露于深紫外线(UVC,100～280nm)时会受到不可逆的光损伤，嘧啶碱基对紫外光辐射具有很高的敏感性，尤其是相邻的胸腺嘧啶碱基，而嘌呤碱基则是光惰性的，此外，光损伤的嘧啶碱基失去了与互补的嘌呤碱基杂交配对的能力。基于此，本发明采用互补DNA链阻断粘性末端以形成双链DNA，随后通过紫外光损伤使双链DNA发生解旋而暴露粘性末端，最后由目标DNA链触发TSDR(图2)。

相对于现有技术，本发明带来的有益技术效果如下：本发明中调控TSDR的方法不涉及额外的光响应试剂，同时也不需要对DNA进行特殊的修饰，具有设计简单、经济和时空选择性的特点，在生物传感、药物传递等生物医学领域具有较大的应用潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。

图1为现有的技术。

图2为本发明中基于紫外光损伤的可控TSDR方法的原理示意图。

图3为实施例1中富含胸腺嘧啶的序列对不同损伤时间的紫外-可见吸收光谱(A)，不同碱基类型的DNA序列对紫外辐射的损伤情况(B)以及碱基光敏性示意图(C)。

图4为实施例2中TSDR荧光光谱图(A)及目标DNA浓度曲线(B)。

具体实施方式

以下实施例能进一步说明本发明内容，但本发明权利要求保护范围不限于以下实施例。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买或者现有方法制备得到。

实施例1

紫外光辐射引起的DNA损伤：用pH为7.2的磷酸盐缓冲液(由10mmol/L磷酸盐，100mmol/L氯化钠和20mmol/L氯化镁组成)配制300μL,1μmol/L的含有15个T碱基的T₁₅溶液，分成三等份并分别置于暗箱式紫外分析仪中以254nm的紫外光照射0、0.5h、2h，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸收光谱，结果如图3A所示，T₁₅的损伤程度随照射时间的延长而增加。相比于上述实验，其他条件不变，将T₁₅替换成A₁₅、C₁₅以及GGGGAGGGGGAGGGG重复上述实验，计算四种碱基序列对紫外辐射的损伤比例(吸光度变化值除以未损伤时吸光度)，如图3B所示，得到不同碱基的光敏性强弱次序为：T＞C＞G＝A(图3C)。

实施例2

根据实施例1得到的不同碱基的光敏性强弱次序(T＞C＞G＝A)设计本实施例实验，得到光控TSDR方法的可行性(图4A)及目标DNA浓度曲线(图4B)：

本实施例中选用的目标DNA链的碱基序列为CGTGCACGTACATGCG(5′-3′)，如序列1所示，H链的碱基序列为FAM-CGCATGTACGTGCACGAAAAAAAAAA(5′-3′)，如序列2所示，L链的碱基序列为TTTTTTTTTTCGTGC(5′-3′)，如序列3所示，P链的碱基序列为ACGTACATGCG-BHQ1(5′-3′)，如序列4所示。

(1)用pH为7.2的磷酸盐缓冲液(由10mmol/L磷酸盐、100mmol/L氯化钠和20mmol/L氯化镁组成)在离心管中分别配制H链、L链、P链溶液和目标DNA链溶液，其中，H链溶液的浓度为2μmol/L，L链溶液的浓度为4μmol/L，P链溶液的浓度为4μmol/L，目标DNA链溶液的浓度为5μmol/L，将H链、L链、P链溶液混匀得到混合液，目标DNA链溶液待用；

(2)将步骤(1)中的混合液置于95℃的水浴锅中，恒温孵育5min，自然冷却2h后转移至4℃冰箱中存储0.5h，得到HLP杂交链溶液；

(3)取三份步骤(2)中所述HLP杂交链溶液，每份80μL，标记为1、2、3号，向1、2号中加入20μL步骤(1)中配得的目标DNA链溶液，向3号中加入20μL磷酸盐缓冲液，充分混匀后，将1、3号置入暗箱式紫外分析仪中进行紫外辐射损伤2h，并随后将三份溶液置入37℃水浴锅中恒温2h，反应完全后，将三份溶液在荧光分光光度计或酶标仪上测定荧光光谱，结果如图4A所示。未经过紫外辐射处理的2号以及未添加目标DNA链的3号实验均显示较低的荧光信号，而1号实验经过紫外辐射损伤导致L链解旋及目标DNA链驱动使得TSDR发生时，可观察到明显的荧光信号；

(4)与上述实验相比，其他条件不变，采用一系列不同浓度(0.25、1.25、2.5、3.75、5、7.5、10μmol/L)的目标DNA链溶液重复步骤(1)、(2)、(3)实验，以520nm处FAM的荧光值和目标DNA链的最终浓度绘制目标DNA浓度曲线。如图4B所示，随着目标DNA浓度的逐渐增加，所测溶液的荧光信号随之增大，表明光控启动后TSDR发生的程度与目标DNA浓度成正相关，在0.05～1.0μmol/L的最终浓度范围内表现出良好的线性相关。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受所述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 目标DNA链(人工序列)

<400> 1

cgtgcacgta catgcg 16

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> H链(人工序列)

<400> 2

cgcatgtacg tgcacgaaaa aaaaaa 26

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> L链(人工序列)

<400> 3

tttttttttt cgtgc 15

<210> 4

<211> 11

<212> DNA

<213> P链(人工序列)

<400> 4

acgtacatgc g 11

Claims

1.一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，包括以下步骤：

（1）根据紫外光辐射损伤实验，得出紫外光辐射对连续的T碱基序列的损伤比例最大；

（2）基于步骤（1）得到的紫外光辐射对连续的T碱基序列的损伤比例最大的结果，在根据目标DNA链，设计L链时，L链中需要包含有连续的T碱基序列；然后再根据目标DNA链和L链，设计H链和P链；

设计H链，其5´端采用荧光分子标记，荧光分子为FAM、Cy3、Cy5和TAMRA荧光分子中的一种，3´端连续A碱基的数量与L链5´端连续T碱基的数量相等；所述L链5´端连续T碱基的数量为6~15个；设计P链时，其3´端采用猝灭剂修饰，其中猝灭剂与H链上修饰的荧光基团相对应，猝灭剂为BHQ1和BHQ2中的一种；

（3）用磷酸盐缓冲液将步骤（2）中所设计的H、L、P三条DNA链以及目标DNA链在离心管中分别配制成溶液，并将H链、L链、P链溶液混匀得到混合液，目标DNA链溶液待用；

（4）将步骤（3）中得到的混合液置于水浴锅中恒温孵育，孵育完毕后，冷却，得到HLP杂交链溶液；

（5）取步骤（4）中得到的HLP杂交链溶液，向其中加入步骤（3）中配制的目标DNA链溶液，混匀，将混合液置于暗箱式紫外分析仪中进行辐射损伤；然后将其置于恒温水浴条件下，由目标DNA链触发TSDR，反应完全后，将混合液进行荧光光谱测定；

（6）其他条件不变，采用一系列不同浓度的目标DNA链溶液重复实验步骤（3）、（4）、（5），测定不同浓度目标DNA链时的荧光光谱，确定不同浓度目标DNA链存在时TSDR进行的程度。

2.根据权利要求1所述的一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，紫外光辐射损伤实验的具体步骤为：用磷酸盐缓冲液配制含有15个T碱基的T₁₅溶液，取三等份将其分别置于暗箱式紫外分析仪中照射不同时间，利用紫外-可见分光光度计测定其吸收光谱；其他条件不变，将T₁₅替换成含有15个A碱基的A₁₅、含有15个C碱基的C₁₅以及含有15个G碱基的G₁₅重复上述实验，通过损伤前后吸光度的变化值计算四种DNA序列的损伤比例，损伤比例为吸光度变化值除以未损伤时吸光度，根据测试结果，得出不同碱基的辐射损伤比例为：T＞C＞G=A。

3.根据权利要求2所述的一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0~7.5，由5~10mmol/L磷酸盐、50~150mmol/L氯化钠和10~30mmol/L氯化镁组成；T₁₅溶液的浓度为0.5~1.5µmol/L；紫外光照射时间为0~3h。

4.根据权利要求1所述的一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，假设目标DNA链的碱基序列为5´-CGTGCACGTACATGCG-3´，如SEQIDNO:1所示，则可设计H链的碱基序列为5´-FAM-CGCATGTACGTGCACGAAAAAAAAAA-3´，如SEQIDNO:2所示，L链的碱基序列为5´-TTTTTTTTTTCGTGC-3´，如SEQ IDNO:3所示，P链的碱基序列为5´-ACGTACATGCG-BHQ1-3´，如SEQ IDNO:4所示。

5.根据权利要求1所述的一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，磷酸盐缓冲液的pH为7.0~7.5，由5~10mmol/L磷酸盐、50~150mmol/L氯化钠和10~30mmol/L氯化镁组成；H链溶液的浓度为1.5~2.5µmol/L，L链溶液的浓度为3.5~4.5µmol/L，P链溶液的浓度为3.5~4.5µmol/L，目标DNA链溶液的浓度为0.25~10µmol/L；DNA序列浓度比为H链:L链:P链=1:2:2。

6.根据权利要求1所述的一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，恒温的温度为90~95℃，孵育时间为3~10min，冷却的具体操作为：自然冷却2~3h后转移至4℃冰箱中继续冷却0.5~1h。

7.根据权利要求1所述的一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，辐射损伤时间为2~3h；恒温温度为35~40℃，TSDR时间为1.5~2.5h。

8.根据权利要求1所述的一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的紫外光辐射损伤实验和步骤（5）中的辐射损伤均采用的紫外辐射波长为255~265nm。

9.根据权利要求8所述的一种基于紫外光损伤的粘性末端介导链取代反应的方法，其特征在于，所使用的暗箱式紫外分析仪中紫外灯的功率为5~10W。