CN105039561B - 使检测汞离子的生物芯片再生的成套试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了使检测汞离子的生物芯片再生的成套试剂及其应用。使用本发明的使检测汞离子的芯片再生的成套试剂对芯片再生得到的再生芯片具有很好的可重复性，与新制备的芯片相比，使用再生方法1获得的再生次数为1‑10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.8％以下，使用再生方法2获得的再生次数为1‑10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.4％以下，使用再生方法3获得的再生次数为1‑10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.8％以下，使用再生方法4获得的再生次数为1‑10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.7％以下，这四种再生方法均获得很好的再生效果。
Description
技术领域
本发明涉及使检测汞离子的生物芯片再生的成套试剂及其应用。
背景技术
汞离子(Hg2+)严重威胁人类健康和生态环境安全，为控制汞离子经摄入进入体内，《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)严格限定饮用水中汞离子(Hg2+)的浓度不能高于0.001mg/L(5nM)。传统的仪器分析方法如原子荧光光谱分析法(AFS)(GB/T4470-1998)、原子吸收分光光度计法(AAS)(GB/T 20380.1-2006)和电感耦合等离子体质谱分析法(ICP-MS)(GB/T 23362.4-2009)难以实现对汞离子(Hg2+)的快速现场检测或对突发汞离子(Hg2+)水污染事件做出快速响应，因而开发简便、快速的汞离子(Hg2+)检测方法已成为目前研究的热点。近年来，基于汞离子(Hg2+)能够造成寡核苷酸中胸腺嘧啶(T)之间发生错配的原理，开发出多种高特异性、快速、简便地用于汞离子(Hg2+)检测的荧光检测方法。
其中，将对汞离子(Hg2+)具有特异识别的寡核苷酸固定在芯片表面检测汞离子(Hg2+)的荧光检测方法，由于性能稳定，易于再生，检测成本低，并且能够与其它检测仪器结合，展现出巨大的应用潜力。
2008年本课题组将一条在汞离子(Hg2+)作用下能形成8对胸腺嘧啶(T-T)错配的寡核苷酸固定在芯片表面，开发出荧光信号强度与水体中的汞离子(Hg2+)浓度成反比的检测方法，检出限低至2.1nM，使用pH值为1.9的质量百分浓度为0.2％的SDS溶液对使用后的芯片进行再生利用，取得了较好的效果。
2012年，赵建龙领导的研究组将含有多个胸腺嘧啶(T)的寡核苷酸固定在芯片表面，开发出荧光信号强度分别与水体中的汞离子(Hg2+)浓度成正比和反比的检测方法，其中反比方法的检测范围为3.6nM-10μM，使用EDTA溶液可使使用后的芯片再生。
尽管上述研究表明利用pH值为1.9的质量百分浓度为0.2％的SDS溶液和EDTA溶液可使芯片再生，但是这些再生方法或者条件较为苛刻，易于对芯片造成损伤；或者只注重对汞离子(Hg2+)的去除，而忽视了对杂交DNA或吸附的DNA的去除，上述再生方法的缺陷均会给后续的测试带来较大的误差。鉴于此，开发条件温和，对汞离子(Hg2+)和DNA去除彻底，简单易用的芯片再生方法已成为一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何使检测汞离子的芯片快速、有效地再生。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了使检测汞离子的芯片再生的成套试剂。
本发明所提供的使检测汞离子的芯片再生的成套试剂，包括成套试剂A、成套试剂B和成套试剂C；
所述成套试剂A，为A1或A2；所述A1为汞离子络合剂，所述汞离子络合剂为乙二胺四乙酸、谷胱甘肽和半胱氨酸中任一种；所述A2为汞离子络合剂水溶液，所述汞离子络合剂水溶液为乙二胺四乙酸水溶液、谷胱甘肽水溶液和半胱氨酸水溶液中的任一种；所述乙二胺四乙酸水溶液由水和溶质组成，所述溶质为乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸在所述乙二胺四乙酸水溶液中的浓度可为1-5M，具体可为1M；所述谷胱甘肽水溶液由水和溶质组成，所述溶质为谷胱甘肽，谷胱甘肽在所述谷胱甘肽水溶液中的浓度可为0.5-5μM，具体可为1μM；所述半胱氨酸水溶液由水和溶质组成，所述溶质为半胱氨酸，半胱氨酸在所述半胱氨酸水溶液中的浓度可为0.5-5μM，具体可为1μM；
所述成套试剂B，为B1或B2；所述B1为DNA洗脱剂，所述DNA洗脱剂由尿素和十二烷基磺酸钠组成，尿素和十二烷基磺酸钠均独立包装；所述B2为DNA洗脱剂水溶液，所述DNA洗脱剂水溶液由尿素水溶液和十二烷基磺酸钠水溶液组成，所述尿素水溶液和所述十二烷基磺酸钠水溶液均独立包装；所述尿素水溶液由水和溶质组成，所述溶质为尿素，尿素在所述尿素水溶液中的质量百分比浓度可为30％-54％，具体可为30％；所述十二烷基磺酸钠水溶液由水和溶质组成，所述溶质为十二烷基磺酸钠，十二烷基磺酸钠在所述十二烷基磺酸钠水溶液中的质量百分比浓度可为0.2％-2％，具体可为0.2％；
所述成套试剂C，为C1或C2；所述C1为芯片恢复剂，所述芯片恢复剂为试剂1、试剂2和试剂3中的任一种；所述试剂1可为配制pH值7.0-8.0，浓度为0.01M的PBS缓冲液所需的试剂和硝酸钠,具体可为配制pH值7.4，浓度为0.01M的PBS缓冲液所需的试剂和硝酸钠；所述试剂2可为配制pH值7.0-8.0浓度为0.01M的Tris-HAc缓冲液所需的试剂和硝酸钠,具体可为配制pH值7.4，浓度为0.01M的Tris-HAc缓冲液所需的试剂和硝酸钠；所述试剂3可为配制pH值7.0-8.0，浓度为0.01M的HEPES缓冲液所需的试剂和硝酸钠,具体可为配制pH值7.4，浓度为0.01M的HEPES缓冲液所需的试剂和硝酸钠；所述C2由水和芯片恢复缓冲液组成，所述芯片恢复缓冲液为芯片恢复缓冲液1、芯片恢复缓冲液2和芯片恢复缓冲液3中的任一种；所述芯片恢复缓冲液1由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH值为7.0-8.0，浓度为0.01M的PBS缓冲液，具体可为pH值7.4，浓度为0.01M的PBS缓冲液,所述溶质为硝酸钠，硝酸钠在所述芯片恢复缓冲液1中的浓度为30mM-100mM，具体可为50mM；所述芯片恢复缓冲液2由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH值为7.0-8.0，浓度为0.01M的Tris-HAc缓冲液，具体可为pH值7.4，浓度为0.01M的Tris-HAc缓冲液,所述溶质为硝酸钠，硝酸钠在所述芯片恢复缓冲液2中的浓度为30mM-100mM，具体可为50mM；所述芯片恢复缓冲液3由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH值为7.0-8.0，浓度为0.01M的HEPES缓冲液，具体可为pH值7.4，浓度为0.01M的HEPES缓冲液,所述溶质为硝酸钠，硝酸钠在所述芯片恢复缓冲液3中的浓度为30mM-100mM，具体可为50mM。
为解决上述技术问题，本发明还提供了使检测汞离子的芯片再生的方法。
本发明所提供的使检测汞离子的芯片再生的方法，包括将所述芯片浸入所述A2中进行络合反应，得到络合反应后的芯片；将所述络合反应后的芯片浸入所述B2中进行洗脱反应，得到洗脱反应后的芯片；将所述洗脱反应后的芯片浸入所述C2中进行芯片恢复，得到再生的芯片。
上述方法中，所述络合反应在10-35℃反应0.5-2min，具体可为25℃反应0.5min或1min。
上述方法中，所述洗脱反应在所述尿素水溶液中10-35℃反应0.5-2min，具体可为25℃反应1min，得到尿素水溶液洗脱后的芯片；将所述尿素水溶液洗脱后的芯片在所述十二烷基磺酸钠水溶液中10-35℃反应0.5-2min，具体可为25℃反应1min，得到所述洗脱反应后的芯片。
上述方法中，所述洗脱反应可进行1-3次，具体可为1或2次。
上述方法中，所述芯片恢复在水中10-35℃恢复0.5-2min，具体可为25℃恢复0.5min，得到水中恢复后的芯片；将所述水中恢复后的芯片在所述芯片恢复缓冲液中10-35℃恢复0.5-2min，具体可为25℃恢复0.5min，得到所述再生的芯片。
上文中，所述检测汞离子的芯片可为基于T-T错配原理的检测汞离子的芯片，如表面固定了名称为TS的含有单链DNA探针的芯片，所述TS为含有聚脱氧胸苷酸的单链DNA，所述TS中的聚脱氧胸苷酸的个数可为12-16个，具体可为14个。
本发明提供的所述使检测汞离子的芯片再生的成套试剂在使检测汞离子的芯片再生中的应用也属于本发明保护的范围。
本发明提供的所述使检测汞离子的芯片再生的方法在检测汞离子中的应用也属于本发明保护的范围。
实验证明，使用本发明的使检测汞离子的芯片再生的成套试剂进行芯片再生得到的再生芯片具有很好的可重复性，与新制备的芯片相比，使用再生方法1获得的再生次数为1-10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.8％以下，使用再生方法2获得的再生次数为1-10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.4％以下，使用再生方法3获得的再生次数为1-10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.8％以下，使用再生方法4获得的再生次数为1-10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.7％以下，这四种再生方法均获得了很好的再生效果。
附图说明
图1为使用再生方法1进行芯片再生的过程；图中1代表将使用过的检测汞离子的生物传感器芯片浸入到浓度为1M的乙二胺四乙酸水溶液中在25℃进行络合反应0.5min；2-1代表将络合反应后的芯片首先浸入到质量百分浓度为30％的尿素水溶液中在25℃进行洗脱反应1min；2-2代表将尿素水溶液洗脱后的芯片再浸入质量百分浓度为0.2％的十二烷基磺酸钠水溶液中在25℃进行洗脱反应1min；3-1代表将洗脱后的芯片首先浸入超纯水中在25℃恢复0.5min；3-2代表将水中恢复后的芯片在芯片恢复缓冲液2中在25℃恢复0.5min。
图2为使用再生方法1获得的再生芯片的Hg2+重复检测效果图。
图3为使用再生方法2进行芯片再生的过程；图中1代表将使用过的检测汞离子的生物传感器芯片浸入到浓度为1μM的谷胱甘肽水溶液中在25℃进行络合反应0.5min；2-1代表将络合反应后的芯片首先浸入到质量百分浓度为30％的尿素水溶液中在25℃进行洗脱反应1min；2-2代表将尿素水溶液洗脱后的芯片再浸入质量百分浓度为0.2％的十二烷基磺酸钠水溶液中在25℃进行洗脱反应1min；3-1代表将洗脱后的芯片首先浸入超纯水中在25℃恢复0.5min；3-2代表将水中恢复后的芯片在芯片恢复缓冲液3中在25℃恢复0.5min。
图4为使用再生方法2获得的再生芯片的Hg2+重复检测的效果图。
图5为使用再生方法3进行芯片再生的过程；图中1代表将使用过的检测汞离子的生物传感器芯片浸入到浓度为1μM的半胱氨酸水溶液中在25℃进行络合反应1min；2-1代表将络合反应后的芯片首先浸入到质量百分浓度为30％的尿素水溶液中在25℃进行洗脱反应1min；2-2代表将尿素水溶液洗脱后的芯片再浸入质量百分浓度为0.2％的十二烷基磺酸钠水溶液中在25℃进行洗脱反应1min；3-1代表将洗脱后的芯片首先浸入超纯水中在25℃恢复0.5min；3-2代表将水中恢复后的芯片在芯片恢复缓冲液2中在25℃恢复0.5min。
图6为使用再生方法3获得的再生芯片的Hg2+重复检测的效果图。
图7为使用再生方法4进行芯片再生的过程；图中1代表将使用过的检测汞离子的生物传感器芯片浸入到浓度为1μM的谷胱甘肽水溶液中在25℃进行络合反应0.5min；2-1代表将络合反应后的芯片首先浸入到质量百分浓度为30％的尿素水溶液中在25℃进行洗脱反应1min；2-2代表将尿素水溶液洗脱后的芯片再浸入质量百分浓度为0.2％的十二烷基磺酸钠水溶液中在25℃进行洗脱反应1min；3-1代表将洗脱后的芯片首先浸入超纯水中在25℃恢复0.5min；3-2代表将水中恢复后的芯片在芯片恢复缓冲液1中在25℃恢复0.5min。
图8为使用再生方法4获得的再生芯片的Hg2+重复检测的效果图。
具体实施方式
一、下述实施例中所用的检测汞离子的生物传感器芯片均是基于T-T错配原理检测汞离子的生物传感器芯片，其制备方法如下：
1、光纤基片表面羟基活化
将光纤基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，80℃静置1h，取出浸泡后的光纤基片，采用超纯水冲洗3次后用N2吹干，然后120℃静置3h，得到表面羟基活化的光线基片，将表面羟基活化的光线基片置于干燥器中冷却和保存。
硫酸-过氧化氢溶液的制备方法：将质量百分含量为98.3％的浓硫酸和质量百分含量为30％的过氧化氢按照体积比3:1进行混合，得到硫酸-过氧化氢溶液。
2、表面硅烷化
将步骤1得到的表面羟基活化的光线基片浸泡于硅烷化剂溶液中，室温静置120min，取出浸泡后的光纤基片，依次用脱水甲苯和无水乙醇冲洗各3次，然后用N2吹干，180℃烘烤1h，得到表面硅烷化的光纤基片，将表面硅烷化的光纤基片置于干燥器中冷却和保存。
硅烷化剂溶液的制备方法：将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解于脱水甲苯，每2mL APTES溶于100mL脱水甲苯中，形成体积百分含量为2％的硅烷化剂溶液。
3、表面偶联化
将步骤2得到的表面硅烷化的光纤基片浸泡于戊二醛偶联剂溶液中，室温静置60min，取出浸泡后的光纤基片，依次用高纯水和浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)各冲洗3次，然后用N2吹干，得到表面偶联化的光线基片，将表面偶联化的光线基片置于干燥器中冷却和保存。
偶联剂溶液：含2％(体积百分含量)戊二醛的浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)。
4、TS探针的固定
将名称为TS的单链DNA探针溶液滴在步骤4得到的表面偶联化的光线基片的表面，然后放入湿度为55-75％，最佳湿度为65％的密闭环境中室温静置18h，依次用0.2％(质量百分含量)的SDS溶液和超纯水各冲洗3次，然后用浓度为20μM的甘氨酸水溶液进行封闭1h，然后再用0.2％(质量百分含量)的SDS溶液和超纯水各冲洗3次，每次1min，用N2吹干，得到表面固定有名称为TS的单链DNA探针芯片，命名为TS探针芯片。该TS探针芯片即为下述实施例中的新制备的芯片。
名称为TS的单链DNA探针溶液的制备方法：将名称为TS的单链DNA探针和NaCl溶于浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中，使名称为TS的单链DNA探针的浓度为150nM，NaCl的浓度为100mM。
名称为TS的单链DNA探针：5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTT-3’。
二、步骤一的基于T-T错配原理检测汞离子的生物传感器芯片按照如下方法检测汞离子
用于本实施例的全光纤倏逝波生物传感器见中国专利ZL 200610089497.4(CN1873450A)。
含有AF-TB的杂交液的制备方法：
AF(靶标1)：3’-AAAAAAAAAAAAAA-F-5’(其中F为花青素荧光染料Cy3)，
TB(靶标2)：5’-TTTTTTTTTTTTTT-B-3’(其中B为荧光淬灭基团BHQ2)。
含有AF-TB的杂交液的制备：由溶剂和溶质组成，溶剂可为pH7.4，浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液，溶质为AF-TB和NaNO3，AF-TB在杂交液中的浓度为30nM；NaNO3在杂交液中的浓度为40mM。
检测步骤：
1、将步骤一制备的TS探针芯片装入全光纤倏逝波生物传感器中。
2、将浓度为10nM的汞离子(Hg2+)溶液加入到含有300μL的含有AF-TB的杂交液的试管中，其中浓度为10nM的汞离子(Hg2+)溶液的加入体积≤1％的含有AF-TB的杂交液的体积，室温(20-30℃)静置8min进行液相杂交反应，得到液相杂交反应后的溶液，对照为加入等体积的蒸馏水替代浓度为10nM的汞离子(Hg2+)溶液。Hg2+能够与AF-TB中的TB形成T–Hg2+–T结构，使得AF-TB中的AF以游离状态存在。
3.将液相杂交反应后的溶液的通入TS探针芯片中，液相杂交反应后的溶液中以游离状态存在的AF能够与TS探针芯片表面固定的TS探针杂交，形成TS-AF的双链，利用全光纤倏逝波生物传感器进行汞离子(Hg2+)检测。在激光引起的倏逝波激发下，结合在TS探针芯片表面的TS-AF的双链产生荧光信号，并为仪器所检测，将不同时间产生的荧光信号进行收集。完成此次Hg2+检测的TS探针芯片即为下述实施例中所用的使用过的检测汞离子的生物传感器芯片。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
乙二胺四乙酸(EDTA)为国药集团公司的产品，分析纯，CAS：60-00-4；谷胱甘肽(GSH)为aldrich-sigma公司的产品,纯度>98％，CAS：70-18-8；半胱氨酸(Cys)为aldrich-sigma公司的产品，纯度>97％,CAS：52-90-4；尿素为国药集团公司的产品，分析纯，CAS：57-13-6；十二烷基磺酸钠(SDS)为国药集团公司的产品，分析纯，CAS：2386-53-0。
全光纤倏逝波生物传感器为本实验室自行开发，中国专利ZL 200610089497.4(CN1873450A)。
光纤为南京春辉科技实业有限公司的产品，产品型号为HCS。
下述实施例中所使用的缓冲液的配方如下：
芯片恢复缓冲液1：由溶剂和溶质组成，溶剂为pH值7.4，浓度为0.01M的PBS缓冲液；溶质为硝酸钠，硝酸钠在芯片恢复缓冲液1中的浓度为50mM。
芯片恢复缓冲液2：由溶剂和溶质组成，溶剂为pH值7.4，浓度为0.01M的Tris-HAc缓冲液；溶质为硝酸钠，硝酸钠在芯片恢复缓冲液2中的浓度为50mM。
芯片恢复缓冲液3：由溶剂和溶质组成，溶剂为pH值7.4，浓度为0.01M的HEPES缓冲液；溶质为硝酸钠，硝酸钠在芯片恢复缓冲液1中的浓度为50mM。
实施例1、全光纤倏逝波生物传感器上的基于T-T错配原理检测汞离子的生物传感器芯片再生方法1
1、将使用过的检测汞离子的生物传感器芯片浸入到浓度为1M的乙二胺四乙酸水溶液中在25℃进行络合反应0.5min，得到络合反应后的芯片。
2、将络合反应后的芯片首先浸入到质量百分浓度为30％的尿素水溶液中在25℃进行洗脱反应1min，得到尿素水溶液洗脱后的芯片；将尿素水溶液洗脱后的芯片再浸入质量百分浓度为0.2％的十二烷基磺酸钠水溶液中在25℃进行洗脱反应1min，得到洗脱后的芯片。
3、将洗脱后的芯片首先浸入超纯水中在25℃恢复0.5min，得到水中恢复后的芯片；将水中恢复后的芯片在芯片恢复缓冲液2中在25℃恢复0.5min，得到再生芯片，该再生芯片的再生次数为1，使用该再生次数为1的再生芯片进行汞离子检测，检测方法同上述步骤二，得到再生次数为1的再生芯片的百分比信号值。
4、重复步骤1-3，共重复9次，得到再生次数为2-10的再生芯片及其百分比信号值。
百分比信号值＝(再生芯片检测Hg2+的最强荧光信号值/新制备的芯片检测Hg2+的最强荧光信号值)×100％。
实验结果见图2，再生次数为1-10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.8％以下。说明使用再生方法1进行再生获得的再生芯片与新制备的芯片对Hg2+的检测效果一致，该方法具有很好的再生效果。
实施例2、全光纤倏逝波生物传感器上的基于T-T错配原理检测汞离子的生物传感器芯片再生方法2
1、将使用过的检测汞离子的生物传感器芯片浸入到浓度为1μM的谷胱甘肽水溶液中在25℃进行络合反应0.5min，得到络合反应后的芯片。
2、将络合反应后的芯片首先浸入到质量百分浓度为30％的尿素水溶液中在25℃进行洗脱反应1min，得到尿素水溶液洗脱后的芯片；将尿素水溶液洗脱后的芯片再浸入质量百分浓度为0.2％的十二烷基磺酸钠水溶液中在25℃进行洗脱反应1min，得到洗脱后的芯片。
3、将洗脱后的芯片首先浸入超纯水中在25℃恢复0.5min，得到水中恢复后的芯片；将水中恢复后的芯片在芯片恢复缓冲液3中在25℃恢复0.5min，得到再生芯片，该再生芯片的再生次数为1，使用该再生次数为1的再生芯片进行汞离子检测，检测方法同上述步骤二，得到再生次数为1的再生芯片的百分比信号值。
4、重复步骤1-3，共重复9次，得到再生次数为2-10的再生芯片及其百分比信号值。
百分比信号值＝(再生芯片检测Hg2+的最强荧光信号值/新制备的芯片检测Hg2+的最强荧光信号值)×100％。
实验结果见图4，再生次数为1-10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.4％以下。说明使用再生方法2进行再生获得的再生芯片与新制备的芯片对Hg2+的检测效果一致，该方法具有很好的再生效果。
实施例3、全光纤倏逝波生物传感器上的基于T-T错配原理检测汞离子的生物传感器芯片再生方法3
1、将使用过的检测汞离子的生物传感器芯片浸入到浓度为1μM的半胱氨酸水溶液中在25℃进行络合反应1min，得到络合反应后的芯片。
2、将络合反应后的芯片首先浸入到质量百分浓度为30％的尿素水溶液中在25℃进行洗脱反应1min，得到尿素水溶液洗脱后的芯片；将尿素水溶液洗脱后的芯片再浸入质量百分浓度为0.2％的十二烷基磺酸钠水溶液中在25℃进行洗脱反应1min，得到洗脱后的芯片。
3、将洗脱后的芯片首先浸入超纯水中在25℃恢复0.5min，得到水中恢复后的芯片；将水中恢复后的芯片在芯片恢复缓冲液2中在25℃恢复0.5min，得到再生芯片，该再生芯片的再生次数为1，使用该再生次数为1的再生芯片进行汞离子检测，检测方法同上述步骤二，得到再生次数为1的再生芯片的百分比信号值。
4、重复步骤1-3，共重复9次，得到再生次数为2-10的再生芯片及其百分比信号值。
百分比信号值＝(再生芯片检测Hg2+的最强荧光信号值/新制备的芯片检测Hg2+的最强荧光信号值)×100％。
实验结果见图6，再生次数为1-10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.8％以下。说明使用再生方法3进行再生获得的再生芯片与新制备的芯片对Hg2+的检测效果一致，该方法具有很好的再生效果。
实施例4、全光纤倏逝波生物传感器上的基于T-T错配原理检测汞离子的生物传感器芯片再生方法4
1、将使用过的检测汞离子的生物传感器芯片浸入到浓度为1μM的谷胱甘肽水溶液中在25℃进行络合反应0.5min，得到络合反应后的芯片。
2、将络合反应后的芯片首先浸入到质量百分浓度为30％的尿素水溶液中在25℃进行洗脱反应1min，得到尿素水溶液洗脱后的芯片；将尿素水溶液洗脱后的芯片再浸入质量百分浓度为0.2％的十二烷基磺酸钠水溶液中在25℃进行洗脱反应1min。
3、重复步骤2一次，得到洗脱后的芯片。
4、将洗脱后的芯片首先浸入超纯水中在25℃恢复0.5min，得到水中恢复后的芯片；将水中恢复后的芯片在芯片恢复缓冲液1中在25℃恢复0.5min，得到再生芯片，该再生芯片的再生次数为1，使用该再生次数为1的再生芯片进行汞离子检测，检测方法同上述步骤二，得到再生次数为1的再生芯片的百分比信号值。
5、重复步骤1-4，共重复9次，得到再生次数为2-10的再生芯片及其百分比信号值。
百分比信号值＝(再生芯片检测Hg2+的最强荧光信号值/新制备的芯片检测Hg2+的最强荧光信号值)×100％。
实验结果见图8，再生次数为1-10的再生芯片的百分比信号值偏差均在4.7％以下。说明使用再生方法4进行再生获得的再生芯片与新制备的芯片对Hg2+的检测效果一致，该方法具有很好的再生效果。
Claims (5)
1.使检测汞离子的芯片再生的成套试剂，包括成套试剂A、成套试剂B和成套试剂C；
所述成套试剂A，为A1或A2；所述A1为汞离子络合剂，所述汞离子络合剂为乙二胺四乙酸、谷胱甘肽和半胱氨酸中任一种；所述A2为汞离子络合剂水溶液，所述汞离子络合剂水溶液为乙二胺四乙酸水溶液、谷胱甘肽水溶液和半胱氨酸水溶液中的任一种；所述乙二胺四乙酸水溶液由水和溶质组成，所述溶质为乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸在所述乙二胺四乙酸水溶液中的浓度为1-5M；所述谷胱甘肽水溶液由水和溶质组成，所述溶质为谷胱甘肽，谷胱甘肽在所述谷胱甘肽水溶液中的浓度为0.5-5μM；所述半胱氨酸水溶液由水和溶质组成，所述溶质为半胱氨酸，半胱氨酸在所述半胱氨酸水溶液中的浓度为0.5-5μM；
所述成套试剂B，为B1或B2；所述B1为DNA洗脱剂，所述DNA洗脱剂由尿素和十二烷基磺酸钠组成，尿素和十二烷基磺酸钠均独立包装；所述B2为DNA洗脱剂水溶液，所述DNA洗脱剂水溶液由尿素水溶液和十二烷基磺酸钠水溶液组成，所述尿素水溶液和所述十二烷基磺酸钠水溶液均独立包装；所述尿素水溶液由水和溶质组成，所述溶质为尿素，尿素在所述尿素水溶液中的质量百分比浓度为30％-54％；所述十二烷基磺酸钠水溶液由水和溶质组成，所述溶质为十二烷基磺酸钠，十二烷基磺酸钠在所述十二烷基磺酸钠水溶液中的质量百分比浓度为0.2％-2％；
所述成套试剂C，为C1或C2；所述C1为芯片恢复剂，所述芯片恢复剂为试剂1、试剂2和试剂3中的任一种；所述试剂1为配制pH值7.0-8.0，浓度为0.01M的PBS缓冲液所需的试剂和硝酸钠；所述试剂2为配制pH值7.0-8.0，浓度为0.01M的Tris-HAc缓冲液所需的试剂和硝酸钠；所述试剂3为配制pH值7.0-8.0，浓度为0.01M的HEPES缓冲液所需的试剂和硝酸钠；所述C2由超纯水和芯片恢复缓冲液组成，超纯水和芯片恢复缓冲液均独立包装；所述芯片恢复缓冲液为芯片恢复缓冲液1、芯片恢复缓冲液2和芯片恢复缓冲液3中的任一种；所述芯片恢复缓冲液1由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH值为7.0-8.0，浓度为0.01M的PBS缓冲液，所述溶质为硝酸钠，硝酸钠在所述芯片恢复缓冲液1中的浓度为30mM-100mM；所述芯片恢复缓冲液2由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH值为7.0-8.0，浓度为0.01M的Tris-HAc缓冲液，所述溶质为硝酸钠，硝酸钠在所述芯片恢复缓冲液2中的浓度为30mM-100mM；所述芯片恢复缓冲液3由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH值为7.0-8.0，浓度为0.01M的HEPES缓冲液，所述溶质为硝酸钠，硝酸钠在所述芯片恢复缓冲液3中的浓度为30mM-100mM；所述检测汞离子的芯片为基于T-T错配原理的检测汞离子的芯片。
2.使检测汞离子的芯片再生的方法，包括将检测汞离子的芯片浸入权利要求1所述成套试剂中的成套试剂A2中进行络合反应，得到络合反应后的芯片；将所述络合反应后的芯片浸入权利要求1所述成套试剂中的成套试剂B2中进行洗脱反应，得到洗脱反应后的芯片；将所述洗脱反应后的芯片浸入权利要求1所述成套试剂中的成套试剂C2中进行芯片恢复，得到再生的芯片；
所述络合反应在10-35℃反应0.5-2min；
所述洗脱反应在所述尿素水溶液中10-35℃反应0.5-2min，得到尿素水溶液洗脱后的芯片；将所述尿素水溶液洗脱后的芯片在所述十二烷基磺酸钠水溶液中10-35℃反应0.5-2min，得到所述洗脱反应后的芯片；
所述洗脱后的芯片在所述超纯水中10-35℃恢复0.5-2min，得到超纯水中恢复后的芯片；将所述超纯水中恢复后的芯片在所述芯片恢复缓冲液中10-35℃恢复0.5-2min，得到所述再生的芯片；
所述检测汞离子的芯片为基于T-T错配原理的检测汞离子的芯片。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述洗脱反应进行1-3次。
4.权利要求1所述的使检测汞离子的芯片再生的成套试剂在使检测汞离子的芯片再生中的应用。
5.权利要求2或3所述方法在检测汞离子中的应用。
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