CN113981044A - 一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，包括如下步骤：1）针对目标tsRNA设计哑铃状DNA模板，使用T4连接酶将哑铃状模板缺口连接；2）目标tsRNA竞争结合DNA模板互补区，破坏DNA模板哑铃状结构，使其呈环状；DNA模板成环后作为模板，目标tsRNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶的作用下，发生滚环扩增；3）在扩增产物中加入分子信标并进行信号检测。本发明无需对目标tsRNA进行预处理、逆转录等步骤，大大节约了时间；恒温即可扩增，对精密仪器的依赖性降低；序列相近的干扰RNA序列不完全互补，无法破坏哑铃结构，就无法开启扩增，特异性强。
Description
技术领域
本发明属于tsRNA检测技术领域，具体涉及一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法。
背景技术
tRNA-derived small RNAs（tsRNA）是近年来发现的、存在于多种生物体内的一类非编码小RNA，来源于成熟tRNA或tRNA前体，其表达和修饰具有组织和细胞特异性。tsRNA参与应激反应、蛋白质翻译调控、核糖体生物合成、肿瘤发生、细胞增殖与凋亡、表观遗传信息的跨代传递等多种生理和病理过程，因此，检测tsRNA对研究机体的生物学功能具有重要意义。
现有的定量检测tsRNA的方法主要为PCR法，先将tsRNA逆转录为cDNA再进行实时荧光定量PCR。或者使用分子信标（MB）,一种茎环结构DNA探针，一端标记荧光基团，一端标记淬灭基团，没有靶分子时，荧光和淬灭基团距离很近，荧光被淬灭，存在靶分子时，分子信标由于序列互补打开茎环结构结合靶分子，荧光和淬灭基团分离，导致荧光回复，具有较高的特异性。
但是，PCR法检测由于小RNA的长度过短，在进行逆转录时还需设计特殊的茎环引物或使用加尾法增加长度，存在操作繁琐、耗时长、试剂昂贵等缺陷；而分子信标（MB）虽然具有较高的特异性，但灵敏度较低，不结合核酸扩增无法检测微量的小RNA。
发明内容
有鉴于此，本发明期望提供一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，能够高灵敏度高特异性地检测tsRNA。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，包括如下步骤：
1）针对目标tsRNA设计哑铃状DNA模板，使用T4连接酶将哑铃状模板缺口连接，形成闭合哑铃状结构；
2）目标tsRNA竞争结合DNA模板互补区，破坏DNA模板哑铃状结构， 使其呈环状；DNA模板成环后作为模板，目标tsRNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶的作用下，发生滚环扩增；
3）在扩增产物中加入分子信标并进行信号检测。
这里，与PCR法相比，步骤1）中无需对目标tsRNA进行预处理、逆转录等步骤，大大节约了时间，减少了操作带来的误差，也节约了试剂，降低检测成本；
这里，步骤2）中采用滚环扩增（RCA）法，扩增时无需反复热变性，恒温即可扩增，对精密仪器的依赖性不高。
进一步地，所述DNA模板包括支点（toehold），支点（toehold）与哑铃状DNA模板互补区相连；所述支点（toehold）及哑铃状DNA模板互补区，与目标tsRNA序列互补配对。
进一步地，滚环扩增后，引入支链引物，进行超分支滚环扩增。
进一步地，所述支链引物与滚环扩增产物互补配对，不与目标tsRNA完全互补配对。
这里，步骤2）可在滚环扩增（RCA）的基础上，进行超分支滚环扩增（HRCA），以提高扩增效率，提升特异性。
图1为本发明制备哑铃状结构模板的工作原理图；图2为本发明哑铃状结构模板滚环扩增及荧光检测的工作原理图，如图1和图2所示，设计好的模板自发互补结合形成哑铃状结构，通过T4连接酶将缺口连接，形成闭合哑铃状DNA模板；
在遇到目标tsRNA后，从支点（toehold）开始互补配对，由于目标tsRNA有更多的互补序列，竞争结合哑铃状DNA模板，破坏哑铃状结构，使其形成环状结构，在phi29聚合酶作用下开启滚环扩增（RCA）；
最后加入分子信标（MB）,检测时，分子信标（MB）打开茎环结构呈链状，与扩增产物互补结合，荧光基团和淬灭基团之间的距离加大，淬灭作用失效，荧光基团发出荧光信号，即检测到待测样本含有目标tsRNA，荧光强度与目标tsRNA含量成正比，可实现定量检测。
这里，可在滚环扩增（RCA）后添加支链引物，与滚环扩增产物结合，以滚环扩增的扩增产物为模板进行超分支滚环扩增（HRCA），最后再加入分子信标（MB）进行荧光检测。
这里，若哑铃状DNA模板遇到序列相近的干扰RNA序列，由于序列不完全互补则无法破坏哑铃结构，无法开启扩增，也就不会有相应扩增产物与分子信标（MB）结合释放荧光被检测到，因此，将DNA模板设计为哑铃状结构来检测目标tsRNA，只有特定目标tsRNA才能开启滚环扩增，特异性强。
进一步地，包括如下步骤：
1）在连接体系中加入哑铃状DNA模板序列、T4连接酶缓冲液、T4连接酶和DEPC处理水进行连接反应；连接反应后加入外切酶，进行去除未连接序列的反应；
2）配制滚环扩增体系，组分包括哑铃状DNA模板、DEPC处理水、phi29 DNA聚合酶缓冲液、phi29 DNA聚合酶、dNTPs、BSA、待测样本；进行滚环扩增反应；
3）在滚环扩增产物中加入分子信标MB，孵育后使用荧光定量PCR仪或者酶标仪检测荧光信号。
进一步地，上述步骤2）组分还包括支链引物，进行超分支滚环扩增反应，提高扩增效率，提升灵敏度。
进一步地，步骤1）所述的连接反应条件为25℃ 2h，65℃ 10min；去除未连接序列的反应条件为37℃ 10min，80℃ 20min。
进一步地，步骤2）所述的滚环扩增反应条件为30℃ 1h，65℃ 10min。
进一步地，步骤3）在扩增产物中加入分子信标MB，90℃孵育3min后缓慢降温至25℃，再使用荧光定量PCR仪或者酶标仪检测荧光信号。
本发明有益效果如下：1）与PCR法相比，无需对目标tsRNA进行预处理、逆转录等步骤，大大节约了时间，减少了操作带来的误差，也节约了试剂，降低检测成本；2）扩增时无需反复热变性，恒温即可扩增，对精密仪器的依赖性降低,操作简便，更适合临床使用；3）对特殊的哑铃状结构的模板进行滚环扩增，序列相近的干扰RNA序列不完全互补，无法破坏哑铃结构，就无法开启扩增，也就不会有相应扩增产物与分子信标（MB）结合释放荧光被检测到，因此，特异性显著提升。
附图说明
图1为本发明制备哑铃状结构模板的连接原理图；
图2为本发明哑铃状结构模板滚环扩增及荧光检测的工作原理图。
其中，toehold是支点；Sybr Green是荧光染料；Fluorophore是荧光基团；Quencher是淬灭基团；RCA是滚环扩增。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面结合附图对本发明的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本发明。
本实施例以tsRNA（序列为5' AUCCCA CUCCUGACACCA 3’）作为目标tsRNA，利用滚环扩增与分子信标对其进行检测的方法如下：
一、哑铃状DNA模板、分子信标的设计合成
1、哑铃状DNA模板序列为：
5'P-TGGGATTCTAAATCACTATGGTCGCGCTAGGTATATATCCCACTCCTCCCtggtgtcAGGAG 3'
其中，标下划线的序列可与目标tsRNA互补配对，中间序列为44个碱基长度。
TGGGAT作为支点（toehold），与目标tsRNA互补结合，以开启滚环扩增，同时作为随后的滚环扩增模板。
2、分子信标序列为：
5' CY5-ccgcgtCGCTAGGTATATATCCCacgcgg-BHQ2 3`
其中，CY5为荧光基团（Fluorophore），BHQ2为淬灭基团（Quencher），分子信标（MB）两端6个碱基分别互补，初始为茎环结构。
分子信标（MB）中间碱基序列与哑铃状DNA模板部分序列相同，即与哑铃状DNA模板滚环扩增产物互补。
检测时，分子信标（MB）打开茎环结构成链状，与滚环扩增产物互补配对。因为淬灭基团与荧光基团之间的距离加大，淬灭作用失效，荧光基团释放荧光信号，即说明检测到特异性扩增产物，待测样本含有目标tsRNA，成功开启了滚环扩增。而所检测到的荧光强度与目标tsRNA浓度成正比。
二、目标tsRNA的检测
1、连接反应以及去除未连接序列
配制连接体系： 6μl哑铃状DNA模板序列（10μM）、5μl T4连接酶缓冲液、1μl T4连接酶（400000U/mL）和38μl DEPC处理水混匀进行连接反应；连接反应条件为25℃ 2h，65℃10min；连接反应后，上述体系加入1μl外切酶Ⅰ（20000 U/mL），0.5μl外切酶Ⅲ（100000 U/mL）；反应条件为37℃ 10min，80℃ 20min，去除未连接序列。
2、滚环扩增
配制滚环扩增体系： 1μl哑铃状DNA模板、13.5μl DEPC处理水、2μl phi29 DNA聚合酶缓冲液、0.5μl phi29 DNA聚合酶（10000U/mL）、1μl dNTPs（10mM）、1μl BSA（2mg/mL）、1μl待测样本；反应条件为30℃ 1h，65℃ 10min。
这里，与PCR法相比，RCA法无需对目标tsRNA进行预处理、逆转录等步骤，大大节约了时间，减少了操作带来的误差，也节约了试剂，降低检测成本；且扩增时无需反复热变性，恒温即可扩增，对精密仪器的依赖性不高。
3、荧光检测
在扩增产物中加入5μl分子信标MB（10μM），90℃孵育3min后缓慢降温至25℃（室温），使用荧光定量PCR仪或者酶标仪检测荧光信号。
而原先此步骤是使用Sybr Green荧光染料检测，即不加入分子信标，向滚环扩增产物中加入1μl 20X Sybr green Ⅰ ，荧光定量PCR仪运行程序为：Holding Stage:30℃10s ; Cycling Stage: 30℃ 1 min , 60 cycles ,Holding Stage: 65℃ 10min，运行结束后取最终荧光强度对比标准曲线，即可得到待测样本中tsRNA浓度。与之相比，使用分子信标进行定量检测特异性更强。
使用分子信标（MB）具体检测方法如下：
1）荧光定量PCR仪检测法：以上连接及扩增反应需在8联管中完成，将加入分子信标（MB）的8联管置于仪器内，在Plate Setup 页面将reporter 改为Cy5。运行程序为Holding Stage:30℃10 s ; Cycling Stage: 30℃2 min,60个循环。运行结束后取荧光曲线末端平台期数值，对比标准曲线即可得到待测样本中tsRNA浓度。
本实施例中，荧光定量PCR仪型号为ABI 7500（7500 Real-Time PCR System ,applied biosystems by Thermo Fisher Scientific）；8联管规格为0.2mL，货号PCR-0208-C,Axygen生产。
2）酶标仪检测法：以上连接及扩增反应需在384孔板中完成，将加入分子信标（MB）的384孔板置于仪器内，设置仪器运行参数：Read Mode : FL ; Read Type: Kinetic ;Wavelength: Excitation 650nm, Emission 670nm ; Plate Type:384 Well Corningflatbtm ; Timing:Total Run Time:2h,Interval:2min；Temperature:30℃。运行结束后取荧光曲线末端平台期数值，对比标准曲线即可得到待测样本中tsRNA浓度。
这里，使用分子信标（MB）检测到荧光信号，即说明检测到特异性扩增产物，只有待测样本含有目标tsRNA，才能成功开启滚环扩增，与Sybr green染料法相比，不会受到干扰序列的影响，特异性更强。
以上，酶标仪型号为SpectraMax M5；384孔板货号为3573，Corning生产；封板膜货号为PCR-TS，Axygen生产。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）针对目标tsRNA设计哑铃状DNA模板，使用T4连接酶将哑铃状模板缺口连接，形成闭合哑铃状结构；
2）目标tsRNA竞争结合DNA模板互补区，破坏DNA模板哑铃状结构， 使其呈环状；DNA模板成环后作为模板，目标tsRNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶的作用下，发生滚环扩增；
3）在扩增产物中加入分子信标并进行信号检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，所述DNA模板包括支点，支点与哑铃状DNA模板互补区相连；所述支点、哑铃状DNA模板互补区，与目标tsRNA序列互补配对。
3.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括超分支滚环扩增，按所述步骤2）滚环扩增后，引入支链引物，进行超分支滚环扩增。
4.根据权利要求3所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，所述支链引物与滚环扩增产物互补配对，不与目标tsRNA完全互补配对。
5.根据权利要求1或2所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）在连接体系中加入哑铃状DNA模板序列、T4连接酶缓冲液、T4连接酶和DEPC处理水进行连接反应；连接反应后加入外切酶，进行去除未连接序列的反应；
2）配制滚环扩增体系，组分包括哑铃状DNA模板、DEPC处理水、phi29 DNA聚合酶缓冲液、phi29 DNA聚合酶、dNTPs、BSA、待测样本；进行滚环扩增反应；
3）在超分支扩增产物中加入分子信标MB，孵育后使用荧光定量PCR仪或者酶标仪检测荧光信号。
6.根据权利要求5所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，所述步骤2）组分还包括支链引物，进行超分支滚环扩增反应。
7.根据权利要求5所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，步骤1）所述的连接反应条件为25℃ 2h，65℃ 10min；去除未连接序列的反应条件为37℃ 10min，80℃ 20min。
8.根据权利要求5所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，步骤2）所述的滚环扩增反应条件为30℃ 1h，65℃ 10min。
9.根据权利要求5所述的一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法，其特征在于，步骤3）在扩增产物中加入分子信标MB，90℃孵育3min后缓慢降温至25℃，使用荧光定量PCR仪或者酶标仪检测荧光信号。
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