JPH09285288A - 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 - Google Patents
急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出Info
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- JPH09285288A JPH09285288A JP8294439A JP29443996A JPH09285288A JP H09285288 A JPH09285288 A JP H09285288A JP 8294439 A JP8294439 A JP 8294439A JP 29443996 A JP29443996 A JP 29443996A JP H09285288 A JPH09285288 A JP H09285288A
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- C07K14/295—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Chlamydiales (O)
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 クラミジア・ニューモニアを特異的に検出す
るためのプローブの提供。 【解決手段】 クラミジア・トラコマチスのＤＮＡ及び
クラミジア・プシタシのＤＮＡとはハイブリダイズせ
ず、クラミジア・ニューモニアのＤＮＡと特異的にハイ
ブリダイズするプローブ。 【効果】 クラミジアの内クラミジア・ニューモニアを
特異的に検出することができる。
るためのプローブの提供。 【解決手段】 クラミジア・トラコマチスのＤＮＡ及び
クラミジア・プシタシのＤＮＡとはハイブリダイズせ
ず、クラミジア・ニューモニアのＤＮＡと特異的にハイ
ブリダイズするプローブ。 【効果】 クラミジアの内クラミジア・ニューモニアを
特異的に検出することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的にクラミジ
ア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）株の検出及びより詳しくは、
呼吸感染に関連する独特のクラミジア株の検出における
モノクローナル抗体及びＤＮＡプローブの使用に関す
る。
ア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）株の検出及びより詳しくは、
呼吸感染に関連する独特のクラミジア株の検出における
モノクローナル抗体及びＤＮＡプローブの使用に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】クラミジアは、動物界を通して遍在し、
そして種々の疾病を引き起こすことが知られている偏性
細胞内寄生体である。クラミジア属は、２種の認識され
る種、すなわちＣ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍ
ａｔｉｓ）及びＣ．プシタシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）
並びに３種のバイオバーへのＣ．トラコマチスの派生を
有する。Ｃ．トラコマチス、すなわち一次性ヒト病原体
であるこの種は、目、呼吸及び尿生殖器感染を引き起こ
す。Ｃ．トラコマチスは初めに、粘膜、たとえば結膜、
鼻咽頭、直腸、尿道及び頸管上にコロニー形成すること
ができ、この後、その感染は分散し、より深い器官系に
影響を及ぼす。
そして種々の疾病を引き起こすことが知られている偏性
細胞内寄生体である。クラミジア属は、２種の認識され
る種、すなわちＣ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍ
ａｔｉｓ）及びＣ．プシタシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）
並びに３種のバイオバーへのＣ．トラコマチスの派生を
有する。Ｃ．トラコマチス、すなわち一次性ヒト病原体
であるこの種は、目、呼吸及び尿生殖器感染を引き起こ
す。Ｃ．トラコマチスは初めに、粘膜、たとえば結膜、
鼻咽頭、直腸、尿道及び頸管上にコロニー形成すること
ができ、この後、その感染は分散し、より深い器官系に
影響を及ぼす。
【０００３】クラミジアの他の種、すなわちＣ．プシタ
シは、ヒト呼吸疾患、すなわちオウム病の原因である。
オウム病は、通常、感染された鳥類への接触によって感
染し、オウム病の発生は、シチメンチョウ及びカモに関
連して、及びペットショップの客の間で起こる。その疾
患はしばしば異型肺炎に類似し、そして軽いものから致
命的なものまでの範囲を有する。そのような肺炎の流行
病は通常、感染された鳥類に由来したが、鳥類のベクタ
ーは必ずしも見出されない。たとえば、１９８７年北フ
ィンランドにおける放射線撮影法による調査の間、軽い
肺炎の流行病が２つの集落に見出された。しかしなが
ら、鳥類による伝染は見出されなかった。
シは、ヒト呼吸疾患、すなわちオウム病の原因である。
オウム病は、通常、感染された鳥類への接触によって感
染し、オウム病の発生は、シチメンチョウ及びカモに関
連して、及びペットショップの客の間で起こる。その疾
患はしばしば異型肺炎に類似し、そして軽いものから致
命的なものまでの範囲を有する。そのような肺炎の流行
病は通常、感染された鳥類に由来したが、鳥類のベクタ
ーは必ずしも見出されない。たとえば、１９８７年北フ
ィンランドにおける放射線撮影法による調査の間、軽い
肺炎の流行病が２つの集落に見出された。しかしなが
ら、鳥類による伝染は見出されなかった。
【０００４】血清疫学研究は、北ヨーロッパにおいてこ
の及びいくつかの他の肺炎流行病におけるクラミジアの
通常の菌株を抱合した。このクラミジアの新規菌株は、
つい最近、重要な呼吸病原菌として確立され、そしてそ
れは研究された成人集団におけるたぶん１２％までの異
型肺炎患者を引き起こした。しかしながらほとんどの感
染は、原因物質がマイコプラスマ・ニューモニア（Ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）又はインフ
ルエンザＡ型又はＢ型ウィルスであるまちがった確信の
ために、抗生物質により不適切に治療された。Ｍ．ニュ
ーモニアのために使用される少量でのエリスロマイシン
による抗生物質治療は、マイコプラスマ感染に対して効
果的であるが、この投与量でのエリスロマイシンはクラ
ミジア感染に対して効果的でない。さらに、これらの感
染は、病状が明確に緩和した後、再発する疾病によって
しばしば特徴づけられる。
の及びいくつかの他の肺炎流行病におけるクラミジアの
通常の菌株を抱合した。このクラミジアの新規菌株は、
つい最近、重要な呼吸病原菌として確立され、そしてそ
れは研究された成人集団におけるたぶん１２％までの異
型肺炎患者を引き起こした。しかしながらほとんどの感
染は、原因物質がマイコプラスマ・ニューモニア（Ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）又はインフ
ルエンザＡ型又はＢ型ウィルスであるまちがった確信の
ために、抗生物質により不適切に治療された。Ｍ．ニュ
ーモニアのために使用される少量でのエリスロマイシン
による抗生物質治療は、マイコプラスマ感染に対して効
果的であるが、この投与量でのエリスロマイシンはクラ
ミジア感染に対して効果的でない。さらに、これらの感
染は、病状が明確に緩和した後、再発する疾病によって
しばしば特徴づけられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】新菌株のクラミジアと
急性呼吸疾患とのこの関連の観点から、この新菌株の存
在を診断するための正確且つ費用的に有効な方法を提供
することがひじょうに所望され、それによって一次感染
の有効な抗生物質治療を可能にするであろう。本発明
は、そのような方法を提供し、そしてさらに他の関連す
る利点によって特徴づけられる。
急性呼吸疾患とのこの関連の観点から、この新菌株の存
在を診断するための正確且つ費用的に有効な方法を提供
することがひじょうに所望され、それによって一次感染
の有効な抗生物質治療を可能にするであろう。本発明
は、そのような方法を提供し、そしてさらに他の関連す
る利点によって特徴づけられる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】簡単に言えば、本発明
は、生物学的サンプル中におけるクラミジア・ニューモ
ニア（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（以
下ＴＷＡＲ生物体と称する）の存在を検出するための方
法を提供する。これらの方法は、ＴＷＡＲ生物体の抗原
決定基に対して向けられたモノクローナル抗体又はＴＷ
ＡＲ生物体に対して特異的なＤＮＡプローブのいづれか
を使用する。
は、生物学的サンプル中におけるクラミジア・ニューモ
ニア（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（以
下ＴＷＡＲ生物体と称する）の存在を検出するための方
法を提供する。これらの方法は、ＴＷＡＲ生物体の抗原
決定基に対して向けられたモノクローナル抗体又はＴＷ
ＡＲ生物体に対して特異的なＤＮＡプローブのいづれか
を使用する。
【０００７】本発明の１つの観点において、その方法
は、（ａ）ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向けら
れた、ラベルされたモノクローナル抗体に、そのＴＷＡ
Ｒ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを暴露する
段階；及び（ｂ）前記モノクローナル抗体と前記ＴＷＡ
Ｒ生物体との間に形成される免疫複合体の存在を検出す
る段階を含んで成る。
は、（ａ）ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向けら
れた、ラベルされたモノクローナル抗体に、そのＴＷＡ
Ｒ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを暴露する
段階；及び（ｂ）前記モノクローナル抗体と前記ＴＷＡ
Ｒ生物体との間に形成される免疫複合体の存在を検出す
る段階を含んで成る。
【０００８】ＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための関
連方法は、（ａ）ＴＷＡＲ生物体が細胞内に含まれるよ
うにＨｅＬａ細胞とＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生
物学的サンプルとを混合し；（ｂ）前記ＴＷＡＲ生物体
を含むＨｅＬａ細胞をインキュベートし；（ｃ）ＴＷＡ
Ｒ生物体の抗原決定基に対して向けられた、ラベルされ
たモノクローナル抗体に前記ＨｅＬａ細胞／ＴＷＡＲ生
物体を暴露し；そして（ｄ）前記ＴＷＡＲ生物体と前記
ラベルされたモノクローナル抗体との間に形成される免
疫複合体の存在を検出することを含んで成る。本発明の
特に好ましい態様においては；前記混合段階は、サンプ
ルよりＨｅＬａ細胞を接種し、そして続いてそのＨｅＬ
ａ細胞上での接種されたサンプルを遠心分離にかけるこ
とを含んで成る。ＤＥＡＥ−デキストラン及びシクロヘ
キサアミドにより前処理することがまた好ましい。
連方法は、（ａ）ＴＷＡＲ生物体が細胞内に含まれるよ
うにＨｅＬａ細胞とＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生
物学的サンプルとを混合し；（ｂ）前記ＴＷＡＲ生物体
を含むＨｅＬａ細胞をインキュベートし；（ｃ）ＴＷＡ
Ｒ生物体の抗原決定基に対して向けられた、ラベルされ
たモノクローナル抗体に前記ＨｅＬａ細胞／ＴＷＡＲ生
物体を暴露し；そして（ｄ）前記ＴＷＡＲ生物体と前記
ラベルされたモノクローナル抗体との間に形成される免
疫複合体の存在を検出することを含んで成る。本発明の
特に好ましい態様においては；前記混合段階は、サンプ
ルよりＨｅＬａ細胞を接種し、そして続いてそのＨｅＬ
ａ細胞上での接種されたサンプルを遠心分離にかけるこ
とを含んで成る。ＤＥＡＥ−デキストラン及びシクロヘ
キサアミドにより前処理することがまた好ましい。
【０００９】本発明の３番目の観点は、生物学的サンプ
ル中においてクラミジアのＴＷＡＲ生物体に対する抗体
の存在を決定するための方法を開示する。その方法は、
一般的に、（ａ）反応混合物を形成するためにＴＷＡＲ
生物体の基本体と共に生物学的サンプルをインキュベー
トし；そして（ｂ）そのＴＷＡＲ生物体に対する抗体の
存在を決定するために前記反応混合物を分析することを
含んで成る。好ましい態様においては、前記分析段階
は、抗体に対するラベルされた特異的な結合パートナー
と前記反応混合物を接触せしめ、そしてそのラベルを検
出することを含んで成る。これに関しては、その特異的
な結合パートナーは、ヤギ抗−ヒトＩｇＭ又はヤギ抗−
ヒトＩｇＧである。
ル中においてクラミジアのＴＷＡＲ生物体に対する抗体
の存在を決定するための方法を開示する。その方法は、
一般的に、（ａ）反応混合物を形成するためにＴＷＡＲ
生物体の基本体と共に生物学的サンプルをインキュベー
トし；そして（ｂ）そのＴＷＡＲ生物体に対する抗体の
存在を決定するために前記反応混合物を分析することを
含んで成る。好ましい態様においては、前記分析段階
は、抗体に対するラベルされた特異的な結合パートナー
と前記反応混合物を接触せしめ、そしてそのラベルを検
出することを含んで成る。これに関しては、その特異的
な結合パートナーは、ヤギ抗−ヒトＩｇＭ又はヤギ抗−
ヒトＩｇＧである。
【００１０】上記に簡単に記載された方法のすべてにお
いて、モノクローナル抗体は、酵素、蛍光体、放射性同
位体又は発光体によりラベルされ得る。これに関して、
検出の段階は、通常、それぞれ酵素反応、蛍光、放射能
又は発光によって存在するのであろう。上記に説明され
た方法は、ＴＷＡＲ生物体又はそのＴＷＡＲ生物体に対
する抗体の存在を検出するために種々の生物学的サンプ
ルに適用され得る。体分泌液、体液及び組織検体は適切
なサンプルである。体分泌液の例は、頸管分泌液、気管
−気管支分泌液、及び咽頭分泌液を含む。適切な体液
は、血液、涙及び中枢神経系液を含む。組織検体の例
は、種々のバイオプシー、たとえば肺組織又はらっぱ管
組織のバイオプシーを含む。さらに実質的にすべての部
分からの組織（心臓組織及び肺組織）が、検死実験内で
試験され得る。
いて、モノクローナル抗体は、酵素、蛍光体、放射性同
位体又は発光体によりラベルされ得る。これに関して、
検出の段階は、通常、それぞれ酵素反応、蛍光、放射能
又は発光によって存在するのであろう。上記に説明され
た方法は、ＴＷＡＲ生物体又はそのＴＷＡＲ生物体に対
する抗体の存在を検出するために種々の生物学的サンプ
ルに適用され得る。体分泌液、体液及び組織検体は適切
なサンプルである。体分泌液の例は、頸管分泌液、気管
−気管支分泌液、及び咽頭分泌液を含む。適切な体液
は、血液、涙及び中枢神経系液を含む。組織検体の例
は、種々のバイオプシー、たとえば肺組織又はらっぱ管
組織のバイオプシーを含む。さらに実質的にすべての部
分からの組織（心臓組織及び肺組織）が、検死実験内で
試験され得る。
【００１１】本発明によれば、上記に記載された方法に
使用するためにＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向
けられたモノクローナル抗体を産生する連続したハイブ
リッド細胞系が確立される。特に好ましい態様において
は、その細胞系は、ハイブリドーマクローンＲＲ ４０
２又はＴＴ ２０５を含んで成る。そのような細胞系に
より産出されるモノクローナル抗体もまた開示されてい
る。上記に示されるように、本発明はまた、ＴＷＡＲ生
物体に対して特異的なＤＮＡプローブも開示する。ＴＷ
ＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なくとも一部を含むそのプ
ローブが、生物学的サンプル中におけるＴＷＡＲ生物体
の存在を検出するための方法に使用され得る。
使用するためにＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対して向
けられたモノクローナル抗体を産生する連続したハイブ
リッド細胞系が確立される。特に好ましい態様において
は、その細胞系は、ハイブリドーマクローンＲＲ ４０
２又はＴＴ ２０５を含んで成る。そのような細胞系に
より産出されるモノクローナル抗体もまた開示されてい
る。上記に示されるように、本発明はまた、ＴＷＡＲ生
物体に対して特異的なＤＮＡプローブも開示する。ＴＷ
ＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なくとも一部を含むそのプ
ローブが、生物学的サンプル中におけるＴＷＡＲ生物体
の存在を検出するための方法に使用され得る。
【００１２】本発明の１つの観点において、その方法
は、（ａ）サンプルに関連するＤＮＡを単離するために
ＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを処
理する段階；（ｂ）基質にその単離されたＤＮＡを添加
する段階；（ｃ）ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラ
ベルされたＤＮＡプローブと共にＤＮＡ担持基質をイン
キュベートする段階；（ｄ）前記基質からハイブリダイ
ズしなかったプローブを分離する段階；及び（ｅ）前記
基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからＴ
ＷＡＲ生物体の存在又は不在を決定する段階を含んで成
る。本発明のもう１つの観点の範囲内の方法は、（ａ）
基質にＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプ
ルを添加し；（ｂ）該サンプルに関連するＤＮＡを暴露
するために前記添加されたサンプルを担持する基質を処
理し；（ｃ）前記ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラ
ベルされたＤＮＡプローブと共に前記ＤＮＡ担持基質を
インキュベートし；（ｄ）前記基質からハイブリダイズ
されなかったプローブを分離し、そして（ｅ）前記基質
に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからＴＷＡ
Ｒ生物体の存在又は不在を決定することを含んで成る。
前記方法内のプローブは、完全な染色体ＤＮＡプローブ
又はＴＷＡＲ生物体に由来したＤＮＡフラグメントプロ
ーブである。本発明のこれらの及び他の観点は、次の詳
細な説明及び添付図面によって明確になるであろう。
は、（ａ）サンプルに関連するＤＮＡを単離するために
ＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプルを処
理する段階；（ｂ）基質にその単離されたＤＮＡを添加
する段階；（ｃ）ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラ
ベルされたＤＮＡプローブと共にＤＮＡ担持基質をイン
キュベートする段階；（ｄ）前記基質からハイブリダイ
ズしなかったプローブを分離する段階；及び（ｅ）前記
基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからＴ
ＷＡＲ生物体の存在又は不在を決定する段階を含んで成
る。本発明のもう１つの観点の範囲内の方法は、（ａ）
基質にＴＷＡＲ生物体を含むと思われる生物学的サンプ
ルを添加し；（ｂ）該サンプルに関連するＤＮＡを暴露
するために前記添加されたサンプルを担持する基質を処
理し；（ｃ）前記ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラ
ベルされたＤＮＡプローブと共に前記ＤＮＡ担持基質を
インキュベートし；（ｄ）前記基質からハイブリダイズ
されなかったプローブを分離し、そして（ｅ）前記基質
に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからＴＷＡ
Ｒ生物体の存在又は不在を決定することを含んで成る。
前記方法内のプローブは、完全な染色体ＤＮＡプローブ
又はＴＷＡＲ生物体に由来したＤＮＡフラグメントプロ
ーブである。本発明のこれらの及び他の観点は、次の詳
細な説明及び添付図面によって明確になるであろう。
【００１３】
【発明の実施の形態】上記に示されるように、血清疫学
研究は、北ヨーロッパ及び他の国においていくつかの肺
炎流行病におけるクラミジアの通常の菌株を包含した。
このクラミジアの新規菌株は、初めの２種の単離体の実
験用名称（ＴＷ−１８３及びＡＲ−３９）から“ＴＷＡ
Ｒ”として本発明において言及される。ＴＷＡＲは、ク
ラミジア属に属することが示されているが、しかし、い
くつかの基準によってＣ．トリコマチス及びＣ．プシタ
シから区別され得る。封入体の形態及び封入体における
グリコーゲンの存在に関しては、ＴＷＡＲ封入体は、グ
リコーゲンを含むＣ．トラコマチス封入体の空胞性質と
は違って、それらの卵形且つ密集した出現及びグリコー
ゲンの不在に基づいてＣ．プシタシにより密接に関連さ
れる。さらにＴＷＡＲ生物体は、Ｃ．トラコマチス種−
特異性モノクローナル抗体と反応しない（Stephensな
ど., J. Immunol. １２８：１０８３，１９８２）。
研究は、北ヨーロッパ及び他の国においていくつかの肺
炎流行病におけるクラミジアの通常の菌株を包含した。
このクラミジアの新規菌株は、初めの２種の単離体の実
験用名称（ＴＷ−１８３及びＡＲ−３９）から“ＴＷＡ
Ｒ”として本発明において言及される。ＴＷＡＲは、ク
ラミジア属に属することが示されているが、しかし、い
くつかの基準によってＣ．トリコマチス及びＣ．プシタ
シから区別され得る。封入体の形態及び封入体における
グリコーゲンの存在に関しては、ＴＷＡＲ封入体は、グ
リコーゲンを含むＣ．トラコマチス封入体の空胞性質と
は違って、それらの卵形且つ密集した出現及びグリコー
ゲンの不在に基づいてＣ．プシタシにより密接に関連さ
れる。さらにＴＷＡＲ生物体は、Ｃ．トラコマチス種−
特異性モノクローナル抗体と反応しない（Stephensな
ど., J. Immunol. １２８：１０８３，１９８２）。
【００１４】ＴＷＡＲ生物体は明らかに、Ｃ．トリコマ
チス種に属さないが、それはまた現在認識されている
Ｃ．プシタシ株とも重要な相違を示す。ＴＷＡＲ及び他
のＣ．プシタシ株は免疫学的に異なる。すなわち、他の
Ｃ．プシタシ株との交叉反応は見出されていない。さら
に、ＴＷＡＲ生物体に対するモノクローナル抗体の産生
において（下記により十分に記載されている）、Ｃ．プ
シタシ種−特異性抗体は検出されず、属−及び菌株−
（ＴＷＡＲセロバー）特異性抗体のみが見出された。
チス種に属さないが、それはまた現在認識されている
Ｃ．プシタシ株とも重要な相違を示す。ＴＷＡＲ及び他
のＣ．プシタシ株は免疫学的に異なる。すなわち、他の
Ｃ．プシタシ株との交叉反応は見出されていない。さら
に、ＴＷＡＲ生物体に対するモノクローナル抗体の産生
において（下記により十分に記載されている）、Ｃ．プ
シタシ種−特異性抗体は検出されず、属−及び菌株−
（ＴＷＡＲセロバー）特異性抗体のみが見出された。
【００１５】プラスミドは、試験されたほとんどすべて
のＣ．プシタシ及びＣ．トラコマチスクラミジア株に見
出されたが、ＴＷＡＲ生物体はプラスミドを持たないこ
とを注目することはまた興味の対象である。さらに、す
べての既知のＣ．プシタシ株は動物又は鳥宿主を有する
が、ＴＷＡＲ生物体のための動物又は鳥宿主は見出され
ていない。本発明によれば、ＴＷＡＲ生物体は、Ｃ．プ
シタシに形態的に類似するが、しかしそれとは異なり、
そして現在認識されているＣ．プシタシ株とは免疫学的
に異なるいづれかのクラミジア株を含むことが定義され
る。代表的なＴＷＡＲ株（ＡＲ−３９）は、American T
ype Culture Collectionに寄託され、そして寄託番号第
５３５９２号を得た。
のＣ．プシタシ及びＣ．トラコマチスクラミジア株に見
出されたが、ＴＷＡＲ生物体はプラスミドを持たないこ
とを注目することはまた興味の対象である。さらに、す
べての既知のＣ．プシタシ株は動物又は鳥宿主を有する
が、ＴＷＡＲ生物体のための動物又は鳥宿主は見出され
ていない。本発明によれば、ＴＷＡＲ生物体は、Ｃ．プ
シタシに形態的に類似するが、しかしそれとは異なり、
そして現在認識されているＣ．プシタシ株とは免疫学的
に異なるいづれかのクラミジア株を含むことが定義され
る。代表的なＴＷＡＲ株（ＡＲ−３９）は、American T
ype Culture Collectionに寄託され、そして寄託番号第
５３５９２号を得た。
【００１６】ハイブリドーマ形成及びモノクローナル抗
体の産生は、種々の微生物疾患の免疫診断に有用である
ことが示された。より詳しくは、モノクローナル抗体
は、ヒト感染の検出及び血清学的な分類を可能にする。
さらに、これらのモノクローナル抗体は、属−及び種−
特異性抗原の同定を促進せしめる。上記に示されたよう
に、ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対するモノクローナ
ル抗体を産生することができる連続したハイブリッド細
胞系が確立される。そのような細胞系を確立するための
一般的な方法は、実験動物、通常マウスを適切な抗原に
より免疫化することを含む。次に、免疫脾臓細胞を単離
し、その化学物質、たとえばポリエチレングリコールに
暴露することによって骨髄腫又はリンパ腫細胞と融合せ
しめる。
体の産生は、種々の微生物疾患の免疫診断に有用である
ことが示された。より詳しくは、モノクローナル抗体
は、ヒト感染の検出及び血清学的な分類を可能にする。
さらに、これらのモノクローナル抗体は、属−及び種−
特異性抗原の同定を促進せしめる。上記に示されたよう
に、ＴＷＡＲ生物体の抗原決定基に対するモノクローナ
ル抗体を産生することができる連続したハイブリッド細
胞系が確立される。そのような細胞系を確立するための
一般的な方法は、実験動物、通常マウスを適切な抗原に
より免疫化することを含む。次に、免疫脾臓細胞を単離
し、その化学物質、たとえばポリエチレングリコールに
暴露することによって骨髄腫又はリンパ腫細胞と融合せ
しめる。
【００１７】次に、融合されたハイブリッド細胞を、悪
性細胞系の増殖を妨げる選択培地、たとえばＨＡＴ培地
中でインキュベートする。ハイブリドーマ細胞を限界希
釈法によりクローンし、そして培養上清液を、所望の特
異性を有するモノクローナル抗体の分泌のために検定す
る。選択されたモノクローナル抗体の多くの収量が、ハ
イブリドーマのイン・ビボでの腹水増殖を通して得られ
た。ＴＷＡＲ生物体に対して特異的であるモノクローナ
ル抗体を得るために、適切なＴＷＡＲ抗原が調製される
べきである。患者ののど（咽頭）からのＴＷＡＲ単離体
を真核細胞培養又は胎児性卵黄のう培養のいづれかを通
して、培養することができる。
性細胞系の増殖を妨げる選択培地、たとえばＨＡＴ培地
中でインキュベートする。ハイブリドーマ細胞を限界希
釈法によりクローンし、そして培養上清液を、所望の特
異性を有するモノクローナル抗体の分泌のために検定す
る。選択されたモノクローナル抗体の多くの収量が、ハ
イブリドーマのイン・ビボでの腹水増殖を通して得られ
た。ＴＷＡＲ生物体に対して特異的であるモノクローナ
ル抗体を得るために、適切なＴＷＡＲ抗原が調製される
べきである。患者ののど（咽頭）からのＴＷＡＲ単離体
を真核細胞培養又は胎児性卵黄のう培養のいづれかを通
して、培養することができる。
【００１８】ほとんどの一次単離物は、好結果をもたら
す真核細胞培養の前、ＴＷＡＲ生物体の卵順応性を必要
とする。特に、ＴＷＡＲ単離物を卵黄のう培養物に１度
又は２度通し、そして次にバイアル中に増殖されたＨｅ
Ｌａ ２２９細胞の培養物上にそれらを接種することが
好ましい。そのＨｅＬａ細胞をＤＥＡＥ−デキストラン
及びシクロヘキサアミドにより前処理することもまた好
ましい。そのＴＷＡＲ単離体は、くり返された培養物通
過により細胞培養物中で増殖することが適合され得る。
特に、約１０又はそれよりも多くの一連の培養物通過が
ＨｅＬａ細胞増殖への適合のために好都合であろう。
す真核細胞培養の前、ＴＷＡＲ生物体の卵順応性を必要
とする。特に、ＴＷＡＲ単離物を卵黄のう培養物に１度
又は２度通し、そして次にバイアル中に増殖されたＨｅ
Ｌａ ２２９細胞の培養物上にそれらを接種することが
好ましい。そのＨｅＬａ細胞をＤＥＡＥ−デキストラン
及びシクロヘキサアミドにより前処理することもまた好
ましい。そのＴＷＡＲ単離体は、くり返された培養物通
過により細胞培養物中で増殖することが適合され得る。
特に、約１０又はそれよりも多くの一連の培養物通過が
ＨｅＬａ細胞増殖への適合のために好都合であろう。
【００１９】図１のＡ及びＢを参照すれば、それぞれＴ
ＷＡＲ生物体及びＣ．トラコマチスにより感染されたＨ
ｅＬａ ２２９細胞の単層を示す顕微鏡写真が、存在す
る。ＴＷＡＲによる感染は、核を切り離さず又は置換し
ていない比較的密集した細胞質封入体を示す。対照的
に、図１のＢは、核を切り離している、Ｃ．トラコマチ
スの典型的な空胞性封入を示す。
ＷＡＲ生物体及びＣ．トラコマチスにより感染されたＨ
ｅＬａ ２２９細胞の単層を示す顕微鏡写真が、存在す
る。ＴＷＡＲによる感染は、核を切り離さず又は置換し
ていない比較的密集した細胞質封入体を示す。対照的
に、図１のＢは、核を切り離している、Ｃ．トラコマチ
スの典型的な空胞性封入を示す。
【００２０】感染された細胞培養物は、通常、ＴＷＡＲ
生物体の感染度のためにモニターされ；そして数パーセ
ントの細胞が感染される場合、多数のバイアル培養物
は、大きな培養ボトル中での増殖のために調製物に接種
される。好ましい態様においては、５０％の感染度が得
られる場合、２０〜３０個のＨｅＬａ ２２９細胞のバ
イアルが、３２−オンスの調剤ボトル培養物に植え込み
を提供するために感染され得る。続く一連の経過は、Ｔ
ＷＡＲ株クラミジアの数を高めるであろう。この適合及
び拡大は、モノクローナル抗体の産生及びスクリーニン
グのためにＴＷＡＲ抗原の十分な量を与えるであろう。
生物体の感染度のためにモニターされ；そして数パーセ
ントの細胞が感染される場合、多数のバイアル培養物
は、大きな培養ボトル中での増殖のために調製物に接種
される。好ましい態様においては、５０％の感染度が得
られる場合、２０〜３０個のＨｅＬａ ２２９細胞のバ
イアルが、３２−オンスの調剤ボトル培養物に植え込み
を提供するために感染され得る。続く一連の経過は、Ｔ
ＷＡＲ株クラミジアの数を高めるであろう。この適合及
び拡大は、モノクローナル抗体の産生及びスクリーニン
グのためにＴＷＡＲ抗原の十分な量を与えるであろう。
【００２１】本発明に使用されるハイブリドーマ産生の
ための免疫原は、精製されたＴＷＡＲ抗原であった。好
ましい態様において、その抗原は、レノグラフィンによ
り精製されたＴＷＡＲ基本小体（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ
ｂｏｄｙ）（＞９９％に精製された）である。ハイブ
リドーマは、免疫マウス脾臓細胞とＮＳ−Ｏ骨髄腫細胞
との融合によって調製され、そして抗−クラミジア抗体
を分泌するハイブリドーマクローンが同定される。好ま
しい態様においては、ハイブリドーマ培養上清液を、Ｅ
ＬＩＳＡによってスクリーンする。特に好ましい態様に
おいては、ＥＬＩＳＡは、ペルオキシダーゼ接合性抗−
マウス免疫グロブリン及び比色検出システムを使用す
る。ミクロ−イムノフルオレセンス技法（S. P. Wang及
びJ. T. Grayston, Amer. J. Ophthal. ７０：３６７
８，１９７０）によるモノクローナル抗体の特異性の試
験がまた好ましい。
ための免疫原は、精製されたＴＷＡＲ抗原であった。好
ましい態様において、その抗原は、レノグラフィンによ
り精製されたＴＷＡＲ基本小体（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ
ｂｏｄｙ）（＞９９％に精製された）である。ハイブ
リドーマは、免疫マウス脾臓細胞とＮＳ−Ｏ骨髄腫細胞
との融合によって調製され、そして抗−クラミジア抗体
を分泌するハイブリドーマクローンが同定される。好ま
しい態様においては、ハイブリドーマ培養上清液を、Ｅ
ＬＩＳＡによってスクリーンする。特に好ましい態様に
おいては、ＥＬＩＳＡは、ペルオキシダーゼ接合性抗−
マウス免疫グロブリン及び比色検出システムを使用す
る。ミクロ−イムノフルオレセンス技法（S. P. Wang及
びJ. T. Grayston, Amer. J. Ophthal. ７０：３６７
８，１９７０）によるモノクローナル抗体の特異性の試
験がまた好ましい。
【００２２】ＴＷＡＲにより誘発されたハイブリドーマ
は、同系のＢＡＬＢ／ｃマウス中に腹腔内接種され得
る。接種する前、２週間、マウスをプリスタンにより感
作することが好ましい。その得られた腹水を収穫し、そ
してモノクローナル抗体を精製することができる。好ま
しい態様においては、腹水性モノクローナル抗体を、プ
ロテインＡ−セファロースカラム上でアフィニティー精
製する。
は、同系のＢＡＬＢ／ｃマウス中に腹腔内接種され得
る。接種する前、２週間、マウスをプリスタンにより感
作することが好ましい。その得られた腹水を収穫し、そ
してモノクローナル抗体を精製することができる。好ま
しい態様においては、腹水性モノクローナル抗体を、プ
ロテインＡ−セファロースカラム上でアフィニティー精
製する。
【００２３】選択されたＴＷＡＲモノクローナル抗体
を、本発明に記載された方法に使用するためにラベル化
することができる。好ましいラベルは、酵素、蛍光体、
放射性同位体及び発光体を含む。これらの及び他のラベ
ルは当業界において良く知られている。これに関する特
に好ましいラベルは、フルオレセインである。次に、そ
のラベルされたＴＷＡＲモノクローナル抗体を、属−、
種−及び株−特異性について試験することができる。第
１表に示されるように、ミクロ−イムノフルオレセンス
アッセイに使用される場合、ＴＷＡＲにより誘発された
モノクローナル抗体は、ＴＷＡＲ単離体と反応したが、
しかしＣ．トラコマチルまたはＣ．プシタシはそうでは
なかった。
を、本発明に記載された方法に使用するためにラベル化
することができる。好ましいラベルは、酵素、蛍光体、
放射性同位体及び発光体を含む。これらの及び他のラベ
ルは当業界において良く知られている。これに関する特
に好ましいラベルは、フルオレセインである。次に、そ
のラベルされたＴＷＡＲモノクローナル抗体を、属−、
種−及び株−特異性について試験することができる。第
１表に示されるように、ミクロ−イムノフルオレセンス
アッセイに使用される場合、ＴＷＡＲにより誘発された
モノクローナル抗体は、ＴＷＡＲ単離体と反応したが、
しかしＣ．トラコマチルまたはＣ．プシタシはそうでは
なかった。
【００２４】
【表１】
【００２５】フルオレセイン接合性ＴＷＡＲモノクロー
ナル抗体は、感染された培養細胞中におけるＴＷＡＲ基
本体及びＴＷＡＲ封入体を特異的に染色するが、しかし
他のクラミジア株を染色しなかった。従って、本発明
は、ＴＷＡＲ特異性抗原決定基に結合するモノクローナ
ル抗体を提供する。
ナル抗体は、感染された培養細胞中におけるＴＷＡＲ基
本体及びＴＷＡＲ封入体を特異的に染色するが、しかし
他のクラミジア株を染色しなかった。従って、本発明
は、ＴＷＡＲ特異性抗原決定基に結合するモノクローナ
ル抗体を提供する。
【００２６】本発明の範囲内で、ＴＷＡＲ特異性モノク
ローナル抗体が、生物学的検体の診断アッセイに使用さ
れて来た。特に、本発明は、臨床的検体のスミア及び接
種された細胞培養物中におけるＴＷＡＲ生物体を検出す
るための方法を提供する。これらの方法は、固定された
検体におけるＴＷＡＲ−特異性抗体決定基に直接的に結
合する、ラベルされたＴＷＡＲ特異性モノクローナル抗
体を使用する。その検体は、固体支持体、たとえばガラ
ススライド、カバースリップ又はミクロタイターウェル
上に固定され得る。その検体又は生物学的サンプルはま
た、メタノール又はエタノールにより、固体支持体に固
定されるべきである。
ローナル抗体が、生物学的検体の診断アッセイに使用さ
れて来た。特に、本発明は、臨床的検体のスミア及び接
種された細胞培養物中におけるＴＷＡＲ生物体を検出す
るための方法を提供する。これらの方法は、固定された
検体におけるＴＷＡＲ−特異性抗体決定基に直接的に結
合する、ラベルされたＴＷＡＲ特異性モノクローナル抗
体を使用する。その検体は、固体支持体、たとえばガラ
ススライド、カバースリップ又はミクロタイターウェル
上に固定され得る。その検体又は生物学的サンプルはま
た、メタノール又はエタノールにより、固体支持体に固
定されるべきである。
【００２７】サンプルがその表面に固定又は結合された
後、そのサンプルは、ラベルされたモノクローナル抗体
に暴露される。他方、ＴＷＡＲ特異性モノクローナル抗
体に結合することができるラベルされた第二抗体が使用
される。この方法の変法は、ラベルのシグナルの増強を
提供することができる。直接的な蛍光抗体技法によるス
ミア検体中のＴＷＡＲ生物体の同定は、迅速であり、簡
単であり、そして比較的安価である。そのスミア技法
は、臨床的調整（初期診断、原因生物体の単離のための
改良された機会、治療の成功に基づく追跡調査）及び表
皮学的調整の両者に使用され得る。
後、そのサンプルは、ラベルされたモノクローナル抗体
に暴露される。他方、ＴＷＡＲ特異性モノクローナル抗
体に結合することができるラベルされた第二抗体が使用
される。この方法の変法は、ラベルのシグナルの増強を
提供することができる。直接的な蛍光抗体技法によるス
ミア検体中のＴＷＡＲ生物体の同定は、迅速であり、簡
単であり、そして比較的安価である。そのスミア技法
は、臨床的調整（初期診断、原因生物体の単離のための
改良された機会、治療の成功に基づく追跡調査）及び表
皮学的調整の両者に使用され得る。
【００２８】ＴＷＡＲ生物体の存在を検出するための方
法を提供する他に、本発明は、生物学的サンプル中にお
けるＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するため
の方法を提供する。ＴＷＡＲ抗体のための血清又は体液
のスクリーニングのための特に好ましい態様は、ミクロ
−ＩＦアッセイである。典型的には、抗原（クラミジア
基本小体抗原）を、顕微鏡のスライド上に固定し、そし
てそのスライドを、ＴＷＡＲ抗体を含むと思われるサン
プルと共にインキュベートする。次に、ラベルされた特
異的結合パートナー（たとえばフルオレセイン接合性抗
−マウス免疫グロブリン）を添加し、そしてその反応
を、ＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するため
に観察する。
法を提供する他に、本発明は、生物学的サンプル中にお
けるＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するため
の方法を提供する。ＴＷＡＲ抗体のための血清又は体液
のスクリーニングのための特に好ましい態様は、ミクロ
−ＩＦアッセイである。典型的には、抗原（クラミジア
基本小体抗原）を、顕微鏡のスライド上に固定し、そし
てそのスライドを、ＴＷＡＲ抗体を含むと思われるサン
プルと共にインキュベートする。次に、ラベルされた特
異的結合パートナー（たとえばフルオレセイン接合性抗
−マウス免疫グロブリン）を添加し、そしてその反応
を、ＴＷＡＲ生物体に対する抗体の存在を決定するため
に観察する。
【００２９】ＤＮＡプローブの使用はまた、種々の微生
物学的疾患の診断に有用であることが示されて来た。よ
り詳しくは、ＤＮＡプローブを用いて、精製されたＤＮ
Ａを検出し、単離されたコロニー中の精製されていない
ＤＮＡを検出し、又は組織、体液、食物及び水中のＤＮ
Ａを直接的に検出することができる。ＤＮＡプローブの
使用の１つの利点は、その生物体、が臨界的な結合部位
のマスキングを通して免疫学的検出を妨げることができ
る共存する抗体の存在において検出され得ることであ
る。
物学的疾患の診断に有用であることが示されて来た。よ
り詳しくは、ＤＮＡプローブを用いて、精製されたＤＮ
Ａを検出し、単離されたコロニー中の精製されていない
ＤＮＡを検出し、又は組織、体液、食物及び水中のＤＮ
Ａを直接的に検出することができる。ＤＮＡプローブの
使用の１つの利点は、その生物体、が臨界的な結合部位
のマスキングを通して免疫学的検出を妨げることができ
る共存する抗体の存在において検出され得ることであ
る。
【００３０】さらに、ＤＮＡプローブは、免疫蛍光技法
によって容易に検定され得ないサンプルに対して使用さ
れるべく可能性を有する。いくつかの異なったアプロー
チが、特定の病原体に対して特異的なＤＮＡプローブの
開発に使用されて来た。これらのアプローチは、（ａ）
完全な染色体ＤＮＡ；（ｂ）その病原体に対してユニー
クなウィルス性機能に関連する配列；（ｃ）プラスミド
ＤＮＡ；（ｄ）リボソームＲＮＡ遺伝子；及び（ｅ）前
記生物体に対して特異的な、クローンされたランダム配
列を含む。
によって容易に検定され得ないサンプルに対して使用さ
れるべく可能性を有する。いくつかの異なったアプロー
チが、特定の病原体に対して特異的なＤＮＡプローブの
開発に使用されて来た。これらのアプローチは、（ａ）
完全な染色体ＤＮＡ；（ｂ）その病原体に対してユニー
クなウィルス性機能に関連する配列；（ｃ）プラスミド
ＤＮＡ；（ｄ）リボソームＲＮＡ遺伝子；及び（ｅ）前
記生物体に対して特異的な、クローンされたランダム配
列を含む。
【００３１】しかしながら、ＴＷＡＲはプラスミドＤＮ
Ａを含まず、そしてウィルス性因子はこの生物体のため
に同定されていないので、本発明は、完全な染色体ＤＮ
Ａプローブ及びＴＷＡＲ生物体に対して特異的であるＴ
ＷＡＲＤＮＡの代表的なクローンされたフラグメントの
両者を開示する。これらのプローブの使用は、Ｃ．トラ
コマチス及びＣ．プシタシとＴＷＡＲとの区別を可能に
する。下記により詳細に説明されているように、ＤＮＡ
プローブは、ＴＷＡＲのＤＮＡ配列とハイブリダイズす
るそれらの能力、及びＣ．トラコマチス及びＣ．プシタ
シからのＤＮＡとのハイブリダイゼーションのそれらの
欠失によって選択された。
Ａを含まず、そしてウィルス性因子はこの生物体のため
に同定されていないので、本発明は、完全な染色体ＤＮ
Ａプローブ及びＴＷＡＲ生物体に対して特異的であるＴ
ＷＡＲＤＮＡの代表的なクローンされたフラグメントの
両者を開示する。これらのプローブの使用は、Ｃ．トラ
コマチス及びＣ．プシタシとＴＷＡＲとの区別を可能に
する。下記により詳細に説明されているように、ＤＮＡ
プローブは、ＴＷＡＲのＤＮＡ配列とハイブリダイズす
るそれらの能力、及びＣ．トラコマチス及びＣ．プシタ
シからのＤＮＡとのハイブリダイゼーションのそれらの
欠失によって選択された。
【００３２】簡単に言えば、完全な染色体ＤＮＡプロー
ブに関しては、ＴＷＡＲのＤＮＡを、精製された基本体
から単離し、ニック−トランスレーションし、そしてド
ットブロットハイブリダイゼーションにおいてプローブ
として使用した。図３に示されるように、完全な染色体
ＤＮＡプローブを用いて、Ｃ．トラコマチス及びＣ．プ
シタシからＴＷＡＲ生物体を同定し、そして区別するこ
とができる。手短に言えば、ＤＮＡフラグメントプロー
ブに関しては、ＴＷＡＲ株を適切な生物学的サンプルか
ら単離し、そしてそのＤＮＡを精製した。制限エンドヌ
クレアーゼによる消化の後、ＤＮＡフラグメントの混合
物を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。次
に、そのＤＮＡフラグメントを、ブロッチング又は電気
溶離のいづれかによってニトロセルロース紙に移した。
次に、ハイブリダイゼーションプローブを添加し、相同
配列を検出した。
ブに関しては、ＴＷＡＲのＤＮＡを、精製された基本体
から単離し、ニック−トランスレーションし、そしてド
ットブロットハイブリダイゼーションにおいてプローブ
として使用した。図３に示されるように、完全な染色体
ＤＮＡプローブを用いて、Ｃ．トラコマチス及びＣ．プ
シタシからＴＷＡＲ生物体を同定し、そして区別するこ
とができる。手短に言えば、ＤＮＡフラグメントプロー
ブに関しては、ＴＷＡＲ株を適切な生物学的サンプルか
ら単離し、そしてそのＤＮＡを精製した。制限エンドヌ
クレアーゼによる消化の後、ＤＮＡフラグメントの混合
物を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。次
に、そのＤＮＡフラグメントを、ブロッチング又は電気
溶離のいづれかによってニトロセルロース紙に移した。
次に、ハイブリダイゼーションプローブを添加し、相同
配列を検出した。
【００３３】より詳しくは、約５００bp，９００bp，１
２００bp，３２００bp及び３８００bpのサイズを有す
る、５種のクローンされたＴＷＡＲのＰｓｔＩＤＮＡフ
ラグメントを、ＡＲ−３９ ＤＮＡの遺伝子バンクから
精製し、そして染色体消化物をプローブするために使用
した。図２に示されるように、それぞれの場合のハイブ
リダイジングフラグメントは、すべてのＴＷＡＲ単離体
に関して同じであった。さらに、活性は、Ｃ．トラコマ
チス又はＣ．プシタシに関しては観察されなかったが、
そのプローブは、ＴＷＡＲ特異性であった。
２００bp，３２００bp及び３８００bpのサイズを有す
る、５種のクローンされたＴＷＡＲのＰｓｔＩＤＮＡフ
ラグメントを、ＡＲ−３９ ＤＮＡの遺伝子バンクから
精製し、そして染色体消化物をプローブするために使用
した。図２に示されるように、それぞれの場合のハイブ
リダイジングフラグメントは、すべてのＴＷＡＲ単離体
に関して同じであった。さらに、活性は、Ｃ．トラコマ
チス又はＣ．プシタシに関しては観察されなかったが、
そのプローブは、ＴＷＡＲ特異性であった。
【００３４】臨床的な用途に使用するために、クローン
され、そして精製されたＴＷＡＲフラグメントを、ドッ
トブロットハイブリダイゼーションにおいてプローブと
して使用することができる。図４に示されるように、Ｔ
ＷＡＲ，Ｃ．プシタシ及びＣ．トラコマチスの分解され
た基本体を試験する場合、前記フラグメントがＴＷＡＲ
とのみ反応した。簡単に言えば、どちらかのタイプのプ
ローブに関しては、感染物質を含むと思われる患者から
の生物学的サンプルを破壊し、そのＤＮＡを開放し、そ
してそのＤＮＡを、物理的（加熱）及び化学的（塩、界
面活性剤）手段によってニトロセルロース上にスポット
として結合せしめる。
され、そして精製されたＴＷＡＲフラグメントを、ドッ
トブロットハイブリダイゼーションにおいてプローブと
して使用することができる。図４に示されるように、Ｔ
ＷＡＲ，Ｃ．プシタシ及びＣ．トラコマチスの分解され
た基本体を試験する場合、前記フラグメントがＴＷＡＲ
とのみ反応した。簡単に言えば、どちらかのタイプのプ
ローブに関しては、感染物質を含むと思われる患者から
の生物学的サンプルを破壊し、そのＤＮＡを開放し、そ
してそのＤＮＡを、物理的（加熱）及び化学的（塩、界
面活性剤）手段によってニトロセルロース上にスポット
として結合せしめる。
【００３５】ニトロセルロースに適用する前のサンプル
調製の方法は、そのサンプル源に依存するであろう。す
べての場合、そのニトロセルロースは、ＤＮＡの結合を
高めるために１Ｍの酢酸アンニモウム中でプレインキュ
ベートされる。多くのサンプルを処理し、そして濃縮す
るためには、それらのサンプルは、好ましくは、たとえ
ばＢｉｏＤｏｔ Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ装置
の使用によってニトロセルロースに適用される。ＤＮＡ
が前に単離されている場合、サンプルは、０．３ＭのＮ
ａＣｌ中で１０分間、煮沸され、そして２Ｍの冷酢酸ア
ンモニウムが添加される。１００μｌのサンプルを、そ
のドットブロット装置に適用し、そして真空下で濾過す
る。ウェルを２Ｍの酢酸アンモニウムにより洗浄し、そ
のウェルに結合している残留核酸を除去する。
調製の方法は、そのサンプル源に依存するであろう。す
べての場合、そのニトロセルロースは、ＤＮＡの結合を
高めるために１Ｍの酢酸アンニモウム中でプレインキュ
ベートされる。多くのサンプルを処理し、そして濃縮す
るためには、それらのサンプルは、好ましくは、たとえ
ばＢｉｏＤｏｔ Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ装置
の使用によってニトロセルロースに適用される。ＤＮＡ
が前に単離されている場合、サンプルは、０．３ＭのＮ
ａＣｌ中で１０分間、煮沸され、そして２Ｍの冷酢酸ア
ンモニウムが添加される。１００μｌのサンプルを、そ
のドットブロット装置に適用し、そして真空下で濾過す
る。ウェルを２Ｍの酢酸アンモニウムにより洗浄し、そ
のウェルに結合している残留核酸を除去する。
【００３６】試験されるべきサンプルがＥＢ又は培養さ
れた細菌から成る場合、培養物を分解し、そして染色体
ＤＮＡを０．５ＮのＮａＯＨ中で１０分間、煮沸するこ
とによって変性し、ＨＣｌの添加によって０．５ＮのＨ
Ｃｌの最終濃度に中和し、そして６×ＳＳＣの最終濃度
にする。臨床的な気道検体に関しては、サンプルをプロ
テイナーゼＫにより処理し、ＳＤＳの添加によって溶解
し、フェノールにより抽出し、ＲＮａｓｅ処理し、フェ
ノールクロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱せし
める。次に、そのサンプルを上記のようにして煮沸する
ことによって変性する。サンプル適用の後、そのフィル
ターを８０℃で２時間、インキュベートし、２〜４時
間、プレハイブリダイズし、そして標準方法（Maniatis
など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor Laboratory,１９８３）によってハイ
ブリダイズせしめる。
れた細菌から成る場合、培養物を分解し、そして染色体
ＤＮＡを０．５ＮのＮａＯＨ中で１０分間、煮沸するこ
とによって変性し、ＨＣｌの添加によって０．５ＮのＨ
Ｃｌの最終濃度に中和し、そして６×ＳＳＣの最終濃度
にする。臨床的な気道検体に関しては、サンプルをプロ
テイナーゼＫにより処理し、ＳＤＳの添加によって溶解
し、フェノールにより抽出し、ＲＮａｓｅ処理し、フェ
ノールクロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱せし
める。次に、そのサンプルを上記のようにして煮沸する
ことによって変性する。サンプル適用の後、そのフィル
ターを８０℃で２時間、インキュベートし、２〜４時
間、プレハイブリダイズし、そして標準方法（Maniatis
など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor Laboratory,１９８３）によってハイ
ブリダイズせしめる。
【００３７】上記に簡単に記載された方法は、サンプル
調製のために適切な方法の単に代表にすぎないことは、
当業者にとって明らかであろう。本質的に、サンプル調
製の目的は、そのサンプルに関連するＤＮＡを生成し、
そしてそのＤＮＡを基質、たとえばニトロセルロース
に、生成の前、又は後のいづれかで添加することであ
る。これらの方法は、完全な染色体ＤＮＡプローブ又は
ＤＮＡフラグメントプローブの両者を調整するために使
用され得る。
調製のために適切な方法の単に代表にすぎないことは、
当業者にとって明らかであろう。本質的に、サンプル調
製の目的は、そのサンプルに関連するＤＮＡを生成し、
そしてそのＤＮＡを基質、たとえばニトロセルロース
に、生成の前、又は後のいづれかで添加することであ
る。これらの方法は、完全な染色体ＤＮＡプローブ又は
ＤＮＡフラグメントプローブの両者を調整するために使
用され得る。
【００３８】患者のサンプルからの相補的ＤＮＡが存在
する場合、ラベルされたハイブリダイゼーションプロー
ブが結合されるであろう。そこで相補的ＤＮＡが存在し
ない場合、そのハイブリダイゼーションプローブは結合
されず、そして容易に洗浄し、除去され得る。非放射能
プローブが使用される場合、そのハイブリダイゼーショ
ンプローブ上のラベルに対する基質が、測定されるべき
反応のために必要であろう。ラベルが32Ｐである場合、
その測定は、写真フィルムの現像を含む。ラベルが酵素
の場合、その測定は、濃度計又は直接的な可視化のいづ
れかによって行なわれ得る。
する場合、ラベルされたハイブリダイゼーションプロー
ブが結合されるであろう。そこで相補的ＤＮＡが存在し
ない場合、そのハイブリダイゼーションプローブは結合
されず、そして容易に洗浄し、除去され得る。非放射能
プローブが使用される場合、そのハイブリダイゼーショ
ンプローブ上のラベルに対する基質が、測定されるべき
反応のために必要であろう。ラベルが32Ｐである場合、
その測定は、写真フィルムの現像を含む。ラベルが酵素
の場合、その測定は、濃度計又は直接的な可視化のいづ
れかによって行なわれ得る。
【００３９】選択されたＤＮＡプローブの感受性を決定
するために、前もって決定された濃度のＴＷＡＲの種々
の希釈溶液を前記のようにして破壊し、そして濾過によ
りニトロセルロースに適用することができる。ＴＷＡＲ
の粒子の計数は、コンゴレッドによるネガティブ染色法
（Gerloff など., J. Infect, Dis. １２３：４２９〜
４３２，１９７１）によって、又は電子顕微鏡（Wangな
ど., Am. J. Opthal.１４４３〜１４５４，１９６７）
によって行なわれ得る。
するために、前もって決定された濃度のＴＷＡＲの種々
の希釈溶液を前記のようにして破壊し、そして濾過によ
りニトロセルロースに適用することができる。ＴＷＡＲ
の粒子の計数は、コンゴレッドによるネガティブ染色法
（Gerloff など., J. Infect, Dis. １２３：４２９〜
４３２，１９７１）によって、又は電子顕微鏡（Wangな
ど., Am. J. Opthal.１４４３〜１４５４，１９６７）
によって行なわれ得る。
【００４０】完全な染色体ＤＮＡプローブよりも本発明
に記載されたＴＷＡＲ特異性フラグメントの１つの利点
は、それらの純度である。細胞培養物のＤＮＡによるク
ラミジアの染色体ＤＮＡの少々の汚染は、みずから非特
異性バックグラウンド反応をもたらすであろう。この可
能性ある問題を迂回するためには、完全な染色体ＤＮＡ
は、ＴＷＡＲの増殖を十分に支持するＭｃＣｏｙ細胞又
は他の非ヒト細胞系において増殖されるＴＷＡＲ生物体
から調製され得る。
に記載されたＴＷＡＲ特異性フラグメントの１つの利点
は、それらの純度である。細胞培養物のＤＮＡによるク
ラミジアの染色体ＤＮＡの少々の汚染は、みずから非特
異性バックグラウンド反応をもたらすであろう。この可
能性ある問題を迂回するためには、完全な染色体ＤＮＡ
は、ＴＷＡＲの増殖を十分に支持するＭｃＣｏｙ細胞又
は他の非ヒト細胞系において増殖されるＴＷＡＲ生物体
から調製され得る。
【００４１】クローン化されたフラグメントの追加の利
点は、完全な染色体ＤＮＡの単離のために多くの量のＴ
ＷＡＲ生物体を増殖するのと比べて、これらの特異的な
配列の多くの量を単離する際、容易且つ安価であること
である。ＤＮＡプローブの単離のために本発明に記載さ
れた方法の他に、ＤＮＡプローブの感受性が、種々の手
段、たとえば（ａ）一本鎖のプローブの使用及び（ｂ）
リボソームｒＲＮＡ遺伝子の単離を通して改良され得
る。次の例は、例示的であって限定するものではない。
点は、完全な染色体ＤＮＡの単離のために多くの量のＴ
ＷＡＲ生物体を増殖するのと比べて、これらの特異的な
配列の多くの量を単離する際、容易且つ安価であること
である。ＤＮＡプローブの単離のために本発明に記載さ
れた方法の他に、ＤＮＡプローブの感受性が、種々の手
段、たとえば（ａ）一本鎖のプローブの使用及び（ｂ）
リボソームｒＲＮＡ遺伝子の単離を通して改良され得
る。次の例は、例示的であって限定するものではない。
【００４２】例 １．ＴＷＡＲ生物体の増殖及び単離 Ａ．細胞培養物の単離 急性呼吸疾患を有する患者からの、トランスポート媒体
（スクロース／カリウム／グルタメート；ＳＰＧ）中の
ど（咽頭）の検体を、C. C. Kuo など．（J. Infect. D
is. １２５：６６５〜６６８，１９７２）からの変法
に従って培養した。それぞれの検体を、接種の前、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン（３０Ｏｅｇ／ml）及びシクロヘキ
サアミド（０．５〜０．８Ｏｅｇ／ml）により前処理さ
れたＨｅＬａ ２２９細胞の単層を含む３個のバイアル
上に接種した。
（スクロース／カリウム／グルタメート；ＳＰＧ）中の
ど（咽頭）の検体を、C. C. Kuo など．（J. Infect. D
is. １２５：６６５〜６６８，１９７２）からの変法
に従って培養した。それぞれの検体を、接種の前、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン（３０Ｏｅｇ／ml）及びシクロヘキ
サアミド（０．５〜０．８Ｏｅｇ／ml）により前処理さ
れたＨｅＬａ ２２９細胞の単層を含む３個のバイアル
上に接種した。
【００４３】その細胞上の接種物を、室温で６０分間、
２，２００rpm で遠心分離した。次に、それらのバイア
ルを３５℃で７２時間インキュベートした（継代１）。
それらのバイアルの１つからの単層をメタノールにより
固定し、そして蛍光抗体により染色し、感染を示す封入
体について調べた。他の２個のバイアルは、継代２のた
めの接種物を供給するために利用され得る。
２，２００rpm で遠心分離した。次に、それらのバイア
ルを３５℃で７２時間インキュベートした（継代１）。
それらのバイアルの１つからの単層をメタノールにより
固定し、そして蛍光抗体により染色し、感染を示す封入
体について調べた。他の２個のバイアルは、継代２のた
めの接種物を供給するために利用され得る。
【００４４】Ｂ．卵培養物の単離 急性呼吸疾患を有する患者からの、ＳＰＧトランスポー
ト媒体中のど（咽頭）の検体を、J. T. Graystonなど．
（Proc. Soc. Exp. Biol. Med. １０３：５９６，１９
６０）の方法に従って、胎児性卵（６〜８日目）の卵黄
のう中に接種した。ストレプトマイシンを、濃度が接種
に基づいて卵当り１０mgに達するまで、その検体に添加
した。それらの卵を、３５℃でインキュベートし、そし
て毎日、明りに透かして調べた。
ト媒体中のど（咽頭）の検体を、J. T. Graystonなど．
（Proc. Soc. Exp. Biol. Med. １０３：５９６，１９
６０）の方法に従って、胎児性卵（６〜８日目）の卵黄
のう中に接種した。ストレプトマイシンを、濃度が接種
に基づいて卵当り１０mgに達するまで、その検体に添加
した。それらの卵を、３５℃でインキュベートし、そし
て毎日、明りに透かして調べた。
【００４５】死んだ後、又は１２〜１３日間生存した
後、卵黄のうを収穫し、そしてＭａｃｃｈｉａｖｅｌｌ
ｏの染色変法によって染色し、クラミジアの基本小体に
ついて調べた。フルオレセインに接合されたＴＷＡＲモ
ノクローナル抗体が感染された卵黄のうを染色するため
に利用可能になる場合、そのＴＷＡＲ生物体を、より一
層容易に見ることができる。Ｍａｃｃｈｉａｖｅｌｌｏ
染色によってこれまで陰性であると思われたいくつかの
継代は、ＴＷＡＲ生物体を含むことが見出された。陽性
培養物は普通、続く継代に基づいて多くの数の基本小体
を示した。
後、卵黄のうを収穫し、そしてＭａｃｃｈｉａｖｅｌｌ
ｏの染色変法によって染色し、クラミジアの基本小体に
ついて調べた。フルオレセインに接合されたＴＷＡＲモ
ノクローナル抗体が感染された卵黄のうを染色するため
に利用可能になる場合、そのＴＷＡＲ生物体を、より一
層容易に見ることができる。Ｍａｃｃｈｉａｖｅｌｌｏ
染色によってこれまで陰性であると思われたいくつかの
継代は、ＴＷＡＲ生物体を含むことが見出された。陽性
培養物は普通、続く継代に基づいて多くの数の基本小体
を示した。
【００４６】Ｃ．細胞培養中に増殖せしめるためのＴＷ
ＡＲ株の適合 そのようにして得られた１３種の単離体うち１つを除く
他のすべては、ほとんどのＴＷＡＲ単離体をＨｅＬａ
２２９細胞培養バイアルにうまく適合せしめるために、
細胞培養物の接種の前、生物体（１又は２継代）の卵適
合物による、胎児性卵の卵黄のうへの初めの接種を必要
とした。
ＡＲ株の適合 そのようにして得られた１３種の単離体うち１つを除く
他のすべては、ほとんどのＴＷＡＲ単離体をＨｅＬａ
２２９細胞培養バイアルにうまく適合せしめるために、
細胞培養物の接種の前、生物体（１又は２継代）の卵適
合物による、胎児性卵の卵黄のうへの初めの接種を必要
とした。
【００４７】ＴＷＡＲ生物体の一連の継代を、Kuo な
ど．（“Nongonococcal Urethritis and Relatecl Infe
ctions, ”３２８〜３３６ページ、１９７７）の変法に
従って、ＨｅＬａ ２２９細胞のバイアル培養中で行な
った。細胞培養物の単離について記載されているように
して（例１．Ａ）、バイアル中の３種の別々のＨｅＬａ
細胞単層を、それぞれの継代のために接種した。１つは
固定され、そして染色され、感染の進行が決定され、そ
して残る２種の単層は、バイアルから削り取られ、そし
て第１の継代について上記に説明されたように正確に再
接種された。少なくとも１０回の連続した細胞培養継代
が適合せしめるためには必要とされた。５０％以上の細
胞を感染せしめるために、その感染度が高まる場合、接
種されるバイアルの数を増し、大きな培養ボトル（３２
オンスの処方用ボトル）中への接種のために感染された
細胞の２０〜３０個のバイアルを供給した。連続した継
代が、細胞の１００％が感染されるまで、ボトル培養中
で続けられた。
ど．（“Nongonococcal Urethritis and Relatecl Infe
ctions, ”３２８〜３３６ページ、１９７７）の変法に
従って、ＨｅＬａ ２２９細胞のバイアル培養中で行な
った。細胞培養物の単離について記載されているように
して（例１．Ａ）、バイアル中の３種の別々のＨｅＬａ
細胞単層を、それぞれの継代のために接種した。１つは
固定され、そして染色され、感染の進行が決定され、そ
して残る２種の単層は、バイアルから削り取られ、そし
て第１の継代について上記に説明されたように正確に再
接種された。少なくとも１０回の連続した細胞培養継代
が適合せしめるためには必要とされた。５０％以上の細
胞を感染せしめるために、その感染度が高まる場合、接
種されるバイアルの数を増し、大きな培養ボトル（３２
オンスの処方用ボトル）中への接種のために感染された
細胞の２０〜３０個のバイアルを供給した。連続した継
代が、細胞の１００％が感染されるまで、ボトル培養中
で続けられた。
【００４８】例 ２．ＴＷＡＲ抗原の調製 ３２オンスの処方用ボトルへのＴＷＡＲ株の適合の後、
その株を、ＨｅＬａ２２９細胞の追加のボトル中で増殖
せしめることによって拡張した。ハンクス液２０ml中に
おいてガラスビーズにより細胞単層をころがすことによ
って、生物体を収穫した。その細胞を音波処理により破
壊し、そしてＨｅＬａ細胞残骸を低速での遠心分離
（１，２００rpm で１０分間）により除去した。次に、
その生物体を、高速での遠心分離（１６，０００rpm で
２０分間）によりペレット化した。
その株を、ＨｅＬａ２２９細胞の追加のボトル中で増殖
せしめることによって拡張した。ハンクス液２０ml中に
おいてガラスビーズにより細胞単層をころがすことによ
って、生物体を収穫した。その細胞を音波処理により破
壊し、そしてＨｅＬａ細胞残骸を低速での遠心分離
（１，２００rpm で１０分間）により除去した。次に、
その生物体を、高速での遠心分離（１６，０００rpm で
２０分間）によりペレット化した。
【００４９】ＴＷＡＲ基本体を、１６，０００rpm で４
０分間、３０％Ｒｅｎｏｇｒａｆｉｎ懸濁液により緩衝
化し（これは汚染物の約６０％を除去する）、そして次
に２３，０００rpm で９０分間、３０〜６５％Ｒｅｎｏ
ｇｒａｆｉｎ直線グラジェントを通すことによって、ま
ず精製した。ＴＷＡＲ基本体の懸濁されたバンドは、９
９％以上精製された。使用される方法は、R. S. Stephe
nsなど．（J. Immunal. １２８：１０８３，１９８
２）の変法であった。
０分間、３０％Ｒｅｎｏｇｒａｆｉｎ懸濁液により緩衝
化し（これは汚染物の約６０％を除去する）、そして次
に２３，０００rpm で９０分間、３０〜６５％Ｒｅｎｏ
ｇｒａｆｉｎ直線グラジェントを通すことによって、ま
ず精製した。ＴＷＡＲ基本体の懸濁されたバンドは、９
９％以上精製された。使用される方法は、R. S. Stephe
nsなど．（J. Immunal. １２８：１０８３，１９８
２）の変法であった。
【００５０】例 ３．免疫化の計画 ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ホルマリンにより殺された５×
１０7 個のＴＷＡＲ生物体により、１日目に腹腔内投与
し、そして同様の接種物により１週間隔で、それから３
又は４回静脈内投与することによって免疫化した。脾臓
を、最後の免疫化の後、３日目に収穫した。
１０7 個のＴＷＡＲ生物体により、１日目に腹腔内投与
し、そして同様の接種物により１週間隔で、それから３
又は４回静脈内投与することによって免疫化した。脾臓
を、最後の免疫化の後、３日目に収穫した。
【００５１】例 ４．ハイブリドーマの構成 ＮＳ−Ｏ骨髄腫細胞系を、融合工程に使用するためにMi
lsteinから得た。ＮＳ−Ｏ細胞は通常、熱不活性化され
た１５％ウシ胎児血清、１mMのグルタミン及び１mMのピ
ルベートを含むＲＰＭＩ １６４０（GIBCO, Grand Isl
and, N.Y.)（“完全ＲＰＭＩ”として言及される）中で
増殖された。脾臓細胞懸濁液を、細かく切り、そして細
かいナイロン製スクリーンを通してその細胞を通すこと
によって調製した。白血球細胞懸濁液を、血清を含まな
いＲＰＭＩにより３度洗浄し；ＮＳ−Ｏ細胞を血清を含
まないＲＰＭＩにより１度洗浄した。
lsteinから得た。ＮＳ−Ｏ細胞は通常、熱不活性化され
た１５％ウシ胎児血清、１mMのグルタミン及び１mMのピ
ルベートを含むＲＰＭＩ １６４０（GIBCO, Grand Isl
and, N.Y.)（“完全ＲＰＭＩ”として言及される）中で
増殖された。脾臓細胞懸濁液を、細かく切り、そして細
かいナイロン製スクリーンを通してその細胞を通すこと
によって調製した。白血球細胞懸濁液を、血清を含まな
いＲＰＭＩにより３度洗浄し；ＮＳ−Ｏ細胞を血清を含
まないＲＰＭＩにより１度洗浄した。
【００５２】ＮＳ−Ｏ細胞及びリンパ球を、２５０×Ｇ
で１０分間、遠心分離することによって、４０％ポリエ
チレングリコール中で融合せしめた（１：４の割合又は
１：８の割合で）。その細胞を完全ＲＭＰＩ１０体積に
より洗浄し、そして１６０×Ｇで５分間遠心分離した。
その上清液をアスピレートし、そしてその細胞を、ＨＡ
Ｔ培地により補充された完全ＲＭＰＩ（これは１．０×
１０-4Ｍのヒポキサンチン、４．０×１０-7Ｍのアミノ
プラリン及び１．６×１０-5Ｍのチミジンを含む）によ
り２．５×１０6 個の細胞／mlに再懸濁した。
で１０分間、遠心分離することによって、４０％ポリエ
チレングリコール中で融合せしめた（１：４の割合又は
１：８の割合で）。その細胞を完全ＲＭＰＩ１０体積に
より洗浄し、そして１６０×Ｇで５分間遠心分離した。
その上清液をアスピレートし、そしてその細胞を、ＨＡ
Ｔ培地により補充された完全ＲＭＰＩ（これは１．０×
１０-4Ｍのヒポキサンチン、４．０×１０-7Ｍのアミノ
プラリン及び１．６×１０-5Ｍのチミジンを含む）によ
り２．５×１０6 個の細胞／mlに再懸濁した。
【００５３】このハイブリッド細胞懸濁液を、３〜５週
才のＢＡＬＢ／ｃマウスからの胸線リンパ球と共に混合
し、２．５×１０6 個の胸線リンパ球／mlの最終濃度に
した。その最終細胞懸濁液を、９６−ウェル マイクロ
テスト プレート（Costar,Cambridge, Mass)のウェル
中に接種した（２００Ｏｅｌ体積中）。ＨＡＴ培地によ
る追加の食餌（体積で５０％の交換）を、５日及び８日
目に与えた。連続した操作、フィーデイング計画及び希
釈を限定することによるクローニングを、Stephensな
ど．（前記）によって記載されているようにして行なっ
た。
才のＢＡＬＢ／ｃマウスからの胸線リンパ球と共に混合
し、２．５×１０6 個の胸線リンパ球／mlの最終濃度に
した。その最終細胞懸濁液を、９６−ウェル マイクロ
テスト プレート（Costar,Cambridge, Mass)のウェル
中に接種した（２００Ｏｅｌ体積中）。ＨＡＴ培地によ
る追加の食餌（体積で５０％の交換）を、５日及び８日
目に与えた。連続した操作、フィーデイング計画及び希
釈を限定することによるクローニングを、Stephensな
ど．（前記）によって記載されているようにして行なっ
た。
【００５４】例 ５．ハイブリドーマクローンのスクリ
ーニング 培養流体中における抗−クラミジア抗体を、酵素結合さ
れた免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出し
た。抗体アッセイに関しては、リン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ，pH７．６）５０Ｏｅｌにおける１×１０5 個のクラ
ミジア生物体を、３７℃で一晩インキュベートすること
によってマイクロテストプレートの個々のプレートによ
り吸着せしめた。対照プレートをマイクロタイタープレ
ートのウェルに感染されていないＨｅＬａ２２９細胞
（１０4 個の細胞／ウェル）を接触することによって調
整した。次の朝、それらのプレートのウェルを、ＰＢＳ
中５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）７５μｌと共に２
時間インキュベートすることによって非特異性タンパク
質の吸着から阻止した。その抗体アッセイは次の３段階
で行われた：
ーニング 培養流体中における抗−クラミジア抗体を、酵素結合さ
れた免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出し
た。抗体アッセイに関しては、リン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ，pH７．６）５０Ｏｅｌにおける１×１０5 個のクラ
ミジア生物体を、３７℃で一晩インキュベートすること
によってマイクロテストプレートの個々のプレートによ
り吸着せしめた。対照プレートをマイクロタイタープレ
ートのウェルに感染されていないＨｅＬａ２２９細胞
（１０4 個の細胞／ウェル）を接触することによって調
整した。次の朝、それらのプレートのウェルを、ＰＢＳ
中５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）７５μｌと共に２
時間インキュベートすることによって非特異性タンパク
質の吸着から阻止した。その抗体アッセイは次の３段階
で行われた：
【００５５】（１）培養流体５０μｌを、３７℃で６０
分間、抗原吸着ウェルのそれぞれの中でインキュベート
した。次に、結合されていない免疫グロブリンを、１％
ＢＳＡを含むＰＢＳにより３度、洗浄することによって
ウェルから除去した。 （２）ペルオキシダーゼ接合の抗−マウス免疫グロブリ
ン（５０μｌ）を、それぞれのウェルに添加し、そして
３７℃で６０分間インキュベートした。残留する非結合
性ペルオキシダーゼ接合体を、ＰＢＳにより３度、洗浄
することによって除去した。 （３）その免疫反応を、基質にＯ−フェニレンジアミン
及びＨ2 Ｏ2 を添加することによって検出し、そして色
素反応を定量化した。ＥＬＩＳＡによって陽性であるこ
とが示された培養上清液をマイクロ−ＩＦ技法で試験す
ることによってさらに抗体特異性を、決定した（例６を
参照のこと）。
分間、抗原吸着ウェルのそれぞれの中でインキュベート
した。次に、結合されていない免疫グロブリンを、１％
ＢＳＡを含むＰＢＳにより３度、洗浄することによって
ウェルから除去した。 （２）ペルオキシダーゼ接合の抗−マウス免疫グロブリ
ン（５０μｌ）を、それぞれのウェルに添加し、そして
３７℃で６０分間インキュベートした。残留する非結合
性ペルオキシダーゼ接合体を、ＰＢＳにより３度、洗浄
することによって除去した。 （３）その免疫反応を、基質にＯ−フェニレンジアミン
及びＨ2 Ｏ2 を添加することによって検出し、そして色
素反応を定量化した。ＥＬＩＳＡによって陽性であるこ
とが示された培養上清液をマイクロ−ＩＦ技法で試験す
ることによってさらに抗体特異性を、決定した（例６を
参照のこと）。
【００５６】例 ６．モノクローナル抗体の産生 同系ＢＡＬＢ／ｃマウス中への１〜５×１０6 個のハイ
ブリッド細胞の腹腔内接種が、２〜３週間内で触診でき
る腫瘍（ハイブリドーマ）を誘発した。腫瘍誘発を確か
めるために、同系の宿主が、Pristane（２，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン、Aldrich Chemical C
o., Milwaukee, Wis.)０．５mlの腹腔内接種によって２
週間前に感作された。ほとんどの場合（＞９０％）、腹
腔内に移植されたハイブリドーマの前進的増殖が、腹水
（１．０〜０．５ml／マウス）の産生によって達成され
た。
ブリッド細胞の腹腔内接種が、２〜３週間内で触診でき
る腫瘍（ハイブリドーマ）を誘発した。腫瘍誘発を確か
めるために、同系の宿主が、Pristane（２，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン、Aldrich Chemical C
o., Milwaukee, Wis.)０．５mlの腹腔内接種によって２
週間前に感作された。ほとんどの場合（＞９０％）、腹
腔内に移植されたハイブリドーマの前進的増殖が、腹水
（１．０〜０．５ml／マウス）の産生によって達成され
た。
【００５７】その腹水中に含まれるモノクローナル抗体
のアイソタイプを、モノクローナル抗体−スクリーンシ
ステム（Zymed Laboratories, San Francisco, Calif.)
を用いるＥＬＩＳＡによって決定した。使用の前、腹水
を、マイクロ−ＩＦ技法によって特定の抗体活性につい
て試験した。
のアイソタイプを、モノクローナル抗体−スクリーンシ
ステム（Zymed Laboratories, San Francisco, Calif.)
を用いるＥＬＩＳＡによって決定した。使用の前、腹水
を、マイクロ−ＩＦ技法によって特定の抗体活性につい
て試験した。
【００５８】マイクロ−ＩＦアッセイに関しては、培養
流体又は腹水を、顕微鏡スライド上に置かれたクラミジ
ア基本体抗原と湿潤室において、３７℃で３０分間、反
応せしめた。反応の後、そのスライドをＰＢＳにより５
度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接
合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして湿潤室
において３７℃で３０分間インキュベートした。インキ
ュベートの後、そのスライドを蒸留水により５度洗浄せ
しめ、そして空気乾燥せしめた。ＦＡ封入流体の一滴を
添加し、そしてカバースリップをそのスライド上に置い
た。その反応はＦＡ−顕微鏡下で観察された。封入体の
染色に関しては、感染されたＨｅＬａ細胞を無水メタノ
ール中において１０分間、固定し、そしてＴＷＡＲ特異
性抗体活性について検定した。
流体又は腹水を、顕微鏡スライド上に置かれたクラミジ
ア基本体抗原と湿潤室において、３７℃で３０分間、反
応せしめた。反応の後、そのスライドをＰＢＳにより５
度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接
合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして湿潤室
において３７℃で３０分間インキュベートした。インキ
ュベートの後、そのスライドを蒸留水により５度洗浄せ
しめ、そして空気乾燥せしめた。ＦＡ封入流体の一滴を
添加し、そしてカバースリップをそのスライド上に置い
た。その反応はＦＡ−顕微鏡下で観察された。封入体の
染色に関しては、感染されたＨｅＬａ細胞を無水メタノ
ール中において１０分間、固定し、そしてＴＷＡＲ特異
性抗体活性について検定した。
【００５９】腹水内に含まれるモノクローナル抗体を、
プロテインＡ−セファロースカラム（Pharmacia Fine C
hemicals, Uppsala, Sweden)上でアフィニティ精製し
た。フルオレセインイソチオシアネート−接合のモノク
ローナル抗体を、Goding（J. Immunol. Meth. １３：２
１５，１９７６）の方法によって調製し、そして直接的
な免疫蛍光アッセイのための滴定により決定されるよう
に、適切な希釈度で使用した。接合されなかったモノク
ローナル抗体を、間接的な免疫蛍光技法のために１：１
００の希釈度で通常使用した。
プロテインＡ−セファロースカラム（Pharmacia Fine C
hemicals, Uppsala, Sweden)上でアフィニティ精製し
た。フルオレセインイソチオシアネート−接合のモノク
ローナル抗体を、Goding（J. Immunol. Meth. １３：２
１５，１９７６）の方法によって調製し、そして直接的
な免疫蛍光アッセイのための滴定により決定されるよう
に、適切な希釈度で使用した。接合されなかったモノク
ローナル抗体を、間接的な免疫蛍光技法のために１：１
００の希釈度で通常使用した。
【００６０】例 ７．診断アッセイ Ａ．塗抹技法 Ｃ．トラコマチスに対するモノクローナル抗体を、臨床
的な検体からのスミアーの直接的な蛍光抗体（ＦＡ）ア
ッセイのためにこれまで使用して来た。Ｃ．プシタシの
菌株に対して特異的なフルオレセイン接合のモノクロー
ナル抗体を、呼吸器検体の同様の直接的ＦＡアッセイに
使用して来た。簡単には、咽頭スワブを、２つの前もっ
て印を付けられた円形の部分（直径５mm) 上のガラスス
ライド上でころがし、そして次に、そのスライドを９５
％エタノール中に１０〜３０分間、浸した。そのスライ
ドを空気中で乾燥せしめた後、蛍光モノクローナル抗体
接合体を、その検体部分に適用した。
的な検体からのスミアーの直接的な蛍光抗体（ＦＡ）ア
ッセイのためにこれまで使用して来た。Ｃ．プシタシの
菌株に対して特異的なフルオレセイン接合のモノクロー
ナル抗体を、呼吸器検体の同様の直接的ＦＡアッセイに
使用して来た。簡単には、咽頭スワブを、２つの前もっ
て印を付けられた円形の部分（直径５mm) 上のガラスス
ライド上でころがし、そして次に、そのスライドを９５
％エタノール中に１０〜３０分間、浸した。そのスライ
ドを空気中で乾燥せしめた後、蛍光モノクローナル抗体
接合体を、その検体部分に適用した。
【００６１】そのスライドを湿潤室で３７℃で３０分間
インキュベートし、蒸留水を含む６個のジャーを通して
すばやく浸し、そして乾燥せしめた。Bacto 蛍光抗体封
入液体（Difico Laboratories, Detroit, Mich.)の一滴
及びカバースリップを、そのスライドに適用し、次にエ
ピフルオレセンス顕微鏡（Carl Zeiss, Oberkochen,Wes
t Germany) により油含浸下で５００倍で試験した。ス
ミアーの全部分を試験した。スライド上の調査結果は、
少なくとも５個の蛍光性基本体が検体中に見出される場
合、ＴＷＡＲ株に関しては陽性として考慮された。陰性
の調査結果を有するスライドを、５分間読み取った。Ｔ
ＷＡＲ単離物を有する７人の患者のうち６人からの咽の
スワブスミアーを、蛍光ＴＷＡＲモノクローナル抗体に
より染色した。４人の患者において、クラミジアの典型
的な基本体が示された。
インキュベートし、蒸留水を含む６個のジャーを通して
すばやく浸し、そして乾燥せしめた。Bacto 蛍光抗体封
入液体（Difico Laboratories, Detroit, Mich.)の一滴
及びカバースリップを、そのスライドに適用し、次にエ
ピフルオレセンス顕微鏡（Carl Zeiss, Oberkochen,Wes
t Germany) により油含浸下で５００倍で試験した。ス
ミアーの全部分を試験した。スライド上の調査結果は、
少なくとも５個の蛍光性基本体が検体中に見出される場
合、ＴＷＡＲ株に関しては陽性として考慮された。陰性
の調査結果を有するスライドを、５分間読み取った。Ｔ
ＷＡＲ単離物を有する７人の患者のうち６人からの咽の
スワブスミアーを、蛍光ＴＷＡＲモノクローナル抗体に
より染色した。４人の患者において、クラミジアの典型
的な基本体が示された。
【００６２】Ｂ．培養技法 フルオレセイン接合のＴＷＡＲ株−特異性モノクローナ
ル抗体を使用して、初期ＨｅＬａ２２９細胞培養継代に
おけるＴＷＡＲ単離体を同定した。その細胞培養単離技
法は、例１．Ａ．に記載されている。ＴＷＡＲ株−特異
性モノクローナル抗体による直接的な蛍光抗体（ＦＡ）
染色は、ＴＷＡＲ単離体の同定をひじょうに促進せし
め、そしてこれらの単離体の直接的な継代を可能にし
た。ＴＷＡＲ単離体のそれぞれは、封入体の直接的なＦ
Ａ染色によって一次ＨｅＬａ２２９細胞培養継代中に同
定された。
ル抗体を使用して、初期ＨｅＬａ２２９細胞培養継代に
おけるＴＷＡＲ単離体を同定した。その細胞培養単離技
法は、例１．Ａ．に記載されている。ＴＷＡＲ株−特異
性モノクローナル抗体による直接的な蛍光抗体（ＦＡ）
染色は、ＴＷＡＲ単離体の同定をひじょうに促進せし
め、そしてこれらの単離体の直接的な継代を可能にし
た。ＴＷＡＲ単離体のそれぞれは、封入体の直接的なＦ
Ａ染色によって一次ＨｅＬａ２２９細胞培養継代中に同
定された。
【００６３】Ｃ．血清学的技法 正常な３％卵黄のうホモジネートと混合された（スライ
ド上に抗原の局在化及び付着を助けるために）ＴＷＡＲ
抗原を、顕微鏡のスライド上に点在せしめ、空気乾燥せ
しめ、アセトンにより１５分間、固定し、そして空気乾
燥せしめた。連続した２倍希釈の血清又は体液（たとえ
ば涙）を、抗原上に適用し、そして、３０℃で３０分
間、湿潤室でインキュベートした。このアッセイ内で、
その流体は、クラミジア基本小体抗原と反応された。
ド上に抗原の局在化及び付着を助けるために）ＴＷＡＲ
抗原を、顕微鏡のスライド上に点在せしめ、空気乾燥せ
しめ、アセトンにより１５分間、固定し、そして空気乾
燥せしめた。連続した２倍希釈の血清又は体液（たとえ
ば涙）を、抗原上に適用し、そして、３０℃で３０分
間、湿潤室でインキュベートした。このアッセイ内で、
その流体は、クラミジア基本小体抗原と反応された。
【００６４】反応の後、そのスライドをＰＢＳにより５
度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接
合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして３７℃
で３０分間、湿潤室でインキュベートせしめた。インキ
ュベートの後、スライドを蒸留水により５度洗浄し、そ
して空気乾燥せしめた。ＦＡ封入流体の一滴を添加し、
そしてカバースリップをそのスライド上に置いた。その
反応をＦＡ−顕微鏡下で観察した。封入体の染色のため
には、感染されたＨｅＬａ細胞を無水メタノール中にお
いて１０分間固定し、そしてＴＷＡＲ−特異性抗体活性
についてアッセイした。第２表は、世界の７つの異なっ
た領域からの成人の血清中に存在する、高い頻度のＴＷ
ＡＲ抗体を示す。さらに、抗体は、女性よりも男性にお
いてより頻繁に存在することが見出された。
度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接
合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして３７℃
で３０分間、湿潤室でインキュベートせしめた。インキ
ュベートの後、スライドを蒸留水により５度洗浄し、そ
して空気乾燥せしめた。ＦＡ封入流体の一滴を添加し、
そしてカバースリップをそのスライド上に置いた。その
反応をＦＡ−顕微鏡下で観察した。封入体の染色のため
には、感染されたＨｅＬａ細胞を無水メタノール中にお
いて１０分間固定し、そしてＴＷＡＲ−特異性抗体活性
についてアッセイした。第２表は、世界の７つの異なっ
た領域からの成人の血清中に存在する、高い頻度のＴＷ
ＡＲ抗体を示す。さらに、抗体は、女性よりも男性にお
いてより頻繁に存在することが見出された。
【００６５】
【表２】
【００６６】例 ８． ＴＷＡＲのＤＮＡの特徴化を通して、この例は、そのＴ
ＷＡＲ生物体が、Ｃ．トラコマチス及びＣ．プシタシと
異なることを示す。 Ａ．クラミジア株：研究されたクラミジア株は、 （１）ＴＷＡＲ：ＴＷ−１８３，ＡＲ−３９，ＡＲ−２
３１，ＡＲ−２７７，ＡＲ−３８８，ＡＲ−４２７，Ａ
Ｒ−４５８及びＬＲ−６５（２，３）； （２）Ｃ．プシタシ：６ＢＣ、骨髄肺炎（Ｍｎ）、ネコ
肺炎（ＦＰ）、テンジクネズミ封入体結膜炎（ＧＰＩ
Ｃ）及び羊流産（ＯＡ）、及び （３）Ｃ．トラコマチス：Ｂ／ＴＷ−５／ＯＴ，Ｄ／Ｕ
Ｗ−３／Ｃｘ及びＬ２／４３４／Ｂｕを含んだ。すべて
のＴＷＡＲ株は、１９８５年シアトルから得られた咽頭
単離体であった。但し、ＴＷ−１８３（これは、１９６
５年タイワンの子供の結膜炎から単離された）を除く。
すべてのクラミジア株は、ＨｅＬａ２２９細胞培養物中
での増殖に適合され、そしてRenografinの直線グラジェ
ントを通して精製された。
ＷＡＲ生物体が、Ｃ．トラコマチス及びＣ．プシタシと
異なることを示す。 Ａ．クラミジア株：研究されたクラミジア株は、 （１）ＴＷＡＲ：ＴＷ−１８３，ＡＲ−３９，ＡＲ−２
３１，ＡＲ−２７７，ＡＲ−３８８，ＡＲ−４２７，Ａ
Ｒ−４５８及びＬＲ−６５（２，３）； （２）Ｃ．プシタシ：６ＢＣ、骨髄肺炎（Ｍｎ）、ネコ
肺炎（ＦＰ）、テンジクネズミ封入体結膜炎（ＧＰＩ
Ｃ）及び羊流産（ＯＡ）、及び （３）Ｃ．トラコマチス：Ｂ／ＴＷ−５／ＯＴ，Ｄ／Ｕ
Ｗ−３／Ｃｘ及びＬ２／４３４／Ｂｕを含んだ。すべて
のＴＷＡＲ株は、１９８５年シアトルから得られた咽頭
単離体であった。但し、ＴＷ−１８３（これは、１９６
５年タイワンの子供の結膜炎から単離された）を除く。
すべてのクラミジア株は、ＨｅＬａ２２９細胞培養物中
での増殖に適合され、そしてRenografinの直線グラジェ
ントを通して精製された。
【００６７】Ｂ．クラミジアＤＮＡの単離：クラミジア
のＤＮＡを、Ｃ．トラコマチスのために前に記載したよ
うにして単離した（Stephensなど., Infect. Immun.
４７：７１３〜７１８，１９８５）。基本的には、精製
された基本体を、３７℃で１時間、プロテイナーゼＫ
（６４μｇ／ml) により処理し、そして１％ＳＤＳ中に
溶解した。フェノールによる抽出の後、水性層を３７℃
で３０分間、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ml) により処理
し、フェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエ
タノールにより沈澱せしめた。
のＤＮＡを、Ｃ．トラコマチスのために前に記載したよ
うにして単離した（Stephensなど., Infect. Immun.
４７：７１３〜７１８，１９８５）。基本的には、精製
された基本体を、３７℃で１時間、プロテイナーゼＫ
（６４μｇ／ml) により処理し、そして１％ＳＤＳ中に
溶解した。フェノールによる抽出の後、水性層を３７℃
で３０分間、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ml) により処理
し、フェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエ
タノールにより沈澱せしめた。
【００６８】Ｃ. プラスミドのスクリーニング：試験さ
れた８種のＴＷＡＲ単離体は、アガロースゲル電気泳動
によって決定される場合、それぞれ７．３及び６．２Kb
p のプラスミドを含む、Ｃ．トラコマチス及びＣ．プシ
タシ対照と比べて、明確なプラスミドＤＮＡを含まなか
った（Weiss など., Infect. Immum. ２：２４４〜２
４８，１９７０）。
れた８種のＴＷＡＲ単離体は、アガロースゲル電気泳動
によって決定される場合、それぞれ７．３及び６．２Kb
p のプラスミドを含む、Ｃ．トラコマチス及びＣ．プシ
タシ対照と比べて、明確なプラスミドＤＮＡを含まなか
った（Weiss など., Infect. Immum. ２：２４４〜２
４８，１９７０）。
【００６９】Ｄ．制限エンドヌクレアーゼ分析及びハイ
ブリダイゼーション：使用される制限酵素は、ＢａｍＨ
Ｉ，ＢｓｔＥII, ＤｐｎＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII,
ＭｂｏＩ, ＭｓｐＩ，ＰｓｔＩ，Ｓａｎ３Ａ、及びＳ
ｓｔＩであった。すべての技法は、高い緊縮条件下で行
われたハイブリダイゼーションによる標準法によって行
われた（Kingsburg, J. Bacteriol. ９８：１４００〜
１４０１，１９６９）。制限エンドヌクレアーゼ分析
は、お互い及び２種のクラミジアの株とＴＷＡＲ単離体
との比較のために使用された。使用されるそれぞれの制
限酵素により、ＴＷＡＲ単離体は、トラホーム及びＣ．
トラコマチスのＬＧＶバイオバーから容易に識別され、
そして５種の異なるＣ．プシタシの株が試験された。こ
の方法の分析の範囲によれば、ＴＷＡＲ単離体の結合パ
ターンが、使用される酵素のうち８種と同一であった。
ブリダイゼーション：使用される制限酵素は、ＢａｍＨ
Ｉ，ＢｓｔＥII, ＤｐｎＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII,
ＭｂｏＩ, ＭｓｐＩ，ＰｓｔＩ，Ｓａｎ３Ａ、及びＳ
ｓｔＩであった。すべての技法は、高い緊縮条件下で行
われたハイブリダイゼーションによる標準法によって行
われた（Kingsburg, J. Bacteriol. ９８：１４００〜
１４０１，１９６９）。制限エンドヌクレアーゼ分析
は、お互い及び２種のクラミジアの株とＴＷＡＲ単離体
との比較のために使用された。使用されるそれぞれの制
限酵素により、ＴＷＡＲ単離体は、トラホーム及びＣ．
トラコマチスのＬＧＶバイオバーから容易に識別され、
そして５種の異なるＣ．プシタシの株が試験された。こ
の方法の分析の範囲によれば、ＴＷＡＲ単離体の結合パ
ターンが、使用される酵素のうち８種と同一であった。
【００７０】Ｅ．サザン ハイブリダイゼーション：Ｔ
ＷＡＲ単離体の間の関係及び他のクラミジアとの関係を
さらに調査するために、約５００bp, ９００bp，１２０
０bp，３２００bp及び３８００bpのサイズの５種のラン
ダムなＴＷＡＲのＤＮＡフラグメントを、ＡＲ−３９の
ＤＮＡの遺伝子バンクから精製し、そして染色体消化物
をプローブするために使用した。図２に示されるよう
に、３. ８kbp(図２のＡ）のＴＷＡＲフラグメント又は
３．２kbp(図２のＢ）のフラグメントが、それぞれＭｓ
ｐＩ又はＨｉｎｄIII により消化されたクラミジアＤＮ
Ａのプローブとして使用される場合、それぞれの場合に
おいてハイブリダイズするフラグメントは、すべてのＴ
ＷＡＲ単離体のために同じであった。さらに、反応性は
試験されたＣ．トラコマチス又はＣ．プシタシに関して
観察されなかったが、両プローブはＴＷＡＲ特異性であ
った。同じ結果が他の３種のプローブに関して得られ
た。
ＷＡＲ単離体の間の関係及び他のクラミジアとの関係を
さらに調査するために、約５００bp, ９００bp，１２０
０bp，３２００bp及び３８００bpのサイズの５種のラン
ダムなＴＷＡＲのＤＮＡフラグメントを、ＡＲ−３９の
ＤＮＡの遺伝子バンクから精製し、そして染色体消化物
をプローブするために使用した。図２に示されるよう
に、３. ８kbp(図２のＡ）のＴＷＡＲフラグメント又は
３．２kbp(図２のＢ）のフラグメントが、それぞれＭｓ
ｐＩ又はＨｉｎｄIII により消化されたクラミジアＤＮ
Ａのプローブとして使用される場合、それぞれの場合に
おいてハイブリダイズするフラグメントは、すべてのＴ
ＷＡＲ単離体のために同じであった。さらに、反応性は
試験されたＣ．トラコマチス又はＣ．プシタシに関して
観察されなかったが、両プローブはＴＷＡＲ特異性であ
った。同じ結果が他の３種のプローブに関して得られ
た。
【００７１】Ｆ．プローブとして完全な染色体ＤＮＡを
用いるドットブロットハイブリダイゼーションを用いて
のＤＮＡ相同体の研究：Ｃ．トラコマチス及びＣ．プシ
タシに対するＴＷＡＲの関係を決定するために、ドット
ブロット分析が、プローブとして完全な染色体ＤＮＡを
用いて行われた。簡単に言えば、精製されたＥＢのＤＮ
Ａ０．２〜５μｇを、０．３ＭのＮａＣｌ中で１０分間
煮沸した。続いて、２．０Ｍの酢酸アンモニウムを添加
し、１００μｌの最終体積にした。サンプルを、Bio-Do
t Microfiltration 装置（Bio-Kad, Richmond, Calif.)
の使用によってニトロセルロース（Trans-Blot, Bio-Ka
d, Richmond, Calif.)に適用した。
用いるドットブロットハイブリダイゼーションを用いて
のＤＮＡ相同体の研究：Ｃ．トラコマチス及びＣ．プシ
タシに対するＴＷＡＲの関係を決定するために、ドット
ブロット分析が、プローブとして完全な染色体ＤＮＡを
用いて行われた。簡単に言えば、精製されたＥＢのＤＮ
Ａ０．２〜５μｇを、０．３ＭのＮａＣｌ中で１０分間
煮沸した。続いて、２．０Ｍの酢酸アンモニウムを添加
し、１００μｌの最終体積にした。サンプルを、Bio-Do
t Microfiltration 装置（Bio-Kad, Richmond, Calif.)
の使用によってニトロセルロース（Trans-Blot, Bio-Ka
d, Richmond, Calif.)に適用した。
【００７２】濾過の前、そのニトロセルロースを、１Ｍ
の酢酸アンモニウム中で洗浄し、ＤＮＡ付着を高めた。
そのニトロセルロースを、前に記載したようにプレハイ
ブリダイズする前及び後で、８０℃で２時間、ベークし
た。ニック−トランスレートされた完全な染色体クラミ
ジアＤＮＡを、煮沸し、そして続いて急速な冷却によっ
て変性し、そしてこれらのハイブリダイゼーション実験
においてプローブとして使用した。相同性％を大まかに
定量化するために、前記ニトロセルロースを、シンチレ
ーション計数のために、Omnifluor (Dnpont, Boston, M
ass.) 中に懸濁された個々のドットに切断した。
の酢酸アンモニウム中で洗浄し、ＤＮＡ付着を高めた。
そのニトロセルロースを、前に記載したようにプレハイ
ブリダイズする前及び後で、８０℃で２時間、ベークし
た。ニック−トランスレートされた完全な染色体クラミ
ジアＤＮＡを、煮沸し、そして続いて急速な冷却によっ
て変性し、そしてこれらのハイブリダイゼーション実験
においてプローブとして使用した。相同性％を大まかに
定量化するために、前記ニトロセルロースを、シンチレ
ーション計数のために、Omnifluor (Dnpont, Boston, M
ass.) 中に懸濁された個々のドットに切断した。
【００７３】すべての実験において、ほとんどのクラミ
ジアＤＮＡ調整物は少量のＨｅＬａのＤＮＡ汚染物を含
むけれどもＨｅＬａのＤＮＡを対照としてスポット化し
た。ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９，Ｃ．トラコマチスセロバー
Ｄ及びＣ．プシタシ株６ＢＣ，ＦＰ, ＯＡ及びＭｎの完
全な染色体ＤＮＡをニック−トランスレートし、そして
種々の単離物の変性された染色体ＤＮＡを含むドットブ
ロットのプローブとして使用した。図３に示されるよう
に、２種のＣ．トラコマチスバイオバーも５種のＣ．プ
シタシ株のいづれも、ＡＲ−３９プローブに対して有意
な相同性を示さなかった。他方、すべてのＴＷＡＲ単離
体は、強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。
ＴＷ−１８３がプローブとして使用される場合、類似す
る結果が得られた。相反する実験がＣ．トラコマチス又
はＣ．プシタシのＤＮＡをプローブとして使用して行わ
れる場合、バックグラウンド上の反応性が、いづれかの
ＴＷＡＲ単離体により示された（データは示されていな
い）。
ジアＤＮＡ調整物は少量のＨｅＬａのＤＮＡ汚染物を含
むけれどもＨｅＬａのＤＮＡを対照としてスポット化し
た。ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９，Ｃ．トラコマチスセロバー
Ｄ及びＣ．プシタシ株６ＢＣ，ＦＰ, ＯＡ及びＭｎの完
全な染色体ＤＮＡをニック−トランスレートし、そして
種々の単離物の変性された染色体ＤＮＡを含むドットブ
ロットのプローブとして使用した。図３に示されるよう
に、２種のＣ．トラコマチスバイオバーも５種のＣ．プ
シタシ株のいづれも、ＡＲ−３９プローブに対して有意
な相同性を示さなかった。他方、すべてのＴＷＡＲ単離
体は、強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。
ＴＷ−１８３がプローブとして使用される場合、類似す
る結果が得られた。相反する実験がＣ．トラコマチス又
はＣ．プシタシのＤＮＡをプローブとして使用して行わ
れる場合、バックグラウンド上の反応性が、いづれかの
ＴＷＡＲ単離体により示された（データは示されていな
い）。
【００７４】例 ９．ＴＷＡＲ−特異性プローブを使用
するアッセイ 上記及び図３及び図４に示されるように、クローンさ
れ、精製されたＴＷＡＲフラグメントが、ＴＷＡＲ、
Ｃ．プシタシ及びＣ．トラコマチスの分解された基本小
体のドットブロットにおいてプローブとして使用される
場合、試験された３種のフラグメント（９００bp，１２
００bp及び３２００bp）は、ＴＷＡＲとのみ反応した。
上記に示されるように、ＤＮＡプローブの感受性は、
（ａ）一本鎖のプローブの使用；及び（ｂ）リボソーム
ｒＲＮＡ遺伝子の単離を通して改良され得る。
するアッセイ 上記及び図３及び図４に示されるように、クローンさ
れ、精製されたＴＷＡＲフラグメントが、ＴＷＡＲ、
Ｃ．プシタシ及びＣ．トラコマチスの分解された基本小
体のドットブロットにおいてプローブとして使用される
場合、試験された３種のフラグメント（９００bp，１２
００bp及び３２００bp）は、ＴＷＡＲとのみ反応した。
上記に示されるように、ＤＮＡプローブの感受性は、
（ａ）一本鎖のプローブの使用；及び（ｂ）リボソーム
ｒＲＮＡ遺伝子の単離を通して改良され得る。
【００７５】一本鎖のプローブの改良 二本鎖ＤＮＡプローブは、プローブの再アニーリングに
より効率的にハイブリダイズしないので、ハイブリダイ
ゼーションのために利用できるプローブの濃度は低めら
れる。従って、ハイブリダイゼーションにおいて一本鎖
のプローブを用いることによってプローブの感受性を高
めることができる。この方法の主な制限は、十分に高い
比活性へのその一本鎖のラベリングである。この問題
は、ＤＮＡプローブの一本鎖挿入体を含む二本鎖ベクタ
ーをもたらす条件を用いることによって避けられ得る
（Arrand, Nuclcic Acid Hybridization：A Practical
Approach中の“Preparation of Nucleic Acid Probes,
”１７〜４５ページ、Oxford,Press, Oxford, Englan
d, １９８５）。
より効率的にハイブリダイズしないので、ハイブリダイ
ゼーションのために利用できるプローブの濃度は低めら
れる。従って、ハイブリダイゼーションにおいて一本鎖
のプローブを用いることによってプローブの感受性を高
めることができる。この方法の主な制限は、十分に高い
比活性へのその一本鎖のラベリングである。この問題
は、ＤＮＡプローブの一本鎖挿入体を含む二本鎖ベクタ
ーをもたらす条件を用いることによって避けられ得る
（Arrand, Nuclcic Acid Hybridization：A Practical
Approach中の“Preparation of Nucleic Acid Probes,
”１７〜４５ページ、Oxford,Press, Oxford, Englan
d, １９８５）。
【００７６】ｐＵＣベクターにおけるＴＷＡＲ遺伝子バ
ンクの初期構造は、一本鎖のバクテリオファージＭ１３
mp１８の複製型（ＲＦ）へのサブクローニングを促進す
る。なぜならば、これらのベクターは、同じｌａｃＺ′
／複数クローニング部位を共有するからである。Ｍ１３
“偶数の”ファージベクター（たとえば、Ｍ１３mp１
８）が、ｐＢＢ３２２由来の配列（前記）にハイブリダ
イズするであろうラベルされたプローブの産生を妨げる
ために、奇数シリーズ（たとえば、Ｍ１３mp１８）の代
わりに使用するために推薦される。この一本鎖ＤＮＡプ
ローブは、Ｈｕ及びMessing(Gene１７：２７１〜２７
７，１９８３）の方法によって調製され得る。このプロ
ーブを放射性ラベルするために、市販されている一般の
プローブプライマーを使用することができる。
ンクの初期構造は、一本鎖のバクテリオファージＭ１３
mp１８の複製型（ＲＦ）へのサブクローニングを促進す
る。なぜならば、これらのベクターは、同じｌａｃＺ′
／複数クローニング部位を共有するからである。Ｍ１３
“偶数の”ファージベクター（たとえば、Ｍ１３mp１
８）が、ｐＢＢ３２２由来の配列（前記）にハイブリダ
イズするであろうラベルされたプローブの産生を妨げる
ために、奇数シリーズ（たとえば、Ｍ１３mp１８）の代
わりに使用するために推薦される。この一本鎖ＤＮＡプ
ローブは、Ｈｕ及びMessing(Gene１７：２７１〜２７
７，１９８３）の方法によって調製され得る。このプロ
ーブを放射性ラベルするために、市販されている一般の
プローブプライマーを使用することができる。
【００７７】このプライマーは、ベクターＤＮＡの合成
を指図し、そして制限された濃度の放射性前駆体の存在
下において、そのプライマー付加部分は、一本鎖ＤＮＡ
プローブ挿入体を含む二本鎖ベクター（Ｍ１３）をもた
らす。Ｍ１３mpバクテリオファージのＲＦ型の単離、Ｍ
１３中へのｐＵＣサブクローニングのための組換え体の
サブクローニング及びＭ１３配列の選択的合成（及びラ
ベリング）のためのすべての方法は、Messing(Meth. En
zymol. １０１：２０〜７９，１９８３）によって記載
されているようにして、標準方法によって行われ得る。
このプローブがサザンハイブリダイゼーションに使用さ
れる場合、それはハイブリダイゼーションの前、変性さ
れない。
を指図し、そして制限された濃度の放射性前駆体の存在
下において、そのプライマー付加部分は、一本鎖ＤＮＡ
プローブ挿入体を含む二本鎖ベクター（Ｍ１３）をもた
らす。Ｍ１３mpバクテリオファージのＲＦ型の単離、Ｍ
１３中へのｐＵＣサブクローニングのための組換え体の
サブクローニング及びＭ１３配列の選択的合成（及びラ
ベリング）のためのすべての方法は、Messing(Meth. En
zymol. １０１：２０〜７９，１９８３）によって記載
されているようにして、標準方法によって行われ得る。
このプローブがサザンハイブリダイゼーションに使用さ
れる場合、それはハイブリダイゼーションの前、変性さ
れない。
【００７８】リボソームＲＮＡ遺伝子の単離。 ＤＮＡプローブの感受性を高めるためのもう１つの方法
は、複数コピー配列を認識するＤＮＡプローブを使用す
ることである。リボソームＲＮＡに対して特異的なクロ
ーン化されたＤＮＡの使用は、細胞当りの目標分子（リ
ボソーム）の多くの数によって、１０００倍まで検出を
高めるための手段として記録されている（Edelstein,
J. Clin. Microbiol. ２２：４２５〜４２７，１９８
６；Kingsbury, Rapid Detection and Identification
of Infections Agents, ９１〜９５ページ、Academic P
ress, N.Y., １９８５；Palmer及びFalkow, Microbiolo
gy１９８６，９１〜９５ページ、American Society for
Microbiology, Washington, D.C.,１９８６）。１つの
そのような方法が下記に説明される。
は、複数コピー配列を認識するＤＮＡプローブを使用す
ることである。リボソームＲＮＡに対して特異的なクロ
ーン化されたＤＮＡの使用は、細胞当りの目標分子（リ
ボソーム）の多くの数によって、１０００倍まで検出を
高めるための手段として記録されている（Edelstein,
J. Clin. Microbiol. ２２：４２５〜４２７，１９８
６；Kingsbury, Rapid Detection and Identification
of Infections Agents, ９１〜９５ページ、Academic P
ress, N.Y., １９８５；Palmer及びFalkow, Microbiolo
gy１９８６，９１〜９５ページ、American Society for
Microbiology, Washington, D.C.,１９８６）。１つの
そのような方法が下記に説明される。
【００７９】合計のＲＡＮが１６ｓのｒＲＮＡの単離の
ために、最適な時間での後接種の決定のために感染せし
めた後、種々の時間でＴＷＡＲ培養物から単離される。
ｒＲＮＡは、Kirby (Kirk など., Bioch. J.１０４：２
５８〜２６２，１９６７；JOhnson, Method in Microbi
olgy １８；３３〜７７，１９８６）の変法によって単
離され得る。この方法は、ＤＮＡ，ｍＲＮＡを実質的に
含まないが、しかしひじょうに少量のｔＲＮＡを含む細
菌性ｒＲＮＡの単離をもたらす（Johnson 、前記) 。Ｒ
Ｎａｓｅを含まない緩衝液を得るために、ジエチルピロ
カーボネート（０．２％）を、１時間水溶液に添加し、
そして続いてオートクレーブ処理する。ガラス器具は、
乾燥加熱オーブン中で焼くことによって、ＲＮａｓｅを
含まないようにされ得る。
ために、最適な時間での後接種の決定のために感染せし
めた後、種々の時間でＴＷＡＲ培養物から単離される。
ｒＲＮＡは、Kirby (Kirk など., Bioch. J.１０４：２
５８〜２６２，１９６７；JOhnson, Method in Microbi
olgy １８；３３〜７７，１９８６）の変法によって単
離され得る。この方法は、ＤＮＡ，ｍＲＮＡを実質的に
含まないが、しかしひじょうに少量のｔＲＮＡを含む細
菌性ｒＲＮＡの単離をもたらす（Johnson 、前記) 。Ｒ
Ｎａｓｅを含まない緩衝液を得るために、ジエチルピロ
カーボネート（０．２％）を、１時間水溶液に添加し、
そして続いてオートクレーブ処理する。ガラス器具は、
乾燥加熱オーブン中で焼くことによって、ＲＮａｓｅを
含まないようにされ得る。
【００８０】精製された粒子を、遠心分離により収穫
し、ｄＨ2 Ｏ中に懸濁し、そして１０％ナフタレンジス
ルホーネート及び７５Ｏｅｌのジエチルピロカーボネー
トを添加する。フレンチプレスによって細胞をフェノー
ル−クレゾール及び０．５％ナフタレンジスルホネート
の混合物中に通すことによって、細胞を分解する。振っ
た後、その混合物を、１７，０００×Ｇで１０分間、遠
心分離し、そして水性層を取り出す。２０×ＳＳＣ１０
mlを添加し、そしてＳＤＳを添加し、０．１％の最終濃
度にし、続いてもう１つのフェノール−クレゾール抽出
を行う。ＲＮＡを、２体積のエタノールの添加により沈
澱せしめ、そして遠心分離によりペレット化する。残留
ＤＮＡ，ｍＲＮＡ及びｔＲＮＡをさらに抽出するため
に、３Ｍの冷酢酸ナトリウムを添加し、その混合物を均
質化し、遠心分離にかけ、そして再沈澱せしめる。
し、ｄＨ2 Ｏ中に懸濁し、そして１０％ナフタレンジス
ルホーネート及び７５Ｏｅｌのジエチルピロカーボネー
トを添加する。フレンチプレスによって細胞をフェノー
ル−クレゾール及び０．５％ナフタレンジスルホネート
の混合物中に通すことによって、細胞を分解する。振っ
た後、その混合物を、１７，０００×Ｇで１０分間、遠
心分離し、そして水性層を取り出す。２０×ＳＳＣ１０
mlを添加し、そしてＳＤＳを添加し、０．１％の最終濃
度にし、続いてもう１つのフェノール−クレゾール抽出
を行う。ＲＮＡを、２体積のエタノールの添加により沈
澱せしめ、そして遠心分離によりペレット化する。残留
ＤＮＡ，ｍＲＮＡ及びｔＲＮＡをさらに抽出するため
に、３Ｍの冷酢酸ナトリウムを添加し、その混合物を均
質化し、遠心分離にかけ、そして再沈澱せしめる。
【００８１】５ｓ，１６ｓ及び２３ｓのリボソームＫＮ
Ａが、Grierson(Gel Electrophoresis of Niucleic Aci
ds, １〜１３９ページ、IRL Press, Oxford,１９８２）
によって記載されているように、１．５％アガロースゲ
ルから電気溶離により精製される。５０mMのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ中で加熱することによって、ＲＮＡを軽いアルカ
リ加水分解にゆだね、そしてインキュベートの時間及び
温度はＲＮＡ種に依存して異なる(Maizels, Cell ９：
４３１〜４３８，１９７６）。
Ａが、Grierson(Gel Electrophoresis of Niucleic Aci
ds, １〜１３９ページ、IRL Press, Oxford,１９８２）
によって記載されているように、１．５％アガロースゲ
ルから電気溶離により精製される。５０mMのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ中で加熱することによって、ＲＮＡを軽いアルカ
リ加水分解にゆだね、そしてインキュベートの時間及び
温度はＲＮＡ種に依存して異なる(Maizels, Cell ９：
４３１〜４３８，１９７６）。
【００８２】この加水分解段階は、ポリヌクレオチドキ
ナーゼのための基質として５′ヒドロキシル基を利用す
るためにそれらの基を開放する。ｒＲＮＡは、標準方法
（Maniatis, 前記) によって、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによる32P ＡＴＰにより末端をラベル化される。
おのおのの種は、種々の制限ｒＲＮＡ遺伝子により調整
されたＴＷＡＲのサザンハイブリダイゼーションのプロ
ーブとして使用され得る。
ナーゼのための基質として５′ヒドロキシル基を利用す
るためにそれらの基を開放する。ｒＲＮＡは、標準方法
（Maniatis, 前記) によって、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによる32P ＡＴＰにより末端をラベル化される。
おのおのの種は、種々の制限ｒＲＮＡ遺伝子により調整
されたＴＷＡＲのサザンハイブリダイゼーションのプロ
ーブとして使用され得る。
【００８３】なぜならばほとんどの細菌種は、ｒＲＮＡ
配列の複数の遺伝子コピーを含むからである。クローン
化されたＴＷＡＲのｒＲＮＡ遺伝子を、ＴＷＡＲ検出に
おけるそれらの感受性及びＣ．トラコマチス及びＣ．プ
シタシとのそれらの反応性のために試験する。サザンハ
イブリダイゼーションデーターに依存して、完全な遺伝
子を含むと思われるいづれかの制限フラグメントがアガ
ロースゲルから電気溶離され、そして同様にして消化さ
れたｐＵＣ１８中にクローン化され、又は前に構成され
た遺伝子バンクがプローブとして異なったｒＲＮＡ種を
用いてスクリーンされる。
配列の複数の遺伝子コピーを含むからである。クローン
化されたＴＷＡＲのｒＲＮＡ遺伝子を、ＴＷＡＲ検出に
おけるそれらの感受性及びＣ．トラコマチス及びＣ．プ
シタシとのそれらの反応性のために試験する。サザンハ
イブリダイゼーションデーターに依存して、完全な遺伝
子を含むと思われるいづれかの制限フラグメントがアガ
ロースゲルから電気溶離され、そして同様にして消化さ
れたｐＵＣ１８中にクローン化され、又は前に構成され
た遺伝子バンクがプローブとして異なったｒＲＮＡ種を
用いてスクリーンされる。
【００８４】ＴＷＡＲの１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む
フラグメントサイズに依存して、その遺伝子は、両方向
におけるＤＮＡ配列決定のために、Ｍ１３mp１８及びＭ
１３mp１９中に直接的にサブクローンされるか、又は小
さなフラグメントに消化され、そしてそれらにサブクロ
ーンされる。すべてのＤＮＡ配列決定は、ＢＲＬからの
市販されているキットを用いて、標準方法によるジデオ
キシヌクレオチド鎖ターミネーター法（Sangerなど., P
roc. Nacl. Acad. Sci. ７４：５４６３〜５４６７，
１９７７）によって行われ得る。クローン化されたＴＷ
ＡＲのｒＲＮＡ遺伝子は、ＴＷＡＲ検出におけるそれら
の感受性及びＣ．トラコマチス及びＣ．プシタシとのそ
れらの反応性について試験され得る。本発明の特定の態
様が例示する目的のためにここで記載されたけれども、
種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得る。
フラグメントサイズに依存して、その遺伝子は、両方向
におけるＤＮＡ配列決定のために、Ｍ１３mp１８及びＭ
１３mp１９中に直接的にサブクローンされるか、又は小
さなフラグメントに消化され、そしてそれらにサブクロ
ーンされる。すべてのＤＮＡ配列決定は、ＢＲＬからの
市販されているキットを用いて、標準方法によるジデオ
キシヌクレオチド鎖ターミネーター法（Sangerなど., P
roc. Nacl. Acad. Sci. ７４：５４６３〜５４６７，
１９７７）によって行われ得る。クローン化されたＴＷ
ＡＲのｒＲＮＡ遺伝子は、ＴＷＡＲ検出におけるそれら
の感受性及びＣ．トラコマチス及びＣ．プシタシとのそ
れらの反応性について試験され得る。本発明の特定の態
様が例示する目的のためにここで記載されたけれども、
種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得る。
【図１】図１のＡは、Ｃ．プシタシの形態学的特徴のＴ
ＷＡＲ封入体を示す写真である。図１のＢは、Ｃ．トラ
コマチスの特徴的な空砲構造を示す写真である。
ＷＡＲ封入体を示す写真である。図１のＢは、Ｃ．トラ
コマチスの特徴的な空砲構造を示す写真である。
【図２】図２のＡは、ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９ＤＮＡの遺
伝子バンクから単離された３．８kbp のＰｓｔＩフラグ
メントによりプローブされた、ＭｓｐＩにより消化され
たＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのオートラジ
オグラフである。図２のＢは、ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９Ｄ
ＮＡの遺伝子バンクから単離された３．２kbp のＰｓｔ
Ｉフラグメントによりプローブされた、ＨｉｎｄIII に
より消化されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション
のオートラジオグラフである。
伝子バンクから単離された３．８kbp のＰｓｔＩフラグ
メントによりプローブされた、ＭｓｐＩにより消化され
たＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのオートラジ
オグラフである。図２のＢは、ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９Ｄ
ＮＡの遺伝子バンクから単離された３．２kbp のＰｓｔ
Ｉフラグメントによりプローブされた、ＨｉｎｄIII に
より消化されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション
のオートラジオグラフである。
【図３】図３は、ＴＷＡＲ単離体ＡＲ−３９からのニッ
クトランスレートされた完全な染色体ＤＮＡによりプロ
ーブされたＣ．トラコマチス，Ｃ．プシタシ及びＴＷＡ
Ｒからの変性されたＤＮＡの点のオートラジオグラフで
ある。
クトランスレートされた完全な染色体ＤＮＡによりプロ
ーブされたＣ．トラコマチス，Ｃ．プシタシ及びＴＷＡ
Ｒからの変性されたＤＮＡの点のオートラジオグラフで
ある。
【図４】図４は、ＰｓｔＩにより消化されたＴＷＡＲ
ＤＮＡから成る遺伝子バンクから単離され、そして精製
された３種のＴＷＡＲ−特異性ＤＮＡプローブによりプ
ローブされたＴＷＡＲ，Ｃ．プシタシ及びＣ．トラコマ
チスからの変性された完全な染色体ＤＮＡの点のオート
ラジオグラフである。
ＤＮＡから成る遺伝子バンクから単離され、そして精製
された３種のＴＷＡＲ−特異性ＤＮＡプローブによりプ
ローブされたＴＷＡＲ，Ｃ．プシタシ及びＣ．トラコマ
チスからの変性された完全な染色体ＤＮＡの点のオート
ラジオグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年５月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１のＡは、Ｃ．プシタシの形態学的特徴のＴ
ＷＡＲ封入体を示す写真であり、図１のＢは、Ｃ．トラ
コマチスの特徴的な空砲構造を示す写真であり、いずれ
も生物の形態を示す図面代用写真である。
ＷＡＲ封入体を示す写真であり、図１のＢは、Ｃ．トラ
コマチスの特徴的な空砲構造を示す写真であり、いずれ
も生物の形態を示す図面代用写真である。
【図２】図２は、ＴＷＡＲ単離体ＡＲ−３９からのニッ
クトランスレートされた完全な染色体ＤＮＡによりプロ
ーブされたＣ．トラコマチス，Ｃ．プシタシ及びＴＷＡ
Ｒからの変性されたＤＮＡの点のオートラジオグラフで
あり、図面代用写真である。
クトランスレートされた完全な染色体ＤＮＡによりプロ
ーブされたＣ．トラコマチス，Ｃ．プシタシ及びＴＷＡ
Ｒからの変性されたＤＮＡの点のオートラジオグラフで
あり、図面代用写真である。
【図３】図３のＡは、ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９ＤＮＡの遺
伝子バンクから単離された３．８kbp のＰｓｔＩフラグ
メントによりプローブされた、ＭｓｐＩにより消化され
たＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのオートラジ
オグラフである。図３のＢは、ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９Ｄ
ＮＡの遺伝子バンクから単離された３．２kbp のＰｓｔ
Ｉフラグメントによりプローブされた、ＨｉｎｄIII に
より消化されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション
のオートラジオグラフであり、電気泳動の結果を示す図
面代用写真である。
伝子バンクから単離された３．８kbp のＰｓｔＩフラグ
メントによりプローブされた、ＭｓｐＩにより消化され
たＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのオートラジ
オグラフである。図３のＢは、ＴＷＡＲ株ＡＲ−３９Ｄ
ＮＡの遺伝子バンクから単離された３．２kbp のＰｓｔ
Ｉフラグメントによりプローブされた、ＨｉｎｄIII に
より消化されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション
のオートラジオグラフであり、電気泳動の結果を示す図
面代用写真である。
【図４】図４は、ＰｓｔＩにより消化されたＴＷＡＲ
ＤＮＡから成る遺伝子バンクから単離され、そして精製
された３種のＴＷＡＲ−特異性ＤＮＡプローブによりプ
ローブされたＴＷＡＲ，Ｃ．プシタシ及びＣ．トラコマ
チスからの変性された完全な染色体ＤＮＡの点のオート
ラジオグラフであり、図面代用写真である。
ＤＮＡから成る遺伝子バンクから単離され、そして精製
された３種のＴＷＡＲ−特異性ＤＮＡプローブによりプ
ローブされたＴＷＡＲ，Ｃ．プシタシ及びＣ．トラコマ
チスからの変性された完全な染色体ＤＮＡの点のオート
ラジオグラフであり、図面代用写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 クオ，チョ−チョウ アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，エヌ．イー．，ツウェンティナイ ンス アベニュ−6531 (72)発明者 ワン，サン−ピン アメリカ合衆国，ワシントン 98052，レ ッドモンド，エヌ．イー．，ワンハンドレ ッドエイティセカンド アベニュ−2050 (72)発明者 キャンベル，リー，アン アメリカ合衆国，ワシントン 98155，シ アトル，エヌ．イー．，エイス アベニュ −17515
Claims (12)
- 【請求項１】 クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａ
ｃｈｏｍａｔｉｓ）又はクラミジア・プシタシ（Ｃ．ｐ
ｓｉｔｔａｃｉ）に対してではなく、クラミジア・プネ
ウモニアエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の抗原決定基
に対して結合するモノクローナル抗体を産生する連続細
胞系。 - 【請求項２】 前記ハイブリッド細胞系がＲＲ ４０２
として同定されるハイブリドーマクローンを含んで成る
請求項１に記載の細胞系。 - 【請求項３】 生物学的サンプル中においてクラミジア
・プネウモニアエに対する抗体の存在を決定するための
方法であって：反応混合物を形成するために、クラミジ
ア・プネウモニアエ又はクラミジア・プネウモニアエ−
特異的抗原と共に前記生物学的サンプルをインキュベー
トし；そしてクラミジア・プネウモニアエに対する抗体
の存在を決定するために前記反応混合物を分析すること
を含んで成る方法。 - 【請求項４】 前記分析段階が、抗体のためのラベルさ
れた特異的結合パートナーと反応混合物とを接触し、そ
してそのラベルを検出することを含んで成る請求項３に
記載の方法。 - 【請求項５】 Ｃ．トラコマチス又はＣ．プシタシに対
してではなく、クラミジア・プネウモニアエのＤＮＡ又
はｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズする単離されたオ
リゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項６】 前記ＤＮＡプローブが、クラミジア・プ
ネウモニアエに由来する完全な染色体ＤＮＡプロブ又は
ＤＮＡフラグメントプローブである請求項５に記載のオ
リゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項７】 検出可能マーカーによりラベルされる請
求項５に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項８】 生物学的サンプルにおいてクラミジア・
プネウモニアエの存在を検出するための方法であって：
サンプルに関連するＤＮＡを単離するクラミジア・プネ
ウモニアエを含むと思われる生物学的サンプルを処理
し；その単離されたＤＮＡを基質に添加し；Ｃ．トラコ
マチス又はＣ．プシタシのＤＮＡ配列の一部ではなく、
クラミジア・プネウモニアエのＤＮＡ配列の少なくとも
一部に特異的にハイブリダイズすることができるラベル
された単離ＤＮＡプローブと共に前記ＤＮＡ担持基質を
インキュベートし；前記基質からハイブリダイズされな
かったプローブを分離し；そして前記基質に結合される
ＤＮＡに関連するラベルの量を検出し、そしてそれから
クラミジア・プネウモニアエの存在又は不在かを決定す
ることを含んで成る方法。 - 【請求項９】 生物学的サンプルにおけるクラミジア・
プネウモニアエの存在を検出するための方法であって、 サンプルにＤＮＡを開放するクラミジア・プネウモニア
エを含むと思われる生物学的サンプルを処理し；Ｃ．ト
ラコマチス又はＣ．プシタシのＤＮＡ配列の一部ではな
く、クラミジア・プネウモニアエのＤＮＡ配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができる単
離されたオリゴヌクレオチド分子と共に前記処理された
サンプルのＤＮＡをインキュベートし；そしてＣ．トラ
コマチス又はＣ．プシタシのＤＮＡ配列の一部ではな
く、ＴＷＡＲ生物体のＤＮＡ配列の少なくとも一部に特
異的にハイブリダイズすることができる単離されたオリ
ゴヌクレオチド分子に関連するラベルを検出し、そして
それによって、サンプルにおけるクラミジア・プネウモ
ニアエの存在又は不在を決定することを含んで成る方
法。 - 【請求項１０】 前記単離されたオリゴヌクレオチド
が、Ｃ．トラコマチス又はＣ．プシタシには結合しない
が、約５００塩基対のクラミジア・プネウモニアエＤＮ
ＡのＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼフラグメントに特
異的にハイブリダイズする請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 生物学的サンプルにおけるクラミジア
・プネウモニアエの存在を検出するための方法であっ
て、 サンプルに細胞材料からの核酸を開放するクラミジア・
プネウモニアエを含むと思われる生物学的サンプルを処
理し；Ｃ．トラコマチス又はＣ．プシタシのｒＲＮＡに
対してではなく、クラミジア・プネウモニアエのｒＲＮ
Ａに対して特異的にハイブリダイズすることができる単
離されたオリゴヌクレオチド分子と共に前記処理された
サンプルをインキュベートし；そして前記単離されたオ
リゴヌクレオチド分子と前記単離されたｒＲＮＡとの間
でのいづれかのハイブリダイゼーションを検出し、それ
によって、サンプルにおけるＴＷＡＲ生物体の存在又は
不在を検出することを含んで成る方法。 - 【請求項１２】 単離されたＴＷＡＲ ｒＲＮＡ遺伝
子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US85838086A | 1986-05-01 | 1986-05-01 | |
| US858380 | 1986-05-01 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502959A Division JP2675564B2 (ja) | 1986-05-01 | 1987-05-01 | 急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10236626A Division JPH11123077A (ja) | 1986-05-01 | 1998-08-10 | 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09285288A true JPH09285288A (ja) | 1997-11-04 |
Family
ID=25328168
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502959A Expired - Fee Related JP2675564B2 (ja) | 1986-05-01 | 1987-05-01 | 急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
| JP8294439A Pending JPH09285288A (ja) | 1986-05-01 | 1996-10-16 | 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
| JP10236626A Pending JPH11123077A (ja) | 1986-05-01 | 1998-08-10 | 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502959A Expired - Fee Related JP2675564B2 (ja) | 1986-05-01 | 1987-05-01 | 急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10236626A Pending JPH11123077A (ja) | 1986-05-01 | 1998-08-10 | 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0577144A1 (ja) |
| JP (3) | JP2675564B2 (ja) |
| AT (1) | ATE104355T1 (ja) |
| CA (1) | CA1341065C (ja) |
| DE (1) | DE3789597T3 (ja) |
| ES (1) | ES2005569A6 (ja) |
| WO (1) | WO1987006617A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008541782A (ja) * | 2005-06-06 | 2008-11-27 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | テスト試料中のＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を決定するための、組成物、方法およびキット |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5424187A (en) * | 1991-06-14 | 1995-06-13 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Method of screening for arterial chlamydial granuloma |
| EP0784059B1 (en) | 1994-09-20 | 2009-02-11 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Polynucleotides encoding an antigenic polypeptide of chlamydia pneumoniae |
| US6210876B1 (en) | 1996-06-06 | 2001-04-03 | Abbott Laboratories | Nucleic acid primers and probes for detecting Chlamydia pneumoniae |
| ATE280183T1 (de) * | 1998-07-31 | 2004-11-15 | Asahi Chemical Ind | Anti-l7/l12-antikörper zum nachweis von bakterien |
| CA3142023A1 (en) * | 2019-05-28 | 2020-12-03 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for preserving dna methylation |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL71699A0 (en) * | 1983-05-02 | 1984-07-31 | Enzo Biochem Inc | Methods and kits for the analysis and detection of biological or genetic material |
| WO1985002685A1 (en) * | 1983-12-12 | 1985-06-20 | Meru, Inc. | Method and materials for the identification of lipopolysaccharide producing microorganisms |
| FI71768C (fi) * | 1984-02-17 | 1987-02-09 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
| GB8426468D0 (en) * | 1984-10-19 | 1984-11-28 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
-
1987
- 1987-05-01 DE DE3789597T patent/DE3789597T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-01 CA CA000536215A patent/CA1341065C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-01 WO PCT/US1987/001011 patent/WO1987006617A2/en active IP Right Grant
- 1987-05-01 JP JP62502959A patent/JP2675564B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-05-01 EP EP93110955A patent/EP0577144A1/en not_active Withdrawn
- 1987-05-01 EP EP87903197A patent/EP0264434B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-01 AT AT87903197T patent/ATE104355T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-05-04 ES ES8701325A patent/ES2005569A6/es not_active Expired
-
1996
- 1996-10-16 JP JP8294439A patent/JPH09285288A/ja active Pending
-
1998
- 1998-08-10 JP JP10236626A patent/JPH11123077A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008541782A (ja) * | 2005-06-06 | 2008-11-27 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | テスト試料中のＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を決定するための、組成物、方法およびキット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| WO1987006617A2 (en) | 1987-11-05 |
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| CA1341065C (en) | 2000-08-01 |
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