JPH01500083A

JPH01500083A - 急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出

Info

Publication number: JPH01500083A
Application number: JP62502959A
Authority: JP
Inventors: グレイストン，ジェイ．，トーマス; クオ，チョ‐チョウ; ワン，サン‐ピン; キャンベル，リー，アン
Original assignee: ワシントン　リサーチ　ファウンデイション
Priority date: 1986-05-01
Filing date: 1987-05-01
Publication date: 1989-01-19
Anticipated expiration: 2012-11-12
Also published as: WO1987006617A3; WO1987006617A2; AU605485B2; CA1341065C; JPH09285288A; DE3789597D1; EP0264434B2; EP0577144A1; DE3789597T2; ES2005569A6; JP2675564B2; ATE104355T1; AU7390687A; EP0264434A1; JPH11123077A; DE3789597T3; EP0264434B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出技術分野本発明は、一般的にクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）株の検出及びより詳しくは、呼吸感染に関連する独特のクラミジア株の検出におけるモノクローナル抗体及びＤＮＡプローブの使用に関する。

背景の技術クラミジアは、動物界を通して遍在し、そして種々の疾病を引き起こすことが知られている偏性細胞内寄生体である。

クラミジア属は、２種の認識される種、すなわち旦、トラコマチス（Ｃ、ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）及び旦、プシタン（Ｃ、ｐｓｉｔｔａｃｉ）並びに３種のバイオバーへの旦、トラコマチスの派生を有する。Ｃ、トラコマチス、すなわち一次性ヒト病原体であるこの種は、目、呼吸及び尿生殖器感染を引き起こす。旦、上皇コマチスは初めに、粘膜、たとえば粘膜、鼻咽頭、直腸、尿道及び頚管上にコロニー形成することができ、この後、その感染は分散し、より深い器官系に影響を及ぼす。

クラミジアの他の種、すなわちＣ，プ之え之は、ヒト呼吸疾患、すなわちオウム病の原因である。オウム病は、通常、感染された鳥類への接触によって感染し、オウム病の発生は、客の間で起こる。その疾患はしばしば異型肺炎に類似し、そして軽いものから利金的なものまでの範囲を有する。そのような肺炎の流行病は通常、感染された鳥類に由来したが、鳥類のベクターは必ずしも見出されない。

たとえば、１９８７年北フインランドにおける放射線撮影法による調査の間、軽い肺炎の流行病が２つの集落に見出された。しかしながら、鳥類による伝染は見出されなかった。

血清疫学研究は、化ヨーロッパにおいてこの及びいくつかの他の肺炎流行病におけ句Ｌｉ主区ヱの通常の菌株を抱合した。このえｉま区ヱの新規菌株は、つい最近、重要な呼吸病原菌として確立され、そしてそれは研究された成人集団におけるたぶん１２％までの異型肺炎患者を引き起こした。しかしながらほとんどの感染は、原因物質がマイコプラスマ　１主ウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）又はインフルエンザＡ型又はＢ型ウィルスであるまちがった確信のために、抗生物質により不適切に治療された。Ｘ、プネウモニアエのために使用される少量でのエリスロマイシンによる抗生物質治療は、ヱ土ユ１立久ヱ感染に対して効果的があるが、この投与量でのエリスロマイシンはクラミジア感染に対して効果的でない。さらに、これらの感染は、症状が明確に緩和した後、再発する疾病によってしばしば特徴づけられる。

新菌株のえＵ乏ヱと急性呼吸疾患とのこの関連の観点がら、この新菌株の存在を診断するための正確且つ費用的に有効な方法を提供することがひじょうに所望され、それにょって−次感染の有効な抗生物質治療を可能にするであろう。本発明は、そのような方法を提供し、そしてさらに他の関連する利点によって特徴づけられる。

発明の開示簡単に言えば、本発明は、生物学的サンプル中におけるクラミジアのＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための方法を提供する。これらの方法は、ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向けられたモノクローナル抗体又はＴＷＡＲ生物体に対して特異的なりＮＡプローブのいづれかを使用する。

本発明の１つの観点において、その方法は、（ａ）　ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向けられた、ラベルされたモノクローナル抗体に、そのＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを暴露する段階；及び（ｂ）前記モノクローナル抗体と前記ＴＷＡＲ生物体との間に形成される免疫複合体の存在を検出する段階を含んで成る。

ＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための関連方法は、（ａ）　ＴＷＡＲ生物体が細胞内に含まれるようにＨｅＬａ細胞とＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルとを混合し；（ｂ）前記ＴＷＡＲ生物体を含むＨｅＬａ細胞をインキュベートし；　（Ｃ）　ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向けられた、ラベルされたモノクローナル抗体に前記ＨｅＬａ細胞／ＴＷＡＲ生物体を暴露し；そして（ｄ）前記ＴＷＡＲ生物体と前記ラベルされたモノクローナル抗体との間に形成される免疫複合体の存在を検出することを含んで成る。

本発明の特に好ましい態様においては；前記混合段階は、サンプルよりＨｅＬａ細胞を接種し、そして続いてそのＨｅＬａ細胞上での接種されたサンプルを遠心分離にかけることを含んで成る。ＤＥＡＥ−デキストラン及びシクロヘキサアミドにより前処理することがまた好ましい。

本発明の３番目の観点は、生物学的サンプル中において一？一旦マクヱのＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するための方法を開示する。その方法は、一般的に、（ａ）反応混合物を形成するためにＴＷＡＲ生物体の基本体と共に生物学的サンプルをインキュベートし；そして（ｂ）そのＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するために前記反応混合物を分析することを含んで成る。好ましい態様においては、前記分析段階は、抗体に対するラベルされた特異的な結合パートナ−と前記反応混合物を接触せしめ、そしてそのラベルを検出することを含んで成る。これに関しては、その特異的な結合パートナ−は、ヤギ抗−ヒトＩｇＭ又はヤギ抗−ヒトＩｇＧである。

上記に簡単に記載された方法のすべてにおいて、モノクローナル抗体は、酵素、蛍光体、放射性同位体又は発光体によりラベルされ得る。これに関して、検出の段階は、通常、それぞれ酵素反応、蛍光、放射能又は発光によって存在するのであろう。

上記に説明された方法は、ＴＷＡＲ生物体又はそのＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を検出するために種々の生物学的サンプルに適用され得る。体分泌液１体液及び組織検体は適切なサンプルである。体分泌液の例は、頚管分泌液、気管− 気管支分泌液、及び咽頭分泌液を含む。適切な体液は、血液、涙及び中枢神経系液を含む。組織検体の例は、種々のバイオプシー、たとえば肺組織又はらっは骨組織のバイオプシーを含む。

さらに実質的にすべての部分からの組￥８（心ｗｔ組織及び肺組織）が、検死実験内で試験され得る。

本発明によれば、上記に記載された方法に使用するためにＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向けられたモノクローナル抗体を産生ずる連続したハイブリッド細胞系が確立される。

特に好ましい態様においては、その細胞系は、ハイブリドーマクローンＲＲ４０２又はＴＴ　２０５を含んで成る。そのような細胞系により産出されるモノクローナル抗体もまた開示されている。

上記に示されるように、本発明はまた、ＴＷＡＲ生物体に対して特異的なりＮＡプローブも開示する。ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なくとも一部を含むそのプローブが、生物学的サンプル中におけるＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための方法に使用され得る。

本発明の１つの観点において、その方法は、（ａ）サンプルに関連するＤＮＡを単離するためにＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを処理する段階；（ｂ）基質にその単離されたＤＮＡを添加する段階；　（ｃ）　ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラベルされたＤＮＡプローブと共にＤＮＡ担持基質をインキュベートする段階；（ｄ）前記基質からハイブリダイズしなかったプローブを分離する段階；及び（ｅ）前記基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからＴＷＡＲ生物体の存在又は不在を決定する段階を含んで成る。

本発明のもう１つの観点の範囲内の方法は、（ａ）基質にＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを添加し；（ｂ）該サンプルに関連するＤＮＡを暴露するために前記添加されたサンプルを担持する基質を処理し：（Ｃ）前記ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラベルされたＤＮＡプローブと共に前記ＤＮＡ担持基質をインキュベートし；（ｄ）前記基質からハイブリダイズされなかったプローブを分離し、そして（ｅ）前記基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからＴＷＡＲ生物体の存在又は不在を決定することを含んで成る。

前記方法内のプローブは、完全な染色体ＤＮＡプローブ又はＴＷＡＲ生物体に由来したＤＮＡフラグメントプローブである。

本発明のこれらの及び他の観点は、次の詳細な説明及び添付図面によって明確になるであろう。

図面の簡単な説明第１Ａ図は、Ｃ、プシタシの形態学的特徴のＴＭＡＲ封入体を示す写真である。

第１Ｂ図は、Ｃ、トラコマチスの特徴的な空砲構造を示す写真である。

第２図は、ＴＷＡＲ単離体ＡＲ−３９からのニックトランスレートされた完全な染色体ＤＮＡによりプローブされた旦、上皇ユマチス、旦、プシタシ及びＴＷＡＲからの変性されたＤＮＡの点のオートラジオグラフである。

第３Ａ図は、ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９ＤＮＡの遺伝子バンクから単離された３、８ｋｂｐのＰｓｔＩフラグメントによりプローブされた、竺辻■により消化されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフである。

第３Ｂ図は、ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９ＤＮＡの遺伝子バンクから単離された３、２ｋｂｐのＰｓｔｌフラグメントによりプローブされた、肛皿■により消化されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフである。

第４図は、Ｐｓｔｌにより消化されたＴＷＡＲＤＮＡから成る遺伝子バンクから単離され、そして精製された３種のＴＷＡＲ−特異性ＤＮＡプローブによりプローブされたＴＷＡＲＳＣ，−ズ」じＬ乞及び旦、上ｉユヱ天スからの変性された完全な染色体ＤＮＡの点のオートラジオグラフである。

Ｈるための　の、能上記に示されるように、血清疫学研究は、化ヨーロッパ及び他の国においていくつかの肺炎流行病におけ剣久久え／ヱの通常の菌株を包含した。このＬｉｌ乏ヱの新規菌株は、初めの２種の単離体の実験用名称（ＴＷ−１８３及びＡＲ−３９）から’ＴＷＡＲ”として本発明において言及される。ＴＷＡＲは、クラミグヱ属に属することが示されているが、しかし、いくつかの基準によって旦、トリコマチス及び旦、プシクシから区別され得る。封入体の形態及び封入体におけるグリコーゲンの存在に関しては、ＴＷＡＲ封入体は、グリコーゲンを含む旦、王立コマチス封入体の空胞性質とは違って、それらの卵形且つ密集した出現及びグリコーゲンの不在に基づいてＣ０１２文２により密接に関連される。さらにＴＷＡＲ生物体は、−Ｑ−０王立ユマチス種−特異性モツクローナル抗体と反応しない（Ｓｔｅｐｈｅｎｓなど、、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２８　：　１０８３．１９８２）。

ＴＭＡＲ生物体は明らかに、Ｃ，）リコマチス種に属さないが、それはまた現在認識されている旦、プシタシ株とも重要な相違を示す。ＴＷＡＲ及び他の旦、プ之叉之株は免疫学的に異なる。

すなわち、他の旦、１２１２株との交叉反応は見出されていない。さらに、ＴＷＡＲ生物体に対するモノクローナル抗体の産生において（下記により十分に記載されている）、ｃ、７”、ｚＵ種−特異性抗体は検出されず、属−及び菌株−（ＴＷＡＲセロバー）特異性抗体のみが見出された。プラスミドは、試験されたほとんどすべての旦、プ之叉之及びＣ，トーコマチスクラミジア株に見出されたが、ＴＷＡＲ生物体はプラスミドを持たないことを注目することはまた興味の対象である。さらに、すべての既知のＣ，プ２叉之株は動物又は鳥宿主を有するが、ＴＷＡＲ生物体のための動物又は鳥宿主は見出されていない。本発明によれば、ＴＷＡＲ生物体は、Ｃ，７”之え２に形態的に類似するが、しかしそれとは異なり、そして現在認識されている旦、プシタシ株とは免疫学的に異なるいづれかのＬｉま２１株を含むことが定義される。代表的なＴＷＡＲ株（ＡＲ−３９）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃａ１ｔｕｒｏ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託され、そして寄託番号第５３５９２号を得た。

ハイブリドーマ形成及びモノクローナル抗体の産生は、種々の微生物疾患の免疫診断に有用であることが示された。より詳しくは、モノクローナル抗体は、ヒト感染の検出及び血清学的な分類を可能にする。さらに、これらのモノクローナル抗体は、属−及び種−特異性抗原の同定を促進せしめる。

上記に示されたように、ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対するモノクローナル抗体を産生ずることができる連続したハイブリッド細胞系が確立される。そのような細胞系を確立するための一般的な方法は、実験動物、通常マウスを適切な抗原により免疫化することを含む。次に、免疫肺臓細胞を単離し、その化学物質、たとえばポリエチレングリコールに暴露することによって骨髄腫又はリンパ腫細胞と融合せしめる。次に、融合されたハイブリッド細胞を、悪性細胞系の増殖を妨げる選択培地、たとえばＨＡＴ培地中でインキュベートする。ハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローンし、そして培養上清液を、所望の特異性を有するモノクローナル抗体の分泌のために検定する。選択されたモノクローナル抗体の多くの収量が、ハイブリドーマの４７　Ｍ±での腹水増殖を通して得られた。

ＴＷＡＲ生物体に対して特異的であるモノクローナル抗体を得るために、適切なＴＷＡＲ抗原が調製されるべきである。患者ののど（咽頭）からのＴＷＡＲ単離体を真核細胞培養又は胎児性卵黄のう培養のいづれかを通して、培養することができる。はとんどの−次単離物は、好結果をもたらす真核細胞培養の前、ＴＷＡＲ生物体の卵順応性を特徴とする特に、ＴＷＡＲ単離物を卵黄のう培養物に１度又は２度通し、そして次にバイアル中に増殖されたＨｅＬａ　２２９細胞の培養物上にそれらを接種することが好ましい。そのＨｅＬａ細胞をＤＥＡＥ−デキストラン及びシクロへキサアミドにより前処理することもまた好ましい。そのＴＷＡＲ単離体は、くり返された培養物通過により細胞培養物中で増殖することが適合され得る。特に、約１０又はそれよりも多くの一連の培養物通過がＨｅＬａ細胞増殖への適合のために好都合であろう。

第１Ａ及び１８図を参照すれば、それぞれＴｈＡＲ生物体及び旦、）うｐ二しチクヨにより感染された１（ｅＬａ　２２９細胞の単層を示す顕微鏡写真が、存在する。ＴＷＡＲによる感染は、核を切り離さず又は置換していない比較的密集した細胞質封入体を示す。

対照的に、第１Ｂ図は、核を切り離している、−Ｃ−０上立ユヱ±困の典型的な空胞性封入を示す。

感染された細胞培養物は、通常、ＴＷＡＲ生物体の感染度のためにモニターされ；そして数パーセントの細胞が感染される場合、多数のバイアル培養物は、大きな培養ボトル中での増殖のために調製物に接種される。好ましい態様においては、５０％の感染度が得られる場合、２０〜３０個のＨｅＬａ　２２９細胞のバイアルが、３２−オンスの調剤ボトル培養物に植え込みを提供するために感染され得る。続く一連の経過は、ＴＷＡＲ株旦ミジアの数を高めるであろう。この適合及び拡大は、モノクローナル抗体の産生及びスクリーニングのためにＴＷＡＲ抗原の十分な量を与えるであろう。

本発明に使用されるハイブリドーマ産生のための免疫原は、精製されたＴＷＡＲ抗原であった。好ましい態様において、その抗原は、レッグラフインにより精製されたＴＷＡＲ基本体（〉９９％に精製された）である。ハイブリドーマは、免疫マウス肺臓細胞とＮ５−０骨髄腫細胞との融合によって調製され、そして抗− クラミシア抗体を分泌するノＸイブリド−マクローンが同定される。好ましい態様においては、ハイブリドーマ培養上清液を、ＥＬＩＳＡによってスクリーンする。特に好ましい態様においては、ＥＬＩＳＡは、ペルオキシダーゼ接合性抗− マウス免疫グロブリン及び比色検出システムを使用する。

ミクロ−イムノフルオレセンス技法（Ｓ、　ｐ、　Ｗａｎｇ及びＪ、　Ｔ。

Ｇｒａｙｓｔｏｎ　、ハｅｒ、　Ｊ、　Ｏｈｔｈａｌ、　７０　：　３６７８　、１９７０）によるモノローナル抗体の特異性の試験がまた好ましい。

ＴＷＡＲにより誘発されたハイブリドーマは、同系のＢＡＬＢ／ｃマウス中に腹腔的接種され得る。接種する前、２週間、マウスをブリスタンにより感作することが好ましい。その得られた腹水を収穫し、そしてモノクローナル抗体を精製することができる。好ましい様態においては、腹水性モノクローナル抗体を、プロティンＡ−セファロースカラム上でアフィニティー精製する。

選択されたＴＷＡＲモノクローナル抗体を、本発明に記載された方法に使用するためにラベル化するさことができる。好ましいラベルは、酵素、蛍光体、放射性同位体及び発光体を含む。これらの及び他のラベルは当業界において良く知られている。これに関する特に好ましいラベルは、フルオレセインである。次に、そのラベルされたＴＷＡＲモノクローナル抗体を、属−１種−及び株−特異性について試験することができる。

第１表に示されるように、ミクロ−イノ１ノフルオレセンスアフセイに使用される場合、ＴＷＡＲにより誘発されたモノクローナル抗体は、ＴＷＡＲ単離体と反応したが、しかし旦、上旦旦マチルまたはｃ、プ之叉之はそうではなかった。

第一よ−１ＴＷＡＲによ　沃　れたモノクロ−ル　の。

ＴＷＡＲ−Ｔ讐　１８３　６４００　３２００ＡＩ？　３９　６４００　３２００ＡＲ２７７６４００３２００ＡＲ３８８６４００３２００旦゛そ躇Ｍさ、　。　３２００フルオレセイン接合性ＴＷＡＲモノクローナル抗体は、感染された培養細胞中におけるＴＷＡＲ基本体及びＴＷＡＲ封入体を特異的に染色するが、しかし他のクラミジア株を染色しなかった。従って、本発明は、ＴＷＡＲ特異性抗原決定基に結合するモノクローナル抗体を提供する。

本発明の範囲内で、ＴＷＡＲ特異性モノクローナル抗体が、生物学的検体の診断アッセイに使用されて来た。特に、本発明は、臨床的検体のスミア及び接種された細胞培養物中におけるＴＷＡＲ生物体を検出するための方法を提供する。これらの方法は、固定された検体におけるＴＷＡＲ−特異性抗体決定基に直接的に結合する、ラベルされたＴＷＡＲ特異性モノクローナル抗体を使用する。その検体は、固体支持体、たとえばガラススライド、カバースリップ又はミクロタイターウェル上に固定され得る。その検体又は生物学的サンプルはまた、メタノール又はエタノールにより、固体支持体に固定されるべきである。サンプルがその表面に固定又は結合された後、そのサンプルは、ラベルされたモノクローナル抗体に暴露される。他方、ＴＷＡＲ特異性モノクローナル抗体に結合することができるラベルされた第二抗体が使用される。この方法の変法は、ラベルのシグナルの増強を提供することができる。直接的な蛍光抗体技法によるスミア検体中のＴＷＡＲ生物体の同定は、迅速であり、簡単であり、そして比較的安価である。そのスミア技法は、臨床的調整（初期診断、原因生物体の単離のための改良された機会、治療の成功に基づく追跡調査）及び表皮学的調整の両者に使用され得る。

ＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための方法を提供する他に、本発明は、生物学的サンプル中におけるＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するための方法を提供する。ＴＷＡＲ抗体のための血清又は体液のスクリーニングのための特に好ましい態様は、ミクロ−ＩＦアッセイである。典型的には、抗原（スラミジア基本体抗原）を、顕微鏡のスライド上に固定し、そしてそのスライドを、ＴＷＡＲ抗体を含むと思われるサンプルと共にインキュベートする。次に、ラベルされた特異的結合パートナ−（たとえばフルオレセイン接合性抗−マウス免疫グロブリン）を添加し、そしてその反応を、ＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するために観察する。

ＤＮＡプローブの使用はまた、種々の微生物学的疾患の診断に有用であることが示されて来た。より詳しく番よ、ＤＮＡプローブを用いて、精製されたＤＮＡを検出し、単離されたコロニー中の精製されていないＤＮＡを検出し、又は組織。

体液２食物及び水中のＤＮＡを直接的に検出することができる。ＤＮＡプローブの使用の１つの利点は、その生物体が、臨界的な結合部位のマスキングを通して免疫学的検出を妨げることができる共存する抗体の存在において検出され得ることである。さらに、ＤＮＡプローブは、免疫蛍光技法によって容易に検定され得ないサンプルに対して使用されるべ（可能性を有する。いくつかの異なったアブローチグ、特定の病原体に対して特異的なりＮＡプローブの開発に使用されて来た。これらのアプローチは、（ａ）完全な染色体ＤＮＡ　；（ｂ）その病原体に対してユニークなウィルス性機能に関連する配列；（Ｃ）プラスミドＤＮＡ；（ｄ）　リポソームＲＮＡ遺伝子；及び（ｅ）前記生物体に対して特異的な、クローンされたランダム配列を含む。

しかしながら、ＴＷＡＲはプラスミドＤＮＡを含まず、そしてウィルス性因子はこの生物体のために同定されていないので、本発明は、完全な染色体ＤＮＡプローブ及びＴＷＡＲ生物体に対して特異的であるＴＷＡＲＤ　Ｎ　Ａの代表的なりローンされたフラグメントの両者を開示する。これらのプローブの使用は、旦、 −ヒラ」二乙チノヨ及び旦、プシタシとＴＷＡＲとの区別を可能にする。

下記により詳細に説明されているように、ＤＮＡプローブは、ＴＷＡＲのＤＮＡ配列とハイブリダイズするそれらの能力、及び旦、トラコマチス及びＣ８１２叉之からのＤＮＡとのハイブリダイゼーションのそれらの欠失によって選択された。

簡単に言えば、完全な染色体ＤＮＡプローブに関しては、ＴＷＡＲのＤＮＡを、精製された基本体から単離し、二、クートランスレーションし、そしてトンドブロフトハイブリダイゼーションにおいてプローブとして使用した。第２図に示されるように、完全な染色体ＤＮＡプローブを用いて、旦、上皇コマチス及び−Ｃ −１２叉之からＴＷＡＲ生物体を同定し、そして区別することができる。

手短に言えば、Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントプローブに関しては、ＴＷＡＲ株を適切な生物学的サンプルから単離し、そしてそのＤＮＡを精製した。制限エンドヌクレアーゼによる消化の後、Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントの混合物を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。次に、そのＤＮＡフラグメントを、プロソチング又は電気溶離のいづれかによってニトロセルロース紙に移した。次に、ハイブリダイゼーションプローブを添加し、相同配列を検出した。より詳しくは、約５００ｂｐ　、９００ｂｐ　。

１２００ｂｐ　、　３２００ｂｐ及び３８００ｂｐのザイズを有する、５種のクローンされたＴ−八Ｒの−Ｉ艷二巨二ｊｌＤＮＡフラグメントを、ＡＲ−３９ＤＮＡの遺伝子バンクから精製し、そして染色体消化物をプローブするために使用した。第３図に示されるように、それぞれの場合のハイブリダイジングフラグメントは、すべてのＴＷＡＲ単離体に関して同じであった。さらに、活性は、旦、上皇ユヱ±ス又はｃ、１之り之に関しては観察されなかったが、そのプローブは、ＴＷＡＲ特異性であった。

臨床的な用途に使用するために、クローンされ、そして精製されたＴＷＡＲフラグメントを、ドツトプロットハイブリダイゼーションににおいてプローブとして使用することができる。第４図に示されるように、ＴＷＡＲ、Ｃ，−ス之！−之及び−Ｃ，王立ユヱ±困の分解された基本体を試験する場合、前記フラグメントがＴＷＡＲとのみ反応した。簡単に言えば、どちらかのタイプのプローブに関しては、感染物質を含むと思われる患者からの生物学的サンプルを破壊し、そのＤＮＡを開放し、そしてそのＤＮＡを、物理的（加熱）及び化学的（塩、界面活性剤）手段によってニトロセルロース上にスポットとして結合せしめる。ニトロセルロースに適用する前のサンプル調製の方法は、そのサンプル源に依存するであろう。

すべての場合、そのニトロセルロースは、ＤＮＡの結合を高めるためにＩＭの酢酸アンモニウム中でブレインキュベートされる。多くのサンプルを処理し、そして濃縮するためには、それらのサンプルは、好ましくは、たとえばＢｉｏＤｏｔ　Ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ装置の使用によってニトロセルロースに適用される。ＤＮＡが前に単離されている場合、サンプルは、０．３　ＭのＮａ（Ｊ中で１０分間、煮沸され、そして２Ｍの冷酢酸アンモニウムが添加される。１０００１のサンプルを、そのドツトプロット装置に適用し、そして真空下で濾過する。ウェルを２Ｍの酢酸アンモニウムにより洗浄し、そのウェルに結合している残留核酸を除去する。試験されるべきサンプルがＥＢ又は培養された細菌から成る場合、培養物を分解し、そして染色体ＤＮＡを０．５　ＮのＮａＯＨ中で１０分間、煮沸することによって変性し、ＨＣｌの添加によって０．５ＮのＨ（Ｊの最終濃度に中和し、そして６ＸＳＳＣの最終濃度にする。臨床的な気道検体に関しては、サンプルをプロテイナーゼＫにより処理し、ＳＤＳの添加によって溶解し、フェノールにより抽出し、ＲＮａｓｅ処理し、フェノールクロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱せしめる。次に、そのサンプルを上記のようにして煮沸することによって変性する。サンプル適用の後、そのフィルターを８０℃で２時間、インキュベートし、２〜４時間、プレハイブリダイズし、そして標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓすど、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８３）によってハイブリダイズせしめる。

上記に簡単に記載された方法は、サンプル調製のために適切な方法の単に代表にすぎないことは、当業者にとって明らかであろう。本質的に、サンプル調製の目的は、そのサンプルに関連するＤＮＡを生成し、そしてそのＤＮＡを基質、たとえばニトロセルロースに、生成の前、又は後のいづれかで添加することである。

これらの方法は、完全な染色体ＤＮＡプローブ又はＤＮＡフラグメントプローブの両者を調整するために使用され得る。

患者のサンプルからの相補的ＤＮＡが存在する場合、ラベルされたハイブリダイゼーションプローブが結合されるであろう。そこで相補的ＤＮＡが存在しない場合、そのハイブリダイゼーションプローブは結合されず、そして容易に洗浄し、除去され得る。非放射能プローブが使用される場合、そのハイブリダイゼーションプローブ上のラベルに対する基質が、測定されるべき反応のために必要であろう。ラベルが３２ｐである場合、その測定は、写真フィルムの現像を含む。ラベルが酵素の場合、その測定は、濃度計又は直接的な可視化のいづれかによって行なわれ得る。

選択されたＤＮＡプローブの感受性を決定するために、前もって決定された濃度のＴＷＡＲの種々の希釈溶液を前記のようにして破壊し、そして濾過によりニトロセルロースに適用することができる。ＴＷＡＲの粒子の計数は、コンゴレッドによるネガティブ染色法（Ｇｅｒｌｏｆｆなど＋ｌ　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ、１２３　：４２９〜４３２．１９７１）によって、又は電子顕微鏡（讐ａｎｇなど、。

−知工Ｊ工」ｌ１ゴー＋　１４４３〜１４５４．１９６７）によって行なわれ得る。

完全な染色体ＤＮＡプローブよりも本発明に記載されたＴＷＡＲ特異性フラグメントの１つの利点は、それらの純度である。細胞培養物のＤＮＡによるクラミジルの染色体Ｄ　Ｎ　Ａの少々の汚染は、みずから非特異性バッククラランド反応をもたらすであろう。この可能性ある問題を迂回するためには、完全な染色体ＤＮＡは、ＴＷＡＲの増殖を十分に支持するＭｃＣｏｙ細胞又は他の非ヒト細胞系において増殖されるＴＷＡＲ生物体か点は、完全な染色体ＤＮＡ０単離のために多くの量のＴＭＡＲ生物体を増殖するのと比べて、これらの特異的な配列の多くの量を単離する際、容易且つ安価であることである。ＤＮＡプローブの単離のために本発明に記載された方法の他に、ＤＮＡプローブの感受性が、種々の手段、たとえば（ａ）−末鎖のプローブの使用及び（ｂ）　リポソームｒＲＮＡ遺伝子の単離を通して改良され得る。

次の例は、例示的であって限定するものではない。

Ｔ誓へＲの　びパ− Ａ、、ｆｆｌ血捷炙勉夏垂離急性呼吸疾患を有する患者からの、トランスポート媒体（スクロース／カリウム／グルタメート；５ＰＧ）中のど（咽頭）の検体を、Ｃ，Ｃ，Ｋｕｏなど、（、ｙ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ。

１２５　：　６６５〜６６８．１９７２）からの変法に従って培養した。それぞれの検体を、接種の前、ＤＥＡＥ−デキストラン（３００ｇ／ｃｎｌ）及びシクロへキサアミド（０，５〜０．８０ｇ／ａＺ）により前処理されたＨｅＬａ　２２９細胞の単層を含む３個のバイアル上に接種した。その細胞上の接種物を、室温で６０分間、２．２００ｒｐａ＋で遠心分離した。次に、それらのバイアルを３５℃で７２時間インキュベートした（継代１）。それらのバイアルの１つからの単層をメタノールにより固定し、そして蛍光抗体により染色し、感染を示す封入体について調べた。他の２個のバイアルは、継代２のための接種物を供給するために利用され得る。

媒体中のど（咽頭）の検体を、Ｊ、　Ｔ、Ｇｒａｙｓｔｏｎなど、（Ｐｒｏｃ。

Ｓｏｃ、　Ｅｘ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、１０３　：　５９６．１９６０）の方法に従って、胎児性卵（６〜８日目）の卵黄のう中に接種した。スト、７−トマイシンを、濃度が接種に基づいて卵当り１０■に達するまで、その検体に添加した。それらの卵を、３５℃でインキュベートし、そして毎日、明りに透かして調べた。死んだ後、又は１２〜１３日間生存した後、卵黄のうを収穫し、そしてＭａｃｃｈｉａｖｅｌｌｏの染色変法によって染色し、久Ｍグヱの基本体について調べた。フルオレセインに接合されたＴＷＡＲモノクローナル抗体が感染された卵黄のうを染色するために利用可能になる場合、そのＴＷＡＲ生物体を、より一層容易に見ることができる。Ｍａｃｃｈｉａｖｅｌ　ｌｏ染色によってこれまで陰性であると思われたいくつかの継代は、ＴＷＡＲ生物体を含むことが見出された。陽性培養物は普通、続く継代に基づいて多（の数の基本体を示した。

Ｃ０戸　に　せしめるためのＴＷＡＲの人そのようにして得られた１３種の単離体うち１つを除く他のすべては、はとんどのＴＷＡＲ，ｌｔ体をＨｅＬａ　２２９細胞培養バイアルにうまく適合せしめるために、細胞培養物の接種の前、生物体（１又は２継代）の卵適合物による、胎児性卵の卵黄のうへの初めの接種を必要とした。

Ｔ−へＲ生物体の一連の紙代を、Ｋｕｏなど、　（”ＮｏｎｇｏｎｏｃｏｃｃａｌＵｒｅｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｃｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ＋ ”　３２８〜３３６ページ。

１９７７）の変法に従って、ＨｅＬａ　２２９細胞のバイアル培養中で行なった。細胞培養物の単離について記載されているようにして（例１．Ａ）、バイアル中の３種の別々のＨｅＬａ細胞単層を、それぞれの継代のために接種した。１つは固定され、そして染色され、感染の進行が決定され、そして残る２種の単層は、バイアルから削り取られ、そして第１の継代について上記に説明されたように正確に再接種された。少な（とも１０回の連続した細胞培養継代が適合せしめるためには必要とされた。

５０％以上の細胞を感染せしめるために、その感染度が高まる場合、接種されるバイアルの数を増し、大きな培養ボトル（３２オンスの処方用ボトル）中への接種のために感染された細胞の２０〜３０個のバイアルを供給した。連続した継代が、細胞の１００％が感染されるまで、ボトル培養中で続けられた。

例２側…■ ３２オンスの処方用ボトルへのＴＷＡＲ株の適合の後、その株を、ＨｅＬａ　２２９細胞の追加のボトル中で増殖せしめることによって拡張した。ハンクス液２０ｍｊ中においてガラスピーズにより細胞単層をころがすことによって、生物体を収穫した。

その細胞を音波処理により破壊し、そしてＨｅＬａ細胞残骸を低速での遠心分ＡＩ　（１、２００ｒｐＩ１１で１０分間）により除去した。

次に、その生物体を、高速での遠心分離（１６，００Ｏｒｐｍで２０分間）によりベレット化した。ＴＷＡＲ基本体を、１６．　ＯＯＯｒｐｍで４０分間、３０％Ｒｅｎｏｇｒａｆ　ｉｎ懸濁液により緩衝化しくこれは汚染物の約６０％を除去する）、そして次に２３．０Ｏｒｐｍで９０分間、３０〜６５％Ｒｅｎｏｇｒａｆ　ｉｎ直線グラジェントを通すことによって、まず精製した。Ｔ−＾Ｒ基本体の懸濁されたバンドは、９９％以上精製された。使用される方法は、Ｒ，Ｓ、　５ｔｅｐｈｅｎｓなど。

（Ｊ、　Ｔｍｍｕｎａｌ、１２８　：　１０８３．１９８２）の変法であった。

例３Ｆ　１（７）ｉ　ＴＢＡＬＢ／ｃマウスを、ホルマリンにより殺された５Ｘ１０’個のＴＷＡＲ生物体により、１日目に腹腔内投与し、そして同様の接種物により１週間隔で、それから３又は４回静脈内投与することによって免疫化した。肺臓を、最後の免疫化の後、３日月に収穫した。

例４ハイブリドーマのＮ５−０骨髄腫細胞系を、融合工程に使用するためにＭｉｌｓｔｅｉｎから得た。Ｎ５−０細胞は通常、熱不活性化された１５％ウシ胎児血清、１ｍＭのグルタミン及び１ｍＭのピルベートを含むＲＰＭＩ　１６４０（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、）　（”完全ＲＰＭＩ”　として言及される）中で増殖された。

肺臓細胞懸濁液を、紺か（切り、そして細かいナイロン製スクリーンを通してその細胞を通すことによって調製した。

白血球細胞懸濁液を、血清を含まないＲＰＭＩにより３度洗浄し；Ｎ５−０細胞を血清を含まないＲＰＭＩにより１度洗浄した。

Ｎ５−０細胞及びリンパ球を、２５０Ｘ’Ｇで１０分間、遠心分離することによって、４０％ポリエチレングリコール中で融合せしめた（１：４の割合又は１：８の割合で）。その細胞を完全ＲＭＰＩＩＯ体積により洗浄し、そして１６０ＸＧで５分間遠心分離した。その上滑液をアスピレートし、そしてその細胞を、ＨＡＴ培地により補充された完全ＲＭＰＩ　（これは１．０Ｘ１０−’Ｍのヒボキサンチン、４．０Ｘ１０−’Ｍのアミノプラリン及び１．６Ｘ１０−’Ｍのチミジンを含む）により２．５　Ｘ　１０％個の細胞／−に再懸濁した。このハイブリッド細胞懸濁液を、３〜５週才のＢＡＬＢ／ｃマウスからの胸腺リンパ球と共に混合し、２．５　ＸＩＯ’個の胸腺リンパ球／−の最終濃度にした。その最終細胞懸濁液を、９６−ウェル　マイクロテスト　プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ＋　Ｍａｓｓ）のウェル中に接種した（２００６１体積中）。ＨＡＴ培地による追加の食餌（体積で５０％の交換）を、５日及び８日目に与えた。連続した操作、食餌計画及び希釈を限定することによるクローニングを、５ｔｅｐｈｅｎｓなど、　（１Ｍ）によって記載されているようにして行なった。

■−エバイブリド−マクローンのスクリーニング培養流体中における抗−クラミシア抗体を、酵素結合された免疫吸着アッセイ　（ＥＬＩＳＡ）によって検出した。抗体アッセイに関しては、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、　ｐ）ｌ’７．６　＞　５００ｔｔにおけるｌＸｌ０’個のクラミジア生物体を、３７℃で一晩インキユベートすることによってマイクロテストプレートの個々のプレートにより吸着せしめた。対照プレートをマイクロタイタープレートのウェルに惑染されていない）ＩｅＬａ　２２９細胞（１０４個の細胞／ウェル）を接触することによって調整した。次の朝、それらのプレートのウェルを、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　７５０　ｆｆｉと共に２時間インキュベートすることによって非特異性タンパク質の吸着から阻止した。その抗体アッセイは次の３段階で行なわれた：（１）　培養流体５０１１ｔを、３７℃で６０分間、抗原吸着ウェルのそれぞれの中でインキュベートした。次に、結合さていない免疫グロブリンを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳにより３度、洗浄することによってウェルから除去した。

（２）　ペルオキシダーゼ接合の抗−マウス免疫グロブリン（５００＃）を；それぞれのウェルに添加し、そして３７℃で６０分間インキュベートした。残留する非結合性ペルオキシダーゼ接合体を、ＰＢＳにより３度、洗浄することによって除去した。

（３）　その免疫反応を、基質にＯ−フェニレンジアミン及びＨ２０□を添加することによって検出し、そして色素反応を定量化した。

ＥＬＩＳＡによって陽性であることが示された培養上滑液をマイクロ−ＩＦ技法で試験することによってさらに抗体特異性を、決定した（例６を参照のこと）。

例６モノクロ−ルー　の　−３同系ＢＡＬＢ／ｃマウス中への１〜５Ｘ１０’個のハイブリッド細胞の腹腔内接種が、２〜３週間内で触診できる腫瘍（ハイブリドーマ）を誘発した。腫瘍誘発を確かめるために、同系の宿主が、Ｐｒ１ｓｔａｎｅ　（２、６、１０、１４− テトラメチルペンタデカン、　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｉｓ、）　０．５−の腹腔内接種によって２週間前に怒作された。はとんどの場合（〉９０％）、腹腔内に移植されたハイブリドーマの前進的増殖が、腹水（１，０〜５．０＋ｎｊ／マウス）の産生によって達成された。

その腹水中に含まれるモノクローナル抗体のアイソタイプを、モノクローナル抗体−スクリーンシステム（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ＋　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃａ１ｉｆ、）を用いるＥＬＩＳＡによって決定した。使用の前、腹水を、マイクロ−ＩＦ技法によって特定の抗体活性について試験した。

マイクロ−ＩＦアフセイに関しては、培養流体又は腹水を、顕微鏡メイライド上に置かれたＬｉま２ヱ基本体抗原と湿潤室においで、３７℃で３０分間、反応せしめた。反応の後、そのスライドをＰＢＳにより５度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして湿潤室において３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベートの後、そのスライドを蒸留水により５度洗浄せしめ、そして空気乾燥せしめた。ＦＡ封入流体の一滴を添加し、そしてカバースリップをそのスライド上に置いた。その反応はＦＡ−顕微鏡下で観察された。封入体の染色に関しては、感染されたＨｅＬａ細胞を無水メタノール中において１０分間、固定し、そしてＴＷＡＲ特異性抗体活性について検定した。

腹水内に含まれるモノクローナル抗体を、プロティンＡ−セファ０−スカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｕｐｐｓａｌａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）上でアフィニティ精製した。フルオレセインイソチオシアネート −接合のモノクローナル抗体を、Ｇｏｄｉｎｇ（Ｊ。

Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１１Ｍｅｔｈ、　１３　：　２１５．１９７６）の方法によって調製し、そして直接的な免疫蛍光アッセイのための滴定により決定されるように、適切な希釈度で使用した。接合されなかったモノクローナル抗体を、間接的な免疫蛍光技法のために１：１００の希釈度で通常使用した。

Ａ、埜北技ユＣ，上ｉユヱ乏囚に対するモノクローナル抗体を、臨床的な検体からのスミア− の直接的な蛍光抗体（ＦＡ）アッセイのためにこれまで使用して来た。ふ、ブ２え之の菌株に対して特異的なフルオレセイン接合のモノクローナル抗体を、呼吸器検体の同様の直接的ＦＡアフセイに使用して来た。簡単には、咽頭スワブを、２つの前もって印を付けられた円形の部分（直径５鶴）上のガラススライド上でころがし、そして次に、そのスライドを９５％エタノール中に１０〜３０間、浸した。そのスライドを空気中で乾燥せしめた後、蛍光モノクローナル抗体接合体を、その検体部分に通用した。そのスライドを湿潤室で３７℃で３０分間インキュベートし、蒸留水を含む６個のジャーを通してすばや（浸し、そして乾燥せしめた。

Ｂａｃｔｏ蛍光抗体封入液体（Ｄｉｆｉｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ。

Ｍｉｃｈ、）の−滴及びカバースリップを、そのスライドに適用し、次にエビフルオレセンス顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ＋　０ｂｅｒｋｏｅｈｅｎ＋Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）により油含浸下で５００倍で試験した。スミア−の全部分を試験した。スライド上の調査結果は、少なくとも５個の蛍光性基本体が検体中に見出される場合、ＴＷＡＲ株に関しては陽性として考慮された。陰性の調査結果を有するスライドを、５分間読み取った。

ＴＷＡＲ単離物を有する７人の患者のうち６人からの咽のスワブスミア−を、蛍光ＴＷＡＲモノクローナル抗体により染色した。

４人の患者において、クラミジアの典型的な基本体が示された。

Ｂ０月Ｊ目剋矢フルオレセイン接合のＴＷＡＲ株−特異性モツクローナル抗体を使用して、初期ＨｅＬａ　２２９細胞培養継代におけるＴＷＡＲ単甜体単量体した。その細胞培養単離技法は、例１．Ａ、に記載されている。ＴＷＡＲ株−特異性モツクローナル抗体による直接的な蛍光抗体（ＦＡ）染色は、ＴＷＡＲ単離体の同定をひじように促進せしめ、そしてこれらの単離体の直接的な継代を可能にした。

ＴＷＡＲ単離体のそれぞれは、封入体の直接的なＦＡ染色によって一次ＨｅＬａ　２２９細胞培養継代中に同定された。

Ｃ３皿痘学朔荻法正常な３％卵黄のうホモジネートと混合された（スライド上に抗原の局在化及び付着を助けるために）　ＴＷＡＲ抗原を、顕微鏡のスライド上に点在せしめ、空気乾燥せしめ、アセトンにより１５分間、固定し、そして空気乾燥せしめた。連続した２倍希釈の血清又は体液（たとえば涙）を、抗原上に適用し、そして、３０℃で３０分間、湿潤室でインキュベートした。このアッセイ内で、その流体は、クラミジア基本体抗原と反応された。反応の後、そのスライドをＰＢＳにより５度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして３７℃で３０分間、湿潤室でインキュベートせしめた。インキュベートの後、スライドを蒸留水により５度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。

ＦＡ封入流体の一滴を添加し、そしてカバースリ、ブをそのスライド上に置いた。その反応をＦＡ−顕微鏡下で観察した。

封入体の染色のためには、感染されたＨｅＬａ細胞を無水メタノール中において１０分間固定し、そしてＴＷＡＲ−特異性抗体活性についてアッセイした。

第２表は、世界の７つの異なった領域からの成人の血清中に存在する、高い頻度のＴＷＡＲ抗体を示す。さらに、抗体は、女性よりも男性においてより頻繁に存在することが見出され′た。

第２表ヱｌヱユＬ　へルシンキ　ノバスコチア試験された数　５５５　２７１　２００％ＴＷＡＲ抗体男性　４８　４７　３５女性　４１　３６　１８試験された数　６４　１９６　９３４　１０４２％ＴＷＡＲ抗体男性　５９　４５　４５女性　５２　４０　３６例８ＴＭＡＲのＤＮＡの特徴化を通して、この例は、そのＴＷＡＲ生物体が、ｐ、− トラコニ乙±２１及び旦、−ズ」りし区と異なることを示す。

Ａ、文旦マクヱ株：研究されたクラミジア株は、（１）　ＴＷＡＲ：　ＴＷ−１８３、ＡＲ−３９、ＡＲ−２３１、ＡＲ−２７７、ＡＲ−３８８。

ＡＲ−４２７、ＡＲ−４５８及びＬＲ−６５（２、３）　；（２）　Ｃ、１之交之：　６　ＢＣ、骨髄肺炎（Ｍｎ）、ネコ肺炎（ＦＰ）　。

テンジクネズミ封入体結膜炎（ＧＰＩＣ）及び羊流産（ＯＡ）　、及び（３）旦、生立ユヱ天ス：　Ｂ／ＴＷ−５１０Ｔ　、Ｄ／ＵＷ−３／Ｃｘ及びＬ２／４３４　／ＢＬＩを含んだ。すべてのＴＷＡＲ株は、１９８５年シアトルから得られた咽頭単離体であった。但し、ＴＷ−１８３（これは、１９６５年タイワンの子供の結膜炎から単離された）を除く。すべてのＬｉま２１株は、ＨｅＬａ　２２９細胞培養物中での増殖に適合され、そしてＲｅｎｏｇｒａｆｉｎの直線グラジェントを通して精製された。

Ｂ、クーミジアＤＮＡの゛−二又立ま乏ヱのＤＮＡを、旦、トラコマチスのために前に記載したようにして単離した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓなど、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４７　：　７１３〜７１８．１９８５）。

基本的には、精製された基本体を、３７℃で１時間、プロテイナーゼＫ　（６４＜３ｇ／ｄ）により処理し、そして１％ＳＤＳ中に溶解した。フェノールによる抽出の後、水性層を３７℃で３０分間、ＲＮａｓｅ（５０＜１５　ｇ　／　ｒｒ！　）により処理し、フェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより沈澱せしめた。

０．１立スま土（７）ＩＩＪ−＝７’ｌ”：試験サレ８　種ノＴＷＡＲｊｌ離体は、アガロースゲル電気泳動によって決定される場合、それぞれ７．３及び６．２　Ｋｂｐのプラスミドを含む、旦、上土且マチス及び旦−工之又之対照と比べて、明確なプラスミドＤＮＡを含まなかった（Ｗｅｉｓｓなど＋ｌ　Ｉｎｆｅｃｔ、　ＩＩＩＩＩＩＩＬＩＩｌｌ、２　：２４４〜２４８．１９７０）。

使用される制限酵素は、ＢａｍＨＩ　、　ＢｓｔＥＩＩ　、　Ｄｐｎ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ　＋ＨｉｎｄＩ［［、Ｍｂｏｌ　、　Ｍｓｐｌ　、　Ｐｓｔｌ、　５ａｎ３Ａ、及び５ｓｔｌでありグイゼーションによる標準法によって行なわれた（影ユ■畑扛Ｌエム」壇倶μｍ鄭ユ怒：　１４００〜１４０１．１９６９）。制限エンドヌクレアーゼ分析は、お互い及び２種のＬｉまグヱの株とＴＷＡＲ単離体との比較のために使用された。使用されるそれぞれの制限酵素により、ＴＷＡＲ＄離体は、トラホーム及び旦、上皇ユヱ±久のＬＧＶバイオバーから容易に識別され、そして５種の異なる旦、ブシタシの株が試験された。この方法の分析の範囲によれば、ＴＷＡＲ単離体の結合パターンが、使用される酵素のうち８種と同一であった。

Ｅ、サザン　ハイブリダイゼーションＳ　ＴＷＡＲ単離体の間の関係及び他のクラミジアとの関係をさらに調査するために、約５００ｂｐ　、９００ｂｐ　、　１２００ｂｐ　、　３２００ｂｐ及び３８００ｂ、のサイズの５種のランダムなＴＷＡＲのＤＮＡフラグメントを、ＡＲ−３９のＤＮＡの遺伝子バンクから精製し、そして染色体消化物をプローブするために使用した。第３図に示されるように、３．８　ｋｂｐ（第３Ａ図）のＴＷＡＲフラグメント又は３．２ｋｂＰ（第３Ｂ図）のフラグメントが、それぞれＭｓｐｌ又は旧ｎｄＩ［Ｉにより消化された工旦亙工１Ｄ　Ｎ　Ａのプローブとして使用される場合、それぞれの場合においてハイブリダイズするフラグメントは、すべてのＴＷＡＲ単離体のために同じであった。さらに、反応性は試験されたーＣ−、トラコマチス又は−ｑ−、プ之り之に関して観察されなかったが、両プローブはＴＷＡＲ特異性であった。同じ結果が他の３種のプローブに関して得られた。

Ｆ、プローブとして６　な”　ＤＮＡＧ　いるド・　トブロ・　トハイブ１　゛イゼーションオ　いてのｎ３１１ｚ：　（、トラコマチス及び−Ｃ−１之り之に対するＴＷＡＲの関係を決定するために、ドツトプロット分析が、プローブとして完全な染色体ＤＮＡを用いて行なわれた。簡単に言えば、精製されたＥＢのＤＮＡ０．２〜５０ｇを、０．３ＭのＮａＣ１中で１０分間煮沸した。続いて、２．０Ｍの酢酸アンモニウムを添加し、１０００１の最終体積にした。サンプルを、Ｂｉｏ−ＤｏｔＭｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ装置（Ｂｉｏ−Ｋａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆ、）の使用によってニトロセルロース（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ、　Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。

Ｃａ１ｉｆ、）に適用した。濾過の前、そのニトロセルロースを、ＩＭの酢酸アンモニづム中で洗浄し、ＤＮＡ付着を高めた。

そのニトロセルロースを、前に記載したようにプレハイブリダイズする前及び後で、８０℃で２時間、焼いた。ニック−トランスレートされた完全な染色体クラミジアＤＮＡを、煮沸し、そして続いて急速な冷却によって変性し、そしてこれらのハイブリダイゼーション実験においてプローブとして使用した。　％相同体を大まかに定量化するために、前記ニトロセルロースを、シンチレーション計数のために、０ｍｎ１−ｆｌｕｏｒ（Ｄｎｐｏｎｔ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓ、）中に懸濁された個々のドツトに切断した。

すべての実験において、はとんどの文旦マ乏ヱＤＮＡ調整物は少量のＨｅＬａのＤＮＡ汚染物を含むけれどもＨｅＬａのＤＮＡを対照としてスポット化した。ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９，Ｃ，上立ユヱ±スセロバーＤ及び旦、プ之又之株６　ＢＣ、ＦＰ　、　ＯＡ及びＭｎの完全な染色体ＤＮＡをニック−トランスレートし、そして種々の単離物の変性された染色体ＤＮＡを含むドツトプロットのプローブとして使用した。第２図に示されるように、２種の旦、トラコマチスバイオバーも５種の−ｇ−、プシタシ株のいづれも、ＡＲ−３９プローブに対して有意な相同性を示さなかった。他方、すべてのＴＷＡＲ単離体は、強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。ＴＷ４８３がプローブとして使用される場合、類似する結果が得られた。相反する実験が旦、トラコマチス又は−ｇ−、プシタシのＤＮＡをプローブとして使用して行なわれる場合、バンクグラウンド上の反応性が、いづれかのＴＷＡＲ単離体により示された（データは示されていない）。

図及び第４図に示されるように、クローンされ、精製されたＴＷＡＲフラグメントが、ＴＷＡＲ，Ｃ，７’之又之及びＣ，）ラコマ±困の分解された基本体のドツトプロットにおいてプローブとして使用される場合、試験された３種のフラグメント（９００ｂｐ　、　１２００ｂｐ及び３２００ｂｐ）は、ＴＷＡＲとのみ反応した。

上記に示されるように、ＤＮＡプローブの感受性は、（ａ）−末鎖のプローブの使用；及び（ｂ）　リポソームｒＲＮＡ遺伝子の単離を通して改良され得る。

ニオ言゛″のプローブの二本鎖ＤＮＡプローブは、プローブの再アニーリングにより効率的にハイブリダイズしないので、ハイブリダイゼーションのために利用できるプローブの濃度は低められる。従って、ハイブリダイゼーションにおいて一本鎖のプローブを用いることによってプローブの感受性を高めることができる。

この方法の主な制限は、十分に高い比活性へのその一本鎖のラベリングである。

この問題は、Ｄ　Ｎ　Ａプローブの一本鎖挿入体を含む二本鎖ベクターをもたらす条件を用いることによって避けられ得る（Ａｒｒａｎｄ、　Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａ上ｍ−中の”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＰｒｏｂｅｓ＋　”１７〜４５ページ＋　０ｘｆｏｒｄ　Ｐｒｅｓｓ＋　０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ＋１９８５）。ｐＵＣベクターにおけるＴＷＡＲ遺伝子バンクの初期構造は、−末鎖のバタテリオファージＭ１３ｍｐ１８の複製型（ＲＦ）へのサブクローニングを促進する。なぜならば、これらのベクターは、同じ１ａｃＺ’／複数クロ一ニング部位を共有するからである。Ｍ１３“偶数の”ファージベクター（たとえば、Ｍ１３ｍｐ１８）が、ｐＢ８３２２由来の配列（前記）にハイブリダイズするであろうラベルされたプローブの産生を妨げるために、寄数シリーズ（たとえば、Ｍ１３ｍｐ１８）の代わりに使用するために推薦される。この一本ｉＪｔ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブは、Ｈｕ及びＭｅｓｓ　ｉｎｇ（Ｇｅｎｅ　１７　：　２７１〜２７７、１９８３）の方法によって調製され得る。

このプローブを放射性ラベルするために、市販されている一般のプローブプライマーを使用することができる。このプライマーは、ベクターＤＮＡの合成を指図し、そして制限された濃度の放射性前駆体の存在下において、そのプライマー付加部分は、−零値ＤＮＡプローブ挿入体を含む二本鎖ベクター（Ｍ１３）をもたらす。Ｍ１３ｍｐバクテリオファージのＲＦ型の単離、Ｍ１３中へのｐｔｌｃのサブクローニングのための組換え体のサブクローニング及びＭ１３１００選択的合成（及びラベリング）のためのすべての方法は、Ｍｅｓｓｉｎｇ（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ。

１０１　：２０〜７９．１９８３）によって記載されているようにして、標準方法によって行なわれ得る。このプローブがサザンハイプリダイゼーションに使用される場合、それはハイブリダイゼーションの前、変性されない。

リポソームＲＮＡ’　云　の“。

ＤＮＡプローブの感受性を高めるためのもう１つの方法は、複数コピー配列を認識するＤＮＡプローブを使用することである。リポソームＲＮＡに対して特異的なりローン化されたＤＮＡの使用は、細胞当りの目標分子（リポソーム）の多くの数によって、１０００倍まで検出を高めるための手段として記録されている（Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２２　：　４２５〜４２７＋　１９８６；　Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ、　Ｒａ　ｉｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　Ａ　ｅｎｊｓ＋　９１〜９５ページ、　Ａｃａｄｅｍｔｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、。

１９８５；　Ｐａｌｍｅｒ及びＦａｌｋｏｉｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏハ■１９８６＋　９１〜９５ページ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，。

１９８６）。１つのそのような方法が下記に説明される。

合計のＲＡＮが、１６ｓのｒＲＮＡの単離のために、最適な時間での後接種の決定のために怒染せしめた後、種々の時間でＴＷＡＲ培養物から単離される。ｒＲＮＡは、Ｋｉｒｂｙ（Ｋｉｒｋなど、。

Ｂｉｏｃｈ、　Ｊ、１０４：　２５８〜２６２．１９６７：　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ肛江吐棧包■　月１３３〜７１．１９８６）の変法によって単離され得る。この方法は、ＤＮＡ　、ｍＲＮＡを実質的に含まないが、しかしひじょうに少量のｔＲＮＡを含む細菌性ｒＲＮＡＯ単離をもたらす（Ｊｏｈｎｓｏｎ、前記）。ＲＮａｓｅを含まない緩衝液を得るために、ジエチルピロカーボネー）（０，２％）を、１時間水溶液に添加し、そして続いてオートクレーブ処理する。

ガラス器具は、乾燥加熱オーブン中で焼くことよって、ＲＮａｓｅを含まないようにされ得る。精製された粒子を、遠心分離により収程し、ｄＨ２０中に懸濁し、そして１０％ナフタレンジスルホネート及び７５Ｃ＋ｆのジエチルピロカーボネートを添加する。フレンチプレスによって細胞をフェノール−クレゾール及び０．５％ナフタレンジスルホネートの混合物中に通すことによって、細胞を分解する。振った後、その混合物を、１７．０００ｘＧで１０分間、遠心分離し、そして水性層を取り出す。２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃｌ０ｍ／を添加し、そしてＳＤＳを添加し、０．１％の最終濃度にし、続いてもう１つのフェノール−クレゾール抽出を行なう。ＲＮＡを、２体積のエタノールの添加により沈澱せしめ、そして遠心分離によりペレット化する。残留Ｄ　Ｎ　Ａ　、　ｍ　ＲＮ　Ａ及びｔＲＮＡをさらに抽出するために、３Ｍの冷酢酸ナトリウムを添加し、その混合物を均質化し、遠心分離にかけ、そして再沈澱せしめる。５ｓ、１６ｓ及び２３ｓのリポソームＫＮＡが、Ｇｒｉｅｒｓｏｎ（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏ　ｈｏｒｅｓｉｓｏｆ　Ｎ１ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ＋　１〜１３９ページ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ＋　０ｘｆｏｒｄ。

１９８２）によって記載されているように、１．５％アガロースゲルから電気溶離により精製される。５０ｍＭのＴｒｉｓ　−Ｈ（Ｊ中で加熱することによって、ＲＮＡを軽いアルカリ加水分解にゆだね、そしてインキュベートの時間及び温度はＲＮＡ種に依存して異なる（Ｍａｉｚｅｌｓ、皿　９　：　４３１〜４３８．１９７６）。この加水分解段階は、ポリヌクレオチドキナーゼのための基質として５′ヒドロキシル基を利用するためにそれらの基を開放する。ｒＲＮＡは、標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｇ）によって、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる”ＰＡＴＰにより末端をラベル化される。おのおのの種は、種々の制限ｒＲＮＡ遺伝子により調整されたＴＷＡＲのサザンハイプリダイゼーションのプローブとして使用され得る。なぜならばほとんどの細菌種は、ｒＲＮＡ配列の複数の遺伝子コピーを含むからである。

クローン化されたＴＷＡＲのｒＲＮＡ遺伝子を、ＴＷＡＲ検出におけるそれらの感受性及び旦、トラコマチス及び旦、プ之り之とのそれらの反応性のために試験する。サザンハイブリダイゼーションデーターに依存して、完全な遺伝子を含むと思われるいづれかの制限フラグメントがアガロースゲルから電気溶離され、そして同様にして消化されたｐｔｌｃＩ８中にクローン化され、又は前に構成された遺伝子バンクがプローブとして異なったｒＲＮＡ種を用いてスクリーンされる。ＴＷＡＲの１６ｓｒ　ＲＮ　Ａ遺伝子を含むフラグメントサイズに依存して、その遺伝子は、両方向におけるＤＮＡ配列決定のために、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ　１３ｍｐ１９中に直接的にサブクローンされるか、又は小さなフラグメントに消化、され、そしてそれらにサブクローンされる。すべてのＤＮＡ配列決定は、ＢＲＬからの市販されているキットを用いて、標準方法によるジデオキシヌクレオチド鎖ターミネータ−法（Ｓａｎｇｅｒなど＋ｌ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｃｌ　、　Ａｃａｄ。

拡　７４　：　５４６３〜５４６７、１９７７）によって行なわれ得る。クローン化されたＴＷＡＲのｒＲＮＡ遺伝子は、ＴＷＡＲ検出におけるそれらの感受性及び旦、王立ユヱ±ス及び旦、１ノ久之とのそれらの反応性について試験され得る。

本発明の特定の態様が例示する目的のためにここで記載されたけれども、種々の修飾が本発明の範囲内で行なわれ得る。

０＾ＦＩＧ。２Ａ　・　・Ｂ・　・Ｇ　・ＦＩＧ、４手続補正書（方式）％式％１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１０１１、発明の名称急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　ワシントンリサーチファウンデイション４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付６、補正の対象（１）　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」の欄（２）委任状（３）明細書及び請求の範囲の翻訳文７、補正の内容＋１３　＋２１　別紙の通り（３）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録（１）　訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１通（２）委任状及びその翻訳文　各１通（３）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通国際調査報告国際調査報告ｎ＝Ｍｔｂｔｕｕｉｅｐ−ＩＣ欝噸ｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｘｒｅ＋−＋ｉ＋＋（＋ａ＋ｂｅｐ−＋ｃｖ＋＋ａ昏Ｃｕｎｗｍｓｃｎｅｍ＝１高唐■≠窒■|ｍｅｎむ−ｗ４自ｎｆｅｒロー＋ｉｓａｍｗｓｔｔｈｎｐ憂ｎ。

１１１１ｆｉｍ　ｙｅ　ａｔ　ｅａｍ３ｉ＃４　ｉｓ　＋ｂｅ　Ｅｕｒ＠％２ａ　ｌ’ＪＩＭＩ　０ｒｋｅ　ｌ’ｎｌ’　ｌｉｋ　中６１　I１ｌｌＩＩ＋ｕｔｌｈｅ１ｗｅＰＣ−一１’ａ＋ｃ＋＋＋Ｏｆｆ＋ｅｃＭｍａｍ＋５ｌｌｉ＋＋ｈｌｅＩｙ＋ｈぜ）Ｃｐ−ｒｌ＋ｅｕｌｘｓｈ＜ｈｓｅｅ＋ｎ■窒モP４＋＋ｉｃ＊１６１ｔｈｅｐｕｒｐ・拳Ｃｅｌｉｎｌａｒｗ＋ｎｎａ。

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向けられたモノクローナル抗体。
２．急性呼吸疾患を引き起こすクラミジア株の抗原に結合するモノクローナル抗体。
３．前記モノクローナル抗体が、前記抗原又は抗原決定基への、細胞系ＲＲ４０２によって産生された抗体の結合を阻止する請求の範囲第１又は第２項記載のモノクローナル抗体。
４．ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向けられたモノクローナル抗体を産生する連続したハイブリット細胞系。
５．前記ハイブリッド細胞系がＲＲ４０２として同定されるハイブリドーマクローンを含んで成る請求の範囲第４項記載の細胞系。
６．前記細胞系が、ＴＷＡＲ生物体に対する抗体を産生することができる免疫脾臓細胞と骨髄腫細胞とのハイブリットである請求の範囲第４項記載の細胞系。
７．細胞系ＲＲ４０２。
８．請求の範囲第７項記載の細胞系によって産生されるモノクローナル抗体。
９．生物学的サンプル中においてＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための方法であって：請求の範囲第１〜３項のいづれかのラベルされたモノクローナル抗体に、ＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを暴露し；そして前記モノクローナル抗体とＴＷＡＲ生物体との間に形成される免疫複合体の存在を検出することを含んで成る方法。
１０．前記ラベルを、酵素，蛍光団，放射性同位体及び発光体から成る群から選択する請求の範囲第９項記載の方法。
１１．前記検出の段階が酵素反応、蛍光、発光放射及び放射能によってである請求の範囲第９項記載の方法。
１２．前記生物学的サンプルを、体分泌物，体液及び組織検体から成る群から選択する特許請求の範囲第９項記載の方法。
１３．生物学的サンプル中においてＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するための方法であって：反応混合物を形成するために、ＴＷＡＲ生物体の基本体と共に生物学的サンプルをインキュベートし；そしてＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するために前記反応混合物を分析することを含んで成る方法。
１４．前記分析段階が、抗体のためのラベルされた特異的結合パートナーと反応混合物とを接触し、そしてそのラベルを検出することを含んで成る請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．生物学的サンプルにおいてＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための方法であって：ＴＷＡＲ生物体が細胞内に取り込まれるように、ＨｅＬａ細胞と共にＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを混合し；ＴＷＡＲ生物体を含むＨｅＬａ細胞をインキュベートし；ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向けられた、ラベルされたモノクローナル抗体にＨｅＬａ細胞／ＴＷＡＲ株を暴露し；そしてＴＷＡＲ生物体とラベルされたモノクローナル抗体との間に形成される免疫複合体の存在を検出することを含んで成る方法。
１６．前記混合段階が、サンプルによりＨｅＬａ細胞を接種し、そして続いてＨｅＬａ細胞上でその接種されたサンプルを遠心分離することを含んで成る請求の範囲第１５項記載の方法。
１７．前記暴露段階がメタノールにより単層を固定することを含む請求の範囲第１５項記載の方法。
１８．ＴＷＡＲを特異的に認識するＤＮＡプローブ。
１９．活性治療物質として使用する請求の範囲第１８項記載のＤＮＡプローブ。
２０．前記ＤＮＡプローブが、ＴＷＡＲ生物体に由来する完全な染色体ＤＮＡプロブ又はＤＮＡフラグメントプローブである請求の範囲第１８項記載のＤＮＡプローブ。
２１．生物学的サンプルにおいてＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための方法であって：サンプルに関連するＤＮＡを単離するために、ＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを処理し；その単離されたＤＮＡを基質に添加し；ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なくとも一部に特異的にハイプリダイズすることができるラベルされたＤＮＡプローブと共にそのＤＮＡ担持基質をインキュベートし；その基質からハイブリダイズされなかったプローブを分離し；そして前記基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからＴＷＡＲ生物体の存在又は不在かを決定することを含んで成る方法。
２２．生物学的サンプルにおいてＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための方法であって：ＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを基質に添加し；サンプルに関連するＤＮＡを暴露するために、前記付着されたサンプルを担持する基質を処理し；ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラベルされたＤＮＡプローブと共に前記ＤＮＡ担持基質をインキュベートし；前記基質からハイブリダイズされなかったプローブを分離し；そしてその基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからＴＷＡＲ生物体の存在又は不在かを決定することを含んで成る方法。