CN112553371A - 一种用于非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr引物和探针及其试剂盒 - Google Patents

一种用于非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr引物和探针及其试剂盒 Download PDF

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陈瑞爱
张文炎
张淑琼
邓智昕
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Abstract

本发明公开了一种用于非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR引物和探针及其试剂盒，所述引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示。本发明提供的荧光定量PCR引物和探针准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。采用本发明制备的试剂盒对25份模拟ASFV阳性动物样品样品进行检测，结果显示非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒检出25份阳性样品，检出率高达100％。

Description

一种用于非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR引物和探针及其试 剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种用于非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR引物和探针及其试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(英文名称：African Swine fever，简称：ASF)是由非洲猪瘟病毒(英文名称：African Swine fever virus，简称：ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。
ASFV可经过口和上呼吸道系统进入猪体，在鼻咽部或是扁桃体发生感染，病毒迅速蔓延到下颌淋巴结，通过淋巴和血液遍布全身。强毒感染时细胞变化很快，在呈现明显的刺激反应前，细胞都已死亡。弱毒感染时，刺激反应很容易观察到，细胞核变大，普遍发生有丝分裂。发病率通常在40％—85％之间，死亡率因感染的毒株不同而有所差异。高致病性毒株死亡率可高达90—100％；中等致病性毒株在成年动物的死亡率在20％—40％之间，在幼年动物的死亡率在70％—80％之间；低致病性毒株死亡率在10％—30％之间。
2018年之前，我国没有非洲猪瘟。分子流行病学研究表明：传入中国的非洲猪瘟病毒属基因Ⅱ型，与格鲁吉亚、俄罗斯、波兰公布的毒株全基因组序列同源性为99.95％左右。中国已查明疫源的68起家猪疫情，传播途径主要有三种：一是生猪及其产品跨区域调运，占全部疫情约19％；二是餐厨剩余物喂猪，占全部疫情约34％；三是人员与车辆带毒传播，这是当前疫情扩散的最主要方式，占全部疫情约46％。因此急需一种可以灵敏度高，特异性强的非洲猪瘟病毒检测方法。
发明内容
本发明第一个方面的目的在于提供一种；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地检测非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR引物和探针。
本发明第二个方面的目的在于提供包含上述引物和探针的检测非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR试剂盒。
本发明第三个方面的目的在于提供一种非诊断目的的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的一个方面，提供一种用于非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：5’-GCC CTC YAA RAA TGT TTG GT-3’(SEQ ID NO：1)，
引物P2：5’-CTG GCA GGA TGC TCC GAT-3’(SEQ ID NO：2)，
探针P：5’-TGTCCCAGTCATATC CGTTGCG-3’(SEQ ID NO：3)。
本发明的第二个方面，提供一种检测非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物和探针。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂和荧光定量PCR试剂。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，更进一步地，所述核酸释放试剂包括：NaOH、SDS、EDTANa2和Tris-HCL。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，优选地，所述NaOH的工作浓度为50mM，所述SDS的含量为0.1％，所述EDTANa2的工作浓度为5mM，所述Tris-HCL的工作浓度为10mM。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，进一步地，所述荧光定量PCR试剂包括以下组分：荧光定量PCR反应Buffer、dNTPs、MgCl2、Taq酶、DEPC处理水、阳性对照。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，更进一步地，所述dNTPs的浓度为25mmol/L，所述MgCl2的浓度为25mmol/L，所述Taq酶的浓度为5U/μL。
本发明的第三个方面，提供一种非诊断目的的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
S1.提取待测样品DNA；
S2.配制荧光定量PCR反应体系，所述荧光定量PCR反应体系包括步骤S1中核酸、引物P1、引物P2、探针P、以步骤S1中核酸为模板进行荧光定量PCR扩增反应。
根据本发明第三个方面所述的方法，进一步地，所述荧光定量PCR的反应体系为25μL，各组分与其对应的体积如下所示：
Figure BDA0002214482990000021
Figure BDA0002214482990000031
根据本发明第三个方面所述的方法，进一步地，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min；95℃5s，60℃20s，共45个循环。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供一种简单快速且高通量检测非洲猪瘟的荧光定量PCR引物和探针，所提供的引物和探针具有；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
2.采用本发明制备的试剂盒对25份模拟ASFV阳性动物样品样品进行检测，结果显示非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒检出25份阳性样品，检出率高达100％。对敏感性质控品的敏感性检测，非洲猪瘟病毒实时荧光PCR快速检测试剂盒的检测极限可以达到约10个拷贝/μL。使用非洲猪瘟病毒VP72基因重组质粒来进行阳性对照的制备，具有生物安全性且无污染。制备出的阳性对照的质量及浓度均有保证，符合非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒质量标准的要求。
附图说明
图1引物探针筛选结果。
图2引物浓度优化结果。
图3探针浓度优化结果。
图4Mg2+浓度优化结果。
图5Taq酶用量优化结果
图6循环条件优化结果。
图7循环次数优化结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例与附图进一步说明本发明的技术方案。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的系统为本领域常规使用的设备。
实施例1引物设计
研究中选择非洲猪瘟病毒VP72作为靶区域，选择其中缺乏二级结构且保守的基因区设计多对引物和探针。
引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％﹣60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，其Tm值比引物Tm值高8℃左右。
设计合成的引物和探针名称如下(从5’→3’端顺序排列)：
探针72。
上游引物：18u，21u，24u，31u，49u，51u。
下游引物：99r，100r，125r，130r，189r，231r，275r。
阳性模板的制备：使用非洲猪瘟病毒VP72基因重组质粒来进行阳性对照的制备。使用质粒提取试剂盒(购自Qiagen公司12125)提取克隆菌株ASFV-VP72的生产用菌液，得到阳性模板DNA溶液。定量后稀释到107拷贝/μL，再进行10倍梯度的逐步稀释，得到6个梯度：1:10、1:102、1:103、1:104、1:105、1:106的模板溶液。
筛选试验：将上述上游引物和下游引物结合不同探针进行配对筛选。所采用的荧光定量PCR反应体系见下表1，反应条件为95℃预变性3min；95℃5s，60℃20s，共45个循环。
表1：荧光PCR反应体系
组分 终浓度
10×Buffer 1×
25mmol/L dNTPs 0.2mmol/L
25mmol/L MgCl2 2.0mmol/L
上游引物 0.2μmol/L
下游引物 0.2μmol/L
探针 0.1μmol/L
Taq酶(5U/μL) 0.0625U/μL
模板DNA 1.0μL
DEPC处理水 补水至25μL
筛选结果见下表2及附图1。从附图1中可以看出，探针72与上游引物21u、下游引物99r的扩增效率较高，且升幅较高。从多次重复试验中选定21u/99r引物对作为该区域的引物对。
表2探针72配对引物的筛选结果
Figure BDA0002214482990000041
Figure BDA0002214482990000051
发明人通过对其余探针的筛选，最终显示：对于非洲猪瘟病毒，探针72配对21u/99r引物对效果最好。
探针72配对21u/99r引物的序列如下：
引物P1(即上游引物21u)：5’-GCC CTC YAA RAA TGT TTG GT-3’(SEQ ID NO：1)；
引物P2(即下游引物99r)：5’-CTG GCA GGA TGC TCC GAT-3’(SEQ ID NO：2)；
探针P(即探针72)：5’-TGTCCCAGTCATATC CGTTGCG-3’(SEQ ID NO：3)。
实施例2荧光定量PCR反应体系的优化
引物浓度的优化：
将引物浓度从0.1μmol/L至0.4μmol/L以0.1μmol/L为间距递增。对引物不同浓度的配比进行了比较，其他条件同表1。采用实施例1中相同的阳性模板DNA溶液作为DNA扩增模板，其中1:106模板采用复管进行试验。反应条件为95℃预变性3min；95℃5s，60℃20s，共45个循环。实验结果见下表3及附图2。
表3不同浓度引物的扩增结果
Figure BDA0002214482990000052
从表3及附图2中结果看出，引物浓度在0.1μM～0.4μM范围内扩增的CT值差别不大，总体而言0.2μM的CT值略有提前，荧光值也较高。因此确定引物最优浓度为0.2μM。
探针浓度的优化：
将探针浓度从0.05μmol/L至0.2μmol/L以0.05μmol/L为间距递增。对探针不同浓度的配比进行了比较，其他条件同表1。采用实施例1中相同的阳性模板DNA溶液作为DNA扩增模板，其中1:106模板采用复管进行试验。反应条件为95℃预变性3min；95℃5s，60℃20s，共45个循环。实验结果见下表4及附图3。
表4不同浓度探针的扩增结果
Figure BDA0002214482990000061
从表4及附图3的实验结果看出，探针浓度在0.05μM～0.2μM范围内扩增的CT值差别不大，总体而言0.1μM的CT值略有提前，荧光值也较高。因此确定探针最优浓度为0.1μM。
Mg2+浓度的优化：
应用筛选好的引物探针，将Mg2+的浓度从1.0mmol/L至3.0mmol/L以1.0mmol/L为间距递增。对不同Mg2+浓度条件下的扩增进行了比较，其它条件同表1。采用实施例1中相同的阳性模板DNA溶液作为DNA扩增模板，其中1:106模板采用复管进行试验。反应条件为95℃预变性3min；95℃5s，60℃20s，共45个循环。实验结果见下表5及附图4。
表5不同浓度镁离子的扩增结果
Figure BDA0002214482990000062
从表5及附图4的结果看出，2.0mM Mg2+扩增的CT值最小，荧光值最高；Mg2+浓度3.0mM后扩增受到抑制，其扩增曲线均向右倾斜。因此确定Mg2+最优浓度为2.0mM。
荧光PCR反应体积的选择：
为确定荧光PCR反应体积的差异，将反应体积为25μL的PCR，与反应体积为50μL的PCR进行对比试验。通过对比试验结果，选择最优的反应体积。采用实施例1中相同的阳性模板DNA溶液作为DNA扩增模板，其中1:106模板采用复管进行试验。反应条件为95℃预变性3min；95℃5s，60℃20s，共45个循环。
实验结果表明采用25μL体系与50μL体系进行PCR反应，所检测的灵敏度基本一致，因此选择25μL的PCR反应体系作为最终应用的反应体系。
Taq酶用量的优化：
Taq酶的活性要求：具DNA聚合酶活性及5’→3’核酸外切酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃1小时后仍保持50％活性。
反应体系中阳性模板的来源：实施例1中阳性模板定量后稀释到107拷贝/μL，再进行10倍梯度的逐步稀释，得到6个梯度：1:10、1:102、1:103、1:104、1:105、1:106的模板溶液。
试验中将Taq酶用量从1U至1.5U以0.25U为间距递增，对不同的Taq酶用量进行了比较，其他条件同下表7中PCR反应液部分。采用上述1:10～1:106梯度稀释模板及阴性对照进行扩增，其中1:106采用复管进行实验，扩增条件：为95℃预变性3min；95℃5s，60℃20s，共45个循环。结果如下表6及附图5所示。
表6不同Taq酶用量的扩增结果
Figure BDA0002214482990000071
从表6级附图5中结果可以看出，Taq酶用量从1U至1.5U范围内扩增的CT值差别不大，总体而言1.25U的CT值略有提前，荧光值也较高。因此确定一个检测中Taq酶最优用量为0.25μL。
结合上述各组分的优化条件，确定非洲猪瘟病毒实时荧光PCR反应体系，如下表7所示。
表7荧光PCR反应体系(25μL)
Figure BDA0002214482990000072
Figure BDA0002214482990000081
实施例3荧光定量PCR反应条件的优化
循环条件的优化：
研究中对变性温度和时间、退火和延伸温度及时间进行了优化实验。主要比较了以下几种循环条件的扩增效率：
方法A：95℃：3min；95℃：15sec，60℃：20sec，45个循环；
方法B：95℃：3min；95℃：25sec，60℃：20sec，45个循环；
方法C：95℃：3min；95℃：5sec，60℃：20sec，45个循环；
方法D：95℃：3min；92℃：10sec，60℃：20sec，45个循环；
方法E：95℃：3min；95℃：5sec，60℃：30sec，45个循环。
上述5种条件对相同的PCR体系进行扩增，采用实施例1中相同的阳性模板DNA溶液中的1:106稀释度模板，每个反应条件采用4个复管。试验后比较扩增效率。实验结果见下表8及附图6。
表8荧光PCR循环温度和时间试验结果
Figure BDA0002214482990000082
试验结果显示5种方法扩增效率相近，我们选择耗时最短的方法，即方法C作为荧光PCR扩增时的最优循环条件。
循环次数的优化：
确定循环条件后，采用循环次数为40和45进行检测，比较扩增结果的CT值和扩增曲线，进而确定扩增的循环次数。结果见附图7所示。
从附图7中可以看出，在所有采用极限梯度稀释法所进行的实验中，采用循环次数为40和45个所能检测到的极限梯度的CT值均在40之前；但是在CT值40之后仍有扩增，为便于更准确地判断，选取45个循环为扩增循环数。
综合上述结果，确定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的扩增条件：95℃:3min；95℃:5sec，60℃:20sec(收集荧光)：45个循环。
实施例4荧光定量PCR引物灵敏度实验
取敏感性质控品(DNA含量为105拷贝/μL)用A盒提取后，用DEPC处理水作1:10、1:102、1:103、1:104、1:105梯度稀释，稀释溶液作为待检模板，进行荧光PCR扩增检测，检测结果见下表9。
表9敏感性检验标准
敏感性检验用质控品稀释度 FAM通道CT值
1:10 ＜25
1:10<sup>2</sup> ＜28
1:10<sup>3</sup> ＜32
1:10<sup>4</sup> ＜36
1:10<sup>5</sup> 无CT值
结果显示，1:104及以内稀释的模板检测结果为阳性，1:105稀释的模板检测结果为阴性。
实施例5荧光定量PCR引物特异性实验
对特异性质控品猪瘟活疫苗核酸(T1)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗核酸(T2)、伪狂犬病活疫苗核酸(T3)、猪流行性腹泻病毒培养液核酸(T4)、猪圆环病毒2型培养液核酸(T5)和正常猪淋巴结10％悬液核酸(T6)进行荧光PCR扩增检测，结果见下表10，检测结果显示T1、T2、T3、T4、T5、T6的检测结果全部为阴性。
表10特异性检验标准
特异性检验用质控品 FAM通道CT值
T1 无CT值
T2 无CT值
T3 无CT值
T4 无CT值
T5 无CT值
T6 无CT值
实施例6核酸释放试剂的优化
核酸释放剂为碱性裂解液，分为Buffer A液和Buffer B液。A液成份包括氢氧化钠(NaOH)、SDS；B液成份包括Tris-HCL、乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)。通过配制不同浓度的NaOH、SDS、EDTANa2和Tris-HCL溶液，进行荧光PCR检测，比较不同浓度组对PCR的Ct值以及曲线形态的影响，从而确定各组分的最优浓度。以市售猪伪狂犬病毒疫苗作为提取核酸的样本。
NaOH最优浓度的确定：
将NaOH以25mM、50mM、75mM、100mM的浓度加入1μL到反应体系中，通过比较不同浓度组对PCR的Ct值以及曲线形态的影响，以确定最优浓度。
SDS最优浓度的确定：
将SDS以0.05％、0.1％、0.15％、0.2％的浓度加入1μL到反应体系中％，通过扩增比较不同浓度组对PCR的背景Ct值以及曲线形态的影响，以确定最优浓度。
EDTANa2最优浓度的确定：
将EDTANa2以2.5mM、5mM、7.5mM、10mM的浓度加入1μL到反应体系中，通过扩增比较不同浓度组对PCR的Ct值以及曲线形态的影响，以确定最优浓度。
Tris-HCL溶液最优浓度的确定：
将Tris-HCL以5mM，10mM、15mM、20mM的浓度加入1μL到反应体系中，通过扩增比较不同终浓度组对PCR的Ct值以及曲线形态的影响，以确定最优浓度。
将上述NaOH溶液、SDS溶液、EDTANa2溶液与Tris-HCL按照最优浓度混合配制为核酸释放剂。以制备的核酸释放剂对猪伪狂犬病活疫苗(Batha-K61株)进行病毒提取，并以商业化病毒DNA提取试剂盒作为对照，以验证核酸释放剂对病毒样本和临床样本的提取能力。结果显示核酸释放剂Buffer A液中NaOH最优浓度为50mM，SDS最优浓度为0.1％；核酸释放剂Buffer B液中EDTANa2最优浓度为5mM、Tris-HCL最优浓度为10mM；与商业化病毒DNA提取试剂盒对比，提取效率接近商业化提取试剂盒。
实施例7对模拟ASFV阳性动物样品的检测
采用优化过的核酸释放试剂及荧光定量PCR反应体系的试剂盒对25份模拟ASFV阳性动物样品进行荧光定量PCR检测。25份模拟ASFV阳性动物样品，其中淋巴结5份，脾脏6份，扁桃体2份采集自江苏省扬州市石塔农贸市场；全血10份采集自扬州市汤汪屠宰场；血球粉2份，购于山东省临朐县华贸蛋白饲料厂。分别在上述25份样品中添加不同浓度的PUC57-P72质粒，模拟ASFV阳性动物样品。
检测结果见表11和表12。
表11批试剂盒对25份模拟阳性样品的敏感性检测结果
Figure BDA0002214482990000101
Figure BDA0002214482990000111
表12试剂盒对模拟阳性样品的敏感性检测统计结果
Figure BDA0002214482990000112
结果表明，实验室制备的3批非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒对模拟ASFV阳性动物样品的敏感性均为100％。
再取敏感性质控品(阳性质粒PUC57-VP72用75％乙醇溶液稀释至105copies/μL，即为敏感性检验用质控品)提取DNA后，用DEPC处理水作1:10、1:102、1:103、1:104、1:105梯度稀释，稀释溶液作为模板立即使用。用3批实验室制备的试剂盒进行检测，确定试剂盒对敏感性质控品的灵敏度。检测结果见表13：
表13试剂盒对敏感性质控品的灵敏度试验
Figure BDA0002214482990000121
结果表明，3批非洲猪瘟病毒实时荧光PCR快速检测试剂盒对1:10、1:102、1:103、1:104梯度稀释质控品的检测结果均为阳性(1:104稀释液中DNA数约为10拷贝/μL)；1:105稀释液无CT值，判为阴性。
对40份非洲猪瘟病毒阴性样品分别进行检测，结果见表14。将检测结果进行统计，结果见表15。
表14试剂盒对40份已知阴性样品的检测结果
Figure BDA0002214482990000122
表15试剂盒对已知阴性样品的检测结果统计
Figure BDA0002214482990000123
从表15中可以看出，实验室制备的3批试剂盒对40份已知阴性样品的检测结果全部为阴性，特异性100％，与病毒分离结果一致。
实施例8非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒
非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括以下试剂：
A盒-核酸释放剂
Buffer A 应为无色透明澄清液体，装量为5mL/瓶×1瓶。
Buffer B 应为无色透明澄清液体，装量为5mL/瓶×1瓶。
B盒-病毒实时荧光PCR检测试剂
荧光PCR反应液应为无色透明澄清液体，装量为1200μL/管×1管。
Taq酶应为无色透明粘稠液体，装量为15μL/管×1管。
阳性对照应为无色透明液体，装量为20μL/管×1管。
阴性对照应为无色透明液体，装量为1000μL/管×1管。
说明书1份/盒
随机抽取一批制备好的试剂盒，将非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒的A盒置于室温环境中，B盒置于-20℃环境中，从开始到第12个月每三个月取1件，第13～21个月每月取1件，进行性状检验，结果如下表16所示。
表16试剂盒保存期试验性状检验结果
Figure BDA0002214482990000131
Figure BDA0002214482990000141
根据性状检验的结果，在非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒在其保存条件下保存21个月，试剂盒各组分的性状检验均符合质量标准的要求。
随机抽取一批制备好的试剂盒，将非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒的A盒置于室温环境中，B盒置于-20℃环境中，从开始到第12个月每三个月取1件试剂盒，第13～21个月每月取1件试剂盒，按照质量标准要求，对敏感性质控品进行敏感性检验。结果如下表17所示。
表17试剂盒保存期试验敏感性检验结果
Figure BDA0002214482990000142
检验结果可以看出，从试验开始到第16个月试验结束，3个批次的所有试剂盒检测10倍倍比稀释的阳性对照的结果均符合：1:104及以内稀释时结果为阳性，1:105稀释时的结果为阴性，CT值稳定。从第17个月开始，各稀释度质控品的CT值开始升高。因此，确定试剂盒在保存条件下保存16个月时仍能满足试剂盒敏感性的要求。
随机抽取一批制备好的试剂盒，将非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒的A盒置于室温环境中，B盒置于-20℃环境中，从开始到第12个月每三个月取1件试剂盒，第13～21个月每月取1件试剂盒，按照质量标准要求，对特异性质控品进行特异性检验。结果如下表18所示。
表18试剂盒保存期试验特异性检验结果
Figure BDA0002214482990000143
Figure BDA0002214482990000151
结果可以看出，从试验开始到第21个月试验结束，3个批次的试剂盒检验6份特异性质控样品T1、T2、T3、T4、T5、T6的结果均为阴性。
SEQUENCE LISTING
<110> 肇庆大华农生物药品有限公司
<120> 一种用于非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR引物和探针及其试剂盒
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccctcyaar aatgtttggt 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctggcaggat gctccgat 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtcccagtc atatccgttg cg 22

Claims (10)

1.一种用于非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示：
引物P1：5’-GCC CTC YAA RAA TGT TTG GT-3’(SEQ ID NO：1)，
引物P2：5’-CTG GCA GGA TGC TCC GAT-3’(SEQ ID NO：2)，
探针P：5’-TGTCCCAGTCATATC CGTTGCG-3’(SEQ ID NO：3)。
2.一种检测非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸释放试剂和荧光定量PCR试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放试剂包括：NaOH、SDS、EDTANa2和Tris-HCL。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述NaOH的工作浓度为50mM，所述SDS的含量为0.1％，所述EDTANa2的工作浓度为5mM，所述Tris-HCL的工作浓度为10mM。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂包括以下组分：荧光定量PCR反应Buffer、dNTPs、MgCl2、Taq酶、DEPC处理水、阳性对照。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs的浓度为25mmol/L，所述MgCl2的浓度为25mmol/L，所述Taq酶的浓度为5U/μL。
8.一种非诊断目的的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取待测样品DNA；
S2.配制荧光定量PCR反应体系，所述荧光定量PCR反应体系包括步骤S1中核酸、引物P1、引物P2、探针P、以步骤S1中核酸为模板进行荧光定量PCR扩增反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为25μL，各组分与其对应的体积如下所示：
Figure FDA0002214482980000011
Figure FDA0002214482980000021
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min；95℃5s，60℃20s，共45个循环。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102094002A (zh) * 2009-12-11 2011-06-15 上海裕隆临床检验中心有限公司 乙型肝炎病毒dna提取试剂及提取方法
US20140004504A1 (en) * 2010-12-10 2014-01-02 Brandeis University Compositions and methods for the detection and analysis of african swine fever virus
CN104774953A (zh) * 2015-04-21 2015-07-15 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 非洲猪瘟病毒cp530r基因的荧光pcr检测试剂及其制备方法与用途
US20170283856A1 (en) * 2014-09-30 2017-10-05 Health&Help Genes Co., LTD Lytic composition and application thereof, kit, method for preparing nucleic acid by utilizing lytic composition, and nucleic acid analysis method
CN107267667A (zh) * 2017-07-14 2017-10-20 成都海之元生物科技有限公司 Dna/rna病毒pcr实时增强反应试剂盒、检测试剂及其使用方法
CN108300808A (zh) * 2018-02-23 2018-07-20 湖南国测生物科技有限公司 一种非洲猪瘟病毒荧光pcr检测试剂盒、制备方法及使用方法
CN109593893A (zh) * 2019-02-03 2019-04-09 郑州中道生物技术有限公司 非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102094002A (zh) * 2009-12-11 2011-06-15 上海裕隆临床检验中心有限公司 乙型肝炎病毒dna提取试剂及提取方法
US20140004504A1 (en) * 2010-12-10 2014-01-02 Brandeis University Compositions and methods for the detection and analysis of african swine fever virus
US20170283856A1 (en) * 2014-09-30 2017-10-05 Health&Help Genes Co., LTD Lytic composition and application thereof, kit, method for preparing nucleic acid by utilizing lytic composition, and nucleic acid analysis method
CN104774953A (zh) * 2015-04-21 2015-07-15 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 非洲猪瘟病毒cp530r基因的荧光pcr检测试剂及其制备方法与用途
CN107267667A (zh) * 2017-07-14 2017-10-20 成都海之元生物科技有限公司 Dna/rna病毒pcr实时增强反应试剂盒、检测试剂及其使用方法
CN108300808A (zh) * 2018-02-23 2018-07-20 湖南国测生物科技有限公司 一种非洲猪瘟病毒荧光pcr检测试剂盒、制备方法及使用方法
CN109593893A (zh) * 2019-02-03 2019-04-09 郑州中道生物技术有限公司 非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Y STEIGER 等: "Rapid and biologically safe diagnosis of African swine fever virus infection by using polymerase chain reaction", 《J CLIN MICROBIOL》 *
李林 等: "非洲猪瘟病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立", 《中国动物检疫》 *

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