CN108410964A - 一种用于减小数字聚合酶链式反应中由光学假象引起的量化误差的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法及一种用于以dPCR确定样品中感兴趣核酸的量或浓度的方法。

Description

一种用于减小数字聚合酶链式反应中由光学假象引起的量化 误差的方法

发明领域

本发明涉及一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法及一种用于以dPCR确定样品中感兴趣核酸的量或浓度的方法。

发明背景

对于许多生物学，生物化学，诊断或治疗目的，必须准确和精确测定样品中核酸的量或浓度。dPCR是一种较新的核酸检测和量化办法，为用于核酸绝对量化和罕见等位基因检测的常规实时定量PCR提供备选方法。dPCR如下起作用，即将核酸的样品分配入许多单独的，平行的PCR反应；这些反应中的有些含有(阳性的)而有些不含(阴性的)靶分子。在PCR分析后，使用阴性反应的分数来生成该样品中靶分子的数目的绝对计数。dPCR胜过实时PCR的关键优势之一是它卓越的量化准确度。这种优势依赖于dPCR的内在特性，因为量化仅仅需要阳性分区的正确计数和理论分配体积的知识(计数数目对PCR效率并非非常灵敏)。不需要量化标准。这消除由标准自身引起的潜在量化误差。

现有技术提供方法用于在基于小滴的测定法中鉴定不正确的阳性或阴性计数及校准或标准化信号(US 2013/0302792 A1)。这种标准化应当改善阳性和阴性计数之间的分离。因此，标准化减小假阳性或阴性计数的风险。最终目标是通过校正为核酸获得的信号来改善核酸浓度测定的准确度和精确度。

然而，现有技术的方法没有考虑PCR中由于光学测定受到假象损害的情形所致的量化误差。

因而，需要减小由光学假象引起的量化误差的，通过dPCR量化感兴趣核酸的方法。本发明的目标是提供那些方法。

通过基于数字聚合酶链式反应(dPCR)的方法解决了该问题，其中分析每个反应区域中光学信号的分布并自感兴趣核酸的量或浓度的计算排除具有光学假象的反应区域。

发明概述

因而，本发明提供一种高度准确和精确的通过dPCR量化核酸的方法，其容许更加精确和准确地测定样品中感兴趣核酸的量或浓度。特别是，上述方法容许排除例如由于反应区域中的杂质(例如污垢)或任选测量中的技术失败而具有光学假象的反应区域。

发明详述

在第一个方面，本发明涉及一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法，其中在反应区域的阵列中量化感兴趣核酸的量或浓度，该方法包括

a)提供dPCR中使用的反应区域的阵列；

b)测定每个反应区域中光学信号的分布；

c)如果步骤b)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分

布的话，将该反应区域鉴定为无效；并

d)自该感兴趣核酸的量或浓度的计算消除鉴定为无效的反应区域。

如上文详述地，可靠测定核酸的量或浓度的方法在数个产业应用中，例如在医药领域中特别重要。对于数个方面，可能不仅必须澄清样品中是否存在核酸，而且可能需要–尽可能精确和准确地–测定样品，例如自患者或产品获得的样品中核酸的量或浓度。例如在疾病严重程度的诊断中或在环境技术或产品的质量控制中，例如为了限定污染或杂质，这可能是感兴趣的。

本dPCR方法聚焦于确定预定体积中存在的核酸数目且不考虑光学假象。

dPCR(数字聚合酶链式反应或数字PCR)是常规聚合酶链式反应方法的一种生物技术精化，它可用于直接量化和任选克隆性扩增核酸，包括DNA，cDNA，RNA或其混合物。dPCR和传统PCR(例如qPCR)之间的关键差异在于测量核酸量的方法，前者是比PCR更加精确和准确的方法，尽管在没有经验的使用者的手中也更加倾向于误差。dPCR的更小动力学范围可能需要稀释样品。dPCR也在一份样品内进行单个反应，然而该样品分拆成大量的分区或反应区域且单独地在每个分区或反应区域中进行反应。这种分拆容许对核酸量的更加可靠收集和灵敏测量。此外，该方法容许准确量化。

如上文详述地，对dPCR样品进行分配，使得样品内的核酸分子个体在许多分开的区域(反应区域)内定位和浓缩。通过假设分子群体遵循泊松(Poisson)分布，样品的分配容许估算核酸的数目。结果是，每个部分会含有一个阴性或阳性反应(分别为“0”或“1”)。在PCR扩增后，通过对含有PCR终产物阳性反应的区域计数，可以对核酸进行量化。在常规定量PCR中，量化结果可能依赖于PCR过程的扩增效率。然而，dPCR不依赖于扩增循环的数目来测定初始样品量，消除量化靶核酸对不确定的指数式数据的依赖性并因此提供绝对量化。

本发明的第一个方面涉及一种用于减小由光学假象引起的量化误差的方法。

光学假象是自除预定来源以外的来源产生的光学信号。在本发明的背景中，它不是自dPCR测定法产生的，但是是光学过程中测定的光学信号的任何不想要的或非故意的改变。假象可以是自干扰事物诸如影响dPCR信号的杂质或光学信号测定中使用的技术或装置任一产生的。

假象可以是任何种类的杂质，包括但不限于污垢，尘埃，刮痕，流体飞溅，例如分离硅油，毛发，纤维，来自指纹的污垢，反应区域的不正确填充或反应区域的分配结构的缺陷，例如由于某些原因而只有一半深度的分区。假象可以位于反应区域的下或上表面任一或其内部。

污垢指使得产品不清楚或不纯的物质。污垢是使用者或观察员眼中不想要的物质(常常是小型颗粒或痕迹)。污垢的常见类型包括但不限于尘埃(有机或矿物质的一般粉末)，例如土壤，油，油脂等的残留物，污物(污秽物质，诸如粪便)，尘垢(黑色，根深蒂固的尘埃，诸如烟灰)和土壤(位于基岩顶部的粘土，沙子，和腐殖质的混合物)。

光学假象也可以是由阵列表面的修饰引起的，诸如在表面(内侧或外侧)上去除或添加材料，包括但不限于刮痕，流体飞溅，例如分离硅油，毛发，纤维，来自指纹的污垢，或阵列结构的缺陷，例如由于某些原因而只有一半深度的分区。最后，反应区域的不正确填充(例如只有反应区域部分填充，仅仅)也可以引起假象。

另外/或者，假象可以是由于成像期间的技术问题。这些假象是由于成像源和图像之间非故意的差异。该差异的原因可以是例如开花，色差，锯齿，失真，JPEG压缩，波纹或噪声。

开花是能溢出到现有像素上，引起图像区域过度曝光的电荷泛滥。

色差是色散所导致的效果，其中透镜未能将所有颜色聚焦至相同会聚点。它是因为透镜对于不同波长的光具有不同的折射率而发生的。透明材料的折射率随着波长的增加而减小，每个的度数是独特的。由于光谱中的每种颜色不能聚焦于单个共同点，因此色差自身表现为沿着将图像的暗和明部分分开的边界的颜色“边缘”。由于透镜的焦距f取决于折射率n，因此不同波长的光会聚焦在不同的位置上。

锯齿或失真指数字图像中的对角线上可见的锯齿状边缘。像素是正方形的，而且因为对角线由一组正方形像素组成，所以当像素较大时它可以看上去像一系列阶梯。后期制作中的锐化会提高锯齿的可见度。

JPEG压缩用于保存图像。JPEG是用于保存数字照片文件的最常见的照片文件格式。然而，JPEG给出图像质量和图像大小之间的平衡。当将文件保存为JPEG时，图像被压缩且质量丢失。

当图像含有高频率的重复区域时引起波纹。这些细节可超出相机的分辨率。它看上去像图像上的波浪形彩色线。

噪声在图像上显示为不想要的或杂散的色斑，而且噪声最常用地是由提高相机的ISO引起的。它在图像的阴影和黑色中会是最明显的，常常是红色，绿色，和蓝色的小点。噪声可以通过使用较低的ISO来降低。

在第一个方面的方法的第一个步骤中，提供dPCR中使用的反应区域的阵列。

dPCR中使用的反应区域可以是适合于在dPCR中使用的反应区域的任何阵列，而且包括但不限于微阵列或纳米阵列的小型化腔室，微流体装置的腔室，微孔或纳米孔。反应区域可以在芯片上，在毛细管中，在核酸结合表面上或在珠上。优选地，阵列是微阵列或在芯片上。

有许多可用的dPCR系统，可用于本发明。商业化的数字PCR平台包括来自Fluidigm的基于微孔芯片的dPCR，来自Life Technologies的基于透孔的QuantStudio12k flex dPCR和3D dPCR，和来自Bio-的基于小滴的ddPCR(ddPCR)QX100和QX200和来自的RainDrop。基于微流控芯片的dPCR可具有多达每个面板数百个反应区域。基于小滴的dPCR通常具有大约20,000个分配的小滴，而且可具有多达每个反应10,000,000个。QuantStudio 12k dPCR在板上实施数字PCR分析，其含有每个子阵列64个反应区域和总共48个子阵列，等于每个阵列总共3072个反应区域。

小滴dPCR(ddPCR)基于水-油乳状液小滴技术。将样品分级成多个小滴(例如约20,000个)，并在每个单独的小滴中发生模板分子的PCR扩增。ddPCR技术使用与大多数标准的基于TaqMan探针的测定法，包括小滴形成化学使用的试剂和工作流程相似的试剂和工作流程。还有，可使用嵌入染料，诸如Evagreen。大量的样品反应分区是ddPCR技术的一个关键方面。非球形分区(例如纳米孔)实际上具有比相同数目的球形分区更大的每份样品体积的面积。

典型地，通过使用更大数目的反应区域，可改进通过dPCR进行的测定的准确度和更重要的是精确度。可使用大约100至200，200至300，300至400，700或更多个反应区域，用于通过PCR测定所讨论的量或浓度。

在第一个方面的方法的第二个步骤中，测定每个反应区域中光学信号的分布。

为此，检测并测定来自每个反应区域的各个子区域的光学信号。优选地，将反应区域细分成子区域进行分析并获得每个子区域的光学信号，由此测定反应区域中光学信号的分布。反应区域细分成子区域可以通过网格化或光栅化来进行，其中将反应区域细分成大致矩形的像素格栅或颜色点。图像是一个点阵数据结构。光栅在技术上通过像素的宽度和高度及每个反应区域的像素数目来表征。在本发明中，检测，测定并登记表征每个子区域的光学信号的值用于进一步的分析。

典型地，通过登记光子来检测光学信号，其产生可记录的输出，通常作为电信号。电信号的强度对应于光学信号的强度。然而，用于检测光学信号的方法是本领域公知的。

光学信号可以以非荧光明或暗场模式或以荧光模式测定。同样在荧光模式中，用合适的图像处理滤器操作来测定子区域的光学信号的值，例如用合适的滤器核进行图像的2d卷积。这种方法对于检测较大数目的，例如像素尺度的相对较小的对象非常有效。图像处理滤器操作的结果是其中分区的中心像素具有峰值的图像，然后检测这些(见例如图1)。

作为第三个步骤，如果步骤b)中测定的反应区域的光学信号在该反应区域中不均匀分布的话，将该反应区域鉴定为无效。

预期反应区域中通常为液体的dPCR组合物是均匀分布的。因而，可以预期，反应区域的子区域中的光学信号本质上相同。信号的不均匀分布暗示假象。如果有至少一个子区域(优选至少3个，更优选至少5个，最优选至少10个)具有与其它子区域的信号相比明显地升高或降低的光学信号，那么信号是不均匀分布的。为了评估分布，记录每个子区域的值。可以通过连续的数字或字母，成像系统上的区域的XY位置，或一行值中的位置来指定子区域，并且将光学信号的值指派给子区域。这个过程容许鉴定阵列上的反应区域及其特性(例如以数值表示的光学信号的强度)。

此后，评估分布。这可以通过彼此比较单个值来进行。如果单个值显著不同于其它值或任何其它值的话或如果该值和该反应区域的其它值或任何其它值之间的差异超出阈的话，信号的分布是不均匀的。

本领域技术人员知道用于评估两个值是否彼此显著不同的统计规程，诸如Student氏t检验或卡方检验。此外，本领域技术人员知道如何选择合适的参照，诸如反应区域的一个或多个子区域的单个值或一组值。或者，它可以是先前测定的值(例如在先前的测定中)或由第三人(例如实验室设备的制造商)提供的值或本领域已知的公开值。

对于假象鉴定和反应区域的无效，基本上，有使用光学信号(例如属于特定子区域的像素)来测定反应区域中的信号强度分布及因此确定假象及其类型，如此执行的不同算法。计算并确定诸如均值信号水平，中值，标准偏差，最大和最小信号梯级等参数，还有分布的形态。如果分区的填充不适当的话，这也可以通过使用信号的阈值来识别，并基于参数集将其作为假象处理。

关于阈的选择，注意到本领域技术人员会能够基于他的经验和主流案例的情况(例如所涉及的测定法或标志物)来选择合适的阈。经验还可以包括先前的相似或相同的测定和其中记录的光学信号的变化。

或者/另外，确定光学信号的平均值或均值和任选的反应区域中光学信号的值的标准偏差。因而，也可以通过分析均值，标准偏差，分布的形态或单个信号相对于信号均值的偏差来评估均匀分布。如果反应区域中光学信号的分布特征在于(i)标准偏差超出阈，(ii)分布形态不适当，(iii)单个信号相对于信号均值的偏差超出阈和/或(iv)信号的均值显著偏离预期的话，可以将该反应区域鉴定为无效。用于鉴定光学假象的例子还显示于图2和3。正如在这些图中可以看出的，在具有尘埃假象的反应区域中的标准偏差显著升高。这些反应区域还显示不适当的分布形态。最小和/或最大信号相对于信号均值的偏差显著升高，而且信号均值偏离在没有假象的反应区域中测量的信号均值。

合适的阈水平可以自典型的标准偏差(例如相同阵列中的固有的)确定和推导。

另外，围绕反应区域的子区域(例如像素)可以包括在反应区域的评估和无效中。这可以包括分析例如平均轮缘值或轮缘值的STDEV。

如果认为某个反应区域会被无效，诸如前一节中描述的，那么可以通过调查反应区域周围的子区域的信号值来应用进一步的假象鉴定方法。通过应用与前一节中描述的相似的概念，计算均值信号水平，中值，标准偏差，最大和最低信号梯级，还有指派给这个轮缘区域的子区域的分布(形态)的形态，可以扩大假象识别的确定性，因为大多数假象具有比反应区域维度更大的横向尺寸。

在一个例示性实施方案中，将传感器放置在阵列的反应区域的焦点位置并捕捉图像。最终，可以评估这幅捕捉的图像。通常，读取整个传感器，例如相机像素。典型地，对光学信号赋予数值，其中获得子区域的数个值。对于假象鉴定和反应区域的无效，彼此比较各值。有不同规程和算法可用于使用光学信号(例如属于特定子区域的像素)来测定反应区域中的信号强度分布及因此确定假象和任选的其类型的分析。计算并确定诸如均值信号水平，中值，标准偏差，最大和最低信号梯级等参数，还有分布的形态(六边形分区形态对例如分区中的圆形形态)。如果反应区域的填充不恰当的话，这也可以通过使用光学信号的阈值来识别，并基于参数集作为假象处理。

作为第四个步骤，自感兴趣核酸的量或浓度的计算消除鉴定为无效的反应区域。“消除”意味着反应区域作为没有评估来处理及忽略。典型地，在量化反应区域的阵列中感兴趣核酸的量或浓度时均不考虑反应区域的信号(阳性或阴性；“0”和“1”，见上文)和体积。

在第二个方面，本发明涉及一种用于确定样品中感兴趣核酸的量或浓度的方法，该方法包括下述步骤：

a)提供怀疑含有该感兴趣核酸的样品；

b)在反应区域的阵列的每个反应区域中以该样品实施dPCR；

c)测定每个反应区域中光学信号的分布；

d)如果步骤c)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分布的话，将该反应区域鉴定为无效；并

e)基于步骤d)中并未鉴定为无效的反应区域的dPCR结果计算该感兴趣核酸的量或浓度。

在本发明的该方法的第一个步骤中，提供怀疑含有感兴趣核酸的样品。

样品可以是任何怀疑含有所讨论的核酸的样品，包括来自受试者的样品。样品是有限数量的材料，其意图与更大量的该材料相同并代表更大量的该材料。获得样品的行动可以由人或自动进行。可以采集或提供样品用于测试，分析，检查，调查，演示，或试验用途。有时，采样可以连续进行。样品可以包含固体，液体或气体或由其组成；它可以是一些中间特征的材料，诸如凝胶或痰，组织，生物体，或这些的组合。优选地，样品是容许容易分发的液体或悬浮液。

即使材料样品作为单独项目不可计数，样品的数量仍然可以是就其体积，质量，尺寸，或其它此类维度而言可描述的。固体样品可以产生一个或少数离散部分，或可以片段化，粒化，或粉化。

本背景中的样品是一定数量的怀疑含有一种或多种要检测或测量和量化的核酸的材料。如本文中使用的，该术语包括但不限于标本(例如活检或医学标本)，培养物(例如微生物学培养物)或环境样品(诸如水或土壤)。样品可以来自受试者，诸如动物或人，它们可以是流体，固体(例如粪便)，悬浮液或组织。术语“来自受试者的样品”包括自任何给定受试者分离的所有生物学流体，排泄和组织。优选地，受试者是动物，更优选哺乳动物或仍更优选人。样品可以自所有各科的驯养动物，以及野性或野生动物获得，包括但不限于诸如有蹄动物，熊，鱼，啮齿动物，等动物。

样品的例子包括但不限于细胞或组织培养物，血液，血清，血浆，针抽吸物，尿液，精子，精液，精浆，前列腺液，提取物，泪液，唾液，汗液，活检，腹水，脑脊液，胸水，羊水，腹膜液，间质液，痰，乳液，淋巴，支气管和其它灌洗样品，或组织提取物样品。样品的来源可以是固体组织，像来自新鲜的，冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检或抽吸物；或来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。

样品可以含有在自然界中天然不与样品的来源混合的化合物，诸如防腐剂，抗凝剂，缓冲剂，固定剂，养分，抗生素，等等。

如果样品未准备好或不适合于dPCR，那么在dPCR中使用之前可能需要进一步加工。通常，样品需要为dPCR进行加工，例如通过稀释样品(以获得容许dPCR的核酸浓度)，去除干扰成分，添加dPCR需要的试剂等。加工可以包括许多不同步骤和技术，它们会取决于多个方面，包括样品的性质，感兴趣核酸的类型和所使用的dPCR方法。典型地，加工包括纯化步骤和/或稀释或浓缩步骤。用于纯化核酸的方法是本领域公知的，而且包括但不限于匀化，清洗，离心，提取，等。可能需要保存样品，例如通过破坏样品，添加防腐剂，冷冻或干燥样品。对于破坏获得的样品，可以使用物理力(例如polytron，研磨或冷冻)或化学方法(例如裂解细胞)。洗涤剂或离液剂可用于匀化。可以通过使用酸性酚/氯仿，滤器，玻璃颗粒或层析(例如用适宜的核酸作为结合配偶)来提取核酸。可能需要在加工的任何时间(在加工开始时，期间和/或结束时)储存样品。对此，添加适宜的培养基，诸如缓冲盐水可能是必须的或合适的。可能需要去除不感兴趣或可能有干扰的污染物和/或核酸。可以使用酶来去除污染物(诸如DNA酶，RNA酶和/或蛋白酶)或保护感兴趣核酸(诸如DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂)。为了灭活酶，加热步骤可能是适宜的。可以使用去除剂来去除不想要的成分，诸如二价阳离子(Ca²⁺和Mg²⁺)。可能需要清洗步骤来交换培养基。

如上文详述地，对于dPCR，感兴趣核酸在dPCR期间不得不以适宜的量或浓度存在。因而，可能需要适宜的稀释或浓缩步骤。核酸的稀释通常通过添加溶剂(诸如对于后面的步骤适宜的培养基，例如dPCR培养基或dPCR缓冲液)来实施。如果例如想要或需要去除不想要的成分或浓缩获得某些终浓度，那么它可以伴有清洗步骤。浓缩可以通过任何富集规程，诸如免疫捕捉，离心，醇沉淀和使用结合基质来进行。加工后，样品准备好在依照第二个方面的发明的方法的步骤b)中进行的dPCR。

如上文详述地，样品含有其量或浓度要在本发明的方法中测定的感兴趣核酸。核酸是对所有已知形式的生命必不可少的生物聚合物。因此，核酸可用作特定生物体的指示剂，而且在例如突变或天然发生变体的情况中还可用作疾病的指示剂。核酸(包括DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸))是由称作核苷酸的单体形成的。每个核苷酸具有三种成分：五碳糖，磷酸根基团，和含氮碱基。如果糖是脱氧核糖，那么聚合物是DNA。如果糖是核糖，那么聚合物是RNA。核酸是最重要的生物大分子之一。它们在所有活的生物体中丰富地找到，它们在其中发挥编码，传递和表达遗传信息的功能–换言之，经由核酸序列或DNA或RNA分子内核苷酸的次序传送信息。核酸的实验研究构成现代生物学和医学研究的一个主要部分，而且形成基因组和法医科学，以及生物技术和制药业的基础。因而，本发明的方法可用于任何这些领域。

核酸可以指示微生物(诸如病原体)，而且可能在诊断疾病，诸如感染中是有用的。感染可以是由细菌，病毒，真菌，和寄生物或其它含有核酸的物体引起的。病原体可以是外源的(自环境或动物来源或自其他人获得)或内源的(来自正常菌群)。样品可以基于体征和症状来选择，应当代表疾病过程，而且应当在施用抗微生物剂之前收集。未加工样品中核酸的量可以指示疾病的严重程度。

或者，核酸可以指示基因性病症。基因性病症是由基因组中的一处或多处异常引起的遗传问题，尤其是自出生就存在的疾患(先天性的)。大多数基因性病症相当罕见且影响每数千或百万中的一个人。基因性病症可以是或不是可遗传的，即自双亲的基因传下去。在不可遗传的基因性病症中，缺陷可以是由新的DNA突变或变化引起的。在此类案例中，只有在种系中发生时，缺陷才会是可遗传的。相同的疾病(诸如一些形式的癌症)可以是由一些人中的遗传的基因型疾患，其他人中的新的突变，和主要是仍有其他人中的环境原因引起的。显然，具有突变的核酸的量可以指示疾病状态。

在本发明的方法中，测定核酸的量或浓度。物质的量是标准品定义的数量。国际单位系统(SI)将物质的量定义为与存在的元素实体的数目成比例，以阿伏加德罗(Avogadro)常数的倒数作为比例常数(以mol为单位)。用于物质的量的SI单位是摩尔。摩尔定义为含有与12g同位素碳-12中的原子相等数目的元素实体的物质的量。因此，样品的物质的量以样品质量除以物质的摩尔质量计算。在本背景中，“量”通常指感兴趣核酸序列的拷贝数。

物质的浓度是组分的丰度除以混合物的总体积。可以区分数种类型的数学描述：质量浓度，摩尔浓度，数目浓度，和体积浓度。术语浓度可以应用于任何种类的化学混合物，但是它最频繁地指溶液中的溶质和溶剂。摩尔(量)浓度具有变体，诸如标准浓度和渗透浓度。优选地，浓度是以数目除以混合物的总体积给出的组分的量。在本发明的背景中，浓度通常是“拷贝每体积”。

优选的，以液体提供样品，这方便进一步的方法步骤。

作为下一个步骤，在反应区域的阵列的每个反应区域中以样品实施dPCR。在dPCR中，扩增并检测所讨论的核酸，其中在分开的反应区域中分离一定数目的每个个别分子。每个反应区域(孔，腔室，珠，乳状液，等)会对扩增和检测具有阴性结果(如果不存在起始分子的话)或阳性结果(如果存在靶定的起始分子的话)任一。这是一种技术，在一定数目的分开的PCR反应间对样品进行有限稀释，使得部分反应没有模板分子且给出阴性扩增结果。在反应终点时对阳性PCR反应的数目计数时，初始样品中存在的个别模板分子逐个计数。基于PCR的技术具有只对能扩增的分子(例如与测序工作流程中的大规模平行PCR步骤相关的)计数的额外优势。在基于数字PCR的方法中，将要分析的核酸分发入一定数目的不同反应区域(诸如孔，珠，乳状液，凝胶点，微流体装置的腔室，等)。重要的是一些而非所有反应区域含有至少一个分子。典型地，每个反应区域会含有一或零个分子。在实践中，分子会随机分发入反应区域，诸如孔。在一定百分比的反应区域(例如80％)为阳性的案例中，一定数目的区域会含有一个或多个分子(例如平均2.2个分子每孔)。可使用统计方法基于不同反应区域的数目和阳性的数目来计算样品中分子的预期总数目。这会产生应用于不同反应区域的部分中核酸的计算量或浓度。可使用一些基于采样和概率的统计方法得到这种浓度。此类分析的一个例子见Dube et al,arXiv:0809.1460v2“Computation of MaximalResolution of Copy Number Variation on a Nanofluidic Device using Digital PCR(2008),”found at arxiv.org,citation arXiv:0809.1460v2[q-bio.GN],firstuploaded on 8September 2008。该出版物提供一系列方程式，可用于基于数字PCR阵列中使用的反应区域的数目和阳性结果的数目来估算分子的浓度和统计学置信区间。这种类型的计算的另一个例子可见于美国专利申请US 2009/0239308A1。

通常，使用泊松分布来预测在随机离散化体积反应器中仅仅会发生单个DNA扩增子的数字方案以利于仅仅一个感兴趣DNA扩增子每个反应体积。以这种方式，由每个反应器体积发射的PCR扩增的信号(例如荧光)是仅仅一个扩增子的产物且与所有其它离散反应器体积分离。然后通过对有多少数字反应器发射与嵌入染料或特定DNA聚合酶探针序列对应的扩增的荧光信号计数来实现量化。由于在数字方案中每个反应器体积限于不超过单条DNA链，因此能正确地假设100％的它的扩增的荧光信号仅仅来自该一条DNA链且对应于引物和探针集。然而，很低的浓度方案就结果的不精确性而言通常是不利的。

存在一些用于dPCR的方法学。例如，已经使用乳状液PCR来制备具有克隆性扩增的DNA的小珠–实质上，每个珠含有一种类型的dPCR扩增子。能在PCR产物上“原位”(即在相同的孔中)实施的基于荧光探针的技术特别适合于这种应用。美国专利No.6,440,705含有这种扩增规程的更加详细的描述。可以在乳状液或凝胶中，在珠上或在多孔板中进行这些扩增。

dPCR还包括基于微流体的技术，其中使用通道和泵将分子递送至一些反应区域。合适的微流体装置是本领域已知的。

本质上作为常规PCR进行dPCR。使合适培养基中的核酸(参照或感兴趣的)与引物，探针和热稳定的聚合酶(例如Taq聚合酶)接触并进行热循环(用于链分离和酶促复制的反应的重复的加热和冷却的循环)。培养基通常含有脱氧核苷酸，缓冲溶液和离子(例如Mg²⁺)。PCR的选择性源自在特定热循环条件下使用与为扩增而靶定的区域互补的引物。通过使用合适的探针(它通常是标记的，例如荧光标记的)来检测所得扩增产物。对于基于mRNA的PCR，首先用逆转录酶将RNA样品逆转录成互补DNA(cDNA)。

典型地，PCR过程由重复25至50次的一系列温度变化组成。这些循环通常由三个阶段组成：第一个，在95℃左右，容许核酸双链分离；第二个，在50至60℃左右的温度，容许引物结合DNA模板；第三个，在68至72℃之间，便于DNA聚合酶进行聚合。由于片段的尺寸小，这种类型的PCR中通常省略最后一个步骤，因为酶能够在比对阶段和变性阶段之间的变化期间增加它们的数目。另外，以例如80℃的温度测量信号(例如荧光)以减小在使用非特异性染料时由引物二聚体的存在引起的信号。所使用的温度和时机取决于极其多种参数，诸如：用于合成DNA的酶，反应中二价离子和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的浓度和引物的结合温度。

在一个实施方案中，提供带来独特能力的dPCR方法，通过使用多种颜色，时间，和强度组合来编码每种独特探针序列从而鉴定更大数目的荧光探针序列(例如TaqMan探针序列)。而且，可以使用不太昂贵的非TaqMan探针实时PCR扩增指示剂(诸如SYBR-或PicoGreen)来实现多路dPCR，其基于单独的时间线索，单独的强度线索，或组合的强度和时间线索，如此以更大的程度及显著的花费降低来区分引物对。如果需要，这些也可用于增强控制和标准化结果以实现更大的准确度。来自典型的5路qPCR的典型的多路限制可以使用荧光报告物提高至多达100路具有有限光谱带的dPCR。

在dPCR之前，同时或之后，测定每个反应区域中光学信号的分布。此后，如果步骤c)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分布的话，将该反应区域鉴定为无效，并自感兴趣核酸的量或浓度的计算消除鉴定为无效的反应区域。上文和下文也给出了这些步骤的更多细节。

在本发明的方法中，测定核酸的量或浓度。物质的量是标准品定义的数量。国际单位系统(SI)将物质的量定义为与存在的元素实体的数目成比例，以阿伏加德罗(Avogadro)常数的倒数作为比例常数(以mol为单位)。用于物质的量的SI单位是摩尔。摩尔定义为含有与12g同位素碳-12中的原子相等数目的元素实体的物质的量。因此，样品的物质的量以样品质量除以物质的摩尔质量计算。

物质的浓度是组分的丰度除以混合物的总体积。可以区分数种类型的数学描述：质量浓度，摩尔浓度，数目浓度，和体积浓度。术语浓度可以应用于任何种类的化学混合物，但是它最频繁地指溶液中的溶质和溶剂。摩尔(量)浓度具有变体，诸如标准浓度和渗透浓度。优选地，浓度是以数目除以混合物的总体积给出的组分的量。

依照本发明的感兴趣核酸是任何其量或浓度要测定的核酸。核酸是对所有已知形式的生命必不可少的生物聚合物。因此，核酸可用作特定生物体的指示剂，而且在例如突变或天然发生变体的情况中还可用作疾病的指示剂。核酸(包括DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸))是由称作核苷酸的单体构成的。每个核苷酸具有三种成分：五碳糖，磷酸根基团，和含氮碱基。如果糖是脱氧核糖，那么聚合物是DNA。如果糖是核糖，那么聚合物是RNA。核酸是最重要的生物大分子之一。它们在所有活的生物体中丰富地找到，它们在其中发挥编码，传递和表达遗传信息的功能–换言之，经由核酸序列或DNA或RNA分子内核苷酸的次序传送信息。核酸的实验研究构成现代生物学和医学研究的一个主要部分，而且形成基因组和法医科学，以及生物技术和制药业的基础。因而，本发明的方法可用于任何这些领域。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，如果反应区域中光学信号分布特征在于(i)标准偏差超出阈，(ii)分布形态不适当，(iii)单个信号相对于信号均值的偏差超出阈，(iv)信号的均值显著偏离预期的话，将该反应区域鉴定为无效。上文给出了关于这些实施方案的更多详情。

即使该方法不要求使用标志物或标记物且可以在其缺失下进行，例如仅仅在明或暗场或检测方法中测定反应区域，使用标志物是优选的。因而，在一个优选的实施方案中，通过使用光学标志物，优选光学可检测的填充控制标志物(fill control marker)或光学可检测的PCR探针来测定光学信号。

光学标志物是光学可检测的标志物。标志物可以是任何dPCR混合物中早就存在的且在dPCR中具有功能的化合物(例如光学可检测的PCR探针)，或者可以是任何为了鉴定假象而添加的化合物。例如，光学标志物可以是填充控制标志物，它也是为了控制每个反应区域中填充和任选基于每个反应区域中检测到的填充控制标志物的量或浓度确定反应区域的体积而使用的(还可参见欧洲专利申请EP 16002057.4)。

因而，(i)为了减小由光学假象引起的量化误差和任选(ii)为了减小由反应体积偏差引起的量化误差和/或为了用作光学可检测的PCR探针，可以将光学标志物添加至dPCR中使用的反应区域的阵列的每个反应区域。标志物可以是任何光学可检测的物质或组合物，任选进一步容许量化每个反应区域中的反应体积和/或作为探针检测核酸。

因而，标志物可以由任何光学可检测的标记物组成或包含其。如本文中使用的，术语“标记物”一般指任何种类的可用于显现，检测，分析和/或量化反应区域中的体积的物质或药剂。标记物可以是例如使得体积光学可检测和/或光学可区分的染料。依照本发明的标记物可包括但不限于可依靠发光分析来检测和/或显现的任何有色的(例如2,4-二硝基苯酚)或发光的(优选发荧光的)分子或吸收标志物(不发荧光的)，诸如荧光素染料，包括但不限于羧基荧光素(FAM)，6-羧基-4′,5′-二氯-2′7′-二甲氧基荧光素(JOE)，荧光素异硫氰酸酯(FITC)，四氯荧光素(TET)，和六氯荧光素，罗丹明染料，诸如例如羧基-X-罗丹明(ROX)，德克萨斯红和四甲基罗丹明(TAMRA)，青色素染料，诸如吡喃青色素染料，DY548，Quasar570，或Cy3，Cy5，Alexa 568，等等。荧光标记物可以自众多供应商购得，包括例如InvitrogenTM(USA)。

标记物的选择典型地由其物理特性(例如光谱特性)，检测设备的可得性和dPCR中的核酸检测中使用的标记物决定。标记物及其检测策略是本领域技术人员公知的。

标志物在每个反应区域中(例如格外地，在液流中，在多孔板中，在芯片上，在阵列或视野中)具有任何合适的统一的或均匀的分布，从而也容许鉴定光学假象。另外，标记物可指示每个反应区域的体积。用于测定标志物/标记物的量或浓度的方法会取决于所使用的标志物且是本领域公知的。优选地，使用荧光标志物，它能依靠荧光来检测和/或量化。

例如，信号可以是荧光信号。如果自每个反应区域测量两个或更多个不同荧光信号(一个用于PCR且一个用于鉴定量化误差和任选作为填充控制标志物)，那么可以例如以独特波长或波段检测信号。或者，格外地，可以在用不同波长或波段的光激发(例如在不同时间或在不同位置激发)后以相同波长/波段测量荧光信号。可以经各自独特的荧光团检测两个或更多个荧光信号。

在一些实施方案中，可以将标志物偶联至扩增反应并因此充当被动参照。在一些实施方案中，可以另外使用标志物作为自对照扩增反应检测的控制信号。对照扩增反应可测量外源或内源模板的扩增。优选地，标记物在该方法期间是稳定的，不经受漂白，独立于扩增反应和/或温度不变量。

显然，可以在不同时间将光学标志物添加至反应区域，同样取决于测定法设计，所使用的光学标志物及其特性。一般而言，可以在进行dPCR之前或之后将标志物添加至反应区域。

例如，在添加进行dPCR所必需的试剂之前标志物就可以存在于反应区域中。在一个例子中，可以在生产或制造阵列时就将标志物分发至阵列。

或者，可以连同dPCR试剂一起将标志物分发至反应区域。如果测量标志物的量或浓度的话，这是特别合适的。在本发明的方法中，优选在分发至反应区域之前将标志物(尤其是填充控制标志物)添加至PCR反应混合物。

如果标志物用于减小由光学假象引起的量化误差和测定阵列的体积的话，它称作填充控制标志物。它可以进一步用作用于为dPCR获得的信号的标准化因子和/或用于自测定消除其它无效样品。反应体积偏差可导致反应区域中不统一的体积。区域的尺寸分布的宽度影响计数率和因此计算核酸浓度的准确度。这种量化误差在低拷贝数每区域是可忽略的，但是在高拷贝数每区域可能变大。这种效果可以通过思考实验来说明，其中一个区域变得很大而所有其它朝向零收缩。在这种情况中，阳性计数显然会趋向于一，导致极端的量化不足。或者/另外，反应体积偏差可能是由于平均反应区域体积不同于预定或预期体积，例如像通过校准值预先确定的体积的事实。在基于小滴和基于阵列的dPCR系统二者中，发现平均分区体积的不确定性是当前系统的准确度误差的主要来源(Dong et al.,2015,Sci.Rep.5,13174和Dong et al.,2014,Anal.Bioanal.Chem.406,1701-1712)。

平均反应区域体积可以由于反应混合物组成的变化(在dPCR阵列的情况中，洗涤剂对反应混合物和密封流体的界面处的弯月面形成具有影响)，由阵列的生产工艺引起的反应区域深度的变化(例如用于生产阵列的制模工具的变化可能与反应区域的几何变化有关)或由填充速度所致反应区域的填充程度的变化而变化。

体积属于由物体(即固体，液体，气体，或等离子体)占据的三维空间。体积可以基于由物体占据的空间的维度(例如长度，宽度，和高度)来计算。它们通常以SI单位表示，例如立方厘米(cm³)，立方米(m³)，升(L)，毫升(mL)，等。关于体积测定的详情还可见欧洲专利申请EP 16002057.4。

感兴趣核酸的量或浓度可以作为一份或每份体积中通过dPCR测定的核酸的数目来计算，其中体积是使用填充控制标志物测定的反应体积的总和。填充控制标志物用于测定每个反应区域中的真实体积和因此用于确定通过dPCR分析的总体积和真实体积。显然，知道正确的体积对于确定所讨论核酸的正确量或其浓度是重要的。总体积是反应区域的体积的总和。通过dPCR获得以数目计的核酸的量。核酸的浓度通常作为核酸的数目/体积(例如μl)给出。关于该方法和基于反应区域的dPCR结果计算感兴趣核酸的量或浓度的进一步详情可见欧洲专利申请EP 16002057.4。

如果所有反应区域归类为有效阳性，有效阴性或无效反应区域的话，以dPCR进行的量化的准确度和精确度可以进一步提高：

-有效阳性反应区域适当填充反应混合物且在扩增后生成阳性PCR信号。-有效阴性反应区域适当填充反应混合物且在扩增后不生成PCR信号。

-无效反应区域没有(或没有充分)填充反应混合物或因光学假象而消除。

如上文详述地，鉴定无效反应区域是重要的。反应区域可能是无效的，因为dPCR之前的填充或分发过程可能导致阵列的反应区域有空的或不充分填充的反应区域。如果它们错误解答为没有核酸的填充孔(阴性)，那么采样体积V高估且浓度低估。这些反应区域可以使用填充控制标志物来鉴定，例如，如果填充控制标志物的信号在下阈以下，那么自计算消除。或者/另外，如果来自特定反应区域的填充控制标志物的信号水平在预定阈值以上，那么可以自靶物浓度的计算丢弃这个反应区域。通常，不能超出其最大高度填充反应区域。更大的信号水平指示可能源自发荧光的尘埃颗粒和其它污染物的假象。

在本发明的一个优选实施方案中，通过每个反应区域的光栅成像来测定分布，特别是其中每个代表光学信号的光栅由光学装置(特别是相机)的恒定数目的像素(尤其是一个像素)组成，和/或其中分布的特征在于光学信号的均值，中值，标准偏差，该最大和最低信号梯级和/或分布的形态。关于这个实施方案的进一步详情在上文给出。

在本发明的一个优选实施方案中，通过非荧光明或暗场或荧光检测方法来测定光学信号。

明场显微术是所有光学显微术照明技术中最简单的。样品照明是投射(即从下面照明和从上面观察)白光且样品中的反差是由样品的密集区域中一些投射光的吸收引起的。明场显微术是用于光学显微镜中的样品照明的一系列技术中最简单的且它的简单性使之成为流行技术。明场显微术图像的典型外观是明亮背景上的黑暗样品，由此得名。

暗场显微术(暗底显微术)描述光学和电子显微术二者中的显微术方法，其自图像排除未散射光束。结果是，标本周围的视野(即没有标本至散射光束的地方)通常是暗的。暗场描述用于增强未染色样品中的反差的照明技术。它通过用不会被物镜收集，因而不会形成图像一部分的光照明样品来运作。这产生暗的，几乎黑色的背景，其上有明亮物体的经典外观。

荧光是由吸收了光或其它电磁辐射的物质发射的光。它是发光的一种形式。在大多数情况中，发射的光具有比吸收的辐射更长的波长，和因此更低的能量。荧光的最惊人例子在如下时刻发生，即吸收的辐射在光谱的紫外线区域中，因而对人眼不可见，而发射的光在可见区中，给予荧光物质只能在暴露于UV光时看到的独特颜色。当辐射源停止时，荧光材料立即停止发光。

在本发明的一个优选实施方案中，光学假象是由于尘埃，刮痕，流体飞溅，毛发，纤维，指纹，反应区域的不正确填充和/或阵列结构的缺陷。关于这些项目的进一步详情在上文给出。

在本发明的方法的另一个优选实施方案中，光学标志物是荧光标志物或吸收标志物。

广泛的荧光标志物可用作依照本发明的填充控制标志物。每个荧光标志物具有特征性的峰激发和发射波长，而且发射光谱常常交叠。因此，用于dPCR和填充控制的荧光标志物的组合取决于用于激发荧光染料的灯或激光的波长，可用的检测器和标志物的特性。

可使用6010系统来检测的例示性荧光染料包括荧光素衍生物，诸如羧基荧光素(FAM)，和PULSAR 650染料(Ru(bpy)3的衍生物)。FAM具有相对较小的Stokes移位，而PULSAR650染料具有很大的Stokes移位。FAM和PULSAR650染料二者可以用大约460-480nm的光来激发。FAM发射最大约520nm(且基本上不在650nm)的光，而PULSAR 650染料发射最大约650nm(且基本上不在520nm)的光。羧基荧光素可以在探针中与例如BLACK HOLE Quencher^TM 1染料配对，而PULSAR 650染料可以在探针中与例如BLACK HOLE Quencher^TM 2染料配对。

更优选地，光学标志物的荧光和/或吸收特性应当不同于一种或多种dPCR探针的。这对于容许方便地区分光学标志物和荧光dPCR探针是有利的。然而，如果光学标志物具有与dPCR中使用的靶探针荧光标志物相同的激发波长或发射波长的话，检测可以进一步简化。这样，光学标志物并不降低检测系统的颜色多路能力。例如，该系统可以具有4个激发和4发射通道。用激发波长1激发较大的Stokes移位染料，并自发射通道4收集发射，它们也用于dPCR。

在另一个更加优选的实施方案中，光学标志物具有至少100nm，优选至少150nm的Stokes移位。Stokes移位是相同电子跃迁的吸收和发射谱的最大条带的位置之间的差异(波长的)。当分子吸收光子时，它获得能量并进入激发态。结果是，它发射光子，由此失去其能量。当发射的光子具有比吸收的光子要少的能量时，这种能量差异就是Stokes移位。较大的Stokes移位消除吸收和发射之间的光谱交叠且容许检测荧光同时减小干扰。主要优势在于较大的Stokes移位染料可以与具有相似的激发或发射光谱任一的其它染料一起使用。然而，由于两种光谱之一在较小和较大Stokes移位染料中之间并不交叠，因此光谱串扰较小。

优选的光学标志物包括ATTO 430LS和ATTO 490LS(可得自ATTO-TEC GmbH，Siegen，DE)，尤其是ATTO 490LS。二者均显示水中较好的溶解性和超过100nm的Stokes移位，这在具有多重荧光标志物的方法中特别有用，因为高Stokes移位最小化检测期间信号的交叠。ATTO 490LS具有FAM的激发波长和Cy5的发射波长。如果与FAM和Cy5组合的话，测量ATTO 490LS不需要另外的滤器。

在依照第一个和第二个方面的本发明的方法的另一个优选实施方案中，感兴趣核酸是选自由DNA，cDNA，RNA和其混合物组成的组的核酸，或是任何其它类型的核酸。

如上文详述地，感兴趣核酸可以是任何对于dPCR合适的核酸。核酸不得不具有合适的长度。它可以含有非核酸成分。它可以是天然发生的，化学合成的或生物技术工程化改造的。优选的，核酸选自由DNA，cDNA，RNA和其混合物组成的组。

本发明的方法在医学领域中特别感兴趣，诸如诊断性或治疗性监测，而且可用于检测和/或量化指示特定微生物，细胞，病毒，细菌，真菌，哺乳动物物种，遗传状态或疾病的感兴趣核酸。照此，该方法可用于检测病原体。病原体具有引起疾病的潜力。典型地，病原体用于描述传染因子，诸如病毒，细菌，朊病毒，真菌，或甚至另一种微生物。当然，本发明的方法也可用于检测非致病性微生物。

例示性病原体包括但不限于：

-细菌：链球菌(Streptococcus)，葡萄球菌(Staphylococcus)，假单胞菌(Pseudomonas)，伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)，分枝杆菌(Mycobacterium)，衣原体(Chlamydophila)，埃里希氏体(Ehrlichia)，立克次氏体病(Rickettsia)，沙门氏菌(Salmonella)，奈瑟氏菌(Neisseria)，布鲁氏菌(Brucella)，分枝杆菌(Mycobacterium)，诺卡氏菌(Nocardia)，李斯特氏菌(Listeria)，弗朗西丝氏菌(Francisella)，军团菌(Legionella)，和耶尔森氏菌(Yersinia)

-病毒：腺病毒，单纯疱疹，水痘-带状疱疹病毒，巨细胞病毒，乳头瘤病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，戊型肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒，黄热病毒，登革病毒，西尼罗河病毒，TBE病毒，HIV，流感病毒，拉沙病毒，轮状病毒和埃博拉病毒

-真菌：假丝酵母(Candida)，曲霉(Aspergillus)，隐球菌(Cryptococcus)，组织胞浆菌(Histoplasma)，肺囊虫(Pneumocystis)和葡萄状穗霉(Stachybotrys)

-寄生物：原生动物寄生物，蠕虫寄生物和节肢动物寄生物在依照第二个方面的本发明的方法的仍有另一个优选实施方案中，样品是自怀疑受到污染的细胞培养物或来源获得的，特别是体液，血液，血浆，血清，尿液，胆汁，脑脊液，拭子，临床标本，器官样品或组织样品或受试者，特别是人，动物或植物，尤其是人。

如上文详述地，“样品”表示一定数量的怀疑含有要量化的感兴趣核酸的材料。如本文中使用的，该术语包括标本(例如活检或医学标本)或培养物(例如微生物学培养物)。样品可以来自植物或动物，包括人，它可以是流体，固体(例如粪便)或组织。样品可以包括取自患者的材料，包括但不限于培养物，血液，唾液，脑脊液，胸水，乳液，淋巴，痰，精液，针抽吸物，等等。样品可以自所有各科的驯养动物，以及野性或野生动物获得，包括但不限于诸如有蹄动物，熊，鱼，啮齿动物，等动物。关于人样品或“组织样品”或“患者样品”或“患者细胞或组织样品”或“标本”，每个均表示自受试者或患者的组织获得的相似细胞或生物学或生物化学化合物的集合。组织样品的来源可以是固体组织，像来自新鲜的，冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检或抽吸物；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液，羊水，腹水，或间质液；或来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品可以含有在自然界中天然不与组织混合的化合物，诸如防腐剂，抗凝剂，缓冲剂，固定剂，养分，抗生素，等等。

在依照第一个和第二个方面的本发明的方法的一个优选实施方案中，在至少100个反应区域，特别是至少1,000个反应区域，尤其是至少5,000个反应区域中进行相同的dPCR。在依照第一个和第二个方面的本发明的方法的一个优选实施方案中，在至多10,000个反应区域，特别是至多50,000个反应区域，尤其是至多100,000个，优选至多1,000,000个反应区域中进行相同的dPCR。

优选地，dPCR牵涉使用一种或多种荧光dPCR探针来检测一种或多种感兴趣核酸，特别是与猝灭剂组合或作为分子信标或作为水解探针。

在PCR应用(诸如实时PCR)中，常常使用荧光来检测扩增产物。它通常在有能力用至少一种规定波长的光束照明每份样品并检测由激发的荧光团发射的荧光的热循环仪中进行。热循环仪还能够快速加热和冷却样品，由此利用核酸和DNA聚合酶的物理化学特性。

dPCR可牵涉使用一种或多种荧光探针来检测感兴趣核酸和/或参照核酸，特别是与猝灭剂组合或作为分子信标或作为水解探针。

常常在qPCR中检测荧光共振能量转移(FRET)。FRET是一种用于测量两个分子(在本案中是两个探针)之间的相互作用的技术。在这种技术中，将两种不同荧光分子(荧光团或标记物)遗传融合至适合于检测核酸的一对探针。FRET的原理基于两种标记物的组合特征。如果用特定波长(吸收频率)的光激发标记物，那么它以不同波长(发射频率)再发射该能量。在FRET中，第一种标记物受到激发，它继而发射具有发射频率的光。如果第一种标记物(供体)的发射峰与第二种标记物(受体)的激发峰交叠，那么可以确定两种标记物接近，因为第一种标记物将能量转移至第二种标记物且第二种标记物以其自身发射频率发射光。净结果是供体发射比它正常情况下会发射的能量更少的能量(因为它会作为光辐射的一些能量改为得以转移至受体)，而受体以其激发频率发射更多的光能量(因为它自供体荧光团得到额外的能量输入)。还有，可以使用荧光染料与猝灭剂的组合。如果猝灭剂接近荧光染料，那么荧光的发射省略。如果荧光模块变成与猝灭剂分开，那么能在用合适波长的光激发后检测到第一种荧光模块的发射。分子信标是发夹形状的探针，具有内部猝灭的荧光团，其荧光在它们结合至靶核酸序列时恢复。如果要检测的核酸与环中的链互补，那么核酸和环之间形成的双链体比干的双链体更加稳定，因为前一种双链体牵涉更多碱基对。这引起荧光团和猝灭剂分开。一旦荧光团远离猝灭剂，用光照明杂合体导致荧光发射。发射的存在报告杂交事件发生且因此测试样品中存在靶核酸序列。水解探针由共价附着至寡核苷酸探针的5’端的荧光团和3’端处的猝灭剂组成。只要荧光团和猝灭剂接近，猝灭就抑制任何荧光信号。探针设计成使得它们在由特定引物集扩增的DNA区域内退火。由于聚合酶延伸引物并合成初生链，因此聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性降解与模板退火的探针。探针的降解自其释放荧光团并打破与猝灭剂的密切接近，由此解除猝灭效果并容许荧光团发荧光。因此，检测到的荧光指示存在所讨论的核酸。

可以在FRET技术中与各种受体荧光模块一起使用的代表性供体荧光模块包括荧光素，萤光黄，B-藻红蛋白，9-吖啶异硫氰酸酯，萤光黄VS，4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸根合芪-2,2'-二磺酸，7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸酯苯基)-4-甲基香豆素，琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯，和4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸根合芪-2,2'-二磺酸衍生物。取决于所使用的供体荧光模块，代表性受体荧光模块包括LC-Red 610，LC-Red 640，LC-Red 670，LC-Red 705，Cy5，Cy5.5，丽丝胺，罗丹明B磺酰氯，四甲基罗丹明异硫氰酸酯，罗丹明x异硫氰酸酯，赤藓红异硫氰酸酯，荧光素，二乙撑三胺五乙酸酯或镧系离子(例如铕或铽)的其它螯合物。供体和受体荧光模块可以自例如Molecular Probes(Junction City，OR)或Sigma ChemicalCo.(St.Louis，MO)获得。

优选地，荧光探针包含荧光素，罗丹明和/或青色素。例如，供体荧光模块可以是荧光素和/或受体荧光模块可以选自由LC-Red 610，LC-Red 640，LC-Red 670，LC-Red 705，Cy5，和Cy5.5组成的组，优选LC-Red 610或LC-Red640。更优选地，供体荧光模块是荧光素且受体荧光模块是LC-Red 640或LC-Red 610。

数种不同荧光团(例如6-羧基荧光素，首字母缩写：FAM，或四氯荧光素，首字母缩写：TET)和猝灭剂(例如四甲基罗丹明，首字母缩写：TAMRA)是可得的。

定义和本发明的第一个方面的方法的背景中做出的例子也适用于第二个方面的那些，反之亦然。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩写具有与本发明领域普通技术人员的共同理解相同的含义。分子生物学中的常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell ScienceLtd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

本发明不限于本文中描述的特定方法学，方案，和试剂，因为它们可以有变化。虽然在本发明的实践中可以使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但是本文中描述了优选的方法和材料。而且，本文中使用的术语学仅仅用于描述特定实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围。

如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”，“一种”，和“所述/该”包括复数所指物，除非上下文另有清楚说明。类似地，词语“包含”，“含有”和“涵盖”应当解读为包含在内而非排除在外。类似地，词语“或”意图包括“和”，除非上下文另有清楚说明。术语“多数”指两个/种或更多个/种。

附图简述

附图意图图示本发明的各个实施方案。因此，所讨论的具体修饰不应解释成限制本发明的范围。对本领域技术人员显而易见的是可以在不背离本发明的范围的情况下进行各种等同，变化，和修饰，因此应当理解的是此类等同实施方案包括在本发明的范围内。

图1图示自源图像至以峰像素为中心的含有分区的图像的步骤

图2图示暗场荧光图像上的假象去除。图2A和2B分别显示具有未猝灭染料的反应区域(正常形态)和具有已猝灭染料和荧光尘埃假象的反应区域。

图3图示明场非荧光上的假象去除。图3A和3B分别显示没有假象的反应区域(正常形态)和具有尘埃假象的反应区域。核心区域由分区边界内侧未因分区边界变阴暗的所有像素组成。假象通过最小值或标准偏差的偏差得到最好区分。

Claims (14)

1.一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法，其中在反应区域的阵列中量化感兴趣核酸的量或浓度，该方法包括

a)提供dPCR中使用的反应区域的阵列；

b)测定每个反应区域中光学信号的分布；

c)如果步骤b)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分布的话，将该反应区域鉴定为无效；并

d)自该感兴趣核酸的量或浓度的计算消除鉴定为无效的反应区域。

2.一种用于确定样品中感兴趣核酸的量或浓度的方法，该方法包括下述步骤：

a)提供怀疑含有该感兴趣核酸的样品；

b)在反应区域的阵列的每个反应区域中以该样品实施dPCR；

c)测定每个反应区域中光学信号的分布；

d)如果步骤c)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分布的话，将该反应区域鉴定为无效；并

e)基于步骤d)中并未鉴定为无效的反应区域的dPCR结果计算该感兴趣核酸的量或浓度。

3.权利要求1或2的方法，其中如果该反应区域中光学信号的分布特征在于(i)标准偏差超出阈，(ii)分布形态不适当，(iii)单个信号相对于信号均值的偏差超出阈和/或(iv)信号的均值显著偏离预期的话，将该反应区域鉴定为无效。

4.权利要求1至3任一项的方法，其中该光学信号是通过使用光学标志物，优选光学可检测的填充控制标志物(fill control marker)或光学可检测的PCR探针测定的。

5.权利要求1至4任一项的方法，其中该分布是通过每个反应区域的光栅成像测定的，特别是其中每个代表光学信号的光栅由光学装置，特别是相机的恒定数目的像素，尤其是一个像素组成和/或其中该分布特征在于该光学信号的均值，中值，标准偏差，最大和最低信号梯级和/或分布的形态。

6.权利要求1至5任一项的方法，其中该光学信号是通过非荧光明或暗场或荧光检测方法测定的。

7.权利要求4至6任一项的方法，其中该光学假象是由于尘埃，刮痕，流体飞溅，毛发，纤维，指纹，反应区域的不正确填充和/或该阵列结构中的缺陷。

8.权利要求4至7任一项的方法，其中该光学标志物是荧光标志物。

9.权利要求8的方法，其中该光学标志物

-具有与一种或多种dPCR探针的荧光和/或吸收特性不同的荧光和/或吸收特性；和/或

-具有至少100nm，优选至少150nm的Stokes移位；和/或

-是ATTO 430LS或ATTO 490LS，优选ATTO 490LS；和/或

-具有与该dPCR中使用的靶探针荧光标志物相同的激发波长或发射波长。

10.权利要求1至9任一项的方法，其中该感兴趣核酸

-是选自由DNA，cDNA，RNA和其混合物组成的组的核酸；和/或

-指示微生物，细胞，病毒，细菌，真菌，哺乳动物物种，遗传状态或疾病。

11.权利要求2至10任一项的方法，其中该样品是自怀疑受到污染的细胞培养物或来源，特别是体液，血液，血浆，血清，尿液，胆汁，脑脊液，拭子，临床标本，器官样品和组织样品或受试者，特别是人，动物和植物，尤其是人获得的。

12.权利要求1至11任一项的方法，其中该反应区域是微阵列或纳米阵列的小型化腔室，微流体装置的腔室，微孔或纳米孔，在芯片上，在毛细管中，在核酸结合表面上或在珠上，尤其是在微阵列中或在芯片上。

13.权利要求1至12任一项的方法，其中该反应区域的阵列包含

-至少100个反应区域，特别是至少1,000个反应区域，尤其是至少5,000个反应区域；和/或

-至多10,000个反应区域，特别是至多50,000个反应区域，尤其是至多100,000，优选至多1,000,000个反应区域。

14.权利要求1至13任一项的方法，其中该dPCR牵涉使用一种或多种荧光dPCR探针来检测一种或多种感兴趣核酸，特别是与猝灭剂组合或作为分子信标或作为水解探针和/或特别是其中该荧光dPCR探针包含荧光素，罗丹明和/或青色素。