CN101985662A

CN101985662A - 一种检测乳腺癌易感性的试剂盒

Info

Publication number: CN101985662A
Application number: CN 201010583569
Authority: CN
Inventors: 周翊峰; 郁晓; 邓杰琼; 王艳萍
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2030-12-10
Also published as: CN101985662B

Abstract

本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测乳腺癌易感性的试剂盒，所述试剂盒包括：检测Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD14基因上rs2569190号SNP位点的特异性引物以及检测所述两个SNP位点的特异性内切酶。本发明通过检测Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD14基因上rs2569190号SNP位点的多态性实现了对乳腺癌易感性的评估。

Description

一种检测乳腺癌易感性的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测乳腺癌易感性的试剂盒，通过同时检测Foxp3基因的单核苷酸多态性(SNP)位点与CD14基因的单核苷酸多态性位点来预测个体对乳腺癌的易感性。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，我国女性乳腺癌发病率逐年增高，发病率占恶性肿瘤的7％～10％，全年约有120万妇女发生乳腺癌，占女姓肿瘤的18％。

科学家已查明，BRCA1与BRCA2基因的突变很大程度上增加了女性患有乳腺癌的可能性。在正常情况下，这两种基因可传递控制细胞繁殖的信息。如果它们出现变异，细胞就会无节制地繁殖，导致癌症形成。但BRCA1和BRCA2在预测乳腺癌家族性风险上却不能令人满意，因为携带BRCA1与BRCA2基因突变的人群相对很少。

人转录因子叉状头翅膀状螺旋转录因子(forkhead/winged helixtranscription factor Foxp3)基因定位于Xp11.23～Xq13.3，属于转录因子forkhead/winged-he2lix家族。Foxp3含有11个外显子和10个内含子，cDNA全长为1869bp，其编码的蛋白Foxp3/Scurfin由431个氨基酸组成，N末端有锌指蛋白、亮氨酸拉链和一个富含脯氨酸的区域。fork2head结构域位于羧基端(氨基酸残基的337～420)，通过该结构域与DNA特定位点结合，调节目的基因的活化和表达。于2003年被证实为CD4+CD25+调节性T细胞(regulatoryT cell，Treg)的特异性标志。

免疫逃逸是肿瘤发生发展的一个重要机制。在肿瘤学的研究领域中，Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞在肿瘤免疫逃逸机制中发挥作用，Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞特异性的表面标志，是发育与功能的决定因素，在肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用。在黑素瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤中都检测到Foxp3高表达。Wolf等在对浸润性乳腺癌中Foxp3的表达研究中发现，Foxp3表达的高低与淋巴结转移的情况密切相关，而与肿瘤大小、浸润程度、激素受体、孕酮水平、是否绝经等无关(参见：Wolf AM，Rumpold H，Wolf D，Gastl G，Reimer D，Jenewein N，Marth C，Zeimet AG.JClin Oncol.2007 25：4499-4500.)。Zuo等在对超过200例的乳腺癌标本研究中的发现与其他文献的结果不一致，认为Foxp3可以抑制癌基因SKP2转录，降低乳腺癌的发病率，Foxp3基因突变会导致SKP2表达上调，增加患乳腺癌的概率(参见：Zuo T，Liu R，Zhang H，Chang X，Liu Y，Wang L，Zheng P，Liu Y.JClin Invest.2007 117：3765-3773)。

人CD14基因位于人5号常染色体的长臂端5q23-q31，约含有1338个核苷酸残基。从核苷酸的第76位到1200位，编码一段有375个氨基酸残基的多肽链。

CD14有两个形态，即mCD14和sCD14。mCD14是一种55kDa的糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固于细胞膜。mCD14蛋白质部分由包括356个氨基酸残基组成的多肽链和一个由19个氨基酸残基组成的末端多肽链构成，其末端多肽为强疏水性性多肽链。人CD14氨基酸序列中39～44位区段是与LPS结合的必要部分。sCD14也是一种糖蛋白，其蛋白质结构与mCD14的蛋白质结构基本相同，(也有报道sCD14蛋白质多肽链序列较mCD14蛋白质多肽链少8个氨基酸)，但sCD14不含有PI结构，故分子量较mCD14小，为48kDa左右。

mCD14主要分布在单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的细胞表面，被激活的中性粒细胞表面也有少量mCD14的存在。而内皮细胞、上皮细胞等表面则未发现mCD14的存在。mCD14还存在于中性粒细胞胞浆内膜性分泌小体和嗜苯胺兰颗粒中。sCD14则存在于正常人和动物的血浆(清)中，人血清中的正常浓度为2～5mg/ml，占血中全部CD14含量的99％。

mCD14是由含有CD14基因的单核细胞、巨噬细胞，自行转录、翻译蛋白质多肽链，在高尔基复合体内糖化后，其羧基端再与PI结合，并由PI的磷脂部分与细胞膜连接。IL-1β和TNF-α能够调节CD14基因的表达，促进CD14mRNA的转录；FMLP和GM-CSF可刺激中性粒细胞，使其细胞表面的mCD14增多。sCD14则是由单核细胞产生。单核细胞产生sCD14的方式可能有两种：①由内源性酶促反应(由蛋白酶或磷脂酶催化)，使mCD14分解(脱去PI成分)、脱落形成。因为体外培养的单核细胞受LPS和IFN-r等刺激后，细胞表面的mCD14明显减少，而培养上清液中sCD14的浓度却明显增加；②由CD14基因转录、合成的CD14蛋白，不进行PI化或逃脱PI化，直接分泌入血。

CD14(包括mCD14和sCD14)的化学结构为糖蛋白，其生物学功能主要是识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。最近的研究表明，CD14也参与了肿瘤的发生发展过程(参见：Subimerb C，Pinlaor S，Lulitanond V，Khuntikeo N，Okada S，McGrath MS，Wongkham S.Clin Exp Immunol.2010161：471-479；Wu CC，Hsu CW，Chen CD，Yu CJ，Chang KP，Tai DI，Liu HP，Su WH，Chang YS，Yu JS.Mol Cell Proteomics.2010 J9：1100-1117.)。

rs2569190位于CD14基因上5’UTR，为A/G多态，在亚洲人群中该多态的频率分布为A0.500，G0.500，基因型A/A0.205、A/G0.590、G/G0.205。rs2569190位点不同的基因型可以通过影响CD14基因的转录水平，从而对CD14的表达起调节作用。

SNP(Single nucleotide polymorphism)，即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DNA多态性，被遗传界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的的一类多态性标记，占大约90％。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病、特别是复杂疾病的易感性和对环境因素、药物反应的差异。

如果可以研发一种通过检测人Foxp3基因和CD14基因检测乳腺癌易感性的方法将有助于乳腺癌的预防和治疗。

发明内容

本发明目的是提供一种检测乳腺癌易感性的试剂盒。

本发明的原理为：发明人经研究发现Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD14基因上rs2569190号SNP位点的多态性与人体对乳腺癌易感性相关，可用于评估个体对乳腺癌的易感性的基础；并且，当被检测DNA的Foxp3基因上的rs2294021号SNP位点基因型为杂合CT型，为乳腺癌易感型；被检测DNA的CD14基因上的rs2569190号SNP位点基因型携带有G型，为乳腺癌易感型；同时为Foxp3基因rs2294021号SNP位点为杂合CT型，CD14基因上rs2569190号SNP位点携带G型的，罹患乳腺癌的风险最高。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种检测乳腺癌易感性的试剂盒，包括：检测Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD14基因上rs2569190号SNP位点的特异性引物以及检测所述两个SNP位点的特异性内切酶。

上述技术方案中，所述试剂盒中特异性引物对是指针Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD14基因上rs2569190号SNP位点而设计，能够特异性扩增包含Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD14基因上rs2569190号SNP位点的DNA片段的引物对。所述特异性引物优选为SED ID NO：1所述碱基序列、SED ID NO：2所述碱基序列、SED ID NO：3所述碱基序列和SEDID NO：4所述碱基序列。本领域的技术人员能够理解本发明的引物不限于这两对引物。

上述技术方案中，所述试剂盒中的特异性内切酶是指针对Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD14基因上rs2569190号SNP位点而选用，能够通过酶切片段长度检测出这两个SNPs位点乳腺癌易感基因型的限制性内切酶，优选为内切酶HaeIII。

上述技术方案中，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件(Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、PCR反应缓冲液、去离子水)及酶切常规组件(反应缓冲液、去离子水)。

上述技术方案中，本发明试剂盒中PCR扩增检测的常规组件的组分和含量为，每10μLPCR扩增体系中包括：1μl 10×PCR反应缓冲液，0.5μl 25mMMgCl₂溶液，0.2μl 25mM dNTP混合液，1U Taq DNA聚合酶，余量为去离子水。

上述技术方案中，本发明试剂盒中酶切常规组件的组分和含量为，每20μl酶切反应体系中包括2μl 10×内切酶反应缓冲液。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、本发明通过检测Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD14基因上rs2569190号SNP位点的多态性实现了对乳腺癌易感性的评估。

2、本发明所述试剂盒可同时检测Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD 14基因上rs2569190号SNP位点的多态性；一步PCR扩增可同时扩增两个目标基因序列；单一种类内切酶通过一步反应实现两段目标基因序列的酶切。

3、本发明相对于其他方法更为简便、快速。

附图说明

图1为实施例一中步骤3所得酶切产物琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

一种检测乳腺癌易感性试剂盒，其组分和含量包括：1μl 10×PCR反应缓冲液，0.5μl 25mM MgCl₂溶液，0.2μl 25mM dNTP混合液，0.2μl(5Units/μl)Taq DNA聚合酶，10μM特异性引物对(四条)各0.2ul，0.5μl HaeIII内切酶(10U/ul)，2μl 10×内切酶反应缓冲液，去离子水9μl。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒保存温度为-20℃。

上述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

步骤1：DNA模板的抽取

使用血液基因组DNA提取系统(非离心柱型)提取外周血的基因组DNA。

步骤2：PCR反应，目的片段的复制

使用可检测乳腺癌易感性的PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物：

有义引物2：5’-ACACACAATCCATAAAGTCACC-3’

(SED ID NO：1)Tm值为56℃

反义引物2：5’-ATCTCCATGCCCTAAGAAGGCCA--3’

(SED ID NO：2)Tm值为56℃

有义引物1：5’-CCCCAAGACCCTACACTCAC 3′

(SED ID NO：3)Tm值为56℃

反义引物1：5’-AGGACACTGCCAGGAGACAC-3’

(SED ID NO：4)Tm值为56℃

有义引物1，反义引物1特异性地复制Foxp3基因上rs2294021号SNP位点多态性的片段，有义引物2，反义引物2特异性地复制CD14基因上rs2569190号SNP位点多态性的片段。

PCR反应体系总体积为10μl，包括1ul 10×PCR反应缓冲液，0.5μl 25mMMgCl₂溶液，0.2μl 25mM dNTP混合液，0.2μl(5Units/μl)Taq DNA聚合酶，10μM特异性引物对(四条)各0.2μl，去离子水7.3μl。在Biometra TprofessionalPCR扩增仪上进行反应，反应条件是94℃5分钟、进行35个循环的94℃40秒、56℃40秒、72℃40秒，72℃10分钟。

步骤3：限制性内切酶酶切

使用可检测乳腺癌易感性的PCR检测试剂盒。在步骤2所得产物加入试剂盒中所包含10×内切酶反应缓冲液2μl，HaeIII内切酶0.5μl(10U/μl)，去离子水7.5μl，在37℃条件下水浴3小时。

步骤4：SNP基因型分析

3％琼脂糖凝胶电泳检测步骤3所得酶切产物，电泳图如图1所示。

根据凝胶成像显示不同条带，所代表的基因型分析如下：

其中，同时含有3条大小为320bp，220bp，110bp的条带，说明被检测DNA的Foxp3基因上的rs2294021号SNP位点基因型为杂合CT型，为乳腺癌易感型；含有2条290bp，60bp大小的条带，说明被检测DNA的CD14基因上的rs2569190号SNP位点基因型携带有G型，为乳腺癌易感型。联合这3基因分析，同时为Foxp3基因rs2294021号SNP位点为杂合CT型，CD14基因上rs2569190号SNP位点携带G型的，罹患乳腺癌的风险最高。

注：实施例中未注明具体实施条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。

实施例二：

通过实施例一的方法对261例乳腺癌患者和356例正常对照进行基因分型，分析各基因型相对应乳腺癌患者和正常对照的概率，得表一，我们发现：携带FOXP3rs2294021CC基因型的个体比携带FOXP3rs2294021TT基因型的个体罹患乳腺癌的风险要高2.22倍，携带FOXP3rs2294021TC基因型的个体比FOXP3rs2294021TT基因型的个体罹患乳腺癌的风险要高1.43倍。同样，携带CD 14rs2569190GG基因型的个体比携带AA基因型的个体发生乳腺癌的风险要高2.83倍，而AG基因型个体起发生乳腺癌的风险要比AA基因型的个体高1.49倍(以上差异均具有显著性，P＜0.05)。

此外通过进一步的分析我们还发现，两个单核苷酸多态性之间还存在这个交互作用，即同时携带FOXP3rs2294021CC和CD 14rs2569190GG的个体比同时携带FOXP3rs2294021TT和CD14rs2569190AA个体发生乳腺癌的几率提高了7.75倍(表二)。随着风险等位基因(携带FOXP3rs2294021C和CD14rs2569190G)的不断参入，其携带个体发生乳腺癌的风险逐步增加(P_trend＜0.05)。

表一、FOXP3、CD14基因单核苷酸多态与乳腺癌风险

表二、FOXP3、CD14基因单核苷酸多态交互作用

核苷酸和/或氨基酸序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种检测乳腺癌易感性的试剂盒

<160> 4

<170> PatentInversion3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

acacacaatccataaagtcacc 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atctccatgccctaagaaggcca 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccccaagaccctacactcac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aggacactgccaggagacac 20

Claims

1. 一种检测乳腺癌易感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：检测Foxp3基因上rs2294021号SNP位点和CD14基因上rs2569190号SNP位点的特异性引物以及检测所述两个SNP位点的特异性内切酶。

2. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述特异性引物为SED ID NO: 1所述碱基序列、SED ID NO: 2所述碱基序列、SED ID NO: 3所述碱基序列和SED ID NO: 4所述碱基序列。

3. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，检测所述两个SNP位点的特异性内切酶为内切酶HaeIII。

4. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件：Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、去离子水；酶切常规组件：反应缓冲液、去离子水。

5. 根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中PCR扩增检测的常规组件的组分和含量为，每10μLPCR扩增体系中包括：1μL 10× PCR反应缓冲液，0.5μL 25mM MgCl2溶液，0.2μL 25mM dNTP混合液，1U Taq DNA 聚合酶，余量为去离子水。

6. 根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，试剂盒中酶切常规组件的组分和含量为，每20μL酶切反应体系中包括2μL 10×内切酶反应缓冲液。