ES2615377T3

ES2615377T3 - Análisis de curva de fusión con sustracción del fondo exponencial

Info

Publication number: ES2615377T3
Application number: ES06803889.2T
Authority: ES
Inventors: Robert Andrew Palais; Carl Thomas Wittwer
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2006-09-20
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2026-09-20
Also published as: US8068992B2; EP3168766A1; AU2006292252B2; US20090222503A1; WO2007035806A2; CA2623268A1; JP2009508530A; EP1927064A2; WO2007035806A3; AU2006292252A2; AU2006292252A1; US8296074B2; CA2623268C; EP3168766B1; US20120116686A1; EP1927064B1; EP1927064A4; JP5301275B2

Abstract

Procedimiento para generar una curva de fusión corregida de una muestra de ácido nucleico, que comprende medir la fluorescencia de la muestra de ácido nucleico en función de la temperatura para producir una curva de fusión original, comprendiendo la muestra un ácido nucleico y una molécula que se une al ácido nucleico para formar un complejo detectable por fluorescencia, comprendiendo la curva de fusión original una señal de fluorescencia de fondo y una señal de la muestra de ácido nucleico; medir un primer y un segundo valores de pendiente a partir de puntos de la curva de fusión original situados en una región de la curva de fusión original en la que no tiene lugar la fusión del ácido nucleico de muestra; utilizar el primer valor de pendiente y el segundo valor de pendiente para buscar un exponencial representativo del ruido de fondo; y separar la señal de la fluorescencia de fondo de la señal de la muestra de ácido nucleico mediante la utilización de un algoritmo de función exponencial para generar una curva de fusión corregida, incluyendo el algoritmo de función exponencial el exponencial representativo del ruido de fondo y comprendiendo la curva de fusión corregida la señal de la muestra de ácido nucleico.

Description

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descripcion

Analisis de curva de fusion con sustraccion del fondo exponencial SECTOR DE LA INVENCION

En general, la presente invencion se refiere al analisis de la curva de fusion de acidos nucleicos. Mas especificamente, varias realizaciones de la presente invencion se refieren a procedimientos y sistemas para analizar los perfiles de fusion de acidos nucleicos de doble cadena mediante la eliminacion de las senales de fluorescencia de fondo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los procedimientos para el analisis de la variacion de secuencia de ADN se pueden dividir en dos categorias generales: 1) determinacion del genotipo de variantes de secuencia conocida y 2) exploracion de variantes desconocidas. Existen muchos procedimientos para la determinacion del genotipo de variantes de secuencia conocida y estan disponibles procedimientos de tubo cerrado, homogeneos, de una sola etapa, que utilizan sondas fluorescentes (Lay M. J. y otros, Clin. Chem 1997; 43: 2262-7). En cambio, la mayoria de las tecnicas de exploracion de variantes desconocidas requieren electroforesis en gel o separacion en columna despues de la PCR. Entre estas se incluyen el polimorfismo de conformacion de cadena unica (Orita O. y otros, Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 2766-70), la migracion de heteroduplex (Nataraj A. J. y otros, Electrophoresis 1999; 20: 1177-1185), electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (Abrams E. S. y otros, Genomics 1990; 7: 463-75), electroforesis en gel en gradiente de temperatura (Wartell R. M. y otros, J Chromatogr A 1998; 806: 169-85), procedimientos de escision quimica o enzimatica (Taylor G. R. y otros, Genet Anal 1999; 14: 181-6), asi como la secuenciacion de ADN. La identificacion de nuevas mutaciones por secuenciacion tambien requiere multiples etapas despues de la PCR, a saber, la secuenciacion en ciclos y la electroforesis en gel. La cromatografia liquida de alto rendimiento desnaturalizante (Xiao W. y otros, Hum Mutat 2001; 17: 439-74) implica inyectar el producto de PCR en una columna.

Los polimorfismos de nucleotido unico (SNP) son con diferencia las variaciones geneticas mas comunes observadas en el hombre y otras especies. En estos polimorfismos, solamente una unica base varia entre los individuos. La alteracion puede causar un cambio de aminoacido en una proteina, alterar las tasas de transcripcion, afectar al empalme y corte del ARNm o no tener ningun efecto visible sobre los procesos celulares. A veces, cuando el cambio es silencioso (por ejemplo, cuando el aminoacido para el que codifica no cambia), el genotipado de SNP aun puede ser util si la alteracion esta unida (asociada) a un unico fenotipo causado por otra alteracion genetica.

Existen muchos procedimientos para el genotipado de SNP. La mayoria utiliza PCR u otras tecnicas de amplificacion para amplificar la plantilla de interes. Se pueden utilizar tecnicas analiticas simultaneas o sucesivas, incluyendo electroforesis en gel, espectrometria de masas y fluorescencia. Son atractivas las tecnicas de fluorescencia que son homogeneas y no requieren la adicion de reactivos despues del comienzo de la amplificacion o el muestreo fisico de las reacciones para el analisis. Algunas tecnicas homogeneas de ejemplo utilizan cebadores de oligonucleotidos para localizar la region de interes y marcadores o colorantes fluorescentes para la generacion de senales. Varios procedimientos basados en PCR son de tubo completamente cerrado y utilizan una enzima termoestable que es estable a la temperatura de desnaturalizacion del aDn, de manera que despues de empezar el calentamiento, no es necesaria ninguna adicion.

Para el genotipado de SNP estan disponibles varios procedimientos de PCR fluorescentes, homogeneos, de tubo cerrado. Entre estos se incluyen sistemas que utilizan sondas de oligonucleotidos FRET con dos cromoforos que interactuan (sondas de hibridacion adyacentes, sondas TaqMan®, balizas moleculares, Scorpions), sondas de un solo oligonucleotido con un solo fluoroforo (G-quenching probes, Crockett, A. O. y C. T. Wittwer, Anal. Biochem. 2001; 290: 89-97 y SimpleProbes®, Idaho Technology) y tecnicas que utilizan un colorante de ADN de doble cadena en lugar de sondas de oligonucleotidos covalentes marcadas con fluorescencia.

Los procedimientos de PCR que controlan la fusion del ADN con colorantes fluorescentes de ADN de doble cadena se han popularizado conjuntamente con la PCR en tiempo real. Dado que la PCR produce ADN suficiente para el analisis de fusion fluorescente, tanto la amplificacion como el analisis se pueden realizar en el mismo tubo, proporcionando un sistema homogeneo, de tubo cerrado, que no requiere etapas de procesamiento o separacion. Los colorantes de ADN de doble cadena se utilizan habitualmente para identificar productos por su temperatura de fusion o Tf.

El poder del analisis de fusion del ADN depende de su resolucion. Los estudios con absorbancia UV a menudo requerian horas para recoger datos de alta resolucion a una velocidad de 0,1-1,0°C/min para asegurar el equilibrio. En cambio, el analisis de fusion fluorescente se adquiere a menudo a 0,1-1,0°C/s y la resolucion se limita a 2-4 puntos/C. Con los recientes avances en electronica (por ejemplo, los convertidores A-D de 24 bits), la fusion a alta resolucion se puede realizar rapidamente con 10-100 veces la densidad de datos (50-100 puntos/°C) de los instrumentos de PCR en tiempo real convencionales, tal como se ha demostrado recientemente para la fusion de la

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sonda y el producto de PCR. Ademas, ahora estan disponibles colorantes saturantes de ADN, tales como LCGreen® Plus (Idaho Technology, Salt Lake City, UT), que maximizan la deteccion de las dobles cadenas no emparejadas (heteroduplex) (vease, por ejemplo, las publicaciones de las patentes de Estados Unidos No. 2005/0233335 y 2006/0019253). Estos dos desarrollos aumentan de forma importante el poder de la fusion del ADN basada en fluorescencia para la identificacion robusta de cambios de una sola base dentro de los productos de PCR.

El analisis de fusion de alta resolucion para la exploracion de genes se basa principalmente en la forma de la transicion de fusion de los productos de la PCR. Un procedimiento disponible para el cribado de polimorfismos de nucleotido unico (SNP) heterocigotos dentro de productos de hasta 1.000 pb tiene una sensibilidad y una especificidad del 97% y del 99%, respectivamente. En muchos casos, el analisis de alta resolucion de la transicion de fusion tambien permite el genotipado sin sondas. Se puede obtener una especificidad incluso mayor para la discriminacion de variantes sobre una region mas pequena mediante la utilizacion de sondas no marcadas. Los genotipos especificos se deducen mediante la correlacion de alteraciones de la secuencia bajo la sonda con los cambios en la Tf de la sonda. Con los recientes avances en colorantes e instrumentacion, la exploracion de alta resolucion de genes y el genotipado con sondas no marcadas se pueden realizar opcionalmente de forma simultanea en la misma reaccion. Se pueden observar las transiciones de fusion del producto de la PCR y la sonda en presencia de un colorante saturante de ADN. Ademas de cribar cualquier variante de secuencia entre los cebadores en el producto de la PCR, se pueden genotipar los polimorfismos y mutaciones habituales. Ademas, la agrupacion jerarquica imparcial puede agrupar con precision las curvas de fusion en genotipos. Se pueden utilizar una, dos o incluso mas sondas no marcadas en una sola PCR.

En el genotipado y la exploracion simultaneos, el analisis de fusion del producto detecta variantes de secuencia en cualquier lugar entre dos cebadores, mientras que el analisis de fusion de la sonda identifica variantes bajo una sonda. Si una variante de secuencia se encuentra entre los cebadores y bajo una sonda, se obtienen tanto la presencia de una variante como su genotipo. Si la fusion del producto indica una variante, pero la sonda no, entonces la variacion probablemente se produce entre los cebadores, pero no bajo la sonda, y es necesario un analisis adicional para el genotipado. Las sondas se pueden colocar en los sitios de variacion de secuencia habitual, de manera que, en la mayoria de los casos, si la exploracion del producto es positiva, las sondas identificaran las variantes de secuencia, reduciendo en gran medida la necesidad de secuenciacion. Con una sonda, se puede establecer el genotipo de un SNP mediante la fusion del producto de la PCR y la sonda. Con dos sondas, se puede examinar el genotipo de dos regiones separadas de la secuencia y el resto del producto de la PCR se puede explorar en busca de variantes de secuencia raras. Se pueden utilizar multiples sondas si difieren en la temperatura de fusion y si cada alelo presenta un patron unico de fusion de la sonda y/o del producto.

En un ejemplo ilustrativo, se criba una poblacion para detectar mutaciones de fibrosis quistica. Dado que solo el 3,8% de los caucasicos son portadores de fibrosis quistica, se esperaria que el 96,2% de los individuos cribados al azar dieran negativo mediante la secuenciacion completa (exon y sitio de empalme). Con 27 exones, el porcentaje de ciclos de secuenciacion que se espera que sean positivos es inferior al 0,14%. Es decir, solo aproximadamente 1 de cada 1.000 ciclos de secuenciacion seria util. Esta es la razon por la que la secuenciacion no se recomienda para el cribado de la fibrosis quistica. En cambio, habitualmente se realiza un panel de mutaciones seleccionadas que detecta el 83,7% de los alelos de la fibrosis quistica.

De manera alternativa, se considera la exploracion y el genotipado simultaneos para el cribado de la fibrosis quistica mediante fusion de alta resolucion. Si la longitud del amplicon se mantiene por debajo de 400 pb, la sensibilidad de la exploracion de alta resolucion se aproxima al 100,0%. Si se analizan las mutaciones y polimorfismos habituales con sondas no marcadas en la misma reaccion, entonces tambien se genotiparan aproximadamente el 80% de las mutaciones. En comparacion con el cribado mediante secuenciacion de novo, la carga de la secuenciacion se puede reducir en un 99,97%.

Los procedimientos de genotipado de tubo cerrado que utilizan analisis de fusion tienen la capacidad de explorar variantes inesperadas. Los procedimientos de fusion tambien utilizan menos sondas, y menos complejas, que los procedimientos especificos de alelo, que requieren una sonda para cada alelo analizado. La discriminacion de alelos mediante la Tf o la forma de la curva es una opcion interesante para el color fluorescente. Los colorantes que, en general, tinen el ADN de doble cadena son atractivos por su simplicidad y coste. Aunque la fiabilidad del genotipado mediante la fusion del amplicon es objeto de controversia, un estudio reciente encontro que 21 de los 21 pares de heteroduplex analizados eran distinguibles mediante fusion de alta resolucion de amplicones pequenos (Graham R, Liew M, Meadows C, Lyon E, Wittwer CT. Dastinguishing different DNA heterozygotes by high-resolution melting. Clin Chem 2005; 51).

A pesar de que las variantes de secuencia habituales normalmente se pueden genotipar con una o dos sondas no marcadas en la misma reaccion, tambien se pueden utilizar mas de dos sondas y/o reacciones secuenciales. Por ejemplo, multiples sondas solapadas pueden localizar variantes raras inesperadas en la region cubierta por una sonda. Se pueden disenar sondas adicionales para identificar la posicion exacta y la secuencia de la variacion. Sin embargo, la secuenciacion de ADN es una estrategia mas directa para la identificacion de nuevas variantes, previamente desconocidas, en particular cuando la region amplificada es muy variable. No obstante, en la gran mayoria de los analisis geneticos, la secuencia de tipo natural amplificada es conocida y las posibles variantes

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habituales son limitadas. En estos casos, la exploracion y el genotipado se pueden realizar en una sola etapa mediante la fusion del ADN con oligonucleotidos simples. No se requieren sondas fluorescentes ni separaciones, y la amplificacion (15 min) y el analisis de fusion (1 -2 min) pueden ser rapidos.

Tal como se ha descrito anteriormente, el genotipado y la exploracion simultaneos, asi como otras tecnicas de genotipado que utilizan el analisis de fusion, han sido areas de investigacion prometedoras. Sin embargo, el analisis de la curva de fusion antes de disponer de capacidad de alta resolucion proporcionaba falta de especificidad y precision. Con la llegada del analisis de la curva de fusion de alta resolucion, el ruido de la fluorescencia de fondo puede interferir con la utilizacion de curvas de fusion para genotipar de manera precisa los SNP, detectar variaciones de secuencia y detectar mutaciones. Dependiendo del amplicon, las tecnicas anteriores de eliminacion de la fluorescencia de fondo han dado lugar a la obtencion de datos erroneos. Por ejemplo, la tecnica de la linea basal utiliza la extrapolacion lineal como procedimiento para normalizar las curvas de fusion y eliminar la fluorescencia de fondo. Esta tecnica funciona bien con sondas marcadas. Sin embargo, esta y otras tecnicas de normalizacion anteriores no han funcionado tan bien con sondas no marcadas (Zhou L, Myers AN, Vandersteen JG, Wang L, Wittwer CT. Closed-Tube Genotyping with Unlabeled Oligonucleotide Probes and a Saturating DNA Dye. Clin Chem. 2004; 50: 1328-1335), fusion de amplicones multiplex pequenos (Liew M, Nelson L, Margraf R, S Mitchell, Erali M, Mao R, Lyon E, Wittwer CT. Genotyping of human platelet antigens 1-6 and 15 by high-resolution amplicon melting and conventional hynridization probes. J Mol Diag, 2006; 8: 97-104) y la fusion combinada de amplicones y sondas no marcadas (Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem 2005; 51: 1770-7), ni funcionan tan bien para amplicones pequenos. Esto es debido, como minimo, en parte, a que los procedimientos de fusion de sondas no marcadas y amplicones pequenos a menudo requieren la sustraccion del fondo a temperaturas mas bajas (40-80°C) a las habituales para la fusion de amplicones estandar a 80-95°C. A estas temperaturas mas bajas, la linea basal de baja temperatura no es lineal, sino una curva con un rapido aumento de la fluorescencia a bajas temperaturas. Cuando se utiliza la extrapolacion lineal, las lineas se pueden cruzar antes de completarse la transicion de fusion y, cuando esto ocurre, las tecnicas anteriores no proporcionan el medio mas preciso para el analisis de la curva de fusion, en parte debido a su dependencia matematica de la fluorescencia absoluta.

Seria ventajoso un sistema y un procedimiento para genotipar SNP, detectar variaciones de secuencia y/o detectar mutaciones con una alta precision en acidos nucleicos de doble cadena a traves de la utilizacion de tecnicas de perfil de fusion de alta resolucion. Ademas, seria adicionalmente ventajoso que la fluorescencia de fondo se pudiera separar de manera automatica y precisa de un perfil de fusion de una muestra de acido nucleico de doble cadena. Seria adicionalmente ventajoso que el sistema y el procedimiento realizaran un analisis preciso de la curva de fusion para amplicones pequenos y grandes, asi como con sondas no marcadas.

CARACTERISTICAS DE LA INVENCION

En un aspecto de la presente invencion, se da a conocer un procedimiento para generar una curva de fusion corregida, tal como se define en la reivindicacion 1.

En otro aspecto de la presente invencion, se da a conocer un sistema para generar una curva de fusion, tal como se define en la reivindicacion 19.

Otras caracteristicas de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica tras la consideracion de la siguiente descripcion detallada de realizaciones preferentes, que ejemplifican el mejor modo de llevar a cabo la presente invencion, tal como se considera actualmente.

DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1A-B son curvas de fusion de alta resolucion de un gen del factor V Leiden diana examinado con una sonda no marcada. La figura 1A muestra las curvas de fusion originales. La figura 1B muestra el genotipado despues de la sustraccion del fondo exponencial.

La figura 2A muestra las curvas de fusion originales del gen del factor V Leiden diana (parte superior) y las curvas de fusion despues de la sustraccion del fondo exponencial y la funcion mejorada con la superposicion de curvas (parte inferior). La figura 2B muestra el intento fallido de una funcion previa con superposicion de curvas en la curva de fusion original de la figura 2A.

Las figuras 3A-C muestran las curvas de fusion analizadas del gen de la lipasa hepatica. La figura 3A muestra una curva de fusion original (panel superior) y un intento fallido de genotipado de la muestra mediante la funcion previa de genotipado (panel inferior). La figura 3B muestra una curva de fusion original (panel superior) y un resultado exitoso del genotipado de la muestra mediante la nueva funcion de agrupamiento (panel inferior). La figura 3C proporciona la curva de fusion de la figura 3B (panel inferior) a lo largo de la placa de reaccion de 96 pocillos.

Las figuras 4A-F muestran una sonda no marcada y el genotipado del amplicon completo del gen de hemocromatosis diana. La figura 4A es una curva de fusion original de alta resolucion. La figura 4B es un grafico

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de la derivada negativa de la curva de fusion de la figura 4A. La figura 4C es el resultado de la sustraccion del fondo exponencial de la curva de fusion de la figura 4B. La figura 4D muestra la curva de fusion original y la figura 4E muestra una normalizacion lineal fallida de linea basal de los datos de la figura 4D. La figura 4F muestra el genotipado del gen de hemocromatosis despues de la sustraccion del fondo exponencial.

Las figuras 5A-D muestran las curvas de fusion de alta resolucion del locus del factor V Leiden y la agrupacion jerarquica imparcial despues de varias funciones. La figura 5A muestra los datos originales de la curva de fusion. La figura 5B muestra la derivada negativa de los datos de fusion originales. La figura 5C muestra una sustraccion de la linea basal lineal realizada sobre los datos de la figura 5B. La figura 5D muestra la funcion de sustraccion del fondo exponencial realizada sobre los datos de la figura 5A, seguida de la normalizacion y el trazado como la derivada negativa.

Las figuras 6A-D muestran las curvas de fusion de alta resolucion del locus del factor V Leiden con genotipado con sonda no marcada. La figura 6A muestra los datos originales de la curva de fusion. La figura 6B muestra el resultado de un grafico de la derivada negativa de los datos de la figura 6A. La figura 6C muestra un grafico de la derivada negativa de la region de la sonda despues de la sustraccion del fondo exponencial utilizando pendientes de las regiones indicadas en los datos de la figura 6B. La figura 6D muestra la agrupacion de 3 genotipos realizada mediante la funcion de agrupacion de los datos de la figura 6C.

Las figuras 7A-D muestran los datos de exploracion y genotipado del exon 11 del gen regulador de la transconductancia de la fibrosis quistica (CFTR). La figura 7a muestra las secuencias variantes analizadas con las sondas no marcadas. La figura 7B muestra las curvas de fusion normalizadas despues de la sustraccion del fondo exponencial. La figura 7C muestra el grafico de la derivada negativa de la region de sonda. La figura 7D muestra un grafico de la diferencia de la transicion de fusion del producto de la PCR.

Las figuras 8A-E muestran las curvas de fusion de alta resolucion del exon 10 del gen CFTR. La figura 8A muestra las secuencias variantes con las sondas. La figura 8B muestra una curva de fusion normalizada despues de la sustraccion del fondo exponencial. La figura 8C muestra el grafico de la derivada negativa realizada sobre los datos de la figura 8B. La figura 8D muestra un grafico de la diferencia de la transicion de fusion del producto de la PCR.

La figura 9A muestra las curvas de fusion originales para un amplicon de p-globina que incluye los locus SNP HbS y HbC. La figura 9B muestra los datos de las curvas de fusion despues de la sustraccion del fondo exponencial. La figura 10C muestra los genotipos agrupados de las curvas de fusion normalizadas de la figura 9B.

Las figuras 10A-C muestran las curvas de fusion de alta resolucion de 60 tipos naturales de muestra en el locus del factor V Leiden. La figura 10A es una curva de fusion normalizada despues de la sustraccion del fondo exponencial. La figura 10B muestra el grafico de diferencia despues de la tecnica de representacion de la diferencia vertical previa. La figura 10C muestra el grafico de diferencia despues de la tecnica de representacion de la diferencia ortogonal.

La figura 11 es un diagrama de bloques de un ejemplo ilustrativo del sistema de analisis nucleico.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERENTES

En referencia a la figura 1, se muestra un perfil de curva de fusion antes (figura 1A) y despues (figura 1B) de realizar la normalizacion con la sustraccion del fondo exponencial (SFE). La SFE es un procedimiento para normalizar los datos de la curva de fusion original y proporciona un conjunto de datos mejor para el analisis y el genotipado. La realizacion de la SFE sobre una curva de fusion derivada u original da lugar a una curva de fusion corregida mas adecuada para un analisis detallado. Las curvas de fusion originales (figura 1A) a menudo representan valores de fluorescencia en funcion de la temperatura.

En un ejemplo, la sustraccion del fondo exponencial se calcula mediante el ajuste de la pendiente de la curva de fusion original a dos temperaturas, Tl y Tr. La curva de fusion original esta representada por el conjunto de ecuaciones (1), a continuacion, en las que F(T) representa la curva de fusion original, M(T) representa la senal de la muestra de acido nucleico, y en las que B(T) representa la senal de fondo. Tl y Tr se obtienen a partir de puntos lejanos a las temperaturas de transicion de fusion de la senal de la muestra, donde la transicion de fusion no afecta significativamente a la pendiente, por lo tanto, la pendiente (M'(T)) de la senal (M(T)) es esencialmente cero y desaparece de manera eficaz de manera exponencial. Esto se refleja en el conjunto de ecuaciones (2).

Conjunto de ecuaciones (1) F(T) = M(T) + B(T)

Conjunto de ecuaciones (2) F’(Tl) = B’(Tl) y F’(Tr) = B’(Tr)

Para la ecuacion 3 se ajusta un modelo exponencial, en la que la forma exponencial se desplaza hasta Tl para la estabilidad numerica a estos dos valores: B'(T) = aCea(T-TL) a T = Tr, Tl, a T = Tl, esto da aC = B'(Tl) y a Tr esto da

aCea(TR-TL) = B'(Tr).

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Conjunto de ecuaciones (3) B(T) = Cea(T'TL)

B'(T) = aCea(T-TL) a T = Tr, Tl aC = B‘(Tl) a T = Tl aCea(TR-TL) = B‘(Tr) a T = Tr

Se entiende que Tl y Tr se han medido al generar la curva de fusion original y, por lo tanto, se utilizan estos valores para obtener los parametros (a) y (C), tal como se muestra en el conjunto de ecuaciones (4).

Conjunto de ecuaciones (4) ea(TR-TL) = B’(Tr)/B’(Tl), de manera que

ln (B’(Tr)/B’(Tl))

a =............................

(Tr - Tl)

C = B’(TL)/a

M(T) = F(T) - Cea(T ) (fondo eliminado)

Dado que las pendientes de Tl y Tr se utilizan para determinar el fondo exponencial en lugar de los valores de fluorescencia, la sustraccion del fondo se puede calcular sin hacer referencia a la cantidad de senal presente, la cual puede variar debido a la cantidad de materiales presentes o simplemente la variacion de muestra a muestra.

La senal M(T), opcionalmente, se puede normalizar, de manera ilustrativa al intervalo 0-100 mediante la aplicacion del desplazamiento y reescalado lineal segun el conjunto de ecuaciones (5) en el intervalo de interes.

Conjunto de ecuaciones (5) M(T) = 100(M(T) - m)/(M - m),

en el que m = min{M(T)} y M = max{M(T)}

De manera alternativa, en otro ejemplo, se puede ajustar un exponencial a la fluorescencia de fondo de una curva de fusion derivada. El fondo se elimina mediante el ajuste de la altura de una curva derivada numericamente por ordenador con un exponencial, a continuacion, se sustrae el fondo de la curva de fusion original. Dado que la derivada de un exponencial es un exponencial con el mismo grado de disminucion, la sustraccion del fondo exponencial se aplica en la presente realizacion de la curva derivada mediante la sustraccion de un ajuste exponencial de los valores a las temperaturas de interes. En este procedimiento, se puede utilizar el valor (altura) de la curva derivada colectiva a dos temperaturas Tl y Tr y ajustar estos valores al modelo correspondiente para B'(t) = Dea(T-TL), en la que D corresponde a aC de la derivada anterior. En esta situacion, los parametros D y a se resuelven de la siguiente manera. A T = Tl, esto da D = B'(Tl), asi que no hay necesidad de resolver para el parametro D; aparece directamente como una medicion. A Tr esto da Dea(TR-TL) = B’(Tr). Dividiendo la segunda ecuacion entre la primera se obtiene ea(TR-TL) = B'(Tr)/B'(Tl), de manera que a = ln (B'(Tr)/B'(Tl))/(Tr - Tl) es coherente con el procedimiento anterior (los grados de disminucion exponencial de un exponencial y su derivada son los mismos), aunque ahora los valores de B' se determinan a partir de la altura de la derivada numerica de los datos medidos en lugar del ajuste de la pendiente de los datos medidos. Finalmente se obtiene la derivada de la senal con la derivada del fondo eliminado mediante sustraccion: M'(T) = F'(T) - Dea(T- L), con los parametros D y a determinados como antes. Al igual que antes, la senal derivada M'(T), opcionalmente, puede normalizarse, de manera ilustrativa hasta el intervalo 0-100 mediante la aplicacion del desplazamiento y reescalado lineal M'(T) = 100(M'(T) - m)/(M - m), en la que m = min{M'(T)} y M = max{M'(T)} en el intervalo de interes, respectivamente.

En la figura 1, se muestran curvas de fusion ilustrativas para varios genotipos en un sistema modelo del gen del factor V Leiden utilizando una sonda no marcada. Las transiciones para la fusion de la sonda no marcada y del amplicon son visibles. En este ejemplo ilustrativo, los pares de lineas 1 (lineas 1, 2) y 2 (lineas 3, 4), tal como se muestran en la figura 1A, representan los pares de cursores respectivos. Cada par de cursores proporciona una region fuera de la transicion de fusion para la extraccion de los intervalos de temperatura de los datos de la curva de fusion original, que se utilizan para la determinacion de F'(Tl) y F'(Tr) en el analisis de la SFE. Cada una de las dos regiones se selecciona de manera que sea lo suficientemente pequena para que la pendiente no cambie significativamente en la region, pero sea lo suficientemente amplia para proporcionar una muestra precisa de la pendiente local. Sin embargo, dado que el fondo es un exponencial, la pendiente no sera constante si la region se ensancha demasiado. En un ejemplo, se pueden disponer algoritmos de posicionamiento inicial automaticos en el software. Por ejemplo, se pueden identificar regiones de fondo en las que se satisface la ecuacion diferencial exponencial, y' = Cy, en la que C es una constante. Si se desea, el software puede permitir al usuario ajustar los cursores para tratar de mejorar los resultados. De manera alternativa, el software puede permitir al usuario fijar los cursores a areas especificas, si se conocen las regiones de transicion de fusion. Son posibles otros procedimientos de fijacion de las regiones.

En el presente ejemplo, se generaron curvas de fusion a partir de los datos extraidos del instrumento de fusion HR-1. Se genera un valor de pendiente Tl a partir del par de cursores 1 y se genera Tr a partir del par de cursores 2. En este ejemplo, los pares de cursores estan situados, respectivamente, a aproximadamente 76°C y 85°C, pero se entiende que la colocacion de los pares de cursores variara dependiendo de las transiciones de fusion del acido o

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acidos nucleicos presentes en la muestra. Los pares de cursores 1 y 2 agrupan la transicion de fusion de la sonda del acido nucleico de muestra, pero el par de cursores 2 tambien se encuentra antes de la region de transicion de fusion del amplicon. Despues de realizar el ajuste exponencial con las pendientes generadas a partir de los pares de cursores, se realiza la sustraccion del fondo exponencial. La figura 1B representa la region de fusion de la sonda despues de haber sustraido el fondo, utilizando las ecuaciones de la SFE y la normalizacion descritas anteriormente. La sustraccion del fondo exponencial para la region de fusion del amplicon utilizando los mismos o diferentes pares de cursores se puede llevar a cabo (no se muestra) con el mismo exponencial encontrado para la region de fusion de la sonda.

Aunque ilustrativamente los pares de cursores se colocan a cada lado, como minimo, de una transicion de fusion, se entiende que la posicion de los pares de cursores puede variar en la practica de la presente invencion. Por ejemplo, en una realizacion alternativa, los valores de las pendientes (Tl y Tr) se obtienen ambos a partir de los puntos antes de la region de fusion de la sonda. En aun otra realizacion alternativa, los valores de las pendientes (Tl y Tr) se obtienen ambos a partir de puntos posteriores a la region de fusion de la sonda, pero antes de la region de fusion del amplicon. En aun otra realizacion alternativa, los valores de las pendientes (Tl y Tr) se obtienen ambos a partir de puntos posteriores a la region de fusion del amplicon. En aun otra realizacion alternativa, los valores de las pendientes (Tl y Tr) se obtienen a partir de puntos anteriores a la region de fusion de la sonda y posteriores a la region de fusion del amplicon. En otra realizacion alternativa, los valores de las pendientes (Tl y Tr) se obtienen en dos puntos cualesquiera de la curva de fusion original, en los que ni la sonda ni el amplicon se funden. Aunque los pares de cursores ilustrativos estan separados el uno del otro, es posible realizar la sustraccion del fondo exponencial con dos valores de pendiente (Tl y Tr) que estan muy juntos. Esto puede ser util para las curvas de fusion muy llenas con regiones sin fusion limitadas.

La eliminacion del fondo exponencial identifica la senal de la curva de fusion de la muestra independiente de la eleccion del usuario de donde el usuario decide ajustar el fondo, siempre y cuando Tl y Tr esten fuera del intervalo de fusion. En general, el ruido de fondo incluye senales de fluorescencia de fondo y senales de fusion alternativas no correspondientes a acidos nucleicos, las cuales interfieren con el analisis de los datos de la muestra. Por ejemplo, cuando se utilizan sondas no marcadas y amplicones multiplex a temperaturas mas bajas (menos de 80°C), el ruido de fondo a baja temperatura ha impedido previamente, de manera ocasional, la identificacion de curvas de senales de la muestra.

Los procedimientos de la tecnica anterior para la sustraccion del fondo pueden fallar a medida que las senales de fondo y las senales de muestreo se aproximan a una amplitud igual. Incluso cuando la senal de la muestra es significativamente mas alta que el fondo, se ha encontrado que la sustraccion del fondo exponencial es mas coherente y precisa.

Como ejemplo, la sustraccion del fondo exponencial proporciona una mayor precision y especificidad cuando se distinguen las curvas de fusion de las muestras. Un estudio reciente encontro el 100% de precision en la distincion entre una muestra de tipo natural normal y una muestra mutante homocigotica cuando los amplicones tenian aproximadamente 40 pares de bases de longitud. Antes de la utilizacion de la sustraccion del fondo exponencial, se entendia teoricamente que una fraccion de amplicones pequenos de una muestra de tipo natural normal y su muestra mutante homologa tendria curvas identicas, en particular si el contenido de GC se mantenia igual entre los dos amplicones. Por lo tanto, la utilizacion de una fusion con mayor resolucion y la eliminacion del fondo exponencial se atribuye a una precision muy elevada del genotipado y la exploracion de mutaciones de las muestras de acido nucleico de doble cadena.

El analisis de fusion de alta resolucion de fusion es util para obtener resultados viables para identificar la eficacia de la eliminacion del fondo y el genotipado. El analisis de fusion se puede realizar en una variedad de instrumentos de fusion, incluyendo los instrumentos de fusion de alta resolucion HR-1® (un horno de fusion basado en capilares) y LightScanner® (un horno de fusion basado en placas) (ambos de Idaho Technology, Salt Lake City, Utah). Sin embargo, se entiende que el analisis de las curvas de fusion se puede realizar en ausencia de la amplificacion, en particular sobre muestras de acido nucleico muy uniformes. En un protocolo de fusion ilustrativo que utiliza el HR-1, en primer lugar las muestras se amplificaron en el LightCycler® (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) (o en el RapidCycler® (Idaho Technology, Salt Lake City, Utah)), a continuacion, se calentaron momentaneamente en el LightCycler a 94°C y rapidamente se enfriaron (ajuste del programa de -20°C/s) hasta 40°C. Los capilares del LightCycler se pueden transferir de uno en uno al instrumento de alta resolucion y calentarse, de manera ilustrativa a 0,3°C/s. El HR-1 es un instrumento de una muestra que rodea un capilar de LightCycler con un cilindro de aluminio. El sistema se calienta mediante calentamiento Joule a traves de una bobina enrollada alrededor del exterior del cilindro. Se pueden adquirir aproximadamente 50 puntos de datos por cada °C. El LightScanner es un sistema basado en placas que proporciona una fusion de alta resolucion sobre placas de microtitulacion de 96 o 384 pocillos. La PCR se puede realizar en cualquier ciclador termico basado en placas compatibles.

En algunos casos, es ventajoso no desnaturalizar el producto despues de la PCR antes de la obtencion de la curva de fusion. Por ejemplo, cuando el objetivo es examinar el numero de secuencias de repeticion (por ejemplo, STR, VNTR), la amplificacion se puede detener en la etapa de extension durante la fase exponencial de la reaccion antes de la fase meseta y, a continuacion, se realiza el analisis de fusion. De esta manera, se pueden analizar productos

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de extension homoduplex. En el examen de las repeticiones, los productos homoduplex pueden ser mas informativos que los productos heteroduplex, en especial porque muchos productos diferentes heteroduplex pueden formarse a partir de diferentes alineaciones de las repeticiones. En algunos casos, puede ser util obtener una curva de fusion de productos homoduplex (sin desnaturalizacion previa) y una curva de fusion de productos heteroduplex (con la desnaturalizacion y la formacion de todas las combinaciones posibles de dobles cadenas). La diferencia entre estas dos curvas de fusion proporciona una medida de la extension de los heteroduplex que se pueden formar utilizando la misma muestra como "control homoduplex".

Las tecnicas de sustraccion del fondo anteriores a menudo incluian la diferenciacion numerica como elemento. La diferenciacion numerica de los datos originales implica un ajuste y suavizado artificial que pueden afectar a la eficacia de los datos. Entre las tecnicas de diferenciacion numerica habituales se incluyen curvas derivadas negativas y curvas derivadas integradas. La presente realizacion no requiere que los datos originales se diferencien numericamente. Esto es una ventaja sobre las tecnicas de sustraccion del fondo anteriores. La conversion de los datos originales en curvas derivadas a menudo implica la amplificacion del ruido de fondo y el suavizado artificial de caracteristicas significativas de los datos de la fusion. La presente realizacion es capaz de distinguir diferencias sutiles, pero molecularmente significativas, en los datos de fusion, lo cual es una ventaja sobre las tecnicas anteriores, que implicaban el analisis de la curva derivada.

Aunque el procedimiento de sustraccion del fondo exponencial anterior se utiliza en referencia a curvas de fusion de acidos nucleicos, se entiende que este procedimiento se puede aplicar a una variedad de conjuntos de datos, incluyendo otros conjuntos de datos biologicos, que tienen ruido de fondo exponencial y es particularmente adecuado cuando es importante la sustraccion del fondo sin utilizar el valor de la senal para el calculo.

Funcion de superposicion de curvas

Un ejemplo alternativo incluye una funcion de superposicion de curvas para utilizar en el analisis de curvas de fusion. Los procedimientos anteriores de superposicion de curvas, o de desplazamiento de temperatura, incluyen las etapas de seleccionar un intervalo de fluorescencia, habitualmente a baja fluorescencia (por ejemplo, del 5 al 15%) de la curva de fusion normalizada, ajustar un polinomio de segundo grado a todos los puntos dentro del intervalo para cada curva y, a continuacion, desplazar cada curva para superponer mejor las representaciones en este intervalo. La superposicion de curvas corrige cualquier variacion menor de temperatura entre pruebas y aumenta la capacidad de distinguir heterocigotos de homocigotos. Sin embargo, el procedimiento anterior no era satisfactorio cuando habia menos de tres (3) puntos en el intervalo. En ausencia de los tres puntos de datos, el procedimiento anterior no podia proporcionar un medio para la superposicion automatica y precisa de curvas, ya que los procedimientos de superposicion matematica conocidos no podian aplicarse con gran precision. Entre los procedimientos de superposicion matematica conocidos se incluyen el procedimiento de minima distancia, el procedimiento de valores promedio mas bajos de la distancia absoluta y el procedimiento de minimos cuadrados.

El presente ejemplo analiza las curvas de fusion normalizadas mediante la superposicion de las mismas entre un valor variable dependiente inferior (yL) y un valor variable dependiente superior (yh). Esto se realiza mediante la extraccion de todos los valores numericos (x, y) en el intervalo, siempre que todos los valores (y) continuen disminuyendo, o todos los valores (y) continuan creciendo. En lugar de ajustar (y) en funcion de (x) y buscar la mejor superposicion de dichos ajustes, los pares ordenados se invierten, haciendo asi que (x) sea funcion de (y). Un ejemplo del ajuste optimo de minimos cuadrados de una funcion desplazada horizontalmente se muestra en el conjunto de ecuaciones 6, xi(y) + c a otro, x2(y) se obtiene mediante la busqueda de la constante c que hace que la diferencia promedio de (xi(y) + c) - x2(y) sea igual a cero.

= { &(*) -

El valor x2(y) se obtiene mediante la busqueda de la constante (c), haciendo asf que la diferencia promedio de (xi(y) + c) - x2(y) sea igual a cero. El valor (z) representa una variable de integracion. El valor (z) en el conjunto de ecuaciones 6 representa el valor (x) o el valor (y), lo cual es, en parte, debido a que la variable independiente es la (y) original e igual al valor de fluorescencia. Las funciones f(z) y g(z) representan secciones entre dos valores de fluorescencia normalizados (bajo y alto) que se eligen para la superposicion de dos curvas de fusion normalizadas, en las que la temperatura se representa en funcion de la fluorescencia. El valor (dz) es una medida normalizada sobre un intervalo de fluorescencia normalizado.

A efectos de explorar heterocigotos en un producto de PCR, la forma es mas importante que la temperatura absoluta o Tf. Los heterocigotos producen heteroduplex que funden a temperaturas mas bajas y distorsionan la forma de una curva de fusion general. Las diferencias en la forma son mas eficaces de utilizar cuando se identifican diferentes genotipos que con las Tf absolutas, ya que la variacion de temperaturas puede estar causada por diferencias menores de las muestras y la variabilidad del instrumento. Entre las posibles diferencias de las muestras se incluyen, pero sin limitarse a las mismas, las variaciones en la fuerza ionica y la aparicion de evaporacion durante los procedimientos de procesamiento. La variabilidad del instrumento tambien es posible con respecto a las posiciones relativas y exactas de los pocillos sobre las placas de muestra.

imagen1

Conjunto de ecuaciones 6 min_c£((f(z) + c) - g{z))2 dz

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Tal como se ha descrito anteriormente, los procedimientos anteriores para comparar la forma de las curvas incluian la superposicion de curvas mediante su desplazamiento a lo largo del eje de temperatura, implementado mediante el ajuste de un polinomio de segundo grado a un intervalo pequeno de fluorescencia de cada curva. A continuacion, se elegia una curva patron arbitraria y las curvas restantes se desplazaban para superponerse con la curva patron sobre esta region. Sin embargo, cuando la densidad de datos y el intervalo de fluorescencia son pequenos, el procedimiento anterior es propenso a fallar, tal como se muestra en la figura 2B. El panel superior (figura 2B) incluye curvas de fusion para un fragmento de PCR del factor V Leiden de 96 muestras de ADN genomico, habiendose normalizado mediante el procedimiento de sustraccion del fondo exponencial. En la figura 2B son visibles tres grupos de genotipos distintos. En el panel superior tambien se muestran marcadores del intervalo de fluorescencia F1, F2 sobre los que se intenta la superposicion. El primer marcador del intervalo F1 se encuentra aproximadamente al 10% de fluorescencia y el segundo marcador del intervalo F2 se encuentra aproximadamente al 15% de fluorescencia. En el panel central se muestra un grafico aumentado de puntos de datos reales de 80 a 82°C contenido en el intervalo de fluorescencia seleccionado. Varias curvas muestran que menos de tres puntos estan incluidos dentro de este intervalo, lo que hace que un ajuste cuadratico sea imposible y, en ultima instancia, conduce a la imposibilidad del procedimiento de superposicion de curvas anterior, tal como se muestra en el panel inferior.

El presente ejemplo utiliza el algoritmo del conjunto de ecuaciones (6) (figura 2A) con el mismo conjunto de datos. La presente realizacion analiza los datos con precision y exito, y, de hecho, para hacerlo solo necesita un punto de datos de cada una de las respectivas curvas, proporcionando de este modo un procedimiento de analisis nuevo y mejorado. En el panel superior de la figura 2A, los datos originales se muestran junto con cursores verticales (vease la figura 1A y la descripcion anterior) que definen las regiones para la estimacion de la pendiente del fondo exponencial. En el panel inferior (figura 2A) se proporcionan las curvas normalizadas con el fondo sustraido que han sido desplazadas en la temperatura de manera satisfactoria, de manera que todas las curvas se superponen dentro de la region de fluorescencia del 10 al 15%.

El presente ejemplo es un procedimiento ventajoso sobre los procedimientos anteriores por diversas razones, incluyendo que solo se requiere un (1) punto de datos para la validez y exactitud de la funcion de superposicion de curvas. La presente realizacion es ventajosa adicionalmente, ya que tiene una optimalidad rigurosa para el ajuste de minimos cuadrados. Se contempla que la presente realizacion de la funcion de superposicion de curvas se puede representar en numerosas representaciones matematicas diferentes de las descritas en el presente documento, y el conjunto de ecuaciones (6) se considera uno de dichos ejemplos.

Funcion de representacion de la diferenoia

Otro ejemplo alternativo incluye una funcion mejorada de representacion de las diferencias para el analisis de las diferencias entre las curvas de fusion de las muestras de acido nucleico. Los procedimientos anteriores sustraian todas las curvas de una curva de referencia arbitraria o un promedio de curvas de referencia. El resultado de la sustraccion era estrictamente la distancia vertical entre las curvas en cada punto de temperatura. Estas representaciones de la diferencia aumentaban visualmente la diferencia entre las curvas para que pudieran ser observadas mas facilmente. Sin embargo, la distancia vertical entre las curvas no representa con precision la distancia mas corta entre las curvas. Este es especialmente el caso cuando el valor de fluorescencia de las curvas de fusion disminuye a una velocidad significativa o con pendiente negativa. Esta deficiencia daba lugar a un artefacto conocido como "burbuja de variacion", que a menudo es claramente visible cuando la disminucion de la fluorescencia es maxima.

Una nueva mejora en la presente funcion de representacion de las diferencias es ponderar las diferencias entre las curvas segun la pendiente de las curvas. Esto proporciona una mejor medida de la distancia entre las curvas, de manera que se pueden identificar de manera correcta y automatica los genotipos comunes y distintos. La ponderacion equilibra el efecto de la pendiente en la medida de la diferencia entre las curvas. Cuando no se realiza la ponderacion, la diferenciacion vertical estandar sobredimensiona la diferencia entre las curvas cuando la pendiente es inclinada, ampliando la propagacion de las curvas de fusion dentro de los mismos genotipos. El presente procedimiento proporciona una aproximacion practica por ordenador a la diferencia ortogonal entre las curvas de fusion, que, de este modo, representa mejor las variaciones en la distancia entre las curvas.

El presente ejemplo proporciona un nuevo procedimiento para el analisis de los datos de las curvas de fusion. Las curvas de fusion analizadas se pueden normalizar mediante diversos procedimientos conocidos, pero es preferente la sustraccion del fondo exponencial novedosa descrita en el presente documento. En lugar de la distancia vertical a cada temperatura, es ventajosa una distancia ortogonal entre las curvas. El presente ejemplo obtiene la menor distancia entre las curvas, que es la menor distancia entre las curvas en cada punto. Cuando la fluorescencia disminuye rapidamente, en lugar de utilizar la distancia vertical entre las lineas, una medida ortogonal a la pendiente de las curvas es mas util y precisa para evaluar las diferencias entre las curvas. Cuando se miden las distancias ortogonales entre dos curvas, los resultados son a menudo diferentes dependiendo de la curva utilizada como referencia. La presente realizacion proporciona un procedimiento para estimar la distancia ortogonal entre dos curvas.

Para compensar el enfasis exagerado sobre las regiones de fusion de dos curvas de fusion que se comparan y el

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consiguiente deenfasis sobre las regiones que rodean sus fusiones primarias cuando se utiliza la diferenciacion vertical simple, f1 (T) - f2(T), se puede encontrar una aproximacion de la distancia ortogonal entre curvas mediante la utilizacion de un conjunto de ecuaciones (7).

Conjunto de ecuaciones (7) fi(T) - f2(T) = max {V(1 + fi’(T)2), V(1 + f2’(T)2)}.

El conjunto de ecuaciones 7 es un ejemplo de un procedimiento para tener en cuenta las regiones de fusion de ambas curvas de fusion de forma simedida. La ecuacion generaliza, ademas, la distancia ortogonal desde el origen hasta la linea (y = b - mx), en la que la distancia vertical desde el origen es (b), pero en la que la distancia ortogonal desde el origen es (b/V(1 + m2)). El resultado de la presente realizacion es una medicion que refleja las variaciones dependientes de la secuencia en las curvas de fusion con mayor sensibilidad y uniformidad a lo largo del intervalo de medicion, a la vez que es adecuada para la utilizacion automatizada y dinamica dentro de un sistema informatico. Un ejemplo de funciones de las diferencias se proporciona en las figuras 10A-C, en las que las diferencias verticales anteriores (figura 10B) y las diferencias ortogonales novedosas (figura 10C) se representan utilizando curvas de fusion normalizadas a las que se ha extraido exponencialmente su fondo. Las representaciones de las diferencias verticales muestran una "burbuja de variacion" alrededor de la region de pendiente mas inclinada, a pesar de que todas las muestras son de tipo natural. La burbuja de variacion se elimina cuando se utiliza la diferenciacion ortogonal.

La ponderacion equilibra el efecto de la pendiente sobre la medida de las diferencias entre las curvas. Cuando no se realiza la ponderacion, la diferenciacion vertical estandar sobredimensiona la diferencia entre las curvas cuando la pendiente es inclinada, ampliando la propagacion de las curvas de fusion dentro del mismo genotipo. La presente invencion da a conocer una aproximacion practica por ordenador a la diferencia ortogonal entre las curvas de fusion que, de este modo, representa mejor las variaciones en la distancia entre las curvas.

Funcion de agrupacion de genotipos

Aun otro ejemplo alternativo incluye una funcion de agrupacion de genotipos con determinacion automatica del numero de grupos. Especificamente, se utilizo una agrupacion jerarquica imparcial a diferencia de los procedimientos anteriores, que agrupaban genotipos basandose en conjuntos de datos aprendidos y puntos de corte arbitrarios. Dado que los genotipos son habitualmente desconocidos antes del analisis, los conjuntos de datos anteriores no predicen de manera satisfactoria la agrupacion adecuada de los futuros conjuntos de datos. Dichos procedimientos de conjuntos de datos aprendidos son a menudo incapaces de proporcionar un medio preciso y automatizado para la agrupacion, en particular para los genotipos desconocidos. En cambio, la agrupacion jerarquica imparcial no requiere un aprendizaje previo o puntos de corte establecidos y se ajusta de manera robusta a la calidad y la resolucion de los datos de fusion disponibles.

El nuevo procedimiento de agrupacion jerarquica imparcial se basa en una medida de la distancia entre las curvas de fusion. La medida de la distancia se selecciona entre: 1) la distancia maxima entre las curvas, 2) el promedio del valor absoluto de la distancia entre las curvas en todos los puntos de temperatura, y 3) el promedio de la media cuadratica de la distancia entre las curvas en todos los puntos de temperatura. De manera preferente, la medida de la distancia se deriva despues de la SFE, la normalizacion, la superposicion opcional de curvas y es la nueva medida de la distancia ortogonal descrita en la seccion anterior. A continuacion, se realiza una agrupacion jerarquica imparcial secuencial, tal como es habitual en la tecnica.

La determinacion automatica del numero mas probable de grupos es un aspecto novedoso de la presente descripcion. Especificamente, la probabilidad para cada nivel de agrupacion (numero de grupos) se determina considerando la proporcion de las distancias entre los niveles de grupos. Durante la agrupacion jerarquica, se unen dos subgrupos C1 y C2 en un grupo mas grande al considerar el promedio ponderado de todos los puntos en cada subgrupo (la cantidad minimizada para determinar que subgrupos se fusionan en cada etapa). En lugar de utilizar los promedios ponderados para calcular las proporciones de las distancias, se utiliza la distancia minima entre las curvas en distintos grupos como una medida mas precisa de la separacion entre los grupos de datos y sus subgrupos. Esto compensa las distancias de crecimiento natural entre las curvas de promedio ponderado que representan subgrupos jerarquicos formados durante el procedimiento de agrupacion aglomerada mediante el mantenimiento de la medida de la distancia asociada con subgrupos, limitada a la distancia entre las curvas mas proximas entre si en cada subgrupo, en lugar de la distancia entre los promedios ponderados unidos mas recientemente. El presente ejemplo determina con precision que nivel de agrupacion es el mas probable mediante la evaluacion de la proporcion entre dos distancias adyacentes a nivel de grupo. Esta proporcion proporciona una evaluacion de probabilidad mas precisa y estable del nivel de agrupamiento (numero de grupos), separando con precision fenomenos a pequena escala de fenomenos a gran escala. La proporcion mas grande define el numero mas probable de grupos, la siguiente proporcion mas grande define el segundo numero mas probable de grupos, etc. En aplicaciones de genotipado en las que hay curvas suficientes para multiples representaciones de los principales genotipos, este procedimiento proporciona un criterio robusto para identificar el nivel de genotipado en la agrupacion jerarquica intrinseca.

En el conjunto de ecuaciones (8) se muestra una representacion matematica del proceso de agrupamiento, en el

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que iifi - f2^ representa la medida de la distancia utilizada en la proporcion que ordena los niveles de agrupamiento (numero de grupos) por probabilidad. La medicion de la diferencia (||f1 - f2||) indica la medida de la distancia entre dos curvas de fusion normalizadas y se selecciona entre un grupo que comprende: la separacion absoluta promedio, la separacion cuadratica promedio y la separacion maxima a una temperatura elegida. Se contempla que se pueden utilizar otros procedimientos conocidos para medir distancias entre dos curvas de fusion con respecto al conjunto de ecuaciones 8.

Conjunto de ecuaciones (8) min_{fi e Ci, f2 e C2} ||fi - ||f21

En un punto en el que se han unido los subgrupos Ci y C2, el valor (fi) representa una curva de fusion asociada con el subgrupo Ci, y el valor (f2) es una curva de fusion asociada con el subgrupo C2. El valor (min_{fi e Ci, f2 e C2}) representa el valor mas pequeno de la distancia entre todos los pares de curvas de fusion, en el que se toma un primer valor de un primer subgrupo, habiendose unido el primer subgrupo, y se toma un segundo valor de un segundo subgrupo.

El presente ejemplo es un nuevo procedimiento para medir la distancia entre los niveles de agrupacion para determinar la probabilidad de un nivel particular (numero de grupos). La nueva medida de la distancia es la distancia minima entre dos miembros cualesquiera, siempre que cada uno sea de un grupo diferente. A efectos de determinar la probabilidad de cualquier nivel de agrupacion (es decir, 3 frente a 4 frente a 5 grupos), la proporcion de la distancia hasta el siguiente grupo se divide por la distancia al grupo anterior. El procedimiento anterior proporciona la clasificacion correcta de los genotipos cuando se varian parametros, tales como la ubicacion de los cursores. Cuando se utilizan promedios ponderados en lugar de la distancia entre las curvas mas proximas entre si en cada subgrupo para determinar la proporcion, la eleccion del numero mas probable de grupos es mucho menos estable. Ademas, la presente realizacion se puede ejecutar de forma automatica con una gran precision.

Las figuras 3A-C muestran la capacidad de la nueva funcion de agrupamiento para asignar el numero correcto de grupos de genotipo a una curva de fusion con multiples muestras. Se amplificaron seis genotipos separados de ADN genomico humano del gen de la lipasa hepatica (BioRad iCycler) utilizando volumenes de reaccion de i0 p.l en una placa de 96 pocillos. Se utilizo iX de una mezcla madre de LightScanner® (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Las muestras se calentaron de 75°C a 94°C a 0,i°C/segundo en el instrumento de fusion LightScanner.

La figura 3A muestra una captura de pantalla de la curva de fusion original (panel superior) para la amplificacion del gen de la lipasa hepatica y la transicion de fusion. El panel inferior muestra el resultado de la funcion de agrupacion previa, junto con un menu desplegable que indica que la funcion de agrupacion previa indica incorrectamente la presencia de solo tres grupos de genotipos distintos en las muestras, que se representan como tres grupos de lineas de colores diferentes.

La figura 3B muestra una captura de pantalla de la curva de fusion original (panel superior) para la amplificacion del gen de la lipasa hepatica y la transicion de fusion. El panel inferior muestra el resultado de la funcion de agrupacion de la presente realizacion, junto con un menu desplegable que indica que la nueva funcion de agrupacion indica correctamente la presencia de seis grupos de genotipos distintos en las muestras, que se representan como seis grupos separados de lineas de colores. La figura 3C muestra que el usuario puede identificar las muestras mediante el genotipo por su posicionamiento en la placa de reaccion de 96 pocillos, mostrado a lo largo del grafico de la fluorescencia frente a la temperatura de la figura 3B.

Se entiende que las representaciones de fusion se pueden analizar utilizando uno o mas de los algoritmos de sustraccion del fondo exponencial, la funcion de superposicion de curvas, la funcion de representacion de las diferencias y la funcion de agrupamiento, y que cada uno de estos procedimientos se pueden utilizar solos o en cualquier combinacion y se pueden utilizar en combinacion con otros procedimientos de analisis de representaciones de fusion.

Ejemplo 1 - Genotipado de mutaoiones y polimorfismos de la hemooromatosis (HFE)

Se conoce que las mutaciones y polimorfismos de los genes de la hemocromatosis interfieren con el metabolismo normal del hierro en los seres humanos. En este ejemplo ilustrativo, la deteccion y la identificacion de genotipos de polimorfismos y mutaciones a traves del analisis de la curva de fusion son mas precisos con la sustraccion del fondo exponencial que con la sustraccion del fondo de la linea basal. El analisis se realizo con amplicones pequenos (78 pb y 40 pb) a efectos de aumentar la diferencia de Tf entre diferentes muestras de homocigotos. Se utilizan sondas no marcadas para el genotipado de SNP, que de otra manera no podrian genotiparse facilmente mediante fusion de amplicones.

Se puede amplifcar ADN genomico humano que representa distintos genotipos de hemocromatosis mediante varios instrumentos de PCR. Un procedimiento de ejemplo incluye volumenes de reaccion de i0 p.l con un LightCycler® 2.0 de Roche. Despues de la amplificacion por PCR, las muestras de HFE se calientan en un instrumento de fusion HR-i (Idaho Technology) durante aproximadamente ii5 segundos. El grafico de la fluorescencia resultante frente a la temperatura se representa como la figura 4A. Las curvas de fusion derivadas se muestran en la figura 4B. En este

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ejemplo ilustrativo, la sustraccion del fondo exponencial se realiza sobre las curvas de fusion derivadas y las curvas de fusion derivadas normalizadas se muestran como la figura 4C. En comparacion con la curva de fusion normalizada del fondo exponencial (figura 4C), la tecnica de linea basal para la normalizacion de curvas de fusion es claramente deficiente. Tal como se muestra en las figuras 4D-4E, la tecnica de la linea basal aplicada a una curva de fusion con sonda mas amplicon combinados (figura 4D) da lugar a una ausencia de datos utilizables (figura 4E), aun cuando las tecnicas de la linea basal y la sustraccion del fondo exponencial utilizaban el mismo conjunto de datos de la curva de fusion (figuras 4B, 4D). La identificacion del genotipo de la figura 4C para las muestras homocigota y heterocigota C282Y, heterocigota y homocigota H63D y de tipo natural se muestra en la figura 4F.

Ejemplo 2 - Agrupacion por derivacion del factor V Leiden con sondas y amplicones combinados (placa de 384 pocillos)

El factor V Leiden es el trastorno de la coagulacion de la sangre hereditario mas comun en los Estados Unidos. Esta presente en aproximadamente el 5% de la poblacion caucasica y aproximadamente el 1,2% de la poblacion afroamericana. El factor V Leiden como diana genica es importante para la deteccion de los SNP que estan relacionados con la disposicion al trastorno de la coagulacion.

Se amplificaron muestras de ADN genomico del factor V Leiden humano que representaban diferentes genotipos del factor V Leiden en un ABI 9700 con un volumen de reaccion de 10 p.l y 12 p.l de una capa de aceite. El ensayo incluyo un amplicon del factor V Leiden de aproximadamente 100 pb que tenia la secuencia 5'-CTGAAAGGTTACTTCAAGGACAAAATACCTGTATTCCTCGCCTGTCCAGGG

ATCTGCTCTTAGAGATTAGAAGTAGTCCTATTAGCCCAGAGGCGATGTC-3' (SEQ ID NO: 1), que se amplifico mediante el cebador directo 5'-CTGAAAGGTTACTTCAAGGAC-3’ (SEQ ID NO: 2) y el cebador inverso 5'-GACATCGCCTCTGGG-3' (SEQ ID NO: 3). El ensayo tambien incluia una sonda no marcada 3'-TGGACATAAGGAGCGGACAGGT-5' (SEQ ID NO: 4) configurada para hibridarse a la cadena directa del amplicon, tal como se indica mediante el subrayado. Las muestras de PCR resultantes se calentaron de 58°C a 88°C a 0,1°C/s en un instrumento de fusion LightScanner utilizando una placa de reaccion de 384 pocillos. El procedimiento de fusion total requirio aproximadamente 5 minutos para su finalizacion.

El instrumento de fusion LightScanner midio y registro la fluorescencia en funcion de la temperatura. La curva de fusion original resultante del procedimiento se muestra en la figura 5A. Se calculo la derivada negativa de la curva de fusion de la figura 5A y se muestra en la figura 5B. En la figura 5B se muestra un diagrama representativo de la placa de 384 pocillos junto con la agrupacion de los genotipos. La eliminacion del fondo no se realizo y el agrupamiento realizado no genotipo correctamente varias de las muestras analizadas (comparese la placa de 384 pocillos con la de la figura 5D).

Se realizo una funcion de correccion lineal sobre el grafico de la derivada de la figura 5B y se muestra en la figura 5C. En la figura 5C se muestra un diagrama representativo de la placa de 384 pocillos junto con la agrupacion de los genotipos. Es evidente a partir de la placa de 384 pocillos que el agrupamiento realizado despues de la correccion lineal no genotipo correctamente varias de las muestras analizadas. La correccion lineal realizada sobre los datos de la curva de fusion derivada incluye la supresion de la pendiente de extremo a extremo mediante la sustraccion de la funcion lineal.

La figura 5D representa los datos de la curva de fusion derivada de la figura 5B despues de realizar la sustraccion del fondo exponencial sobre el conjunto de datos. Solo despues de la sustraccion del fondo exponencial se obtiene la correcta agrupacion de genotipos. La precision de la agrupacion de genotipos es visible dentro de la placa de 384 pocillos (figura 5D), en la que las letras “S-N-P” indicando los genotipos por posicion de la placa, y la identificacion adecuada es visible para la region del amplicon y la sonda del gen diana del factor V Leiden.

Ejemplo 3 - Agrupacion por derivacion del factor V Leiden solo con la sonda (placa de 96 pocillos)

Se amplificaron muestras de ADN genomico del factor V Leiden humano que representaban diferentes genotipos del factor V Leiden en un ABI 9700 con un volumen de reaccion de 10 p.l y 12 p.l de una capa de aceite. El ensayo incluyo un amplicon del factor V Leiden y una sonda no marcada, tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2, en presencia de 1X LCGreen Plus®. Las muestras de PCR resultantes se calentaron de 58°C a 88°C a 0,1°C/s en un instrumento de fusion LightScanner utilizando una placa de reaccion de 96 pocillos. El procedimiento de fusion total requirio aproximadamente 5 minutos para su finalizacion.

El instrumento de fusion LightScanner midio y registro la fluorescencia en funcion de la temperatura. La curva de fusion original resultante del procedimiento se muestra en la figura 6A. Se realizo un grafico de la derivada negativa en funcion de la temperatura a partir de los datos de la curva de fusion de la figura 6A y se muestra en la figura 6B. Dos conjuntos de lineas de cursores verticales estan presentes a aproximadamente 59°C y 60°C, y 71°C y 72°C, respectivamente. Se generan pendientes con la tecnica de la sustraccion del fondo exponencial utilizando estas lineas de cursores. Despues del calculo automatico y el ajuste, se sustrae el fondo exponencial del grafico de la derivada negativa original. El resultado de la sustraccion del fondo exponencial especifico para la region de la sonda se muestra en la figura 6C. Aunque los cursores de la pendiente vertical estan situados a cada lado de la region de

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la sonda, el exponencial utilizado para la region de la sonda tambien se puede utilizar para la region del amplicon. De hecho, la localizacion absoluta de donde se obtienen las pendientes no es determinante del exponencial, siempre que las pendientes se encuentren en posiciones en las que no se produce ninguna fusion de la muestra. Los datos de la region de la sonda (figura 6C) se agrupan automaticamente mediante la funcion de agrupacion del genotipo. Las muestras de acido nucleico de la placa de 96 pocillos se agrupan en tres genotipos y se muestran en la figura 6D.

Con respecto a los ejemplos 4 y 5, se utilizaron los siguientes procedimientos e instrumentos. Para el analisis se utilizaron ADN genomico humano de muestras de genotipos conocidos del factor V Leiden y muestras de ADN genomico heterocigoto con mutaciones seleccionadas de la fibrosis quistica.

Las Tf previstas de las sondas fueron inferiores a las Tf observadas, quizas debido a la estabilizacion del colorante. Se ajusto la temperatura de fusion de diferentes duplex de sonda/alelo mediante la longitud de la sonda, la posicion del desapareamiento y el contenido de dU frente a dT en la sonda. Se evito la extension de sondas no marcadas durante la PCR mediante la incorporacion de un 3'-fosfato durante la sintesis. De manera alternativa, se pueden utilizar otros mecanismos de bloqueo en 3', de manera ilustrativa, mediante la aportacion adicional de un desapareamiento adicional de dos bases adicionales al extremo 3' de la sonda. Cuando se utiliza una polimerasa negativa 5'-exonucleasa, las sondas se deben disenar para fundir a una temperatura mas baja que la temperatura de extension de la PCR.

Se puede utilizar la asimetria de cebadores, ilustrativamente en proporciones de 1:5 a 1:10, para producir suficiente producto de doble cadena para la fusion del amplicon y suficiente producto de una cadena para la hibridacion de la sonda. La PCR para el factor V realizada en un formato de 384 pocillos utilizo volumenes de 5 p.l e incluia 20 ng de ADN genomico en Tris 50 mM, pH 8,3 con MgCl2 3 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 500 |xg/ml de BSA, 1X LCGreen® PLUS (Idaho Technology), 0,2 U de KlenTaql® (AB Peptides) y 70 ng de anticuerpo TaqStart® (Clontech). La PCR se realizo en un ciclador termico 9700 (ABI) con una desnaturalizacion inicial a 94°C durante 10 s, seguido de 50 ciclos de 94°C durante 5 s, 57°C durante 2 s y 72°C durante 2 s. Despues de la PCR, las muestras se calentaron hasta 94°C durante 1 s y, a continuacion, se enfriaron hasta 10°C antes de la fusion.

Se realizo la PCR para la amplificacion de los exones de CFTR 10 y 11 en volumenes de 10 p.l e incluia 50 ng de ADN genomico en Tris 50 mM, pH 8,3 con MgCl2 2 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 500 |xg/ml de BSA, 1X LCGreen I (Idaho Technology) y 0,4 U de Taq polimerasa (Roche). La PCR se realizo en tubos capilares en un LightCycler (Roche) con una desnaturalizacion inicial de 95°C durante 10 segundos, seguido de 45 ciclos de 95°C durante 1 s, 54°C durante 0 s y 72°C durante 10 s. Despues de la amplificacion, las muestras se calentaron hasta 95°C durante 0 s y se enfriaron rapidamente hasta 40°C antes de la fusion.

Cuando se amplificaron las muestras de acido nucleico en placas de 384 pocillos, se realizo la obtencion de la fusion en una version prototipo del LightScanner® (Idaho Technology). Se sustituyeron los diodos emisores de luz de 470 nm estandar por diodos emisores de luz de 450 nm (Bright-LED Optoelectronics). Ademas, los filtros opticos se cambiaron a filtros de excitacion de 425-475 nm y filtros de emision de paso largo de 485 nm (Omega Optical). La placa se calento de 55 a 88°C a 0,1°C/s con un intervalo de captura de 300 ms, una exposicion de 15 ms y una potencia LED del 100%, dando lugar a aproximadamente 25 puntos/°C.

La fusion de los exones de CFTR se llevo a cabo en el instrumento de fusion de alta resolucion HR-1 (Idaho Technology) con una adquisicion de 24 bits de la temperatura y la fluorescencia. Despues de la PCR en el LightCycler, cada tubo capilar se transfirio al HR-1 y se fundio de 50°C a 90°C con una pendiente de 0,3°C/s, dando lugar a 65 puntos/°C.

Las curvas de fusion se pueden analizar en cualquier software adecuado conocido en la tecnica. Un paquete de software de ejemplo para implementar los procedimientos de analisis de fusion de las diversas realizaciones de la presente invencion es LabVIEw (National Instruments). La normalizacion y la sustraccion del fondo se realizaron, en primer lugar, mediante el ajuste de un exponencial al fondo que rodea las transiciones de fusion de interes. Se obtuvieron graficos de la derivada de las transiciones de fusion de la sonda mediante la estimacion polinomica de Salvitsky-Golay. Las curvas de fusion de los productos de la PCR se compararon sobre graficos de diferencias de curvas de fusion normalizadas con la temperatura superpuesta. Las curvas de fusion normalizadas estaban superpuestas con la temperatura (para eliminar pequenos errores de temperatura entre pocillos o pruebas) mediante la seleccion de un intervalo de fluorescencia (ilustrativamente baja fluorescencia/alta temperatura, habitualmente 5-10% de fluorescencia) y el desplazamiento de cada curva a lo largo del eje X para superponer mejor una muestra patron dentro de este intervalo. Los graficos de diferencias de las curvas normalizadas superpuestas con la temperatura se obtuvieron tomando la diferencia de fluorescencia de cada curva de la curva de tipo natural promedio a todos los puntos de temperatura. Estos procedimientos analiticos se han aplicado previamente a la exploracion de mutaciones y emparejamientos de HLA.

La agrupacion jerarquica imparcial aglomerativa de los datos de las curvas de fusion se realizo mediante procedimientos anteriores programados a medida en LabVIEW. La distancia entre las curvas se tomo como el promedio del valor absoluto de la diferencia de fluorescencia entre las curvas sobre todos los puntos de temperatura.

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El numero de grupos se identified de forma automatica mediante la seleccion de la mayor proporcion de distancias entre los niveles de agrupacion consecutiva. Los procedimientos de agrupacion representan medios menos precisos para agrupar genotipos que los nuevos procedimientos de agrupacion descritos en el presente documento (figuras 9A-D).

Ejemplo 4 - Exploracion y genotipado de CFTR

Se han elegido varios exones del gen regulador de la transconductancia de la fibrosis quistica (CFTR) para demostrar la exploracion y el genotipado simultaneos de multiples variantes. Se analizaron tres SNP en dos regiones del exon 11 del gen de CFTR con dos sondas no marcadas, secuencias en parte TCTTGGAGAA (SEQ. ID NO: 5) y AGGTCAACGA (SEQ. ID NO: 6). Dos de las mutaciones estaban separadas solo por seis bases, lo que permitia que una de las sondas pudiera cubrir ambas mutaciones (figura 7A). Se amplificaron cinco replicas de cada genotipo y se analizaron. Las curvas de fusion normalizadas despues de la SFE (figura 7B) muestran regiones de fusion de la sonda (56-74°C) y de fusion del producto de la PCR (80-83°C). En una observacion casual, no esta claro a partir de la curva de fusion normalizada que informacion se puede extraer. Sin embargo, cuando la region de la sonda se muestra como un grafico de la derivada (figura 7C), las transiciones de fusion de todos los alelos comunes con ambas sondas son evidentes. Ambas sondas no marcadas se emparejaban con la secuencia de tipo natural, pero una de las sondas era mas corta y contenia dU en lugar de dT para disminuir su temperatura de fusion. La sonda mas estable cubria un unico SNP, dando lugar a dos alelos separados por la Tf, siendo ambos mas estables que todos los alelos de la sonda menos estable. La sonda menos estable cubria dos SNP, dando lugar a tres picos para los genotipos comunes. El desapareamiento especifico y su posicion dentro de la sonda afectan a la estabilidad del duplex, permitiendo un diseno de sonda que distingue alelos multiples. En la figura 7D se muestra un grafico de las diferencias del producto de la PCR. Las muestras mutantes heterocigotas, de tipo natural y homocigotas son claramente diferentes. Sin embargo, es dificil distinguir entre diferentes heterocigotos solo mediante la fusion del producto de la PCR. La agrupacion jerarquica imparcial agrupaba todos los heterocigotos juntos (datos no mostrados). Los tres heterocigotos estan todos en la misma clase de SNP (12), dando lugar a los mismos desapareamientos de heteroduplex (C:A y T:G) y emparejamientos de homoduplex (C:G y A:T). Aunque las estabilidades previstas de los tres heterocigotos utilizando la termodinamica del vecino mas proximo (13, 14) no son identicas, el genotipado definitivo requeria la utilizacion de sondas. El punto fuerte de la fusion del producto es identificar facilmente la presencia de heterocigotos, mientras que las sondas no marcadas discriminan adicionalmente entre heterocigotos e identifican mas facilmente variantes de homocigotos. Tal como se ilustra con este ejemplo, la combinacion del genotipado y la exploracion da lugar a la observacion de transiciones de fusion del amplicon (producto de la PCR) y la sonda no marcada.

Ejemplo 5 - Genotipado de CFTR

Tambien se analizaron tres SNP y dos deleciones en el exon 10 del gen de CFTR con dos sondas no marcadas. La sonda con la mayor Tf, secuencia en parte TTCTCAGTTT (SEQ. ID NO: 7) cubria un unico SNP, mientras que la sonda con la Tf mas baja, secuencia en parte TATCATCTTTG (SEQ. ID NO: 8), cubria dos SNP y dos deleciones (figura 8A). Las curvas de fusion normalizadas despues de la SFE (figura 8B) muestran regiones de fusion de la sonda a baja temperatura (56-67°C), fusion de la sonda a alta temperatura (67-75°C) y fusion del producto de la PCR (80-83°). Cuando las regiones de las sondas se muestran como un grafico de la derivada (figura 8C), los cinco genotipos heterocigotos siguen trayectorias unicas que los distinguen del tipo natural y entre si. Cuatro de los heterocigotos muestran picos resueltos, mientras que uno se identifica por un pico ancho que resulta de un desapareamiento relativamente estable (un desapareamiento A:G cerca de un extremo de la sonda en una region rica en AT). La discriminacion de alelos no requiere una Tf unica para cada alelo, solo que las curvas sean diferentes en alguna region de la transicion de fusion. En la figura 8D se muestra un grafico de las diferencias de la transicion de fusion del producto de la PCR. El doble heterocigoto muestra la mayor desviacion del tipo natural, ya que estan presentes dos desapareamientos dentro del producto de la PCR. Los cuatro heterocigotos individuales son facilmente distinguibles del tipo natural. A diferencia del exon 11, todos los heterocigotos se pudieron genotipar mediante la fusion del producto de la PCR o la sonda. La consideracion de ambas regiones a menudo proporciona una confirmacion independiente del genotipo.

Ejemplo 6 - Genotipado del amplicon completo de 3 globina

La p globina presenta una diana genica con SNP conocidos que son importantes para el analisis de hemoglobinopatias, las mas destacadas son las mutaciones HbC y HbS. Se amplificaron muestras de ADN genomico humano de diferentes genotipos de p globina en un LightCycler de Roche utilizando volumenes de reaccion de 10 pi. Se utilizo 1X LCGreen® de Idaho Technology en la PCR para amplificar un amplicon de 45 pb: 5'-CCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCC-3' (SEQ. ID NO: 9). Las muestras del producto de la PCR se calentaron de aproximadamente 72°C a aproximadamente 88°C a 0,3°C/s en el instrumento de fusion HR-1. El tiempo requerido para la fusion es de aproximadamente 60 segundos.

El instrumento de fusion HR-1 midio y registro la fluorescencia de las muestras en funcion de la temperatura. La curva de fusion original para el amplicon completo de p globina se muestra en la figura 9A. A continuacion, se

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normaliza la curva de fusion original para el amplicon completo de p globina mediante el procedimiento de sustraccion del fondo exponencial descrito en el presente documento, lo que da lugar a una curva de fusion que es la fluorescencia relativa de las muestras en funcion de la temperatura en la figura 9B. La funcion de agrupacion de genotipos se realiza sobre las curvas de fusion normalizadas de la figura 9B. La figura 9C muestra los genotipos agrupados de las curvas de fusion normalizadas de la figura 9B.

Ejemplo 7 - Analisis de Ios graficos de diferenoias del tipo natural del factor V Leiden

Se amplificaron muestras de ADN genomico del factor V Leiden humano que representaban 60 muestras de tipo natural diferentes del factor V Leiden en un ABI 9700 con un volumen de reaccion de 10 p.l y 12 p.l de una capa de aceite. El ensayo incluyo un amplicon del factor V Leiden y una sonda no marcada, tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2, en presencia de 1X LCGreen Plus®. Las muestras de PCR resultantes se calentaron de 58°C a 88°C a 0,1°C/s en un instrumento de fusion LightScanner utilizando una placa de reaccion de 96 pocillos. El procedimiento de fusion total requirio aproximadamente 5 minutos para su finalizacion.

El instrumento de fusion LightScanner midio y registro la fluorescencia en funcion de la temperatura. La aplicacion de varias funciones en los graficos de diferencias proporciona un valor de diferencia de fluorescencia en funcion de la temperatura. Las curvas de fusion para 60 tipos naturales del factor V Leiden se muestran en la figura 10A despues de realizar la funcion de sustraccion del fondo exponencial. La curva de fusion normalizada aparece como una curva negra gruesa, que es caracteristica de las similitudes sustanciales de las 60 muestras de tipo natural.

La figura 10B representa el resultado grafico de la tecnica previa de la representacion de diferencias verticales, que representa la diferencia de fluorescencia vertical entre las 60 muestras de tipo natural en funcion de la temperatura. Esta tecnica previa de representacion de diferencias verticales presenta un artefacto interesante cuando las curvas de fusion tienen una pendiente suficientemente inclinada. El artefacto se manifiesta como una "burbuja" aproximadamente entre 80,25°C y 81,5°C (figura 10B), que es la parte mas inclinada de la pendiente de la curva de fusion de datos originales.

El artefacto del grafico de las diferencias verticales representa la amplificacion artificial de pequenas diferencias entre las 60 muestras de tipo natural. La figura 10C representa los resultados de la funcion del grafico de las diferencias ortogonales. Dado que la funcion del grafico de diferencias esta disenado para medir con precision la diferencia entre las muestras, la estrecha proximidad de la diferencia de fluorescencia representada en funcion de la temperatura es indicativa de la similitud significativa entre las 60 muestras de tipo natural (figura 10C). El grafico de la diferencia de fluorescencia frente a la temperatura de las 60 muestras de tipo natural aparece como una sola linea gruesa aproximadamente centrada en la diferencia de fluorescencia cero.

En referencia a la figura 11, se contempla que las realizaciones de la presente invencion se pueden implementar en un sistema informatico -100-. El sistema informatico -100- comprende un instrumento de fusion de acido nucleico -102-, un dispositivo de almacenamiento de memoria -104- y una unidad de procesamiento central (CPU) -106-. El dispositivo de almacenamiento de memoria -104- y la CPU -106- pueden estar integrados (no mostrado) dentro de la carcasa del instrumento de fusion -102- o pueden disponerse externamente (figura 11), ilustrativamente como un ordenador portatil o de sobremesa. El sistema -100- puede incluir de manera alternativa una interfaz grafica de usuario (GUl) -108- para la visualizacion, manipulacion y el analisis de la curva de fusion de alta resolucion. El usuario -110- puede interactuar directamente con el instrumento de fusion, la GUI o cualquier otro aspecto del sistema -100-. El dispositivo de almacenamiento de memoria -104- incluye un codigo legible por ordenador que es la realizacion exacta o equivalente a las realizaciones de la invencion dada a conocer en el presente documento. El codigo legible por ordenador incluye instrucciones para realizar los procedimientos descritos en el presente documento y se ejecuta mediante cualquier dispositivo de procesamiento central adecuado conocido en la tecnica. El software esta disponible con la mayoria de los instrumentos de fusion y, a menudo, permite la visualizacion de las transiciones de fusion de la sonda y del producto como picos derivados, habitualmente mediante la estimacion polinomial Salvitsky-Golay de la pendiente en cada punto. Varios dispositivos centrales de procesamiento ejecutan diferentes lenguajes de codificacion y los lenguajes de codificacion a menudo son distintos en su estructura y ejecucion. Las diversas realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo y el alcance de la presente invencion no pretende estar limitado por los ejemplos y ecuaciones proporcionadas en el presente documento.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> university of Utah Research Foundation Palais, Robert A Wittwer, Carl T

Claims

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reivindicaciones

1. Procedimiento para generar una curva de fusion corregida de una muestra de acido nucleico, que comprende medir la fluorescencia de la muestra de acido nucleico en funcion de la temperatura para producir una curva de fusion original, comprendiendo la muestra un acido nucleico y una molecula que se une al acido nucleico para formar un complejo detectable por fluorescencia, comprendiendo la curva de fusion original una senal de fluorescencia de fondo y una senal de la muestra de acido nucleico;

medir un primer y un segundo valores de pendiente a partir de puntos de la curva de fusion original situados en una region de la curva de fusion original en la que no tiene lugar la fusion del acido nucleico de muestra; utilizar el primer valor de pendiente y el segundo valor de pendiente para buscar un exponencial representativo del ruido de fondo; y

separar la senal de la fluorescencia de fondo de la senal de la muestra de acido nucleico mediante la utilizacion de un algoritmo de funcion exponencial para generar una curva de fusion corregida, incluyendo el algoritmo de funcion exponencial el exponencial representativo del ruido de fondo y comprendiendo la curva de fusion corregida la senal de la muestra de acido nucleico.
2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la senal de fluorescencia de fondo se calcula mediante el ajuste de un exponencial descendente a una curva de fluorescencia de fondo frente a temperatura, derivandose el exponencial descendente del primer valor de pendiente tomado de un punto anterior a la transicion de fusion del acido nucleico y el segundo valor de pendiente tomado de un punto posterior a la transicion de fusion del acido nucleico.
3. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, que comprende, ademas, realizar una funcion de diferencia para identificar diferencias entre la curva de fusion corregida y una curva de fusion corregida de una segunda muestra de acido nucleico.
4. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, que comprende, ademas, agrupar los genotipos de una pluralidad de muestras de acido nucleico adicionales, en el que el agrupamiento se consigue dinamicamente mediante la asociacion de la distancia minima entre los perfiles de fusion de las muestras de diferentes grupos.
5. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la senal de fluorescencia de fondo se calcula utilizando la ecuacion

en la que

ea(TR-TL) = B'(Tr)/B'(Tl),

ln (B'(Tr)/B'(Tl))

a =............................

(Tr - Tl)

B'(Tl) es el primer valor de pendiente, y B'(Tr) es el segundo valor de pendiente, y

la separacion de las senales de fluorescencia de fondo comprende la utilizacion de la ecuacion

M(T) = F(T) - Cea(T-TL)

en la que

M(T) es la senal de la muestra de acido nucleico, F(T) es la curva de fusion original, y

C = B'(TL)/a.
6. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la muestra de acido nucleico es un producto de doble cadena de una reaccion PCR.
7. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la muestra de acido nucleico esta genotipada para variaciones de secuencia conocidas y explorada para variaciones de secuencias desconocidas.
8. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la curva de fusion corregida comprende una transicion de fusion para un producto de PCR y una sonda no marcada.
9. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la muestra comprende un amplicon multiplex.
10. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que una o mas variantes de secuencia pueden estar presentes en

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el acido nucleico, identificandose las variantes a partir de la curva de fusion o la derivada de la misma.
11. Procedimiento, segun la reivindicacion 3, que comprende, ademas, realizar una funcion de superposicion de curvas con la curva de fusion corregida de la muestra y una curva de fusion de una segunda muestra corregida, requiriendo la funcion de superposicion de curvas un unico punto de datos.
12. Procedimiento, segun la reivindicacion 3, en el que la funcion de diferencia aproxima la distancia ortogonal entre la curva de fusion corregida y la curva de fusion de la segunda muestra corregida mediante la utilizacion de la siguiente ecuacion: f1 (T) - f2(T) = max (V(1 + f1 ’(T)2), V(1 + f2’(T)2)}.
13. Procedimiento, segun la reivindicacion 3, en el que la funcion de diferencia compensa el enfasis exagerado en las regiones de fusion de la curva de fusion corregida y la curva de fusion de la segunda muestra corregida.
14. Procedimiento, segun la reivindicacion 3, en el que la funcion de diferencia compensa el menor enfasis en las regiones de fusion primarias de la curva de fusion corregida y la curva de fusion de la segunda muestra corregida.
15. Procedimiento, segun la reivindicacion 7, en el que la reaccion PCR es asimedida, produciendo mas de una primera cadena de producto que de una segunda cadena de producto, realizandose la PCR en presencia de una sonda no marcada configurada para hibridarse a la primera cadena de producto.
16. Procedimiento, segun la reivindicacion 13, en el que la funcion de diferencia genera una medida de la diferencia que refleja las variaciones dependientes de la secuencia entre la primera curva de fusion de muestra y la curva de fusion de la segunda muestra.
17. Procedimiento, segun la reivindicacion 13, en el que la funcion de diferencia identifica un genotipo que corresponde a la primera muestra y un genotipo que corresponde a la segunda muestra.
18. Procedimiento, segun la reivindicacion 17, que comprende, ademas, agrupar los genotipos de una muestra de acido nucleico, en el que el agrupamiento se consigue dinamicamente mediante la asociacion de la distancia minima entre las curvas de fusion de muestra de grupos distintos.
19. Sistema para generar una curva de fusion corregida, que comprende:

un instrumento de fusion de alta resolucion para calentar un complejo detectable por fluorescencia mientras se controla su fluorescencia, comprendiendo el complejo un acido nucleico y una especie fluorescente, estando el instrumento de fusion adaptado para medir y registrar la temperatura de la muestra y la fluorescencia de la muestra para determinar la fluorescencia de la muestra en funcion de la temperatura de la muestra para producir un perfil de fusion, comprendiendo el perfil de fusion una senal de fluorescencia de fondo y una senal de fluorescencia de muestra;

una unidad central de procesamiento (CPU) para llevar a cabo instrucciones ejecutables por ordenador; y un dispositivo de almacenaje de memoria para almacenar instrucciones ejecutables por ordenador que, cuando son ejecutadas por la CPU, provocan que la cPu lleve a cabo un proceso para analizar las variaciones de secuencia del acido nucleico, en el que el procedimiento incluye generar una curva de fusion corregida mediante el procedimiento, segun la reivindicacion 1.
20. Sistema, segun la reivindicacion 19, que comprende, ademas: realizar una funcion de diferencia para identificar diferencias entre la curva de fusion de muestra corregida y una curva de fusion de la segunda muestra corregida, habiendose separado previamente la senal de fluorescencia de fondo de la primera curva de fusion de muestra corregida y la curva de fusion de la segunda muestra corregida.
21. Sistema, segun la reivindicacion 17, que comprende, ademas, agrupar los genotipos de una pluralidad de muestras de acido nucleico, alcanzandose el agrupamiento dinamicamente mediante la asociacion de la distancia minima entre las curvas de fusion de muestra de grupos distintos.
22. Sistema, segun la reivindicacion 19, en el que el sistema se configura para el genotipado para mutaciones conocidas y la exploracion para mutaciones no conocidas.
23. Sistema, segun la reivindicacion 19, en el que la funcion exponencial se calcula utilizando la ecuacion

ea(TR-TL) = B’(Tr)/B’(Tl),

ln (B’(Tr)/B’(Tl))

a =............................

(Tr - Tl)

B’(Tl) es el primer valor de pendiente, y

B’(Tr) es el segundo valor de pendiente, y la sustraccion comprende la utilizacion de la ecuacion 5 M(T) = F(T) - Cea(T-TL)

en la que

M(T) es la senal de la muestra,

10 F(T) es el perfil de fusion, y

C = B’(TL)/a.

Fluorescencia Fluorescencia

imagen1

imagen2

Temperatura (°C)

g3qgQ3558SSgB88a8a0SQ5£iS3S225Sa’83B8G88i5

A1

DI

Cl

Dl

El

FI

G1

HI

A!

B2

C2

D2

E2

F2

G2

H2

A3

B3

C3

D3

E3

F3

G3

H3

A4

B4

C4

D4

E4

F4

G4

H4

AS

Por favor, agrupe el am pi icon con los cursores inferiores (1 y 2) y los cursores superiores (3 y 4)

imagen3

imagen4

Figura 3A

imagen5

imagen6

imagen7

Temperatura (°C)

imagen8

Fluorescencia

imagen9

CD

_Tipo natural qJ C2S2Y Het C2B2Y Horn § H63D Het H63D Horn |§ S65C Het H Desconocido-1 ^ Desconocido-2 ^ Desconocido-3

imagen10

imagen11

IY>

'si

Tipo natural A C2S2Y Het Q

imagen12

C282Y Ham @ .A''"'

H63D Hst (fl /vA

HGSDHam S6EC Het

Desconocido-1

Desconocido-2

Desconocido-3

AtA

A A

imagen13

Figura 4B

imagen14

l\0

00

_Tipo natural jp

led - Paintj ||

C2S2Y Horn ^ H63D Het ^ H63D Horn ^ SSSCHet 83

Desconocido-1 m Desconocido-2 Desconocido-3 09

imagen15

I—

£

TJ

■

imagen16

Datos originates

l\3

CO

imagen17

222251= Datos normalizados

200000 - 180000- 160000 - 140000- 120000 - 100000 - 80000 - 60000 - 40000 - 20000 -

Figura 4E

94-

58,5 60,0

62,0

64,0

66,0

68,0

70,0

72,0

74,0

76,0

Jf

78,0

80,0

82,0

84,0

86,0 87,

CO

o

Figura 4F

IH63D T139C S65C _____Amp-licon

CS92V huso fass

HETS

Doble

Tipo natural

imagen18

Fluorescencia

imagen19

Temperatura

imagen20

imagen21

■dF/dT

imagen22

20-

15-

10-

5-

0-

58 60

62 64

66 68 70 72 74 76 78

Temperatura

80 82 84

Fluorescencia

Figura 6A

imagen23

Temperatura

dF/dT

CO

CD

imagen24

dF/dT

imagen25

Temperatura

-dF/dT

OJ

00

imagen26

imagen27

(3551 R553

<3542

Tipo natural

TCTTGGAGAA

■AGGTCAACGA..

G542XHem

Figura 7B

100

Temperatura (C)

A Fluorescencia (%)

Figura 7C

imagen28

Temperatura (°C)

imagen29

Temperatura (°C)

imagen30

1507

ST508

sd

0453

1506

Tipo natural

, TTCTCAGTTT

.tATCA'TCTTTG

• CO>'*»k

HE07Hftfc

^F50SH#t

rsoscfie

aiGC.-Het

Figura 8B

80

imagen31

imagen32

A Fluorescencia (%)

Fluorescencia Fluorescencia

imagen33

Temperatura (°C)

imagen34

imagen35

Temperatura (°C)

to

O O

imagen36

imagen37

Usuario

GUI

102

Dispositivo de

a macenamiento

de memoria

Instrumento de fusion

104

FIG. 11