CN114113615A - 一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条及检测方法 - Google Patents

一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条及检测方法，所述免疫层析检测试纸条由试纸和抗原生物素探针两部分组成；所述试纸包括支撑底板、从测试端依次固定在支撑底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及手柄端的吸水纸；所述硝酸纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫采用吸附有胶体金标记的羊抗鼠IgG的玻璃纤维棉制成；所述检测线喷涂有链霉亲和素；所述质控线喷涂有兔抗羊IgG；所述抗原生物素探针为靶标物半抗原与载体蛋白偶联后形成的靶标物人工抗原，靶标物人工抗原再与生物素偶联获得抗原生物素探针。可广泛应用于单克隆抗体制备过程中小鼠血清、细胞上清或腹水等样品中的靶标物特异性抗体的检测。

Description

一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条及检测 方法
技术领域
本发明涉及一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条及检测方法，属于免疫学检测领域。
背景技术
免疫层析技术是一种以硝酸纤维素膜为载体，标记抗原或抗体作为示踪剂的一种层析检测技术。与传统的免疫分析方法相比，这项技术具有操作简单、快速、成本低、不需要熟练的技术人员或昂贵的设备等优点，已经广泛应用于医药、畜牧业、农业及食品安全等领域。
单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、少或无交叉反应等特性，已广泛应用于疾病的诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向制药的制备等。单克隆抗体在理论和实践上的应用，成为解决生物学、医学等诸多重大问题的重要手段。
但是单克隆抗体制备过程比较繁琐，特别是细胞融合过程中杂交瘤细胞的筛选。从融合开始，杂交瘤细胞需要经过4-5轮的筛选，现有技术多是通过ELISA方法检测其是否分泌特异性抗体，以及抗体的免疫学特性，工作量庞大，费时费力；而且通过ELISA方法筛选出来的抗体，灵敏度及亲和力参差不齐，能成功用于免疫层析试纸等快速检测产品的研发的概率较低。如果用免疫层析试纸进行单抗的筛选工作，则可以大大节省工作量，且筛选出的抗体灵敏度和亲和力更好，更适合免疫层析试纸等快速检测产品的研发。但筛选单克隆抗体有着多种多样的靶标，针对每个靶标建立一个免疫层析试纸进行筛选成本高不便于推广应用，因此急需一种通用的免疫层析试纸，来解决现在存在的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条及检测方法，可广泛应用于单克隆抗体制备过程中小鼠血清、细胞上清或腹水等样品中的靶标物特异性抗体的检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条，由试纸和抗原生物素探针两部分组成；所述试纸包括支撑底板、从测试端依次固定在支撑底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及手柄端的吸水纸；所述硝酸纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫采用吸附有胶体金标记的羊抗鼠IgG的玻璃纤维棉制成；所述检测线喷涂有链霉亲和素；所述质控线喷涂有兔抗羊IgG；所述抗原生物素探针为靶标物半抗原与载体蛋白偶联后形成的靶标物人工抗原，靶标物人工抗原再与生物素偶联获得抗原生物素探针。
所述载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
所述抗原生物素探针的制备方法为：
第一步，取3-6mg生物素加入0.1-0.5mL DMSO中充分溶解，得混合物1；
第二步，取3-6mg EDC加入0.5mL双蒸水中充分溶解，然后在室温搅拌下加入到混合物1的溶液中，反应30min，得混合物2；
第三步，将1-10mg靶标物人工抗原在搅拌状态下加入到混合物2的溶液中，室温反应2h后，PBS透析3d，获得抗原生物素探针。
所述的免疫层析检测试纸条的检测方法，包括以下步骤：
1)评价杂交瘤细胞分泌抗体效价
第一步，根据待测细胞板样品数目，取等量的加样孔，做好标记，分别加入5-500μg/mL的抗原生物素探针20μL/孔；
第二步，抽取细胞培养板中的细胞上清80μL/孔，分别加入第一步细胞检测板的对应孔中，混合均匀；
第三步，取出样品孔条平放于桌面上，分别插入如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，10min后观察读取结果，根据试纸条显色结果对细胞分泌抗体进行评价，筛选得到抗体阳性细胞孔；
2)评价杂交瘤细胞分泌抗体灵敏度
第一步，在不同的样品杯中分别加入靶标物抗原标准品溶液40μL/孔；
第二步，取步骤1)筛选所得抗体阳性细胞孔，用PBS稀释0-5倍后，抽取稀释后的细胞上清40μL/孔，分别加入第一步对应的样品孔中，混合均匀，反应1-3min；
第三步，向第二步样品孔中分别加入5-500μg/mL的抗原生物素探针20μL/孔；
第四步，将样品孔条平放于桌面上，插入如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，10min后观察读取结果；根据试纸条显色结果对抗体灵敏度进行评价，筛选得到灵敏度好的细胞转孔扩大培养。
所述抗体效价的结果判定方法为：在质控线处出现紫红色线，说明本试纸有效；仅在质控线处出现一条紫红色线，而检测线处不出现紫红色线，说明靶标物抗体为阴性；在质控线和检测线处出现两条紫红色线，说明靶标物抗体为阳性；
其中检测线显色强弱与抗体滴度高低在一定范围内成正比，检测线颜色越深抗体滴度越高。
评价抗体灵敏度的结果判定方法为：本检测方法基于竞争法原理，在质控线处出现紫红色线，说明本试纸有效；在质控线和检测线处出现两条紫红色线，说明样品孔中抗体与靶标物抗原不反应；若检测线颜色减弱或不出现紫红色线，说明样品孔中抗体与靶标物抗原反应；
在抗原标准品浓度固定时，检测线显色强度与抗体灵敏度成反比，检测线显色越弱则说明抗体灵敏度越好，选择检测线不显色的细胞转孔扩大培养。
评价抗体灵敏度时，采用抗体浓度固定、抗原标准品浓度系列稀释时，检测线显色强度与抗原浓度呈反比，检测线消失所需抗原量越少说明抗体灵敏度越好，选择灵敏度好的细胞转孔进行下一步操作。
所述的免疫层析检测试纸条在制备单克隆抗体过程中检测样品中靶标物抗体中的应用。
所述制备单克隆抗体过程中检测样品为小鼠血清、细胞上清或腹水。
检测原理：
本发明制备的免疫层析试纸由试纸搭配抗原生物素探针构成。试纸由支撑底板、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫5部分构成；样品垫由玻璃纤维棉经样品垫处理液浸泡干燥后制成；结合垫由玻璃纤维棉固定胶体金标记的羊抗鼠IgG制成；层析膜为硝酸纤维素膜，其上固定有亲和素形成的“检测线”印迹，兔抗羊IgG形成的“质控线”印迹，用以拦截金标的免疫复合物形成肉眼可见的信号；吸水垫由吸水纸板制成，主要吸收流过层析膜的待检样品溶液，为虹吸反应提供动力。将靶标物人工抗原与生物素偶联制备抗原生物素探针。
将抗原生物素探针加入待检测样品中混匀反应后，使用试纸检测。当样品中抗体为阴性时，金标羊抗鼠IgG不与抗原生物素探针反应，流经检测线时亲和素不能拦截金标羊抗鼠IgG，不显示条带，流经质控线时金标羊抗鼠IgG被固定的兔抗羊IgG拦截形成质控线，试纸显示1条紫红色条带；当样品中抗体为阳性时，待检测抗体与抗原生物素探针反应形成抗原抗体复合物，随着虹吸作用流经金标垫时与金标羊抗鼠IgG形成金标羊抗鼠IgG-抗体-抗原生物素复合物，流经检测线时被亲和素拦截，显示紫红色条带，多余的金标羊抗鼠IgG流经质控线被固定的兔抗羊IgG拦截形成质控线，试纸显示2条紫红色条带(图1)。其中检测线显色强度与样品中抗体浓度呈正比，可以对抗体水平进行评价。当评价抗体灵敏度时，加入靶标物抗原后，抗原首先与抗体反应封闭抗体的结合位点，将不再与抗原生物素探针反应，随着虹吸作用流经金标垫时虽然与金标羊抗鼠IgG形成复合物，但是流经检测线时不能被亲和素拦截，从而不显示条带。
本发明的有益效果：
本发明在进行半抗原抗体筛选时，先对抗体水平进行评价，检测线显色强弱与抗体滴度高低在一定范围内成正比，检测线颜色越深说明抗体滴度越高；然后评价抗体对抗原的灵敏度：选择合适的抗体浓度，加入相同浓度的抗原标准品溶液，混合反应1-3分钟后，加入抗原生物素探针混匀进行检测，如果抗体与抗原反应则会阻断抗体与抗原生物素探针的反应，从而减弱检测线的显色强度，，检测线显色越弱则说明抗体与抗原反应性越好；固定抗体浓度，加入不同浓度的抗原标准品溶液，混合反应1-3分钟后，加入抗原生物素探针混匀进行检测，完全抑制检测线显色所用抗原量越少说明抗体灵敏度越好。
本发明通过制备不同靶标物的抗原生物素探针，可以进行不同抗原特别是小分子抗原的单克隆抗体筛选，大大降低了工作量，而且通过免疫层析试纸筛选的抗体，整个检测反应在10分钟内完成检测，从而提高了获得抗体的亲和力，更适合用于免疫学快速检测方法的建立。该试纸可广泛应用于单克隆抗体制备过程中小鼠血清、细胞上清或腹水等样品中的靶标物特异性抗体的检测。
附图说明
图1为本发明的试纸条结构示意图；
其中，1、样品垫；2、结合垫、3、硝酸纤维素膜、4、检测线；5、质控线；6、吸水纸；7、支撑底板。
图2为本发明的试纸条评价双咪苯脲杂交瘤细胞分泌抗体效价结果图。
图3为本发明的试纸条评价双咪苯脲杂交瘤细胞分泌抗体灵敏度结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1一种通用型免疫层析试纸的制备
1、胶体金溶液的制备
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液：将99mL超纯水加入到洁净的带刻度的200mL锥形瓶中，将锥形瓶置于加热磁力搅拌器上加热并搅拌，加入1mL 1％(w/v)氯金酸溶液，加热至沸腾，然后迅速加入3mL 1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热溶液，颜色经过透明-黑色-深红色-酒红色变化，待颜色不再变化时再加热5min，室温冷却后，用超纯水将胶体金定容至100mL，4℃保存，得到胶体金，备用。
用0.1mol/L的K2CO3调整胶体金溶液的pH为8.0左右。将羊抗鼠IgG用超纯水稀释到1mg/mL浓度，按10μL羊抗鼠IgG溶液加1mL胶体金溶液的比例，把浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG溶液逐滴加入到胶体金溶液中，室温反应30min，加入10％(v/v)的BSA(牛血清白蛋白)至终浓度为1％，室温反应10min，4℃、12000r/min离心30min，弃上清，沉淀用10mL金标蛋白重悬液(20mmol/L硼酸缓冲液含1％(w/v)的BSA、3％海藻糖和0.03％叠氮钠)重悬为10×浓缩液，4℃保存，得到胶体金标记的羊抗鼠IgG(以下称金标羊抗鼠IgG)，备用。
2、通用型免疫层析试纸条的组装
用喷涂仪按7μL/cm的用量，将5×金标羊抗鼠IgG浓缩液喷涂于玻璃纤维棉上，制备得到金标羊抗鼠IgG结合垫，42℃干燥1h，加干燥剂密封，备用。
将2mg/mL的兔抗羊IgG抗体喷涂在硝酸纤维素膜的质控线位置，将2mg/mL的链霉亲和素喷涂在硝酸纤维素膜的检测线位置，于42℃干燥4h，加干燥剂密封，备用。
样品垫由玻璃纤维棉经样品垫处理液浸泡干燥后制成。
然后将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫及吸水纸按照图1所示依次粘贴于支撑底板上，各组份间重叠1-2mm，用切割机切成试纸条。
实施例2双咪苯脲生物素探针的制备
1、双咪苯脲(IMI)人工抗原的制备
第一步，取鸡卵清白蛋白(OVA)6.57mg，溶于1mL的0.1mol/L 4-吗啉乙烷磺酸(MES，pH 5.5)中，然后加入8.37mg EDC和5.04mg NHS。将该混合物溶液在室温下持续搅拌15min，得混合物1。
第二步，将5.09mg IMI溶于400μL二甲基亚砜中，并逐滴加到混合物1中，于4℃反应12h。将产物在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中透析3d，获得IMI-OVA偶联物。
2、双咪苯脲生物素探针的制备
第一步，取3.46mg生物素加入0.5mL DMSO(二甲基亚砜)中充分溶解，得混合物2。第二步，取4.05mg EDC加入0.5mL双蒸水中充分溶解，然后在室温搅拌下加入到混合物2的溶液中，反应30min，得混合物3。第三步，取5mg IMI-OVA偶联物搅拌状态下加入到混合物3的溶液中,室温反应2h后，PBS透析3d，获得双咪苯脲生物素探针。
实施例3双咪苯脲杂交瘤细胞的筛选方法
在进行杂交瘤细胞筛选之前对双咪苯脲生物素探针工作浓度和孵育时间进行筛选，根据筛选条件进行检测。
1、使用通用型免疫层析试纸条评价杂交瘤细胞分泌抗体效价
第一步，在12孔/条，共8条样品孔组成的96孔检测板上做好标注，然后分别加入10μg/mL的双咪苯脲生物素探针20μL/孔(实施例2所得)。
第二步，抽取96孔细胞培养板中待检测细胞上清样品(不同的双咪苯脲杂交瘤细胞)80μL/孔(可根据显色结果适当稀释细胞上清)，分别加入第一步96孔检测板的对应位置孔中，混合均匀。
第三步，取出样品孔条平放于桌面上，分别插入通用型免疫层析试纸(实施例1所得)，10min后观察读取结果；筛选得到IMI单克隆抗体阳性细胞孔。检测结果如图2所示。
结果判定：在质控线(C)处出现紫红色线，说明本试纸有效；仅在C线处出现一条紫红色线，而检测线(T)处不出现紫红色线，说明IMI抗体为阴性；在C线和T线处出现两条紫红色线，说明IMI抗体为阳性，而且T线显色强弱与抗体滴度高低在一定范围内成正比，检测线颜色越深抗体滴度越高。
由图2可知，其中该96孔细胞板中阳性细胞孔共有47孔，分别对其进行灵敏度评价(实验时得到的检测线为彩色条带较清楚，换成黑白图显示效果受限)。
2、使用通用型免疫层析试纸条评价杂交瘤细胞分泌抗体灵敏度
第一步，在12孔/条样品杯中分别加入5ng/mL的IMI抗原标准品溶液40μL/孔。
第二步，取IMI单克隆抗体阳性细胞孔，分别用PBS稀释0-5倍后(根据上述实验试纸的显色强弱，显色强的稀释倍数高)，抽取稀释后的细胞上清40μL/孔，分别加入第一步对应的样品孔中，混合均匀，反应1min。
第三步，向第二步样品孔中分别加入10μg/mL的IMI生物素探针20μL/孔(实施例2所得)。
第四步，将样品孔条平放于桌面上，插入通用型免疫层析试纸(实施例1所得)，10min后观察读取结果。检测结果如图3所示。
结果判定：本检测方法基于竞争法原理，IMI抗原标准品与IMI生物素探针竞争结合样品中的抗体。当样品孔中抗体对IMI抗原标准品灵敏度差时，会与IMI生物素探针结合，流经检测线时被固定的亲和素拦截，在试纸C线和T线处出现两条紫红色线；当样品中抗体对IMI抗原标准品灵敏度好时，将不再与IMI生物素探针结合，流经检测线时则不显色。
相同的IMI抗原标准品浓度，T线处显色强弱与抗体对IMI抗原标准品的灵敏度成反比，检测线显色越弱则说明抗体灵敏度越好，选择检测线不显色的细胞转孔扩大培养，进而得到所需的单克隆抗体。
由图3可知，选择第2、4、6、8、12孔进行细胞转孔扩大培养(实验时得到的检测线为彩色线条，较清楚，换成黑白图显示效果受限)。
评价抗体灵敏度时，若采用抗体浓度固定，抗原标准品浓度系列稀释，则检测线显色强度与抗原浓度呈反比，检测线消失所需抗原量越少说明抗体灵敏度越好，选择灵敏度好的细胞转孔进行下一步操作。
实施例4杆菌肽锌(BAC)生物素探针制备
1、杆菌肽锌人工抗原制备
第一步，称取10mg BAC溶于1mL CBS(PH 9.6)中，此溶液标记为A液。称取10mg OVA溶于0.1mol/LMES中,然后加入5mg EDC和3mg NHS，室温反应15min，此溶液标记为B液。将B液缓慢逐滴加入到A液中，混匀后室温搅拌反应4h。反应产物在PBS溶液中透析3d，获得BAC-OVA偶联物。
2、杆菌肽锌生物素探针制备
第一步，取3.56mg生物素加入0.5mL DMSO中充分溶解。第二步，取4.12mg EDC加入0.5mL双蒸水中充分溶解，然后在室温搅拌下加入第一步溶液中，反应30min。第三步，取5mgBAC-OVA偶联物搅拌状态下加入第二步溶液中,室温反应2h后，PBS透析3d，获得杆菌肽锌生物素探针。
实施例5杆菌肽锌杂交瘤细胞的筛选方法
采用如实施例1所述的通用型免疫层析试纸，采用如实施例3所述的筛选方法，利用如实施例4制备的杆菌肽锌生物素探针，可用于对杆菌肽锌单克隆抗体的筛选。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不仅局限于实施例的限制，其他的标记材料、靶标物、探针及样品等的置换，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条，其特征在于，由试纸和抗原生物素探针两部分组成；所述试纸包括支撑底板、从测试端依次固定在支撑底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及手柄端的吸水纸；所述硝酸纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫采用吸附有胶体金标记的羊抗鼠IgG的玻璃纤维棉制成；所述检测线喷涂有链霉亲和素；所述质控线喷涂有兔抗羊IgG；所述抗原生物素探针为靶标物半抗原与载体蛋白偶联后形成的靶标物人工抗原，靶标物人工抗原再与生物素偶联获得抗原生物素探针。
2.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
3.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述抗原生物素探针的制备方法为：
第一步，取3-6mg生物素加入0.1-0.5mL DMSO中充分溶解，得混合物1；
第二步，取3-6mg EDC加入0.5mL双蒸水中充分溶解，然后在室温搅拌下加入到混合物1的溶液中，反应30min，得混合物2；
第三步，将1-10mg靶标物人工抗原在搅拌状态下加入到混合物2的溶液中，室温反应2h后，PBS透析3d，获得抗原生物素探针。
4.一种如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)评价杂交瘤细胞分泌抗体效价
第一步，根据待测细胞板样品数目，取等量的加样孔，做好标记，分别加入5-500μg/mL的抗原生物素探针20μL/孔；
第二步，抽取细胞培养板中的细胞上清80μL/孔，分别加入第一步细胞检测板的对应孔中，混合均匀；
第三步，取出样品孔条平放于桌面上，分别插入如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，10min后观察读取结果，根据试纸条显色结果对细胞分泌抗体进行评价，筛选得到抗体阳性细胞孔；
2)评价杂交瘤细胞分泌抗体灵敏度
第一步，在不同的样品杯中分别加入靶标物抗原标准品溶液40μL/孔；
第二步，取步骤1)筛选所得抗体阳性细胞孔，用PBS稀释0-5倍后，抽取稀释后的细胞上清40μL/孔，分别加入第一步对应的样品孔中，混合均匀，反应1-3min；
第三步，向第二步样品孔中分别加入5-500μg/mL的抗原生物素探针20μL/孔；
第四步，将样品孔条平放于桌面上，插入如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，10min后观察读取结果；根据试纸条显色结果对抗体灵敏度进行评价，筛选得到灵敏度好的细胞转孔扩大培养。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述抗体效价的结果判定方法为：在质控线处出现紫红色线，说明本试纸有效；仅在质控线处出现一条紫红色线，而检测线处不出现紫红色线，说明靶标物抗体为阴性；在质控线和检测线处出现两条紫红色线，说明靶标物抗体为阳性；
其中检测线显色强弱与抗体滴度高低在一定范围内成正比，检测线颜色越深抗体滴度越高。
6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，评价抗体灵敏度的结果判定方法为：本检测方法基于竞争法原理，在质控线处出现紫红色线，说明本试纸有效；在质控线和检测线处出现两条紫红色线，说明样品孔中抗体与靶标物抗原不反应；若检测线颜色减弱或不出现紫红色线，说明样品孔中抗体与靶标物抗原反应；
在抗原标准品浓度固定时，检测线显色强度与抗体灵敏度成反比，检测线显色越弱则说明抗体灵敏度越好，选择检测线不显色的细胞转孔扩大培养。
7.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，评价抗体灵敏度时，采用抗体浓度固定、抗原标准品浓度系列稀释时，检测线显色强度与抗原浓度呈反比，检测线消失所需抗原量越少说明抗体灵敏度越好，选择灵敏度好的细胞转孔进行下一步操作。
8.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条在制备单克隆抗体过程中检测样品中靶标物抗体中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制备单克隆抗体过程中检测样品为小鼠血清、细胞上清或腹水。
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