KR102117159B1 - 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법 - Google Patents
형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지질막 염색제(lipid membrane fluorescent dye)를 이용해 엑소좀을 염색시킨 다음, 형광 편광 값을 분석하여 엑소좀을 정량 하는 방법, 상기 방법을 이용하는 엑소좀 염색 및 정량용 키트 및 암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
본 발명의 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법은 모든 반응이 세척 없이 단일 튜브에서 이루어지며, 복잡한 과정 없이 신속하고 효율적으로 엑소좀을 염색 및 정량 할 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 상용키트에 비해 높은 정밀도와 재현성으로 암 세포 및 정상 세포에서 분비되는 엑소좀을 성공적으로 정량화 하였으며, 암 세포에서 증가된 엑소좀을 효과적으로 측정 가능하므로, 암의 조기 진단을 신속하고 간단하게 수행할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법은 모든 반응이 세척 없이 단일 튜브에서 이루어지며, 복잡한 과정 없이 신속하고 효율적으로 엑소좀을 염색 및 정량 할 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 상용키트에 비해 높은 정밀도와 재현성으로 암 세포 및 정상 세포에서 분비되는 엑소좀을 성공적으로 정량화 하였으며, 암 세포에서 증가된 엑소좀을 효과적으로 측정 가능하므로, 암의 조기 진단을 신속하고 간단하게 수행할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지질막 염색제(lipid membrane staining dye)를 이용해 엑소좀을 염색시킨 다음, 형광 편광 값을 분석하여 엑소좀을 정량 하는 방법, 상기 방법을 이용하는 엑소좀 염색 및 정량용 키트 및 암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
질병 진단 및 치료 모니터링에 대한 새로운 접근법은 최소한의 합병증으로 반복적으로 편리하게 수득할 수 있는 순환 바이오 마커를 개발하는 것이다. 이러한 유형의 기술을 액체 생검(liquid biopsy)이라고 하며, 전통적인 생검에 비해 침습성이 낮아서 암과 같은 질병에 대한 차세대 진단 및 모니터링 도구로 부상하고 있다 (R.M. Johnstone, Blood Cells Mol. Dis., 2006, 36, 315; H. Im, et al., Nat. Biotechnol., 2014, 32, 490; N. Zarovni, et al., Methods., 2015, 87,46).
부모세포(parental cells)에 의해 분비되고 체액에서 순환되는 엑소좀(exosome; 직경 30-200 nm)은 부모세포와 동일한 게놈 및 프로테옴 정보를 가지고 있기 때문에 특별한 주목을 받고 있으며, 엑소좀은 대부분의 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체(membrane vesicle)이다. 이 엑소좀 안에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있는 것이 보고된 바 있다. 특히 혈청 내에는 과량의 RNA 분해 효소(RNase)가 존재하므로 세포로부터 분비되는 유전물질들이 쉽게 분해되어 측정하기 쉽지 않은 반면, 엑소좀 안에 존재하는 RNA의 경우에는 RNA 분해효소로부터 보호되어 안정적으로 존재하는 것이 알려져 있다. 이와 같이, 조직 또는 세포 유래 엑소좀은 엑소좀을 분비한 조직 또는 세포의 상태를 반영하기 때문에, 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고된 바 있다. 또한, 엑소좀은 비침습성 암 진단을 위해 엑소좀이 분비된 세포를 대신하여 바이오마커로 사용 가능하다는 연구가 증가하고 있으며(D.D. Taylor, S.Shah, Methods., 2015, 87, 3), 암 진단에서의 엑소좀의 역할이 증가하고 있으므로 임상에서 전통적인 생검을 대신할 수 있을 것으로 기대되고 있다 (S. Jia , et al., Expert Rev. Mol. Diagn., 2014, 14, 307).
현재 많은 연구자들에 의해 단백질과 핵산 등과 같은 엑소좀 바이오마커의 간소화된 분석을 위한 연구가 이루어지고 있다 (G. Brock, E. et al., Transl. Cancer Res., 2015, 4, 280). 예를 들어, 앱타머 패널이 결합된 금 나노입자를 이용하여 엑소좀 표면 단백질 검출을 위한 비색분석법(colorimetric analysis)이 연구되었으며, 상기 연구에서 특정 엑소좀 존재 시에, 엑소좀 단백질 마커에 친화력을 가지고 있는 앱타머는 금 나노입자에서 분리되어 특정 비색 패턴을 생성하게 된다 (Y. Jiang, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 11916). 다른 연구에서, 약물 치료 효능과 관련된 엑소좀 mRNA을 분석하기 위해 엑소좀 분리, RNA 추출 및 실시간 PCR과 같이 세 개의 기능적 모듈로 구성된 면역 자성 엑소좀 RNA(immuno-magnetic exosome RNA; iMER)으로 불리우는 미세유체 플랫폼이 개발되었다 (S. Jeong, et al., ACS nano., 2016, 10, 1802).
전반적으로, 엑소좀 바이오 마커 분석을 위한 최신 기술의 대부분은 암 모니터링 및 진단을 위한 연구가 증가하고 있으며, 엑소좀은 정상 세포에 비해 암 세포로부터 분비가 증가된다는 사실에 입증하여, 엑소좀 수준은 암 또는 암 재발의 조기 진단을 위해 사용될 수 있다는 보고가 있다 (F. Cappello,et al., Eur. J. Pharm. Sci., 2017 ,96, 93; T.B. Schaaij-Visser, et al., Biochim. Biophys Acta Proteins Proteom., 2013, 1834, 2242; E.R. Sauter, Transl. Cancer Res., 2017, 6, S1394).
하지만, 엑소좀 바이오마커의 분석은 상당한 진보에도 불구하고, 엑소좀 정량에 있어서 엑소좀 바이오마커의 다운 스트림 분석을 위한 핵심 기술은 여전히 기술적 과제로 남아있다. 현재까지, 나노입자 추적 분석, 유동 세포 계측법 및 TRPS(Tunable Resistive Pulse Sensing)를 포함하는 직접적인 입자 계수 시스템이 사용되고 있으나, 대부분의 실험실에서 거의 사용되지 않는 정교한 기술 및 특별하고 부피가 큰 도구의 요구는 광범위하고 실제적인 적용을 크게 제한하는 문제점이 있다 (E. Van der Pol, et al., J. Thromb. Haemost., 2014, 12, 1182).
이를 위한 대안으로, 엑소좀 내 풍부한 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase; AChE)에 의존하는 EXOCET 엑소좀 정량 키트(EXOCET exosome quantification kit, Systems Biosciences)라는 상용 키트가 개발되었다 (R.M.Johnstone, et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 9412; J. Conde-Vancells,et al., Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 2010, 6, 543; G.I. Lancaster, M.A. Febbraio, J. Biol. Chem., 2005, 280, 23349; A. Savina, et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 20083). AChE는 모든 엑소좀에 존재하는 것으로 알려져 있고, 비색반응으로 아세틸콜린의 가수분해를 촉진하기 때문에 간단하고 빠른 엑소좀 정량화에 점점 더 많이 이용되는 추세이다. 상업용 키트는 훌륭한 분석 성능으로 총 분석 시간을 단축하지만, 여전히 엑소좀 용해, 원심분리 및 비색 신호를 형성하는 효소 반응과 같은 복잡한 단계를 수반하며, 더 심각하게는 독점적인 문제로 꽤 비싼(단일분석의 경우 $ 6) 문제점이 있다. 따라서, 엑소좀을 신뢰적으로 측정할 수 있는 간단하고 비용 효율적인 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명에서는 신속하고 비용 효율적인 엑소좀 염색 및 정량 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 고가의 시약과 별도의 세척 단계가 필요하지 않는 엑소좀 염색 및 정량 방법을 개발하였다. 본 발명에서 개발된 시스템은 알킬기를 포함하는 지방족 및 형광체로 구성된 지질막 염색제의 형광 편광(fluorescence polarization) 검출을 이용한 것으로, 엑소좀에 존재하는 인지질 막에 상기 지질막 염색제가 삽입되어 느린 확산 속도로 인해 높은 형광 편광 값을 유도하는 것을 확인하였으며, 본 발명의 시스템은 모든 반응이 세척 없이 단일 튜브에서 이루어지며, 복잡한 과정 없이 신속하고 효율적으로 엑소좀을 정량 할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 시스템을 이용하여 암 세포 및 정상 세포에서 분비되는 엑소좀을 성공적으로 정량화 하였으며, 암 세포에서 증가된 엑소좀을 효과적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 형광 편광법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 이용하고, 지질막 염색제를 포함하는 엑소좀 정량용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 이용한 암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 엑소좀 및 지질막 염색제를 반응 시켜, 엑소좀을 염색시키는 단계; 및 (c) 형광 편광(fluorescence polarization) 값을 측정하여 엑소좀을 정량 하는 단계;를 포함하는 형광 편광법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법을 제공한다.
본 발명에 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 지질막 염색제는 알킬기를 포함하는 지방족 및 형광체로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 형광체는 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(Fluorescein isothiocyanate; FITC) 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서, 상기 (b) 단계의 지질막 염색제는 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트-컨쥬게이티드 페길레이티드 모노아실 리피드(Fluorescein isothiocyanate conjugated PEGylated monoacyl lipid; FITC-C18-PEG), 1, 2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Polyethylene glycol; DSPE- PEG), 콜레스테롤-폴리에틸렌 글리콜(cholesterol-Polyethylene glycol; Cholesterol-PEG), PKH67 레드 플루오레센트 셀 링커(Red Fluorescent Cell Linker), 펑션 스페이서 리피드-플루오레세인(Function Spacer Lipid-Fluorescein; FSL-Fluorescein), 엔-(플루오레세인-5-티오카르바모일)-1,2-디헥사데칸오일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민(N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; Fluorescein DHPE) 및 5-도데카노일아미노 플로오레세인(5-dodecanoylamino fluorescein; C12-FAM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서, 상기 (c) 단계는 (ⅰ) 엑소좀 표준물질을 농도별로 희석하여 준비한 다음, 지질막 염색제와 함께 반응시킨 후, 형광 편광을 측정하여 표준곡선을 작성하는 단계; 및 (ⅱ) 시료에서 분리한 엑소좀에 대한 형광 편광 값을 표준곡선에 대입하여 엑소좀 수를 정량 하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서, 상기 형광 편광은 여기 파장 485 nm, 방출 파장 528 nm 조건으로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 엑소좀 염색 및 정량 방법을 이용하고, 지질막 형광염료를 포함하는 엑소좀 염색 및 정량 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 키트는 표준곡선 작성을 위한 엑소좀 표준물질을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 환자의 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 엑소좀 및 지질막 염색제를 반응 시켜, 엑소좀을 염색시키는 단계; 및 (c) 형광 편광(fluorescence polarization) 값을 측정하여 엑소좀을 정량 하는 단계;를 포함하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 암은 대장암, 치종암, 혈액암, 후두암, 식도암, 구강암, 기저세포암, 담도암, 갑상선암, 직장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 일실시예에서, 상기 (b) 단계의 지질막 염색제는 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트-컨쥬게이티드 페길레이티드 모노아실 리피드(Fluorescein isothiocyanate conjugated PEGylated monoacyl lipid; FITC-C18-PEG), 1, 2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Polyethylene glycol; DSPE- PEG), 콜레스테롤-폴리에틸렌 글리콜(cholesterol-Polyethylene glycol; Cholesterol-PEG), PKH67 레드 플루오레센트 셀 링커(Red Fluorescent Cell Linker), 펑션 스페이서 리피드-플루오레세인(Function Spacer Lipid-Fluorescein; FSL-Fluorescein), 엔-(플루오레세인-5-티오카르바모일)-1,2-디헥사데칸오일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민(N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; Fluorescein DHPE) 및 5-도데카노일아미노 플로오레세인(5-dodecanoylamino fluorescein ; C12-FAM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서, 상기 (c) 단계는 (ⅰ) 엑소좀 표준물질을 농도별로 희석하여 준비한 다음, 지질막 염색제와 함께 반응시킨 후, 형광 편광을 측정하여 표준곡선을 작성하는 단계; 및 (ⅱ) 생물학적 시료에서 분리한 엑소좀에 대한 형광 편광 값을 표준곡선에 대입하여 엑소좀 수를 정량하고, 정상 대조군에서 분리한 엑소좀 수와 비교하여 엑소좀의 수가 증가한 경우를 암으로 판별하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법은 모든 반응이 세척 없이 단일 튜브에서 이루어지며, 복잡한 과정 없이 신속하고 효율적으로 엑소좀을 염색 및 정량 할 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소좀 염색 및 정량 방법은 상용키트에 비해 높은 정밀도와 재현성으로 암 세포 및 정상 세포에서 분비되는 엑소좀을 성공적으로 정량화 하였으며, 암 세포에서 증가된 엑소좀을 효과적으로 측정 가능하므로, 암의 조기 진단을 신속하고 간단하게 수행할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 형광 편광법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 HT-29 세포로부터 분리된 엑소좀을 관찰한 결과이다 (A 및 B : SEM 이미지, C : 엑소좀 분포도).
도 3은 EXOCET 엑소좀 정량 키트(EXOCET exosome quantification kit)를 이용하여 HT-29 세포로부터 분리된 엑소좀을 정량한 결과이다.
도 4는 형광 편광법을 이용하여 HT-29 세포로부터 분리된 엑소좀을 정량한 결과이다 (A : 표준 엑소좀을 이용한 검정곡선(회색선: C12-FAM, 빨간선 : FAM), B 및 C : 엑소좀 염색 여부를 형광현미경을 통해 관찰한 사진).
도 5는 C12-FAM 및 엑소좀 배양시간에 따른 현광 편광값을 측정한 결과이다.
도 6은 TCMK-1 세포로부터 분리된 엑소좀을 관찰한 결과이다 (A 및 B : SEM 이미지, C : 엑소좀 분포도).
도 7은 정상세포(TCMK-1) 및 암세포(HT-29)에서 분비되는 엑소좀을 본 발명의 형광 편광법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법으로 측정한 결과이다.
도 2는 HT-29 세포로부터 분리된 엑소좀을 관찰한 결과이다 (A 및 B : SEM 이미지, C : 엑소좀 분포도).
도 3은 EXOCET 엑소좀 정량 키트(EXOCET exosome quantification kit)를 이용하여 HT-29 세포로부터 분리된 엑소좀을 정량한 결과이다.
도 4는 형광 편광법을 이용하여 HT-29 세포로부터 분리된 엑소좀을 정량한 결과이다 (A : 표준 엑소좀을 이용한 검정곡선(회색선: C12-FAM, 빨간선 : FAM), B 및 C : 엑소좀 염색 여부를 형광현미경을 통해 관찰한 사진).
도 5는 C12-FAM 및 엑소좀 배양시간에 따른 현광 편광값을 측정한 결과이다.
도 6은 TCMK-1 세포로부터 분리된 엑소좀을 관찰한 결과이다 (A 및 B : SEM 이미지, C : 엑소좀 분포도).
도 7은 정상세포(TCMK-1) 및 암세포(HT-29)에서 분비되는 엑소좀을 본 발명의 형광 편광법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법으로 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 엑소좀을 이용한 암 진단 방법에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으나, 훌륭한 분석 성능을 가진 상업용 엑소좀 정량 키트의 경우에도 여전히 엑소좀 용해, 원심분리 및 비색 신호를 형성하는 효소 반응과 같은 추가 단계가 필요하며 비용이 비싼 단점이 있다.
본 발명에서는 형광 편광법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법이 신속하고 비용 효율적으로 엑소좀을 정량 할 수 있음을 확인함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 또한, 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 높은 정밀도와 재현성으로 암 세포 및 정상 세포에서 분비되는 엑소좀을 성공적으로 정량화 하였으며, 암 세포에서 증가된 엑소좀을 효과적으로 정량 하였다.
따라서, 본 발명은
(a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 엑소좀 및 지질막 염색제를 반응 시켜, 엑소좀을 염색시키는 단계; 및
(c) 형광 편광(fluorescence polarization) 값을 측정하여 엑소좀을 정량 하는 단계;
를 포함하는 형광 편광법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명의 엑소좀 염색 및 정량 방법은 액체 생검(liquid biopsy)을 통해 수행할 수 있으며, 본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 엑소좀이 포함된 것으로 알려진 생물학적 시료를 이용할 수 있다.
본 발명의 엑소좀 염색 및 정량 방법은 도 1에 모식도로 나타내었으며, 지질막 염색제를 핵심 검출 구성 요소로 사용한다. 상기 지질막 염색제(lipid membrane staining dye)는 (i) 형광 편광 값을 생성하는 형광물질 및 (ⅱ) 엑소좀 멤브레인에 부착하는 알킬기를 포함하는 지방족으로 구성되며, 알킬기를 포함하는 지방족은 친유성 꼬리(lipophilic tail)로, 엑소좀의 인지질 이중층에 특이적으로 삽입되면 느린 확산 운동으로 인해 높은 형광 편광값이 생성된다. 형광 편광 시그널은 본질적으로 비율계량 방식(ratiometric)으로 환경 노이즈에 견고하므로, "혼합 및 판독(mix-and-read)"분석이 가능한 장점이 있으며, 본 발명의 엑소좀 염색 및 정량 방법은 모든 반응이 세척 없이 단일 튜브에서 이루어지기 때문에 실제로 유용하게 사용 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 지질막 염색제(lipid membrane staining dye)는 알킬기을 포함하는 지방족 및 형광체로 구성된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지질막 염색제에서 알킬기를 포함하는 지방족은 지방족 포화탄화수소의 알칸(alkane)에서 수소원자 1개가 빠진 원자단을 의미하며, 엑소좀의 인지질에 특이적으로 삽입될 수 있도록 탄소수 5개 이상이되, 탄소수가 20개 이하인 것이 바람직하다. 하지만, 콜레스테롤과 같이 친유성을 가지며, 지질막에 특이적으로 삽입이 가능한 물질을 제한 없이 사용 가능하다.
상기 형광체는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 바람직하게는 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(Fluorescein isothiocyanate; FITC) 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지질막 염색제는 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트-컨쥬게이티드 페길레이티드 모노아실 리피드(Fluorescein isothiocyanate conjugated PEGylated monoacyl lipid; FITC-C18-PEG), 1, 2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Polyethylene glycol; DSPE- PEG), 콜레스테롤-폴리에틸렌 글리콜(cholesterol-Polyethylene glycol; Cholesterol-PEG), PKH67 레드 플루오레센트 셀 링커(Red Fluorescent Cell Linker), 펑션 스페이서 리피드-플루오레세인(Function Spacer Lipid-Fluorescein; FSL-Fluorescein), 엔-(플루오레세인-5-티오카르바모일)-1,2-디헥사데칸오일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민(N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; Fluorescein DHPE) 및 5-도데카노일아미노 플로오레세인(5-dodecanoylamino fluorescein ; C12-FAM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 5-도데카노일아미노 플로오레세인(5-dodecanoylamino fluorescein ; C12-FAM)일 수 있으나, 지질막을 염색할 수 있는 것으로 알려진 당업계에 공지된 형광 염료를 제한 없이 사용할 수 있다.
좀 더 구체적으로, 상기 (b) 단계는
(ⅰ) 엑소좀 표준물질을 농도별로 희석하여 준비한 다음, 지질막 염색제와 함께 반응시킨 후, 형광 편광을 측정하여 표준곡선을 작성하는 단계; 및
(ⅱ) 시료에서 분리한 엑소좀에 대한 형광 편광 값을 표준곡선에 대입하여 엑소좀 수를 정량 하는 단계;
를 포함할 수 있으며, 상기 표준곡선은 하기 수학식 1로 표기될 수 있다.
[수학식 1]
생물학적 시료 엑소좀 수 = (ΔFP - 절편값)/표준곡선 기울기
상기 ΔFP는 FP-FP0 값으로, FP0 및 FP는 엑소좀의 부재 및 존재에 따른 각각의 형광 편광 수치이다. 상기 절편값은 Y 절편값으로, X(엑소좀 수) = 0 일 때의 형광 편광 값이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 엑소좀 염색 및 정량 방법이 효과적으로 엑소좀을 염색 및 정량 할 수 있는지 확인하기 위해 암세포인 HT-29에서 분비된 엑소좀을 정량 하였다. 먼저, HT-29에서 분비된 엑소좀의 형태를 관찰한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, HT-29 세포로부터 분리된 엑소좀이 둥근형태와 균일한 크기분포(약 200 nm)를 나타내며, 이는 공지된 바와 일치하는 것을 확인하였다 (V. Sokolova, et al., Colloids Surf. B Biointerfaces., 2011, 87, 146).
다음으로, 도 3에 나타난 바와 같이 상업적 EXOCET 엑소좀 정량 키트를 사용하여 HT-29에서 분비된 엑소좀의 개수가 750 x 107인 것을 확인하고 이를 엑소좀 표준물질로 하여 형광 편광 값을 측정하여 표준검정 곡선을 작성하였다.
도 4A에 나타난 바와 같이, FP 신호변화(ΔFP=FP-FP0; 여기서, FP0 및 FP는 엑소좀의 부재 및 존재에 따른 각각 형광 편광 수치임)는 우수한 선형 관계로 엑소좀 표준 수가 증가함에 따라 증가하였으며 (R2=0.99), 검출한계(3σ/slope)는 28 x 107개의 엑소좀 (17.5 x 105 exosomes /㎕)으로 다른 엑소좀 정량 방법과 비슷하거나 더 우수한 것을 확인하였다.
또한, 지질막 염색제의 알킬기를 포함하는 지방족에 해당하는 친유성 꼬리 부분이 엑소좀과의 상호작용에 의해 형광 편광 값이 증가한다는 가정을 확인하기 위해, 알킬기를 갖지 않는 플루오레세인(FAM)을 대조군으로 사용하였으며, 대조군의 경우 엑소좀의 수에 관계없이 거의 일정한 ΔFP를 나타내었다 (P = 0.7775, 편도 분석 (ANOVA). 도 4B 및 도 4C에 나타난 바와 같이 형광 현미경으로 확인한 결과, 엑소좀은 대조군인 FAM에는 염색되지 않고 지질막 염색제인 C12-FAM에 의해서만 염색이 되는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 엑소좀과 C12-FAM 사이의 반응시간을 최적화한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 20분까지 배양시간이 증가함에 따라 ΔFP 값이 증가하였으며, 배양시간 20분 이후에는 ΔFP 값이 더 이상 증가하지 않는 것을 확인하였다. 즉, 상기 결과는 지질막 염색제인 C12-FAM이 엑소좀 인지질에 결합하기 때문에 형광 편광 값이 증가함을 의미하며, 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 단순한 엑소좀 정량화에 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 엑소좀 정량 방법에 대한 정확성을 평가한 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 HT-29 엑소좀 계수의 변동계수(coefficient of variation; CV)는 10% 미만이고 회수율(recovery ratio)은 95% 내지 102%로 우수한 정밀도와 재현성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 정상세포에서 분비된 엑소좀도 본 발명의 엑소좀 정량 방법으로 측정할 수 있는지 확인하고자 하였다. 우선 도 6에 나타난 바와 같이 정상세포인 TCMK-1에서 분비된 엑소좀은 HT-29 엑소좀과 거의 비슷한 모양과 크기(약 200nm)를 가지는 것을 확인하였다. 본 발명의 엑소좀 정량 방법으로 TCMK-1에서 분리된 엑소좀을 정량하여 정확성을 확인한 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 9 % 미만의 변동 계수 (CV) 및 95% 내지 105%의 회수율로 매우 정밀하고 재현성 있게 측정된 것을 나타내었다. 즉, 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 암세포뿐만 아니라 정상세포에서 분비된 엑소좀을 효과적으로 정량 할 수 있는 것을 확인하였으며, 이는 세포 이외의 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담 및 림프액 등과 같이 엑소좀이 존재하는 생물학적 시료에서 효과적으로 엑소좀을 정량 할 수 있는 것을 확인하였다.
본 발명은 또한, 본 발명의 엑소좀 염색 및 정량 방법을 이용하고, 지질막 형광염료를 포함하는 엑소좀 염색 및 정량 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 표준곡선 작성을 위한 엑소좀 표준 물질이 추가로 포함될 수 있으며, 본 발명의 형광 편광법을 이용한 엑소좀 정량 방법에 대해 기재된 매뉴얼이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한,
(a) 환자의 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 엑소좀 및 지질막 염색제를 반응 시켜, 엑소좀을 염색시키는 단계; 및
(c) 형광 편광(fluorescence polarization) 값을 측정하여 엑소좀을 정량 하는 단계;
를 포함하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 대장암, 치종암, 혈액암, 후두암, 식도암, 구강암, 기저세포암, 담도암, 갑상선암, 직장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 방법은 엑소좀의 분비가 증가한다고 알려진 암의 진단에 제한 없이 적용될 수 있다.
구체적으로 , 상기 (c) 단계는
(ⅰ) 엑소좀 표준물질을 농도별로 희석하여 준비한 다음, 지질막 염색제와 함께 반응시킨 후, 형광 편광을 측정하여 표준곡선을 작성하는 단계; 및
(ⅱ) 생물학적 시료에서 분리한 엑소좀에 대한 형광 편광 값을 표준곡선에 대입하여 엑소좀 수를 정량하고, 정상 대조군에서 분리한 엑소좀 수와 비교하여 엑소좀의 수가 증가한 경우를 암으로 판별하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 암 진단을 위한 정보 제공 방법은 본 발명의 형광 편광법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법을 이용한 것으로, 구체적인 내용은 상기에 기재된 바와 동일하다.
암 진단을 좀 더 효율적으로 수행하기 위해 엑소좀의 수는 암과 암 재발의 조기 진단을 위한 가장 신뢰할 수 있는 진단 지표로 연구되고 있다 (F. Cappello, et al., Eur. J. Pharm Sci., 2017, 96, 93; C. Sheridan, Nature Biotechnol., 2016, 34, 359; S. Fais, et al., ACS nano, 2016, 10, 3886). 이에, 본 발명에서는 본 발명의 엑소좀 정량 방법을 이용하여 암 진단을 위한 정보 제공이 가능한지 확인하였다. 암세포인 HT-29 세포 및 정상세포인 TCMK-1에서 분비된 엑소좀을 수득하여 본 발명의 방법으로 엑소좀을 정량한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 암세포는 정상세포보다 엑소좀 분비 비율이 2배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 형광 편광법을 이용한 엑소좀 정량 방법을 이용하여 정확하게 암 진단을 위한 정보 제공이 가능함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법은 별도의 세척 단계 없이 지질막 염색제 및 엑소좀의 반응 단계만 필요하며, 20분 내 정량화가 완료되는 것을 확인하였으므로, 복잡한 과정 없이 신속하고 효율적으로 엑소좀을 정량화할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 상용 키트에 비해 높은 정밀도 및 재현성으로 암세포 및 정상 세포에서 분비되는 엑소좀을 성공적으로 정량화하였다. 하기 표 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 상용키트에 비해 민감도가 높으며, 반응시간이 짧을 뿐만 아니라 더 낮은 비용으로 수행할 수 있는 장점이 있다.
| 본 발명 엑소좀 정량 방법 | EXOCET 엑소좀 정량 키트 | |
| 원리 | 지질막 염색제에 대한 형광 편광 값 측정 |
아세틸콜린에스터라아제 활성에 대한 비색 반응 측정 |
| 민감도 | 17.5 x 105 엑소좀/㎕ | 28.3 x 105 엑소좀/㎕ |
| 반응시간 | 20 분 | 30 분 |
| 비용 | 단일 분석 당 0.01$ | 단일 분석 당 6$ |
나아가, 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 암 세포에서 증가된 엑소좀을 효과적으로 측정 가능하므로, 암의 조기 진단을 신속하고 간단하게 수행할 수 있는 효과가 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
HT-29에서 분비된 엑소좀 분리 및 관찰
1-1 : 엑소좀 분리
본 발명에서는 형광 편광 분석법을 이용한 엑소좀 정량 방법이 효과적인지 확인하기 위해, 암세포인 HT-29에서 분비된 엑소좀을 정량하고자 하였다.
먼저, HT-29 세포(human colon cancer cell line; KCLB 30038, 한국세포주은행)는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, 영인프런티어), 100U/㎖ 페니실린(penicillin, Gibco BRL, 미국) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin, Gibco BRL, 미국)이 포함된 DMEM 배지(Gibco BRL, 미국)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하여 준비하였다.
엑소좀은 ExoQuick-TC 엑소좀 침전용액(ExoQuick-TC exosome precipitation solution, System Biosciences, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 HT-29 세포에서 분리하였다. 간단하게, HT-29 세포를 5% 엑소좀 고갈 소태아혈청(Exosome-depleted fetal bovine serum, System Biosciences, 미국)이 포함된 소포체 고갈 배지(vesicle-depleted medium; IMEM, Gibco BRL, 미국)에서 48시간 동안 배양시킨 다음, 1,500g에서 15분 동안 원심분리하여 세포 및 잔해물이 제거된 세포 배양액을 수득하였다. 배지 상등액을 30 KDa(Macrosep Advance Centrifugal Devices, Pall corporation, 미국)를 통해 농축하고, ExoQuick-TC 엑소좀 침전용액과 혼합하기 위해 새로운 튜브로 옮겼다. 그 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 혼합물을 30분 동안 1,500g에서 원심분리하였으며, 튜브의 바닥에 형성된 펠렛을 PBS(phosphate-buffer saline)에 재현탁시켜 엑소좀을 수득하였다.
1-2 : HT-29에서 분리된 엑소좀 관찰
실시예 1-1에서 분리한 엑소좀은 전자주사현미경(scanning electron microscopy; SEM) 및 동적광란산란(dynamic light scattering; DLS) 분석을 통해 확인하였다. SEM 이미지는 전계방사형 주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope; FE-SEM, HITACHI SU8010, Hitachi corporation, 일본)을 사용하여 측정하였다. 샘플 준비를 위해 엑소좀을 -20℃ 냉동기에서 100% 메탄올 (Sigma-Aldrich, 미국)로 20분간 고정시킨 다음, 고정된 엑소좀을 PBS로 2회 세척한 후, 50%, 70%, 80% 및 95% 농도의 에탄올로 순차적으로 탈수시켰다. 그 다음, 에탄올을 완전히 제거하고 샘플을 실온에서 건조시킨 후, 백금 코팅하여 분석하였다. 크기 분포 측정을 위해, PBS에 용해되어 있는 엑소좀을 DLS(Dynamic Light Scattering, DynaPro Plate Reader, Wyatt Technology, 미국)을 사용하여 분석하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, HT-29에서 분비된 엑소좀의 형태를 관찰한 결과 HT-29 세포로부터 분리된 엑소좀이 둥근형태와 균일한 크기분포(약 200 nm)를 나타내며, 이는 공지된 바와 일치하는 것을 확인하였다 (V. Sokolova, et al., Colloids Surf. B Biointerfaces., 2011, 87, 146).
형광 편광법을 이용한 HT-29에서 분비된 엑소좀 염색 및 정량
2-1 : 상업 키트를 이용한 HT-29 엑소좀 정량
형광 편광법을 이용하여 엑소좀을 정량하기 위해, 엑소좀 표준 곡선을 작성하였다.
먼저, 실시예 1-1에서 분리한 HT-29 엑소좀을 상업적 EXOCET 엑소좀 정량 키트(EXOCET exosome quantification kit, Systems Biosciences, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정량하였다. EXOCET 반응 버퍼를 용해된 엑소좀과 혼합한 다음, 20분 동안 실온에서 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더(SpectraMax iD5 multi-mode microplate reader, Molecular Devices, 미국)을 사용하여 405 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 도 3의 엑소좀 표준 곡선을 이용하여 HT-29 엑소좀을 정량한 결과, HT-29 엑소좀의 수는 750 x 107으로 확인되었다 (흡광도 = 0.9127).
2-2 : 엑소좀 표준정량 곡선 작성
상기와 같이 초기 카운트가 750 x 107으로 결정된 HT-29 엑소좀을 연속 희석하여 표준물질로 준비하였으며, 형광 편광 값을 측정하기 위한 지질막 염색제는 5-도데카노일아미노 플루오레세인(5-dodecanoylamino fluorescein; C12-FAM, Thermo Fisher Scientific, 미국)를 사용하였다.
상기 연속 희석 하여 준비된 HT-29 엑소좀 및 1.6 μM C12-FAM를 1 mM HEPES (pH 8) 및 1.6 mM NaCl로 구성된 160 ㎕ 반응 버퍼에 혼합하여 20분 동안 실온에서 반응시켜 엑소좀을 염색시킨 다음, 형광 편광 값을 마이크로플레이트 리더(SpectraMax iD5 multi-mode microplate reader, Molecular Devices, 미국)을 사용하여 여기 파장 485 nm, 방출 파장 528 nm으로 측정하였다.
측정된 형광 편광 값으로 HT-29 엑소좀에 대한 표준 곡선을 작성하였으며, 도 4A에 나타난 바와 같이, FP 신호변화(ΔFP=FP-FP0; 여기서, FP0 및 FP는 엑소좀의 부재 및 존재 하에 각각 형광 편광임)는 우수한 선형 관계로 엑소좀 표준 수가 증가함에 따라 증가하였으며 (R2=0.99), 검출한계(3σ/slope)는 28 x 107개의 엑소좀 (17.5 x 105 exosomes /㎕)으로 다른 엑소좀 정량 방법과 비슷하거나 더 우수한 것을 확인하였다 (J. De Vrij, et al., Nanomedicine., 2013, 8, 1443).
지질막 염색제의 친유성 꼬리와 엑소좀의 상호작용에 의해 C12-FAM의 FP 값이 증가한다는 가정을 확인하기 위해, 알킬기를 갖지 않는 플루오레세인(fluorescein; FAM, Sigma-Aldrich, 미국)을 대조군으로 사용하였다. 대조군의 경우 엑소좀의 수에 관계 없이 거의 일정한 ΔFP를 나타내었다 (P = 0.7775, 편도 분석 (ANOVA)).
실제로 HT-29 엑소좀이 C12-FAM 및 대조군인 FAM에 의해 염색이 되었는지 확인하기 위해 형광 현미경으로 관찰한 결과, 도 4B 및 도 4C에 나타난 바와 같이, 엑소좀은 FAM에는 염색되지 않고 C12-FAM에 의해서만 염색되는 것을 확인하였다.
엑소좀 및 지질막 염색제 최적 반응 시간 확인
엑소좀과 지질막 염색제의 최적 반응시간을 확인하기 위해, 100 x 107 개의 HT-29 엑소좀 및 1.6 μM C12-FAM를 1 mM HEPES (pH 8) 및 1.6 mM NaCl로 구성된 160 ㎕ 반응 버퍼에 혼합하고, 10분, 15분, 20분, 25분 및 30분 동안 각각 실온에서 반응시켜 엑소좀을 염색 시킨 다음, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 형광 편광 값을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 반응 시간 20분 까지 시간이 증가함에 따라 ΔFP 값이 증가하였으며, 반응 시간 20분 이후에는 ΔFP 값이 더 이상 증가하지 않는 것을 확인하였다.
형광 편광법을 이용한 엑소좀 정량 방법에 대한 정확성 확인
본 발명의 형광 편광법을 이용한 엑소좀 정량 방법의 정확성을 평가하기 위해, 실시예 1-1에서 분리한 HT-29 엑소좀을 동일한 양으로 두개로 나누어 분할하여 4세트를 준비하였다. 분할된 엑소좀을 각각 상용 EXOCET 엑소좀 정량 키트(EXOCET exosome quantification kit) 및 본 발명의 엑소좀 정량 방법을 이용하여 정량하였다.
상용키트는 포함된 메뉴얼에 따라, 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 실시예 2-2와 동일한 방법으로 수행하였으며, 두 경우 모두 이미 농도를 알고 있는 엑소좀을 표준물질로 하여 표준곡선을 작성하고, 작성된 표준 곡선을 이용하여 상기 분할된 4 세트의 엑소좀 수를 정량하였다.
| 샘플 번호 | 상용 키트 (x107) | 본 발명 엑소좀 정량 방법 (x107) | SDa | CV (%)b | 회수율 (%)c |
| 1 | 248 | 247 | 18.7 | 7.6 | 99.7 |
| 2 | 360 | 343 | 12.4 | 3.6 | 95.3 |
| 3 | 550 | 558 | 54.2 | 9.7 | 101.5 |
| 4 | 760 | 765 | 3.6 | 0.5 | 100.7 |
a : 3번 측정값 대한 표준편차(Standard deviation)
b : 변동 계수(Coefficient of variation) = SD/mean × 100
c : 본 발명 정량 방법 / 상용키트 × 100
표 2에 나타난 바와 같이, 상용 키트와 비교하였을 때 본 발명의 엑소좀 정량 방법으로 측정한 HT-29 엑소좀 계수의 변동계수(coefficient of variation; CV)는 10% 미만이고 회수율(recovery ratio)은 95% 내지 102%로 우수한 정밀도와 재현성을 나타내었다.
TCMK-1에서 분비된 엑소좀의 정량 및 정확성 확인
5-1 : TCMK-1에서 분비된 엑소좀 분리 및 관찰
본 발명에서는 형광 편광 분석법을 이용한 엑소좀 정량 방법이 보편적 적용이 가능한지 확인하기 위해, 정상세포인 TCMK-1에서 분비된 엑소좀을 정량하고자 하였다.
TCMK-1(Mus musculus kidney normal; KCLB 10139, 한국세포주은행)는 10% 소태아혈청(Exosome-depleted fetal bovine serum), 100U/㎖ 페니실린(penicillin, Gibco BRL, 미국) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin, Gibco BRL, 미국)이 포함된 DMEM 배지(Gibco BRL, 미국)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하여 준비하였다.
상기 준비된 TCMK-1 세포에서 실시예 1-1과 동일한 방법으로 엑소좀을 분리한 다음, 상기 실시예 1-2과 같이 전자주사현미경(scanning electron microscopy; SEM) 및 동적광란산란(dynamic light scattering; DLS) 분석을 통해 분리된 엑소좀을 관찰하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, HT-29 엑소좀과 거의 비슷한 모양과 크기(약 200 nm)를 가지는 것을 확인하였다.
5-2 : 형광 편광법을 이용한 엑소좀 정량 및 정확성 확인
본 발명의 엑소좀 정량 방법으로 상기 실시예 5-1에서 분리한 TCMK-1 엑소좀의 정량 및 정량 방법의 정확성을 확인하고자 하였다.
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 TCMK-1 엑소좀을 동일한 양으로 두개로 나누어 분할하여 총 4세트를 준비한 다음, EXOCET 엑소좀 정량 키트(EXOCET exosome quantification kit) 및 본 발명의 엑소좀 정량 방법을 이용하여 정량하였다.
| 샘플 번호 | 상용 키트 (x107) | 발명 엑소좀 정량 방법 (x107) | SDa | CV (%)b | 회수율(%)c |
| 1 | 130 | 124 | 8.4 | 6.8 | 95.1 |
| 2 | 179 | 189 | 16.7 | 8.9 | 105.4 |
| 3 | 310 | 305 | 25.4 | 8.3 | 98.4 |
| 4 | 365 | 370 | 3.3 | 0.9 | 101.5 |
a : 3번 측정값 대한 표준편차(Standard deviation)
b : 변동 계수(Coefficient of variation) = SD/mean × 100
c : 본 발명 정량 방법 / 상용키트 × 100
표 3에 나타난 바와 같이, 9 % 미만의 변동 계수 (CV) 및 95 % 내지 105 %의 회수율로 매우 정밀하고 재현성있게 측정된 것을 나타내었다. 즉, 본 발명의 엑소좀 정량 방법은 엑소좀 측정을 안정적으로 수행할 수 있는 것을 분명하게 확인하였다.
형광 편광법 기반 엑소좀 정량 방법을 이용한 암 진단을 위한 정보 제공
본 발명의 형광 편광법을 이용한 엑소좀 정량 방법이 암 진단에 활용될 수 있는지 확인하기 위해, 암세포인 HT-29 및 정상세포인 TCMK-1에서 분비된 엑소좀을 형광 편광법을 이용하여 정량하였다.
먼저, 상기 HT-29 세포 및 TCMK-1 세포를 동일한 수로 각각 4개의 세트로 준비한 다음, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 각각의 세포에서 분비된 엑소좀을 수득하였다. 수득한 엑소좀은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 형광 편광법을 이용하여 엑소좀을 정량하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 암 세포는 정상 세포보다 엑소좀 분비 비율이 2배 이상 증가하는 것을 확인하였으며, 본 발명의 엑소좀 정량 방법으로 정확하게 암 진단을 위한 정보 제공을 할 수 있음을 확인하였다.
Claims (14)
- (a) 생물학적 시료로 부터 엑소좀을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 엑소좀과 알킬기를 포함하는 지방족 및 형광체로 구성된 지질막 염색제를 반응시켜, 엑소좀을 염색시키는 단계; 및
(c) 형광 편광(fluorescence polarization) 값을 측정하여 엑소좀을 정량하는 단계;를 포함하는 형광 편광법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 엑소좀 염색 및 정량 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 형광체는 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(Fluorescein isothiocyanate; FITC) 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 엑소좀 염색 및 정량 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 지질막 염색제는 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트-컨쥬게이티드 페길레이티드 모노아실 리피드(Fluorescein isothiocyanate conjugated PEGylated monoacyl lipid; FITC-C18-PEG), 1, 2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Polyethylene glycol; DSPE- PEG), 콜레스테롤-폴리에틸렌 글리콜(cholesterol-Polyethylene glycol; Cholesterol-PEG), PKH67 레드 플루오레센트 셀 링커(Red Fluorescent Cell Linker), 펑션 스페이서 리피드-플루오레세인(Function Spacer Lipid-Fluorescein; FSL-Fluorescein), 엔-(플루오레세인-5-티오카르바모일)-1,2-디헥사데칸오일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민(N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; Fluorescein DHPE) 및 5-도데카노일아미노 플로오레세인(5-dodecanoylamino fluorescein ; C12-FAM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 엑소좀 염색 및 정량 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는
(ⅰ) 엑소좀 표준물질을 농도별로 희석하여 준비한 다음, 지질막 염색제와 함께 반응시킨 후, 형광 편광을 측정하여 표준 곡선을 작성하는 단계; 및
(ⅱ) 시료에서 분리한 엑소좀에 대한 형광 편광 값을 표준 곡선에 대입하여 엑소좀 수를 정량하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 엑소좀 염색 및 정량 방법.
- 삭제
- (a) 환자의 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 엑소좀과 알킬기를 포함하는 지방족 및 형광체로 구성된 지질막 염색제를 반응시켜, 엑소좀을 염색시키는 단계; 및
(c) 형광 편광(fluorescence polarization) 값을 측정하여 엑소좀을 정량하는 단계; 를 포함하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 암은 대장암, 치종암, 혈액암, 후두암, 식도암, 구강암, 기저세포암, 담도암, 갑상선암, 직장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 삭제
- 제8항에 있어서, 상기 형광체는 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(Fluorescein isothiocyanate; FITC) 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계의 지질막 염색제는 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트-컨쥬게이티드 페길레이티드 모노아실 리피드(Fluorescein isothiocyanate conjugated PEGylated monoacyl lipid; FITC-C18-PEG), 1, 2-디스테아로일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Polyethylene glycol; DSPE- PEG), 콜레스테롤-폴리에틸렌 글리콜(cholesterol-Polyethylene glycol; Cholesterol-PEG), PKH67 레드 플루오레센트 셀 링커(Red Fluorescent Cell Linker), 펑션 스페이서 리피드-플루오레세인(Function Spacer Lipid-Fluorescein; FSL-Fluorescein), 엔-(플루오레세인-5-티오카르바모일)-1,2-디헥사데칸오일-에스엔-글리세로-3-포스포에탄올아민(N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; Fluorescein DHPE) 및 5-도데카노일아미노 플로오레세인(5-dodecanoylamino fluorescein ; C12-FAM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (c) 단계는
(ⅰ) 엑소좀 표준물질을 농도별로 희석하여 준비한 다음, 지질막 염색제와 함께 반응시킨 후, 형광 편광을 측정하여 표준곡선을 작성하는 단계; 및
(ⅱ) 생물학적 시료에서 분리한 엑소좀에 대한 형광 편광 값을 표준 곡선에 대입하여 엑소좀 수를 정량하고, 정상 대조군에서 분리한 엑소좀 수와 비교하여 엑소좀의 수가 증가한 경우를 암인 것으로 정보를 제공하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법.
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| KR1020180105485A KR102117159B1 (ko) | 2018-09-04 | 2018-09-04 | 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020180105485A KR102117159B1 (ko) | 2018-09-04 | 2018-09-04 | 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법 |
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ID=69803012
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| KR1020180105485A KR102117159B1 (ko) | 2018-09-04 | 2018-09-04 | 형광 편광 기법을 이용한 엑소좀 염색 및 정량 방법 |
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Non-Patent Citations (2)
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| V.S. Trubetskoy et al, FEBS LETTERS, Vol.269(1), pp.79-82.(1990.08.31.)* |
| Yuan Wan et al, Nat Biomed Eng., Vol. 1, pp. 1-24.(2017.12.31.)* |
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