CN117330748A - 基于4-wj结构触发的双重rca扩增的电化学外泌体检测体系及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于4‑WJ结构触发的双重RCA扩增的电化学外泌体检测体系，属于肿瘤检测领域；电化学外泌体检测体系包括电化学传感器的工作电极，通过金电极表面修饰纳米金颗粒以提高金电极表面积并有助于结合适配体1，在适配体1捕获靶外泌体后，外泌体进一步结合适配体2形成“三明治夹心”结构，该结构通过双重适配体可以显著提高检测特异性。随后，通过DNA四向连接结构(DNA four‑way junction，4‑WJ)触发的双重RCA体系实现目标信号的指数扩增；最后，通过亚甲基蓝/G‑四联体DNA酶技术有助于电化学信号的进一步放大，实现高灵敏度检测。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤检测领域，具体涉及基于4-WJ结构触发的双重RCA扩增的电化学外泌体检测体系，还涉及利用该体系检测外泌体的方法。
背景技术
肿瘤源性的外泌体(约30-150nm)，是一种由恶性细胞分泌到细胞外环境，携带亲代癌症细胞的生物学信息的磷脂双分子层囊泡。因此，肿瘤源性外泌体被认为是癌症早期非侵入性液体活检的有应用前景的生物标志物。目前，许多方法，如纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)、流式细胞术、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、动态光散射(dynamic light scattering，DLS)等，已被用于肿瘤源性外泌体测定。然而，这些方法较为昂贵和工艺流程复杂、灵敏度和特异性相对不足以及需要相应的标记的，这些均限制了技术应用。相比之下，电化学生物传感器在精确分析肿瘤源性外泌体方面近年来被逐步研发，因为它具有便携性、样品需求少、高灵敏度、成本低廉、易于信号放大和信号实时监测等优点。这些电化学测定方法利用外泌体表面特异性肿瘤生物标志物和信号探针与肿瘤标志物的高免疫亲和相互作用来鉴定肿瘤相关外泌体。然而，外泌体表面的肿瘤标志物种类繁多，且表达量较低，因此阻碍了对外泌体的高效检测。总之，在癌症早期，迫切需要建立一种具有高灵敏度和高特异性的方法从众多外泌体和非外泌体污染物(如蛋白质聚集物和脂蛋白)中来检测肿瘤来源的外泌体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于4-WJ结构触发的双重RCA扩增的电化学外泌体检测体系；本发明的目的之二在于提供利用所述电化学外泌体检测体系检测外泌体的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、基于4-WJ结构触发的双重RCA扩增的电化学外泌体检测体系，电化学外泌体检测体系包括电化学传感器的工作电极，DNA四向连接结构，RCA扩增体系和亚甲基蓝反应溶液；所述工作电极为功能化AuNPs修饰的电极；
所述功能化AuNPs修饰的电极为AuNPs修饰的电极表面连接特异识别外泌体的适配体1；
所述DNA四向连接结构包括与外泌体识别的适配体2DNA链，U链构成的分子信标探针以及由F链和M链构成的二元DNA探针；所述适配体2DNA链分别与F链和M链互补，所述U链与F链和M互补，杂交能形成DNA四向连接结构；
所述亚甲基蓝反应溶液包括含1mM亚甲基蓝、pH 8.0、10mM HEPES和100mM KCl。
本发明优选的，所述适配体1核酸链的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选的，所述适配体2DNA链的序列如SEQ ID NO.2所示；所述U链的序列如SEQ ID NO.3所示；所述F链的序列如SEQ ID NO.4所示；所述M链的序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明优选的，所述RCA扩增体系包括浓度为10U/μL的phi29 DNA聚合酶，10mMdNTPs，20mg/mL牛血清白蛋白、10×phi29DNA聚合酶反应缓冲液，富含C碱基的cDNA。
2、利用所述电化学外泌体检测体系检测外泌体的方法，包括如下步骤：
(1)功能化AuNPs修饰的电极的制备：将金电极抛光后在HAuCl4溶液中电沉积得到AuNPs修饰的电极，然后通过Au-S键在电极表面组装硫化的适配体1，再用MCH封闭电极，得到功能化AuNPs修饰的电极；
(2)制备待测血清：将待测全血样品以3500rpm离心10分钟，以收集浅黄色上清液作为待测样品；
(3)电化学方法检测：将制备的功能化AuNPs修饰的电极与含外泌体的待测样品孵育以捕获目标外泌体，用PBS漂洗后与含适配体2的结合缓冲液(1mM CaCl2·2H2O,6mMMgCl2·6H2O,25mM C6H12O6·H2O)孵育形成Apt2-T/Exo/MCH/Apt1/AuNPs/GE，然后加入含有F链、M链和U链的结合缓冲液滴定到电极上，以形成DNA四向连接结构，接着加入RCA反应体系，产生大量G重复碱基，再将电极在亚甲基蓝反应溶液中孵育形成MB/G四联体结构，最后用电化学检测在20mM KCl、pH 8.0、20mM HEPES中MB/G-四链体结构的电信号；
所述结合缓冲液各组分浓度如下：1mM CaCl2·2H2O,6mM MgCl2·6H2O,25mMC6H12O6·H2O。
本发明优选的，所述RCA反应体系中包括浓度为10U/μL的phi29 DNA聚合酶，10mMdNTPs，20mg/mL牛血清白蛋白、10×phi29DNA聚合酶反应缓冲液，富含C碱基的cDNA。
本发明优选的，所述电化学检测参数为电位为-0.1V至-0.6V；脉冲周期：0.1s；振幅：0.01V；脉冲宽度：0.05s。
本发明优选的，所述电化学检测使用功能化AuNPs修饰的电极为工作电极，铂对电极、饱和甘汞参比电极组成的三电极系统。
本发明的有益效果在于：本发明公开基于4-WJ结构触发的双重RCA扩增的电化学外泌体检测体系，使用该体系检测具有如下优点：
1、恒温检测，避免了高温对肿瘤源性外泌体表面肿瘤标志物的破坏。
2、超灵敏检测，基于4-WJ结构触发的双重RCA扩增技术和亚甲基蓝/G-四联体DNA酶技术，实现了低至20个/ml德痕量外泌体的超灵敏检测。
3、高特异性检测，双适配体三明治夹心结构和4-WJ结构实现了高特异性检测，能够从多种外泌体混合物种准确检测目标外泌体。
4、具有普适性，该传感策略结构简单，仅需要根据目标外泌体表面肿瘤标志物更换相应适配体及DNA探针，即可完成多种类型肿瘤源性外泌体的高灵敏、高特异性检测，且该传感器价格低廉，检测速度快，具有较高性价比。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明检测原理；
图2为外泌体表征(A：透射电镜观察外泌体形态；B：外泌体的大小分布；C：WB分析细胞和外泌体表面蛋白标记物；D：适体与其各自蛋白质靶标之间的结合亲和力)；
图3为电化学适体的可行性分析(A：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；B：DPV峰值电流；C：逐步装饰的CV结果；D：EIS的电子转移电阻)。
图4为电化学适体传感器的最佳条件(A：Aptl的浓缩物；B：K+浓缩剂；C：捕获靶外泌体的时间；D：外泌体与Apt2-T之间的孵育时间；E：RCA反应时间；F：捕获靶外泌体的温度；G：外泌体与Apt2-T之间的孵育温度；这些电化学信号用1x106颗粒/mL的MCF-7外泌体获得，平均值为三个独立的测定和误差条指示。
图5为电化学传感器的电化学性能(A：适体传感器对不同MCF-7外泌体浓度的DPV反应；B:DPV电流的状态图发生变化；C：不同MCF-7外泌体浓度的DPV峰值电流校准图)。
图6为特异性结果(A：从五个细胞系释放的不同外泌体DPV曲线；a)空白对照；b)MCF-10a分泌的异构酶；c)BMSC分泌泌体；d)HepG2分泌外泌体；e)A-375分泌的外泌体；f外泌体混合物，包括五种不同的外泌体；g)MCF-7分泌的外泌体；B：DPV电流变化直方图(***p＜0.0001；n.s.：无显著差异)；C：适体传感器在28天内的稳定性误差条代表三次独立测试测得的标准偏差)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明检测原理如下：在金电极表面修饰纳米金颗粒以提高金电极表面积并有助于结合适配体1(Apt-1)，在适配体1捕获靶外泌体后，外泌体进一步结合适配体2(Apt-2)形成“三明治夹心”结构，该结构通过双重适配体(CD63适配体和MUC-1适配体)可以显著提高检测特异性。随后，通过DNA四向连接结构(DNA four-way junction，4-WJ)触发的双重RCA体系实现目标信号的指数扩增，4-WJ包含了适配体2DNA链，由U链构成的分子信标探针(molecular beacon probe，MBP)以及由F链和M链构成的二元DNA探针(binary DNA probe，BDP)。最后，通过亚甲基蓝/G-四联体DNA酶技术有助于电化学信号的进一步放大，具体见图1所示。
实施例1、外泌体分离和表征
(1)外泌体分离：将MCF-7、A-375、MSC和HepG2细胞在补充有1％青霉素-链霉素溶液和10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，MCF-10a细胞在特定培养基(特定不清楚，需要给出培养基的名称或者成分)中培养。所有细胞在37℃、5％ CO2至80％细胞融合度的湿润气氛中孵育。随后，将所有细胞在含有10％无外泌体胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的培养基中培养48小时，培养基温度为37℃，含5％ CO2，以收集足够的细胞培养上清液。最后，使用ExoQuick外泌体沉淀溶液从上清液中提取源自不同细胞类型的外泌体。
(2)外泌体表征：使用JEM-1400Plus透射电子显微镜获得分离的MCF-7外泌体的电子显微镜图像，结果如图2中A所示。外泌体碟状膜结构，直径约为120nm，与早期研究中报道的外泌体内尺寸相对应。外泌体的分布大小和浓度通过NTA进一步确定，结果如图2中B所示。结果显示，外泌体的峰值浓度出现在122nm，平均浓度约为5.76×1010个颗粒/mL。Western blot印迹分析(WB)和NanoFCM用于确定外泌体蛋白标记。通过WB将外泌体表面蛋白标记物CD63和MUC1与MCF-7细胞进行比较，验证了它们的表达，结果如图2中C和D所示。结果显示NanoFCM还用于显示外泌体上CD63和MUC1蛋白的存在，以及适体与其各自蛋白质靶标之间的结合亲和力。
实施例2、适体传感器的可行性验证
(1)DNA链的制备。在正式检测之前，对Apt1、Apt2-T和U链进行独立的变性和退火。它们分别在95℃、75℃、55℃、25℃和4℃下处理5分钟，以保持发夹结构。为了以后使用，使用超纯水将所有独特的核酸链稀释到10μM。
其中Apt1的序列如下：
SH-(CH2)6-ATATACACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA(SEQ ID NO.1)；
Apt2-T的序列如下：5’-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGTTTTTTTTGCCACACTGACTTAATGACTCCTTA CTTA-3’(SEQ ID NO.2)；
U链的序列如下：5’-GCACGTTTCATACACACATTCGTGCTTTTGGG-3’(SEQ ID NO.3)；
F链；5’-TAAGTAAGGAGTCATTA/iSp9/TATGAAACGGTGCTTTTGGG-3’(SEQ ID NO.4)；
M链：5’-GCAGAATGTGTG/iSp9/AGTCAGTGTGGCAA-3’(SEQ ID NO.5)。
采用天然12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证适体的可行性。将DNA链进行杂交反应，结果如图3中A所示。结果显示Apt2-T链(泳道1)可以分别成功地与泳道6和泳道7中的F链(泳道2)和M链(泳道3)结合。泳道4和泳道5分别代表U链和cDNA模板。泳道8、9、10和11表明，只有当Apt2-T、F、M和U四种成分都存在时，才能形成4-WJ结构。其中，泳道8不具有M链，泳道9不具有F链，并且泳道10不具有Apt2-T链。此外，正如预期的那样，在将RCA反应体系添加到4-WJ溶液中之后，具有极低迁移率的双RCA产物出现在泳道12的顶部，4-WJ结构带消失，证实了4-WJ结构成功地触发了RCA反应。
实施例3、金电极的制备及其适用性评价
将直径为2mm的裸金电极(GE)分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料手动抛光，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声清洁2分钟。再用超纯水彻底冲洗并用氮气流干燥后，通过将裸GE浸入新制备的食人鱼溶液(98％ H2SO4：30％ H2O2＝3：1)中10分钟进一步清洁残留杂质。在超水洗和氮气干燥后，通过在0.5M H2SO4中以0.1V/s的扫描速率在0-1.6V下的循环伏安法(CV)扫描电极，直到获得最小的波动。接下来，在-30mM HAuCl4溶液中，在-0.2V下将清洁干燥的裸GE电沉积20s，以获得AuNPs修饰的电极(AuNPs/GE)。为了AuNPs/GE的功能化，通过Au-S键(Apt1/AuNPs/GE)在电极表面组装硫化的CD63适体(Apt1)。具体而言，通过将含有1μM Apt1和5μM TECP的混合物孵育1小时来去除二硫键。然后，将5μL混合物滴在AuNPs/GE上，并在37℃下孵育过夜。第二天，在4℃下用1mM MCH封闭电极表面上未被占据的结合位点0.5小时，然后进行超水洗(MCH/Apt1/AuNPs/GE)。最终电极储存在4℃下，用于外泌体捕获的进一步阶段和该适体传感器的稳定估计。
然后电化学特性验证生物传感器的适用性。首先，建立双RCA/4-WJ/Apt2-T/Exo/MCH/Apt1/AuNPs/GE。将修饰的电极(MCH/Apt1/AuNPs/GE)与200μL含有指定浓度MCF-7外泌体的结合缓冲液(1mM CaCl2·2H2O,6mM MgCl2·6H2O,25mM C6H12O6·H2O)溶液在37℃下孵育1.5小时，以捕获目标外泌体(Exo)(Exo/MCH/Apt1/AuNPs/GE)。用PBS洗涤外泌体结合电极三次后，在37℃下孵育CB溶液中的5μL 1μM Apt2-T链2.5小时形成Apt2-T/Exo/MCH/Apt1/AuNPs/GE。通过用PBS漂洗三次来去除未结合的Apt2-T链。接下来，将含有F链(1μM)、M链(0.5μM)和U链(0.5μM)的结合缓冲液滴定到电极上，并在37℃下孵育30分钟，以形成4-WJ结构(4-WJ/Apt2-T/Exo/MCH/Apt1/AuNPs/GE)。丢弃剩余溶液后，RCA反应系统，包括1μLphi29DNA聚合酶(10U/μL)、1μL dNTPs(各10mM)、0.1μL牛血清白蛋白(20mg/mL)、2μLphi29DNA聚合酶反应缓冲液(10×)和1μL富含C碱基的cDNA(10μM，序列为(CGAGAAACCCAAAAGCACTGACCCTCCCACCCCTCCCACCCCTATATCGTAGC(SEQ ID NO.6))，将14.9μL超纯水垂直引入电极上，并在37℃下孵育1小时，以产生大量G重复碱基(双RCA/4-WJ/Apt2-T/Exo/MCH/Apt1/AuNPs/GE)作为扩增产物。
然后将建立的双RCA/4-WJ/Apt2-T/Exo/MCH/Apt1/AuNPs/GE电极与包含1mM MB、10mM HEPES(pH 8.0)和100mM KCl的5μL MB溶液在37℃下孵育2小时来形成MB/G四联体结构。最后，DPV方法用于测量包含20mM KCl的20mM HEPES(pH 8.0)中MB/G-四链体结构的最终电信号，相关参数为：电位为-0.1V至-0.6V；脉冲周期：0.1s；振幅：0.01V；脉冲宽度：0.05s。此外，在含有100mM KCl的10mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液的电化学缓冲液中，分别通过CV(电位：-0.1V–0.6Vand扫描速率：0.1V/s)和EIS(频率：0.1–105Hz)方法记录电极表面的整个改性过程。所有电化学测定均使用由铂对电极、饱和甘汞参比电极和装饰金工作电极组成的经典三电极系统进行。所有实验都要重复三次。
在图3中B，显示在改性电极的不同相中测量了DPV峰值电流。在MCH/Apt1/AuNPs/GE形成后，观察到代表MB非特异性吸附的DPV信号(曲线a)。在分别不存在1×106个颗粒/mLMCF-7外泌体和Phi29 DNA聚合酶的情况下，添加双RCA产物后，DPV信号仅略有增加(曲线b和d)。与没有AuNPs电定位(曲线c)和基于新修饰的F1链的单个RCA反应(曲线e)相比，包含AuNPs电子定位和双RCA反应的外泌体测量可以导致DPV信号的显著增加(曲线f)。
电化学适体传感器的修饰在含有100mM KC的10mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行了进一步表征，包括两种有效的技术，CV和EIS。图3中C显示了引入的适体传感器的逐步装饰的CV结果。对于纯GE，可以看到两个氧化还原峰(曲线a)。在裸露的GE上电沉积AuNPs后，氧化还原峰增大，电势差略有减小(曲线b)，表明AuNPs已在电极上成功生成，并且在电子转移方面表现良好。在依次添加Apt1、MCH、MCF-7外泌体、4-WJ的四种组分和MB分子后，氧化还原峰开始下降，因为传感表面上[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原探针的电子转移受到生物分子和DNA带负电荷的磷酸主链的阻碍。
与CV的峰值电流类似，随着GE的逐步修饰，EIS的电子转移电阻(Rct)也表现出相应的变化趋势。反映电极界面变化的Rct值可以用EIS曲线的半圆直径来表示。如图3中D所示，具有小半圆直径和长尾的裸GE表现出优异的电子导电性和扩散性(曲线a)。与CV的变化一致，AuNPs电沉积显著促进了电子转移速率，导致EIS曲线几乎是直的(曲线b)。随后，半圆直径随着每个电极改性步骤而逐渐增大(曲线c、d、e、f、g、h和i)，显示出对电子传输的障碍越来越大，所有这些发现都证实了所提出的适体传感器是成功构建的。
实施例4、实验条件的优化
固定在AuNPs/GE上的巯基化Apt1的密度可以通过改变添加到电极表面的Apt1浓度来调节。如图4中A所示，将范围从200到2000nM的不同Apt1浓度滴到电极表面上。在37℃下孵育过夜和随后的步骤后，通过DPV测量MB/G-四链体的电流信号，最大信号出现在Apt1浓度为1000nM时。此外，信号随着Apt1浓度的增加而降低，表明1000nM是最佳的Apt1浓度。此外，K+浓度也进行了调整，如图4中B所示，因为K+在G-quadruplex的发育中发挥着关键作用，G-quadryplex能够捕获大量MB指标并最终增加信号。选择以下浓度作为候选浓度：0、50、100、150和200mM。DPV值随着K+浓度的变化而变化，直到在100mM达到最大值，然后逐渐下降，表明这是理想的K+浓度。
图4中C为不同时间信号的变化。结果显示信号随着反应时间从0.5小时增加到1.5小时而增加，并从1.5小时逐渐下降到2.5小时，这表明1.5小时被认为是在电极表面捕获外来体的理想反应时间。与此类似，由于Apt2-T同时作为4-WJ结构的引发剂和靶链，因此还检查了MCF-7外泌体和Apt2-T之间的反应时间。图4中D显示，随着反应时间的延长，信号变化先上升后下降，表明2.5小时是Apt2-T链与外泌体结合的合适时间。此外，孵育时间，包括0.5、1、1.5、2和2.5小时，分别应用于适体传感器，以估计RCA反应时间的影响。信号在1小时达到峰值，然后逐渐减弱，如图4中E所示。结果，确定合适的RCA反应时间为1小时。这些发现表明，空间位阻使延长反应时间变得无用。
此外，捕获MCF-7外泌体和Apt2-T链的最佳反应温度是独立确定的。在图4中F和4中G所示的候选温度中，37℃是两种操作最合适的反应温度。因此，选择37℃作为适体传感器方法的最佳温度。
实施例5、电化学传感器的电化学性能
使用实施例4优化的最佳条件下测定所制备的生物传感器的准确定量。通过将一系列浓度的MCF-7外泌体添加到CB溶液中并分别监测其相关的DPV信号，结果如图5所示。结果显示，电流信号随着MCF-7外泌体浓度的变化而变化。信号随着靶MCF-7外泌体浓度的增加而逐渐增加，与MCF-7外来体浓度的对数在1×102-1×107粒子/mL范围内呈线性关系。线性拟合方程为I＝0.07657LgC+0.0997(I代表DPV电流信号，C是MCF-7外泌体的浓度，R2＝0.98135)。根据3σ/k规则(其中σ是空白信号的标准偏差(SD)，k是线性方程斜率)，计算出该适体传感器的检测限(LOD)为20个粒子/mL。与先前报道的用于外来体检测的其他生物传感器技术相比，我们的适体传感器表现出了具有较低LOD和相对较大检测线性范围的吸引人的性能，有望以极低的外来体浓度进行癌症早期诊断。这可能有助于4-WJ触发的双RCA辅助MB/G-四链体策略的优秀扩增能力。
传感器的特异性：评估所创建的适体传感器的特异性是进一步评估其性能的一个重要方面。因此，来源于五种细胞系的不同外泌体被用于通过将外泌体分为七组来验证适体传感器的选择性，即不含外泌体的空白对照、MCF-10a外泌体、BMSC外泌体，HepG2外泌体(A-375外泌体)、MCF-7外泌体和包括五种外泌体类型的外泌体混合物。这些外泌体的浓度为1×105个粒子/mL，高于LOD，以确保这些结果的可信度。如图5中A所示，在没有靶MCF-7外泌体的四组中产生的DPV信号与对照信号无法区分。相反，在含有MCF-7外泌体的另外两组中，信号显著增加。此外，在对这七组的结果进行统计分析后，MCF-7外泌体组的结果与除混合物组外的其他组的结果显著不同(P<0.0001)(图5中B)。此外，当MCF-7外泌体与上述四种外泌体类型混合时，信号与MCF-7外来体组的信号相似。因此，所提出的策略表现出靶MCF-7外泌体从非特异性干扰中的特异性分化，这可能是由于适体传感器上的两个适体三明治型和4-WJ结构。
传感器的重复性和稳定性：通过用三个相同的电极测量每个浓度的MCF-7外泌体来评估所制备的生物传感器的再现性。结果显示，MCF-7外泌体在1×102、1×103、1×104和1×105粒子/mL下的电流信号的相对标准偏差(RSD)分别为2.25％、1.71％、1.24％和2.11％。这些结果证实了所提出的适体传感器的充分再现性。
此外，还对引入的适配体传感器的稳定性进行了评估。在28天的过程中，使用四组相同修饰的电极(MCH/Apt1/AuNPs/GE)，制备并储存在4℃的PBS中，每7天检测相同数量的MCF-7外泌体。如图5中C所示，在28天内，随着电极保存时间的延长，DPV信号逐渐降低。具体而言，信号保持在初始信号(n＝3)的98.75％(第7天)、95.89％(第14天)、87.50％(第21天)和83.39％(第28天)内，RSD分别为1.04％、2.15％、2.04％和1.24％(表S8)。这表明所提出的适体传感器足够稳定，可以长期使用。
人血清中MCF-7外泌体的测定：将来自四名健康志愿者的全血样品在室温下以3500rpm离心10分钟，以收集浅黄色上清液作为血清。然后，通过将收集的血清与相同体积的CB溶液混合来制备2倍稀释的血清。使用DPV方法对含有不同量外泌体的MCF-7外泌体血清样品进行定量。对于每个浓度，进行三次检测，最终信号值为三个值的平均值。测量的MCF-7外泌体浓度是通过将平均电流值代入先前的线性拟合方程来确定的，如表1所示。
表1、检测不同浓度的MCF-7外泌体
结果显示，不同浓度的MCF-7外泌体(即1×102、1×103、1×104和1×105颗粒/mL)的回收率分别为100.5％、110.3％、110％和114.2％，RSD分别为4.54％、5.93％、1.35％和2.87％。结果揭示了制造的具有极端性质的适体传感器的潜在临床应用，这易于促进癌症的早期诊断和监测。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (8)
1.基于4-WJ结构触发的双重RCA扩增的电化学外泌体检测体系，其特征在于：电化学外泌体检测体系包括电化学传感器的工作电极，DNA四向连接结构，RCA扩增体系和亚甲基蓝反应溶液；所述工作电极为功能化AuNPs修饰的电极；
所述功能化AuNPs修饰的电极为AuNPs修饰的电极表面连接特异识别外泌体的适配体1；
所述DNA四向连接结构包括与外泌体识别的适配体2DNA链，U链构成的分子信标探针以及由F链和M链构成的二元DNA探针；所述适配体2DNA链分别与F链和M链互补，所述U链与F链和M互补，杂交能形成DNA四向连接结构；
所述亚甲基蓝反应溶液包括含1mM亚甲基蓝、pH 8.0、10mM HEPES和100mM KCl。
2.根据权利要求1所述基于4-WJ结构触发的双重RCA扩增的电化学外泌体检测体系，其特征在于：所述适配体1核酸链的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述基于4-WJ结构触发的双重RCA扩增的电化学外泌体检测体系，其特征在于：所述适配体2DNA链的序列如SEQ ID NO.2所示；所述U链的序列如SEQ ID NO.3所示；所述F链的序列如SEQ ID NO.4所示；所述M链的序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求1所述基于4-WJ结构触发的双重RCA扩增的电化学外泌体检测体系，其特征在于：所述RCA扩增体系包括浓度为10U/μL的phi29 DNA聚合酶，10mM dNTPs，20mg/mL牛血清白蛋白、10×phi29DNA聚合酶反应缓冲液，富含C碱基的cDNA。
5.利用权利要求1～4任一项所述电化学外泌体检测体系检测外泌体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)功能化AuNPs修饰的电极的制备：将金电极抛光后在HAuCl4溶液中电沉积得到AuNPs修饰的电极，然后通过Au-S键在电极表面组装硫化的适配体1，再用MCH封闭电极，得到功能化AuNPs修饰的电极；
(2)制备待测血清：将待测全血样品以3500rpm离心10分钟，以收集浅黄色上清液作为待测样品；
(3)电化学方法检测：将制备的功能化AuNPs修饰的电极与含外泌体的待测样品孵育以捕获目标外泌体，用PBS漂洗后与含适配体2的结合缓冲液(1mM CaCl2·2H2O,6mM MgCl2·6H2O,25mM C6H12O6·H2O)孵育形成Apt2-T/Exo/MCH/Apt1/AuNPs/GE，然后加入含有F链、M链和U链的结合缓冲液滴定到电极上，以形成DNA四向连接结构，接着加入RCA反应体系，产生大量G重复碱基，再将电极在亚甲基蓝反应溶液中孵育形成MB/G四联体结构，最后用电化学检测在20mM KCl、pH 8.0、20mM HEPES中MB/G-四链体结构的电信号；
所述结合缓冲液各组分浓度如下：1mM CaCl2·2H2O,6mM MgCl2·6H2O,25mM C6H12O6·H2O。
6.根据权利要求5所述电化学外泌体检测体系检测外泌体的方法，其特征在于：所述RCA反应体系中包括浓度为10U/μL的phi29 DNA聚合酶，10mM dNTPs，20mg/mL牛血清白蛋白、10×phi29DNA聚合酶反应缓冲液，富含C碱基的cDNA。
7.根据权利要求5所述电化学外泌体检测体系检测外泌体的方法，其特征在于：所述电化学检测参数为电位为-0.1V至-0.6V；脉冲周期：0.1s；振幅：0.01V；脉冲宽度：0.05s。
8.根据权利要求5所述电化学外泌体检测体系检测外泌体的方法，其特征在于：所述电化学检测使用功能化AuNPs修饰的电极为工作电极，铂对电极、饱和甘汞参比电极组成的三电极系统。
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| CN202311305928.6A Active CN117330748B (zh) | 2023-10-10 | 2023-10-10 | 基于4-wj结构触发的双重rca扩增的电化学外泌体检测体系及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117330748B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140057252A1 (en) * | 2006-03-31 | 2014-02-27 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Binary DNA Probe for Fluorescent Analysis of Nucleic Acids |
| CN109655512A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-04-19 | 南京鼓楼医院 | 一种基于适配体与滚环扩增的外泌体检测方法 |
| CN111521782A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-08-11 | 上海市中医医院 | 一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法 |
-
2023
- 2023-10-10 CN CN202311305928.6A patent/CN117330748B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140057252A1 (en) * | 2006-03-31 | 2014-02-27 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Binary DNA Probe for Fluorescent Analysis of Nucleic Acids |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MAHMOUD LABIB ET AL.: "Four-Way Junction Formation Promoting Ultrasensitive Electrochemical Detection of MicroRNA", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》, 18 September 2013 (2013-09-18), pages 9422 * |
| MAHMOUD LABIB ET AL.: "Protein Electrocatalysis for Direct Sensing of Circulating MicroRNAs", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》, 14 December 2014 (2014-12-14), pages 1395 - 1403 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117330748B (zh) | 2024-05-07 |
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