CN108613934B - 一种dna传感器及其制备方法、一种检测短链dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA传感器及其制备方法、一种检测短链DNA的方法，将制备的聚吡咯/银@氯化银复合材料电极置于发夹DNA HP1的溶液，孵化后，再放入不同浓度的短链DNA中进行孵化，再浸泡在含有Zn2+的8‑17DNAzyme溶液中，即制备成DNA传感器。将没食子酸作为电活性物质，通过检测光电流的响应大小，来定量检测短链DNA的浓度。与现有技术相比，本发明提供的PEC DNA检测方法不仅检测限低，检测范围广，而且对目标DNA有很好的选择性.此外，可以广泛应用于检测各种DNA序列，特别是那些短的特定DNA序列，为开展痕量DNA序列检测开辟了新的途径，也为各种疾病的早期诊断提供了有效的检测手段。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体设计一种DNA传感器及其制备方法、一种检测短链DNA的方法，利用聚吡咯/银@氯化银纳米线复合电极作为电极材料光电检测慢性髓细胞白血病的短链DNA物种。
背景技术
慢性骨髓性白血病(CML)是一种克隆性骨髓增殖性疾病。慢性粒细胞白血病患者在初期并未出现任何明显的症状，慢性病程可持续3-5年，这些现象给CML的诊断带来了困难。BCR/ABL基因是该疾病的传统基因，并且几乎存在于所有CML患者的病例中。
BCR/ABL基因有许多种类型，而b3a2型是最常见的突变类型之一。因此，检测b3a2型基因会有助于对疾病进行早期诊断和监测，进一步提高检测微小残留白血病细胞的能力。
近年来，CML融合基因的临床诊断和预后监测方法包括染色体分析，Southern杂交，聚合酶链式反应(PCR)，荧光原位杂交(FISH)等。但上述这些方法都有一定的局限性。染色体分析是耗时且不敏感的；传统的Southern杂交检测具有特异性，但对基因序列低复制性的检测非常不敏感，检测方法复杂，周期过长，而且依赖于危险的放射性标记，限制了它的广泛性应用于临床。PCR是一种基于酶的DNA扩增技术，通常用于这些应用。虽然PCR非常敏感，但从实际的角度来看，它仍有待改进。它的缺点包括相对较长的测定时间，高的测定成本以及偶尔会导致“假阳性”信号的容易出错的性质。FISH技术需要复杂的荧光着色系统，其灵敏度仍不高，不能在临床上广泛应用。因此，开展和调查CML基因检测技术是非常重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA传感器及其制备方法。
本发明还提供了一种检测短链DNA的方法，利用制备的聚吡咯/银@氯化银纳米线复合电极作为传感器，光电检测慢性髓细胞白血病的短链DNA物种的方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供的一种DNA传感器的制备方法为：
1)将聚吡咯/银@氯化银纳米线复合电极置于发夹DNA HP1的溶液中，孵化，然后取出电极洗涤，干燥；
2)将步骤1)处理后的电极置于不同浓度的目标短链DNA溶液中进行孵化，然后取出电极洗涤，干燥；
3)步骤2)处理后的电极置于含Zn2+和8-17DNAzyme的溶液中，孵化；然后取出电极洗涤，干燥；即得DNA传感器。
步骤1)中将聚吡咯/银@氯化银纳米线复合电极置于50μL 4μM的发夹DNA HP1的溶液中，DNA HP1溶液的配制方法为：将买回来的DNA HP1加pH 7.4的0.1M的PBS缓冲溶液配成100μM的HP1溶液，然后再用同样的PBS溶液稀释到4μM的浓度；备用；
步骤1)中所述聚吡咯/银@氯化银纳米线复合电极采用201410299007.8公开的方法制备得到。
步骤1)中所述发夹DNA HP1序列为：
5′-GTGAAGGGCGACCACAGAGTTCAAAAGCCCTTCACTAT/RA/GGAAGAGA-SH-3′；
步骤1)中所述孵化：孵化温度为0-4℃，孵化时间≥12h；
步骤2)中将步骤1)处理后的电极置于50μL短链DNA溶液中进行孵化，短链DNA溶液浓度分别为0.01nM,0.05nM，0.1nM，0.5nM，1nM，2nM，4nM，8nM，12nM，16nM和20nM，所有短链DNA溶液都是用pH7.4的0.1MPBS缓冲溶液配制的；
步骤2)所述孵化是指：孵化温度为35℃-37℃，孵化时间为≥2h。
步骤2)中所述的短链DNA的序列为type b3a2DNA。
步骤2)中所述type b3a2DNA序列为5′-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3′；
步骤3)所述含Zn2+和8-17DNAzyme的溶液制备方法为：
将50μL 1μM的8-17DNAzyme溶液和1μL20μM的Zn2+溶液混合，均是用pH7.4的0.1MPBS的缓冲溶液配制即得。
所述8-17DNAzyme序列为
5′-TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAAGGGCTTTTGAACTCCGTCGCCCTTC-3′；
步骤3)所述孵化是指：孵化温度为35℃-37℃，孵化时间为≥90min。
一种DNA传感器，采用上述方法制备得到。
本发明还提供了一种检测短链DNA的方法，包括以下步骤：
将上述制备的传感器作为工作电极，进行光电检测，以500W的Xe灯作为光源，没食子酸GA为电活性物质，在PBS缓冲溶液中进行，通过检测光电流的响应变化，构建短链DNA浓度的关系，实现定量检测短链DNA。
本发明中，在没有加入发夹DNAHP1时，检测的光电流很大；但发夹DNAHP1修饰在工作电极上后，由于工作电极接触不到电活性物质(GA)，检测到的光电流就很小。当加入目标type b3a2DNA后，发夹DNAHP1的发夹结构得以打开，可以与长链DNA 8-17DNAzyme酶互补配对，而将目标短链DNA挤下来。由于这样形成的双链DNA有Zn2+的切割位点，所以在Zn2+的作用下，双链DNA被切割后只剩下很短的单链DNA在电极表面，工作电极又可以接触到电活性物质(GA)，光电流又得到恢复。随着加入的目标DNA的浓度不同，光电流的回复情况也随之改变。找到目标DNA的浓度与光电流变化的关系，构建线性关系，从而可以定量检测目标DNA的浓度大小。
本发明提供的一种聚吡咯/银@氯化银纳米线复合电极作为电极材料光电检测慢性髓细胞白血病的短链DNA物种的方法，与现有技术相比，本发明提供的PEC DNA检测方法不仅检测限低，检测范围广,而且对目标DNA有很好的选择性.此外,PEC DNA测定法可以广泛应用于检测各种DNA序列，特别是那些短的特定DNA序列,为开展痕量DNA序列检测开辟了新的途径，也为各种疾病的早期诊断提供了有效的检测手段。
附图说明
图1为实施例1中制备的DNA传感器检测目标type b3a2DNA的实验可行性图；1矩形是指没有加入发夹DNA HP1时，检测的光电流信号，光电流信号很大；2矩形是指发夹DNA(HP1)修饰在工作电极上后检测到的光电流，电流很小；3矩形是指当加入目标typeb3a2DNA以及在8-17DNAzyme和Zn2+的作用下，恢复的光电流信号；
图2为实施例1中制备的DNA传感器检测不同浓度的目标type b3a2DNA的光电流响应图；
图3为实施例1中制备的DNA传感器检测的目标type b3a2DNA浓度的对数与光电流的线性关系图；
图4为实施例1中制备的DNA传感器选择性图；
a是指目标DNA，b和c是与目标DNA在不同位置有一个碱基不一样的短链DNA，d是有三个碱基不同的短链DNA，e是完全不一样的短链DNA，f是空白样；
图5为实施例1制备的DNA传感器对目标type b3a2DNA检测过程中8-17DNAzyme浓度的优化图；
图6为实施例1制备的DNA传感器对目标type b3a2DNA检测过程中在8-17DNAzyme和Zn2+混合溶液中浸泡时间的优化图；
图7为实施例1制备的DNA传感器对目标type b3a2DNA检测过程中Zn2+浓度的优化图；
图8为实施例1制备的DNA传感器对目标type b3a2DNA检测过程中溶液的PH值的优化图；
图9为本发明检测原理示意图。
具体实施方式
实施例1
一种检测短链DNA的方法，检测慢性髓细胞白血病的短链DNA物种，包括以下步骤：
1)、聚吡咯/银@氯化银复合材料电极的制备：采用201410299007.8公开的方法制备得到。
2)、DNA传感器的制备：将步骤1)制备的聚吡咯/银@氯化银复合材料电极浸入50μL4μM的发夹DNA HP1溶液中孵化，孵化温度为4℃，孵化时间12h，电极取出，洗涤、干燥后，再将该电极分别放入50μL不同浓度的type b3a2DNA溶液中孵化，孵化温度为37℃，孵化时间为2h，电极取出，洗涤、干燥后，再将电极被放入50μL 1μM的8-17DNAzyme和1μL20μM的Zn2+溶液的混合溶液中孵化，孵化温度为37℃，孵化时间为90min，电极取出，洗涤、干燥后，得到的电极为DNA传感器。
上述DNA HP1溶液的配制方法为：将买回来的DNA HP1加pH 7.4的0.1M的PBS缓冲溶液配成100μM的HP1溶液，然后再用同样的PBS溶液稀释到4μM的浓度；备用；
发夹DNA HP1序列为：
5′-GTGAAGGGCGACCACAGAGTTCAAAAGCCCTTCACTAT/RA/GGAAGAGA-SH-3′；
type b3a2DNA序列为5′-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3′，type b3a2DNA溶液浓度分别为0.01nM,0.05nM，0.1nM，0.5nM，1nM，2nM，4nM，8nM，12nM，16nM和20nM，所有type b3a2DNA溶液都是用pH7.4的0.1MPBS缓冲溶液配制的；
8-17DNAzyme序列为
5′-TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAAGGGCTTTTGAACTCCGTCGCCCTTC-3′；
50μL1μM的8-17DNAzyme溶液和1μL20μM的Zn2+溶液均是用pH7.4的0.1MPBS的缓冲溶液配制即得。
3)、光电检测目标DNA方法：将100μM没食子酸作为电活性物质，上述制备的传感器电极作为工作电极。在PBS缓冲溶液中进行，通过检测光电流的响应变化，构建typeb3a2DNA浓度的关系，实现定量检测type b3a2DNA。结果如图2和图3所示
在没有加入HP1时，检测的光电流很大；但HP1修饰在工作电极上后，由于工作电极接触不到电活性物质，检测到的光电流就很小。当加入不同浓度的目标type b3a2DNA，经过8-17DNAzyme和Zn2+的作用，光电流的恢复情况也随之改变。找到目标DNA的浓度与光电流变化的关系，从而可以定量检测目标DNA的浓度大小。结果图如1所示。
实施例2
重复实施例1，将短链DNA分别替换为与目标DNA在不同位置有一个碱基不一样的短链DNA、有三个碱基不同的短链DNA、完全不一样的短链DNA和空白样，结果如图4。
实施例3
重复实施例1，改变检测过程中8-17zyme浓度，得到结果如图5。
实施例4
重复实施例1，将电极在8-17DNAzyme和Zn2+混合溶液中浸泡时间的优化图；结果如图6。
实施例5
重复实施例1，改变检测过程中Zn2+浓度，结果如图7。
实施例6
重复实施例1，改变使用的PBS缓冲溶液PH值，结果如图8。
Claims (7)
1.一种DNA传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
1）将聚吡咯/银@氯化银纳米线复合电极置于发夹DNA HP1的溶液中，孵化，然后取出电极洗涤，干燥；
2）将步骤1）处理后的电极置于不同浓度的短链DNA溶液中进行孵化，然后取出电极洗涤，干燥；
3）步骤2）处理后的电极置于含Zn2+和8-17DNAzyme的溶液中，孵化；然后取出电极洗涤，干燥；即得DNA传感器；
步骤1）中所述发夹DNA HP1序列为：
5′-GTGAAGGGCGACCACAGAGTTCAAAAGCCCTTCACTAT/RA/GGAAGAGA-SH-3′；
步骤2）中所述的短链DNA的序列为type b3a2 DNA；所述type b3a2 DNA序列为5′-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3′；
所述8-17DNAzyme序列为：5′-TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAAGGGCTTTTGAACTCCGTCGCCCTTC-3′。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述孵化：孵化温度为0-4℃，孵化时间≥12h。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2）所述孵化是指：孵化温度为35℃-37℃，孵化时间为≥2 h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，短链DNA溶液浓度分别为0.01nM,0.05nM，0.1nM，0.5nM，1nM，2nM，4nM，8nM，12nM，16nM和20nM。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤3）所述孵化是指：孵化温度为35℃-37℃，孵化时间为≥90 min。
6.一种权利要求1或2所述的制备方法制备的DNA传感器。
7.根据权利要求6所述的DNA传感器，其特征在于，所述DNA传感器的使用方法包括以下步骤：
将DNA传感器作为工作电极，进行光电检测，以500W的Xe灯作为光源，没食子酸为电活性物质，在PBS缓冲溶液中进行，通过检测光电流的响应变化，构建目标短链DNA浓度的关系，实现定量检测短链DNA。
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