KR20220063434A

KR20220063434A - 뎅기바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 바이오센서

Info

Publication number: KR20220063434A
Application number: KR1020200149275A
Authority: KR
Inventors: 이택; 최진하; 이연주; 민준홍
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2022-05-17
Also published as: KR102535008B1

Abstract

본 개시는 단일 가닥으로 형성된 제1올리고뉴클레오티드, 상기 제1올리고뉴클레오티드의 5'말단에 연결되는 고정부, 상기 제1올리고뉴클레오티드의 3'말단에 연결되는 신호부 및 뎅기바이러스(Dengue virus)의 RNA 염기서열의 일부인 제2올리고뉴클레오티드를 인식하고 결합하는 크리스퍼/Cpf1 복합체(CRISPR/Cpf1 complex)를 포함하는 제1제제, 및 상기 크리스퍼/Cpf1 복합체에 상기 제2올리고뉴클레오티드와 경쟁적으로 결합하는 DNA 염기서열을 갖는 제3올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2제제를 포함하는 뎅기바이러스 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 뎅기바이러스 검출용 바이오센서, 및 상기 바이오센서를 포함하는 뎅기바이러스 검출용 진단키트에 관한 것이다.

Description

뎅기바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 바이오센서{Composition for detecting dengue virus and a biosensor including the same}

본 개시(disclosure)는 뎅기바이러스(dengue virus)를 전기화학적 방법으로 검출하기 위한 조성물, 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다.

뎅기(Dengue) 바이러스는 플라비비리대 과(family Flaviviridae)의 플라비바이러스 속(genus Flavivirus)에 속하는 단일가닥양성(single strand postivie-sense) RNA 바이러스이다. 뎅기열과 뎅기출혈열은 뎅기바이러스에 감염된 이집트숲모기(Aedes aegypti)나 흰줄숲모기(Aedes albopictus)가 사람을 무는 과정에서 발병하는 급성열성 질환이다.

뎅기바이러스에 감염되면 임상 증상에 따라 고열, 반점, 백혈구 감소증과 혈소판 감소증을 동반하는 뎅기열, 심한 경우인 출혈이 동반되는 뎅기출혈열(dengue haemorrhagic fever) 및 혈관의 투과성 증가와 저혈압성 쇼크를 동반하는 뎅기쇼크 증후군(dengue shock syndrome)이 나타나며, 매년 세계적으로 약 5천만 명 내지 1억 명의 뎅기바이러스 감염자가 발생하고 있는 것으로 추정된다.

뎅기바이러스는 혈청학적으로 다른 네 가지 혈청형(DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4)이 존재하고, 이 네 가지 혈청형은 밀접하게 연관이 되어 질병을 일으킨다. 이들 뎅기바이러스는 동일한 증상을 유발하기 때문에 증상만으로는 감염된 뎅기바이러스의 혈청형을 구분할 수 없다. 동일한 혈청형에 대해서는 일생 방어 면역이 성립되지만 다른 혈청형에 재감염되면 방어되지 않을 뿐만 아니라 오히려 증상을 악화시킬 수 있다.

감염시 관절통, 근육통, 급성 발열 등이 동반되고 대부분 7-10일 후에 회복되지만, 일부 환자를 사망에 이르게 한다. 뎅기열은 전염속도가 가장 빠른 열대성 질환으로 질병관리본부에 의하면 현재 전 세계 인구의 약 3분의 1이 뎅기바이러스의 감염 위험에 노출되어 있고, 매년 400만 명의 감염자가 발생하고 있다. 해외여행의 증가로 우리나라로 유입된 사례가 보고되고 있다. 그러나, 현재 예방 백신과 특별한 치료제가 없고, 모기에 물리지 않도록 예방하는 것이 중요하다.

감염된 바이러스의 혈청형을 구분하는 일반적인 방법으로는 모기 혹은 세포 배양액을 통해 바이러스를 분리한 후 뎅기바이러스 각 혈청형 특이적인 항체를 이용하여 면역형광법으로 분석하는 것이다. 그러나 바이러스 분리는 수일에서 수주가 소요되고, 검체의 부적절한 처리나 바이러스 항체 복합체 형성, 살아있는 바이러스의 낮은 카피수(copy number) 등으로 인해 검사 성공률이 매우 낮은 실정이다.

현재 뎅기열의 진단에 사용되는 방법은 효소면역측정법(ELISA)에 의해 혈청에서 안티-뎅기 IgM 및 IgG의 혈청학적 검출에 기반을 두고 있다. 그러나, 검체 시료 내에 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 등과 같은 유사 바이러스의 존재 시에는 중복 검출로 인해 진단 결과에 대한 신뢰도가 낮으며, 이러한 혈청학적 방법으로는 질병의 초기 단계에서 뎅기바이러스의 감염을 검출할 수 없다는 단점이 있다.

최근에 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)이 신속하고 민감도가 높으며 간편하고, 정확하게 작동 시 재현성이 우수하다는 장점으로 인해 뎅기바이러스를 비롯한 다수의 RNA 바이러스 검사를 위해 사용되고 있다. 비록 RT-PCR은 바이러스 분리 시스템과 유사한 민감성을 가지지만 일반적인 배양법에서처럼 서툰 조작이나 부적절한 시료 저장 상태, 항체로 인해 그 결과에 영향을 받지 않는다. 그러나 RT-PCR은 부적절한 프라이머 디자인 또는 PCR 조건, 그로 인한 비특이적 혼성화로 인해 나타나는 위-양성(false-positive) 결과가 문제시 되고 있다. 그리고 RT-PCR에서 증폭단계는 많은 시간, 비용이 들고 절차가 복잡한 문제점이 있다.

첫째, 뎅기바이러스에 높은 민감도(sensitivity)와 향상된 검출한계(Limid of Dectection, LOD)를 갖는 조성물 및 바이오센서를 제공하는 것이다.

둘때, 뎅기바이러스의 조기진단을 위한 진단키트를 제공하는 것이다.

셋째, 뎅기 바이러스와 결합가능한 크리스퍼/Cpf1 복합체(CRISPR/Cpf1 complex에 경쟁적으로 결합하는 DNA를 활용한 바이오센서를 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 단일 가닥으로 형성된 제1올리고뉴클레오티드, 상기 제1올리고뉴클레오티드의 5'말단에 연결되는 고정부, 상기 제1올리고뉴클레오티드의 3'말단에 연결되는 신호부 및 뎅기바이러스(Dengue virus)의 RNA 염기서열의 일부인 제2올리고뉴클레오티드를 인식하고 결합하는 크리스퍼/Cpf1 복합체(CRISPR/Cpf1 complex)를 포함하는 제1제제; 및 상기 크리스퍼/Cpf1 복합체에 상기 제2올리고뉴클레오티드와 경쟁적으로 결합하는 DNA 염기서열을 갖는 제3올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2제제;를 포함하는 뎅기바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 신호부는 산화환원반응을 통해 외부로 전자를 전달하는 메틸렌블루를 포함할 수 있다.

상기 제1올리고뉴클레오티드의 3'말단에 결합하여 상기 신호부와 상기 제1올리고뉴클레오티드를 연결하는 연결부;를 더 포함할 수 있다.

상기 연결부는 비오틴(Biotin) 결합단백질일 수 있다.

또한, 상기 신호부는 상기 비오틴 결합단백질과 결합하는 아비딘(Avidin)계열의 단백질과 금나노입자를 결합시킨 아비딘계열 단백질-금나노입자를 상기 메틸렌블루와 컨쥬게이션(conjugation)시킬 수 있다.

상기 아비딘계열의 단백질은 스트렙타비딘(Streptavidin)일 수 있다.

한편, 상기 제2뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열 중 하나의 염기서열일 수 있다.

상기 제3뉴클레오티드는 상기 서열번호 1 내지 상기 서열번호 4의 염기서열에 각각 대응되어 상기 크리스퍼/Cpf1 복합체에 경쟁적으로 결합가능한 서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열중 하나의 염기서열일 수 있다.

상기 크리스퍼/Cpf1 복합체의 크리스퍼는 상기 서열번호 1 내지 상기 서열번호 4의 염기서열에 대응되어 각각 결합가능한 염기서열중 하나의 염기서열로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 제1올리고뉴클레오티드는 서열번호 9의 염기서열로 이루어질 수 있다.

한편, 상기 바이러스 검출용 조성물 및 상기 고정부와 결합되는 기판부를 포함하는 뎅기바이러스 검출용 바이오센서를 제공하는 것이다. .

상기 신호부는

산화환원반응을 통해 외부로 전자를 전달하는 메틸렌블루를 포함할 수 있다.

상기 연결부는 비오틴(Biotin) 결합단백질일 수 있다.

상기 신호부는 상기 비오틴 결합단백질과 결합하는 아비딘(Avidin)계열의 단백질과 금나노입자를 결합시킨 아비딘계열 단백질-금나노입자를 상기 메틸렌블루와 컨쥬게이션(conjugation)시킬 수 있다.

상기 제2뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열 중 하나의 염기서열일 수 있다.

상기 크리스퍼/Cpf1 복합체의 크리스퍼는 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 제4뉴클레오티드일 수 있다.

한편, 상기 뎅기바이러스 검출용 바이오센서를 포함하는 뎅기바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.

첫째, 뎅기바이러스에 높은 민감도(sensitivity)와 향상된 검출한계(Limid of Dectection, LOD)를 가질 수 있다.

둘때, 뎅기바이러스의 조기진단을 위한 진단키트를 개발할 수 있다.

셋째, 뎅기 바이러스와 결합가능한 크리스퍼/Cpf1 복합체(CRISPR/Cpf1 complex)에 경쟁적으로 결합하는 DNA를 활용한 바이오센서를 개발할 수 있다.

도 1(a)내지 도 1(c)는 본 개시에서 설명하는 바이오센서의 원리를 개략적으로 설명한 것이다.
도 2(a)는 단일가닥 DNA(ssDNA)의 3'말단에 금나노입자 및 메틸렌블루가 결합시 제타포텐셜 측정값을 나타낸 것이다. 도 2(b)는 단일가닥 DNA(ssDNA)의 3'말단에 금나노입자 및 메틸렌블루가 결합된 모습을 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope)으로 촬영한 것이다.
도 3는 TBE-PAGE에서의 전기영동의 일례를 도시한 것이다.
도 4(a)는 금 기판(bare AU), 금 기판에 ssDNA가 결합된 경우, 3'말단에 금나노입자(AuNPs)와 메틸렌블루가 결합된 ssDAN의 경우, Exo1이라는 제한효소를 첨가한 경우의 사각형파 전압전류법(Square Wave Voltammetry Method, SWV 법)에 의한 전압 및 전류를 나타낸 것이다. 도 4(b)는 3'말단에 금나노입자(AuNPs)와 메틸렌블루가 결합된 경우, Exo1이라는 제한효소를 첨가한 경우 전류피크값을 비교한 것이다.
도 5(a)는 금 기판(bare AU), 3'말단에 메틸렌블루가 결합된 ssDNA의 경우, 3'말단에 금나노입자(AuNPs)와 메틸렌블루가 결합된 ssDNA경우의 사각형파 전압전류법(Square Wave Voltammetry Method, SWV 법)에 의한 전압 및 전류를 나타낸 것이다. 도 5(b)는 각각의 전류피크값을 비교한 것이다.
도 6는 TBE-PAGE에서의 전기영동의 다른 일례를 도시한 것이다.
도 7(a)는 DENV-4 tcDNA의 농도에 따라 달라지는 사각형파 전압전류법(Square Wave Voltammetry Method, SWV 법)에 의한 전압 및 전류를 나타낸 것이다. 도 7(b)는 DENV-4 tcDNA의 농도에 따른 전류피크값을 나타낸 것이다.
도 8(a)는 DENV-4 RNA의 농도에 따라 달라지는 사각형파 전압전류법(Square Wave Voltammetry Method, SWV 법)에 의한 전압 및 전류를 나타낸 것이다. 도 8(b)는 DENV-4 RNA의 농도에 따른 전류피크값을 나타낸 것이다. 도 8(c)는 뎅기바이러스의 농도에 따른 사각형파 전압전류법(Square Wave Voltammetry Method, SWV 법)에 의한 전압 및 전류를 나타낸 것이다. 도 8(d)는 DENV-4 RNA의 농도에 따른 전류피크값을 나타낸 것이다.
도 9(a)는 DENV-4 tcDNA와 결합시 CRISPR/Cpf1 복합체의 ssDNA의 절단효과를 확인하기 위한 전류피크값의 일례이다 도 9(b)는 DENV-4 RAN와 결합ㅅCRISPR/Cpf1 복합체의 ssDNA의 비절단효과를 확인하기 위한 전류피크값의 일례이다.

이하에서는 첨부된 도면을 참고하여 본 개시의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 이하에 기술될 장치의 구성이나 제어방법은 본 개시의 실시예를 설명하기 위한 것일 뿐 본 개시의 권리범위를 한정하기 위함은 아니며, 명세서 전반에 걸쳐서 동일하게 사용된 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.

본 명세서 중에서 사용되고 있는 특정한 용어는 단지 설명의 편의를 위한 것일 뿐으로 예시된 실시예의 한정으로 사용되고 있는 것은 아니다.

이하에서 언급되는 구성요소 앞에 '제1, 제2, 제3' 등의 표현이 붙는 용어 사용은, 지칭하는 구성요소의 혼동을 피하기 위한 것일 뿐, 구성요소들 사이의 순서, 중요도 또는 주종관계 등과는 무관하다. 예를 들면, 제1구성요소 없이 제2구성요소 만을 포함하는 발명도 구현 가능하다.

본 명세서에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

도 1은 본 개시의 일례인 뎅기바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용하는 바이오센서(100)를 도시한 것이다. 그리고 작동원리를 개략적으로 나타낸 것이다.

도 1(a)를 참조하면, 본 개시의 일례인 뎅기바이러스 검출용 조성물은 단일 가닥(single strand)으로 형성된 제1올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 상기 제1올리고뉴클레오티드의 5'말단에 연결되는 고정부(120), 상기 제1올리고뉴클레오티드의 3'말단에 연결되는 신호부(110) 및 뎅기바이러스(Dengue virus)의 RNA 염기서열의 일부인 제2올리고뉴클레오티드를 인식하고 결합하는 크리스퍼/Cpf1 복합체(CRISPR/Cpf1 complex, 130)를 포함하는 제1제제와 상기 크리스퍼/Cpf1 복합체에 상기 제2올리고뉴클레오티드와 경쟁적으로 결합하는 DNA 타입의 제3올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2제제를 포함할 수 있다.

상기 제1올리고뉴클레오티드는 단일가닥의 DNA(이하 ssDNA라 칭함)일 수 있다. 구체적으로는 본 명세서에서는 서열번호 9의 ssDNA를 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 단일가닥의 DNA타입의 올리고뉴클레오티드이면 어떠한 것이든 무방하다. 후술할 크리스퍼/Cpf1 복합체(CRISPR/Cpf1 complex, 130)가 특정 염기서열을 갖는 제3올리고뉴클레오티드에 결합 후, 절단기능이 활성화되어 비특이적으로 ssDNA를 절단하기 때문이다. 즉, 상기 ssDNA는 DNA를 구성하는 4가지 염기의 조합으로 이루어진 단일가닥의 올리고뉴클레오티드이면 어떠한 것이든 무방하다.

상기 제1올리고뉴클레오티드의 5'말단에는 고정부(120)가, 3' 말단에는 신호부(110)가 결합될 수 있다. 상기 고정부(120)는 기판부(140)와의 결합을 위해 필요하고, 상기 신호부(110)는 외부로의 전자전달을 위해 필요하기 때문이다.

상기 고정부(120)의 일례로 티올기(Thiol)기가 사용될 수 있다. 이와 달리 아민(Amine)기를 이용할 수도 있다. 상기 신호부는 산화환원반응을 통해 전자전달이 가능한 분자이면 어떠한 것이든 무방하다. 구체적으로 메틸렌블루(Methylene Blue 또는 MB)가 이용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 메틸렌블루(113)가 제1올리고뉴클레오티드의 3'말단에 결합하여 사용되어도 외부에서 기판부를 통해 전기화화적 신호, 예컨대 전류 또는 임피던스, 를 측정하할 수 있다. 그러나, 상기 메틸렌블루의 신호를 증폭하기 위해서 상기 신호부(110)는 금나노입자(Au nanoparticle, 또는 AuNP)(111)를 포함할 수 있다.

상기 금나노입자(111)또는 AuNP는 소정의 나노크기의 직경을 갖는 금으로 만들어진 입자를 뜻한다. 일반적으로 구형일 수 있으나 반드시 원형에 국한되지 않는다. 나노크기란 200nm이하의 입자를 뜻하며, 단일입자일 수도 있고, 혼성화된(hybrid) 입자일 수도 있다. 입자를 구형으로 가정시 금나노입자(111)의 직경은 바람직하게 10 nm일 수 있다.

상기 금나노입자(111)에는 스트렙타비딘(strpetabvidin 또는 STV,)이라는 결합단백질과 결합될 수 있다. 이를 스트렙타비딘과 결합된 금나노입자(이하 STV-AuNP)라 칭한다. 상기 금나노입자(111)를 스트렙타비딘과 같은 결합단백질과 결합시키는 이유는 상기 금나노입자를 상기 ssDNA에 결합시키기 위함이다.

스트렙타비딘(112)은 아비딘(avidin)계열의 결합단백질로 비오틴(biotin)(113)이라는 결합단백질과 결합하는 것으로 잘 알려져 있다. 스트렙타비딘 외에도 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)을 이용하여도 비오틴 단백질과 결합가능하다.

상기 신호부(110)는 MB와 STV-AuNP가 결합된 형태일 수 있다. MB가 STV-AuNP(112)와 컨쥬게이션(conjugation)되면, 메틸렌블루가 결합된 스트렙타비딘-금나노입자(이하 STV-MB-AuNP(117)라 칭함)를 형성할 수 있다. STV-AuNP에는 상기 금나노입자의 넓은 표면적으로 인해 메틸렌블루가 복수 개 결합될 수 있으므로, 상기 신호부(110)에서 발생되는 전기화학적 신호가 더 증폭될 수 있는 효과를 가질 것이다. 이에 대해서는 후술할 실시예4에서 실험하였다.

도 1(a)를 참조하면, 상기 STV-MB-AuNP(117)가 상기 ssDNA(125)와 결합하기 위해서는 상기 ssDNA(125)의 3'말단에는 상기 STV-MB-AuNP(117)와 결합시키기 위한 연결부(127)가 구비될 수 있다. 상기 연결부(127)는 바람직하게 비오틴(bioton) 결합단백질을 포함할 수 있다.

따라서, 상기 ssDNA(125)의 5'말단에는 고정부(120), 3'말단에는 연결부(127)가 위치할 수 있고, 상기 연결부(127)가 다시 신호부(110)와 결합될 수 있다. 즉, 상기 ssDNA(125)의 3'말단과 신호부(110) 사이에는 연결부(127)가 위치할 수 있다.

상기 고정부(120)와 상기 연결부(127)를 포함하는 ssDNA의 구조의 일례로 5'-/5ThioMC6-D/ATG TTG TTC TGC CCA TCG/3Bio/-3'를 가질 수 있다. Bio는 비오틴(biotin)의 약자이고, 5ThioMC6-D 는 5' Thiol Modifier C6 S-S를 뜻한다. 이를 SH-ssDNA-biotin이라 칭한다.

상기 SH-ssDNA-biotin과 상기 STV-MB-AuNP(117)가 스트렙타비딘-비오틴의 결합에 의해 결합시, SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP라 칭하였다. 또는 간략히 SH-ssDNA-biotin/MB-AuNP라 칭하였다.

상기 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP는 티올기에 의해 기판부(140)에 고정화될 수 있다. 상기 기판부(140)는 MB에서 방출되는 전자를 전기적연결을 통해 외부로 내보낼 수 있다. 이를 외부에서 전류나 임피던스로 감지할 수 있다. 이를 통해 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP의 전기화학적 신호의 변화를 감지하여 뎅기바이러스를 검출할 수 있는 것이다.

상기 제1제제는 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP와 더불어 뎅기바이러스(Dengue virus)의 RNA 염기서열의 일부인 제2올리고뉴클레오티드를 인식하고 결합하는 크리스퍼/Cpf1 복합체(CRISPR/Cpf1 complex, 130)를 포함한다.

상기 크리스퍼/Cpf1 복합체(130) 또는 크리스퍼 복합체는 크리스퍼라는 가이드 RNA(crRNA)와 Cpf1이라는 제한효소가 결합된 복합체로 유전자편집을 위해 사용되고 있다. 특히 크리스퍼 복합체의 제한효소로 Cas9과 달리 Cpf1은 단일 RNA에 의해 구동되는 절단효소로 crRNA만 필요로 하고 tracrRNA는 불필요하다. 그리고 표적의 절단을 위한 인식부위의 서열인 PAM(protospacer-adjaent motif)이 필수적으로 요구되지 않는다.

상기 크리스퍼 복합체가 인식하여 절단하는 타겟DNA가 있는 경우, 상기 크리스퍼 복합체가 타겟DNA에 결합한 후, Cpf1의 절단기능이 활성화되어 주변의 비특이적인 ssDNA도 절단하는 현상이 일어난다. 이러한 크리스퍼 유전자가위를 기반으로 한 분자진단기술 개발을 이용한 것은 셜록(SHERLOCK, Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) 기술, 디텍터(DETECTR) 기술 등이 있다

본 개시는 이러한 기술을 이용한 뎅기바이러스의 RNA를 검출할 수 있는 조성물 및 이를 활용한 바이오센서 또는 진단키트에 관한 것이다.

뎅기바이러스는 양성 단일가닥 RNA바이러스로 혈청학적으로 4가지 혈청형(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4)이 존재한다. 따라서, 뎅기바이러스(Dengue virus)의 RNA 염기서열의 일부인 제2올리고뉴클레오티드는 혈청형에 따라 각각 DENV-1 RNA, DENV-2 RNA, DENV-3 RNA 및 DENV-4 RNA의 4가지가 가능하다. 각각의 염기서열은 아래의 표 1 또는 서열목록에서 서열번호 1 내지 서열번호 4에 해당한다. 상기 DENV-1 RNA, DENV-2 RNA, DENV-3 RNA 및 DENV-4 RNA는 뎅기바이러스의 4가지 혈청형을 대표하는 염기서열일 수 있다. 이와 달리, 뎅기바이러스(Dengue virus)의 RNA 염기서열 전부를 이용하여도 무방하다.

본 개시에서 서열번호 1 내지 서열번호 4에 해당하는 DENV-1 RNA, DENV-2 RNA, DENV-3 RNA 및 DENV-4 RNA는 각각 특이적으로 식별할 수 있는 염기서열일 수 있다.

그리고, 상기 DENV-1 RNA, DENV-2 RNA, DENV-3 RNA 및 DENV-4 RNA에 대응되는 경쟁적인 DNA타입의 제3올리고뉴클레오티드로는 DENV-1 tcDNA, DENV-2 tcDNA, DENV-3 tcDNA 및 DENV-4 tcDNA가 있다. 각각의 염기서열은 아래의 표 1 또는 서열목록에서 서열번호 5 내지 서열번호 8에 해당한다. 여기서 tc는 검출대상과 경쟁적(target competitive)이라는 뜻이다. 예컨대, DENV-1 RNA의 염기서열이 5'-CGUACAGCUUCCAUGGUUUG-3' 이면, 상기 DENV-1 RNA와 크리스퍼복합체에 경쟁적으로 결합하는 DENV-1 tcDNA의 염기서열은 5'-CGTACAGCTTCCATGGTTTG-3'이다. 즉, DNA타입이므로 핵산이 바뀌고, 염기가 우라실(U)대신 티민(T)로 바뀐 것이다. DENV-2 tcDNA, DENV-3 tcDNA 및 DENV-4 tcDNA도 마찬가지로 변경된 것이다.

또한, 상기 크리스퍼(crRNA/Cpf1) 복합체는 검출대상인 DENV-1 RNA, DENV-2 RNA, DENV-3 RNA 및 DENV-4 RNA 중 어느 하나를 인식해서 결합가능하도록 설계되어 있다. 즉, 상기 DENV-1 RNA, DENV-2 RNA, DENV-3 RNA 및 DENV-4 RNA 중 어느 하나와 상보적인 결합이 가능하도록 염기서열이 설계되어 있다. 또한, 상기 크리스퍼는 상기 DENV-1 RNA, DENV-2 RNA, DENV-3 RNA 및 DENV-4 RNA 중 어느 하나와 경쟁적인 DENV-1 tcDNA, DENV-2 tcDNA, DENV-3 tcDNA 및 DENV-4 tcDNA와도 결합가능하다.

즉, DENV-1 RNA 및 DENV-1 tcDNA가 crRNA에 경쟁적으로 결합가능하도록 상기 크리스퍼가 설계될 수 있다. 또는 DENV-2 RNA 및 DENV-2 tcDNA가 crRNA에 경쟁적으로 결합가능하도록 상기 크리스퍼가 설계될 수 있다. 또는 DENV-3 RNA 및 DENV-3 tcDNA가 crRNA에 경쟁적으로 결합가능하도록 상기 크리스퍼가 설계될 수 있다. 또는 DENV-4 RNA 및 DENV-4 tcDNA가 crRNA에 경쟁적으로 결합가능하도록 상기 크리스퍼가 설계될 수 있다.

구체적으로 상기 crRNA의 염기서열중 하나가 아래의 표 1 또는 서열목록에서 서열번호 10에 표시되어 있다. 이는 DENV-4 crRNA 로 DENV-4 RNA 및 DENV-4 tcDNA가 경쟁적으로 결합가능한 크리스퍼 RNA의 하나이고, 5'-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUCCAACAAGCAGAACAACAU-3'과 같은 염기서열을 가지고 있다.

이하에서는 DENV-4 crRNA (이하 crRNA로 칭함)를 이용하여 실시예 및 설명을 하고 있으나, 뎅기바이러스의 다른 혈청형의 RNA바이러스인 DENV-1 RNA, DENV-2 RNA 또는 DENV-3 RNA를 검출하기 위해 crRNA를 얼마든지 변형설계가 가능하다. 또한, 각각 crRNA에 경쟁적으로 결합할 수 있는 상기 DENV-1 tcDNA, DENV-2 tcDNA 또는 DENV-3 tcDNA도 자명하게 합성가능하다.

이하에서는 구체적인 예를 들어 크리스퍼 복합체를 활용한 뎅기바이러스의 검출원리를 설명하였다.

서열번호 10의 염기서열을 갖는 DENV-4 crDNA (이하 줄여서 crDNA)의 경우 서열번호 4의 염기서열을 갖는 DENV-4 RNA를 인식하여 결합할 수 있다. 즉, crDNA/Cfp1 복합체는 DENV-4 RNA를 인식하고 결합할 수 있다. 또한 crDNA/Cfp1 복합체는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 DENV-4 tcDNA (target competivie DNA)와도 결합할 수 있다.

즉, 검출대상(target)인 DENV-4 RNA와 상기 DENV-4 RNA와 염기서열이 동일하나 DNA 타입인 DENV-4 tcDNA는 crDNA/Cfp1 복합체에 경쟁적으로 결합할 수 있다.

이때, crDNA/Cfp1 복합체가 DENV-4 tcDNA와 결합시에는 Cfp1의 절단(cleavage)기능이 활성화되어 주변에 위치하는 ssDNA를 비특이적으로 절단할 수 있다. 반면, crDNA/Cfp1 복합체가 DENV-4 RNA와 결합시에는 Cfp1의 절단(cleavage)기능이 활성화되지 못한다.

즉, crDNA/Cfp1가 DENV-4 tcDNA와 결합시 주변의 ssDNA를 비특이적으로 절단하는 반면, crDNA/Cfp1는 DENV-4 RNA와 결합시에는 주변의 ssDNA를 절단하지 못한다.

만약 ssDNA가 절단시 발현되는 형광리포터가 있다면, 이를 통해 뎅기바이러스가 존재하는지 안하는지 알 수 있을 것이다. 마찬가지로 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP에서 crDNA/Cfp1가 DENV-4 tcDNA와 결합시 ssDNA가 절단된다면, MB에 의한 외부로의 전자전달이 차단될 것이다. 반면, SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP에서 crDNA/Cfp1가 DENV-4 RNA와 결합시에는 ssDNA가 절단되지 않으므로 MB에 의한 외부로의 전자전달이 차단되지 않을 것이다.

예컨대, 검사대상(sample)에 DENV-4 tcDNA를 포함하는 제2제제와 섞은 후, 크리스퍼 복합체와 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP를 포함하는 제1제제와 반응시킬수 있다. 만약 검사대상에 검사대상에 DENV4-RNA가 존재하지 않는다면, 즉 DENV-4형의 바이러스에 감염되지 않았다면, DENV-4 tcDNA만이 crDNA/Cfp1에 결합하게 될 것이다. 이 경우 전기화학적 특성, 예컨대 전류값, 의 변화가 매우 크게 나타날 것 것이다.

만약 검사대상에 DENV4-RNA가 존재한다면, 즉 DENV-4형의 바이러스에 감염되었다면, DENV4-RNA가 DENV-4 tcDNA와 경쟁적으로 crDNA/Cfp1에 결합하게 될 것이다. 이 경우 전기화학적 특성, 예컨대 전류값, 의 변화가 상대적으로 크지 않을 것이다. 이러한 원리를 이용하게 되면, 뎅기바이러스의 감염여부를 진단할 수 있다. 이러한 전기화학적 특성을 이용하면 증폭과정과 같은 과정이 불필요할 수 있다.

도 1(b)를 참조하면, 사람의 혈액과 같은 검사대상(sample)과 DENV-4 tcDNA를 소정의 농도 비율로 섞은 용액을 crDNA/Cfp1 복합체와 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP을 포함하는 제1제제와 반응시키면, 검사대상에 DENV-4 RNA가 있는 경우 crDNA/Cfp1 복합체에 DENV-4 tcDNA와 경쟁적으로 결합할 수 있다. 이 경우, DENV-4 RNA와 결합된 crDNA/Cfp1 복합체는 ssDNA를 절단하지 못하므로, MB에서 산화환원반응에 의해 방출되는 전자가 줄어들지 않는다. 따라서, 전기화학적 특성, 예컨대 전류값, 의 변화가 크지 않을 것이다. 상기 DENV-4 RNA의 농도가 많을수록 더욱 전기화학적 특성의 변화가 없을 것이다. 이를 비효소적 효과(non-enzymatic effect)라 칭한다.

반면, 도 1(c)를 참조하면, 검사대상(sample)에 DENV-4 RNA가 없는 경우 crDNA/Cfp1 복합체는 DENV-4 tcDNA와만 결합하게 되므로, crDNA/Cfp1 복합체는 ssDNA를 절단할 수 있다. 따라서, MB에서 산화환원반응에 의해 방출되는 전자가 외부로 방출되지 않게 된다. 따라서, 전기화학적 특성, 예컨대 전류값이 줄어들게 될 것이다.

즉, crDNA/Cfp1 복합체에 대한 DENV-4 RNA와 DENV-4 tcDNA의 경쟁적 결합에 따라 전기화학적 특성이 달라지는 원리를 이용한 것이다. 그러므로 뎅기바이러스 검출용 조성물은 제1제제와 DENV-4 tcDNA를 포함하는 제2제제를 포함할 수 있다.

지금까지는 DENV-4 RNA와 DENV-4 tcDNA에 대해서만 설명하였으나, 전술한 바와 같이 각 혈청형에 따라 경쟁적인 DNA를 합성하고, 이를 인식하는 crRNA를 합성할 수 있으므로 뎅기바이러스의 4가지 혈청형을 모두 검출할 수 있다.

위와 같은 뎅기바이러스 검출용 조성물중 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP는 SH기를 이용하여 기판부(140)에 고정화시킬 수 있다. 이 경우 상기 기판부(140)를 통해 외부로 전기적으로 연결될 수 있으므로 바이오센서로 활용가능할 것이다.

즉 본 개시에서 바이오센서(100)의 일례는 상기 뎅기바이러스 검출용 조성물 및 상기 고정부와 결합되는 기판부(140)를 포함할 수 있다.

상기 기판부(140)는 금으로 형성될 수 있다. 상기 기판부(140)는 일종의 전극(electrode)역할을 수행할 수 있다.

상기 기판부(140)는 실리콘(Si) 웨이퍼의 표면이 금으로 얇게 박막코팅된 형태일 수 있다. 일례로 상기 기판부(140)는 Si 웨이퍼를 고온에서 산소에 노출시켜 산화시켜 SiO₂층을 형성하여 절연층을 형성한 후, 그 위에 크롬(Cr)과 금(AU)을 전자빔 증착장비(e-beam evaporator)를 이용하여 증착시킨 형태일 수 있다. 이를 금기판(141)이라 칭한다. 바람직하게 Cr과 AU가 증착된 두께는 각각 2 nm와 50 nm일 수 있다. 크롬과 금의 증착을 위해 전자빔 증착장비대신 스퍼터(Sputter)나 열증착방법등 다양한 방법을 사용할 수 있다.

만약 크롬과 금을 증착하기에 앞서, 리쏘그래피를 활용하여 패턴화시키는 경우, 기판부(140)에는 최소한 4개의 배열을 갖도록 Si 웨이퍼에 사각형 판 형태의 금을 증착시킬 수 있다. 각각의 배열에는 검사용액을 수용할 수 있는 PDMS형태의 챔버가 부착될 수 있다. 그리고, 상기 최소한 4개의 배열위에 각각 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP와 크리스퍼 복합체를 고정화시킬수 있다. 이 때 크리스퍼 복합체는 각각 DENV-1 RNA와 DENV-1 tcDNA, DENV-2 RNA와 DENV-2 tcDNA, DENV-3 RNA와 DENV-3 tcDNA DENV-4 RNA와 DENV-4 tcDNA를 인식하는 4종류의 크리스퍼 복합체가 들어있다. 이 경우, 각 챔버에서 각 혈청형을 검출가능하므로 이를 통해 한번에 동시에 뎅기바이러스의 혈청형을 판단할 수 있을 것이다.

아래의 표 1에서는 본 명세서에서 언급된 다양한 종류의 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 정리하여 나타내었다.

[표 1]

이하에서는 본 발명의 실시예를 상세히 설명하였다.

실시예 1. 메틸렌블루(MB)와 스트렙타비딘-금나노입자의 컨쥬게이션(conjugation)

메틸렌블루(Methylene Blue 또는 MB, 112)와 컨쥬게이션(conjugation)된 스트렙타비딘(streptavidin 또는 STV, 113)-금나노입자(AuNP, 111)은 정전기적 인력을 이용하여 결합시켰다. 양의 전하를 가진 메틸렌블루(112)는 음의 전하를 띄는 금나노입자(111)에 고정화시킬 수 있다. 우선 10nm 직경의 금나노입자(111)에 아비딘(avidin)계열의 결합단백질, 예컨대 스트렙타비딘(streptabividin), 이 결합된 스트렙타비딘-금나노입자(111)를 메틸렌블루(112)와 함께 인산완충생리식염수(Phosphate Buffered Saline, pH = 7.4, 이하 PBS라 칭함)에 넣는다. 그리고, 상기 스트렙타비딘-금나노입자(111)와 메틸렌블루(112)를 몰비(molar ratio) 1:20으로 400 RPM(revolutions per minute, 분당회전수)에서 20분동안 섞는다. 이전 논문에 따르면, 스트렙타비딘-금나노입자(STV-AuNP, 115)와 메틸렌블루(112)의 몰비 1:20은 가장 우수한 안정성을 갖는 컨쥬게이트된 반응을 보이기 때문에 선정되었다. 반응하지 않은 입자들이나 분자들을 없애기 위해, 스트렙타비딘-금나노입자(111)와 메틸렌블루(112)이 섞인 용액을 4000 RPM에서 30분간 3 kDa의 초원심분리 필터장치(3kDa ultra centrifugal filter device)를 이용하여 농축시켰다. 스트렙타비딘-금나노입자(111)와 메틸렌블루(112)가 결합되어 스트렙타비딘-메텔린블루-금나노입자(또는 STV-MB-AuNP, 117)를 형성하는 것을 확인하기 위해, 제타포텐셜을 측정하였다. 도 2(a)는 스트렙타비딘-금나노입자(STV-AuNP, 115)와 스트렙타비딘-메텔린블루-금나노입자(또는 STV-MB-AuNP, 117)의 제타포텐셜을 비교하여 나타낸 것이다. MB가 STV-AuNP(115)와 결합하는 경우, MB(112)의 양전하로 인해 AuNP(111)의 표면전하가 양의 값을 가지게 되므로 제타포텐셜 값에 변화가 일어날 수 있다. 이를 실험으로 확인한 결과 스트렙타비딘-금나노입자(STV-AuNP, 115)일 때는 제타포텐셜 값이 -28.17 mV인 반면, 스트렙타비딘-메텔린블루-금나노입자(또는 STV-MB-AuNP, 117)는 제타포텐셜 값이 -16.90 mV로 절대값이 줄어들었음을 알 수 있다.

도 2(b)는 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 이용해 촬용한 MB-AuNP의 이미지이다. 이를 통해 AuNP와 결합된 MB가 기능성을 가짐을 알 수 있다. AuNP 주변의 코로나(corona)는 MB가 기능화(functionalization)된 것을 뜻한다. 도 2(b)에 도시된 TEM 사진의 스케일바(scale bar)는 5 nm이다.

실시예 2. 크리스퍼 RNA(crRNA)에 DENV-4 RNA와 경쟁적으로 결합하는 DENV4-tcDNA의 특이적 결합 테스트

검출대상(taget)인 서열번호 4의 염기서열을 갖는 DENV-4 RNA가 상기 DENV-4RNA를 인식하고 결합하는 크리스퍼 RNA(crRNA)에 결합하는지 여부와, 경쟁적 검출대상 (competitive target)인 서열번호 8의 DENV-4 tcDNA가 상기 크리스퍼 RNA(crRNA)에 결합하는지 여부를 테스트하였다. 우선, 200 μL의 스트렙타비딘-금나노입자(STV-AuNP, 115)와 서열번호 9의 염기서열을 갖는 ssDNA의 5’말단에 티올기, 3’말단에 비오틴이 결합된 10 μM의 SH-ssDNA-biotin 중 100 μL를 1시간동안 상온(room temperature 또는 RT)에서 반응시켰다. 상기 SH-ssDNA-biotin은 구체적으로 5'-/5ThioMC6-D/ATG TTG TTC TGC CCA TCG/3Bio/-3’의 구조를 갖는다. 상기 ssDNA는 18 mer 즉, 18개의 뉴클레오티드로 구성된다. 5’말단에는 고정부로 활용하기 위한 티올기가 결합하고, 3’말단에는 STV-MB-AuNP와 결합가능하기 위해 비오틴(Biotin) 결합단백질과 결합될 수 있다.

1시간동안 상온(room temperature 또는 RT)에서 반응시킨 후, 반응물을 10000 RPM에서 10분간 원심분리한 후, 탈이온수(DeIonized Water)를 이용하여 3번 세척하였다. 그리고, STV-AuNP(115)와 결합된 SH-ssDNA-biotin에 10 μM의 crRNA (염기서열은 5’-UAA UUU CUA CUC UUG UAG AUU UCC AAC AAG CAG AAC AAC AU-3’ 이고, 염기의 개수는 41 mer이다) 100 μL를 추가한 후, 1시간동안 상온에서 반응시켰다. 반응물을 10000 RPM에서 10분간 원심분리한 후 DEPC 처리수를 이용해 3번 세척하였다.

마지막으로, 10 μM의 DENV-4 tcDNA(5’-ATG TTG TTC TGC TTG TTG GAA-3’, 21 mer)에서 100 μL와 10 μM의 서열번호 11의 염기서열을 갖는 HRPzyme-3WJa(5’-TT TGG GTA GGG CGG GTT GGG TTG CCA TGT GTA TGT GGG-3’, 38 mer)에서 100 μL를 취해 각각 STV-AuNP와 결합된 SH-ssDNA-biotin에 추가한 후, 반응을 위해 1시간 대기하였다. 다시 10000 RPM에서 10분간 원심분리한 후, 상층액(supernatant)을 취하였다. DENV-4 tcDNA와 특이적으로 결합된 crRNA는 TBE 버퍼(Tris-Borate-EDTA Buffer)에서 8% 네이티브(native) 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)을 이용하여 전기영동(80V에서 50분간)시켰다.

크리스퍼(Crisper) 작동 원리에 따라, ssDNA를 무작위로 절단하는 기능은 DENV-4 RNA와 등동한 염기서열을 갖는 DENV-4 tcDNA와 crRNA에 결합된 Cpf1 단백질에 의해 활성화된다. 따라서 검출대상(target)과 crRNA/Cpf1 복합체(complex)의 특이적 결합을 확인할 필요가 있다.

도 3을 참조하면, tcDNA와 crRNA/Cpf1 복합체의 특이적 결합을 확인하기 위해 폴리아크릴아마이드 젤을 활용한 전기영동(Polyacrylamide gel Electrophoresis 또는 PAGE)을 수행 하였다. 전기영동시키는 샘플의 사이즈 비교를 위한 DNA ladder 래더는 1번 레인(lane)에 추가되었고, SH-ssDNA- biotin (18 mer), crRNA (41 mer), DENV-4 tcDNA (21 mer)는 각각 2번, 3번, 4번 레인에 추가되었다. 그리고, SH-ssDNA-biotin, crRNA 와 DENV-4 tcDNA는 5번 레인에 추가되었다. 그리고, SH-ssDNA-biotin, crRNA 와 비표적DNA(HRPzyme-3WJa, 38 mer)은 6번 레인에 추가되었다. 마지막으로 음성 대조군으로 비표적 DNA(HRPzyme-3WJa)는 7번 레인에 추가되었다.

도 3을 참조하면, 전기영동결과 5번레인에서는, 탐침(probe)인 SH-ssDNA-biotin과 crRNA/Cpf1 복합체가 결합되어 상부 밴드가 발생했음을 보여주고 있다. 5번레인에서는 SH-ssDNA-biotin, crRNA 와 DENV-4 tcDNA가 혼합되어 있다. 이 때, 뉴클레오티드 결합 사이의 더 긴 염기쌍이 안정적이고, 새로운 혼성화(hybridization)를 유도한다는 DNA가닥 치환의 원리(principle of strand displacement)에 의해 SH-ssDNA-biotin과 crRNA의 결합보다, DENV-4 tcDNA와 crRNA의 상보적 결합이 보다 안정적이므로, crRNA와 DENV-4 tcDNA가 결합하게 된다.

그리고, crRNA와의 상보적 반응을위한 DENV-4 tcDNA 서열은 SH-ssDNA- biotin보다 뉴클레오티드(nucleotide 또는 NT)가 3 MER 더 많도록 설계되었다. 그러므로, 5번 레인의 상부 밴드는 DENV-4 tcDNA와 crRNA가 결합된 것임을 알 수 있다.

반면, crRNA와 대조군(6번 레인)과의 반응 결과는 대조군만 있는 결과(7번 레인)와 유사하였다. 따라서, 이는 crRNA가 비표적DNA와 반응하지 않았음을 알 수 있다. 이러한 결과는 DENV-4 tcDNA와 crRNA가 서로 특이적으로 결합하는 것을 뜻한다.

실시예 3. 엑소뉴클레아제 I을 이용하여 전기화학적방법으로 ssDNA의 절단여부 확인

Cpf1이라는 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 ssDNA 절단실험에 앞서, 서열번호 9의 염기서열을 갖는 ssDNA가 Cpf1과 유사한 엑소뉴클레아제(Exonuclease)의 하나인 Exo1을 이용하여 상기 ssDNA의 절단실험을 수행하였다.

이를 위해 금으로 코팅되거나 금이 증착된 기판(이하 금기판, 151)을 피라냐 용액(Piranha solution)으로 전처리하였다. 피라냐 용액은 황산과 과산화수소가 7:3의 비율로 혼합된 것으로 상온에서 이물질 제거를 위한 세척용으로 사용할 수 있다. 이 후, 3시간동안 SH-ssDNA-biotin를 상기 금기판(141)에 고정화시키는 작업을 수행하였다. SH-ssDNA-biotin의 티올(Thiol)기가 금기판(141)에 상기 SH-ssDNA-biotin를 고정시킬 수 있다. 이후 탈이온수로 세척한 후, STV-MB-AuNP를 SH-ssDNA-biotin이 고정된 금기판(141)(0.8 cm × 2 cm)위에서 1시간동안 배양시켰다. STV-MB-AuNP의 스트렙타비딘(STV)과 SH-ssDNA-biotin의 비오틴(biotin)을 서로 결합시키기 위함이다. 그리고 1시간동안 Exo1과 반응시켰다.

Exo1에 의한 ssDNA의 절단여부를 전기화학적으로 확인하기 위해, 사각형파 전압전류법(Square Wave Voltammetry Method, 또는 SWV법)을 이용하였다. 이를 위해 전기화학에서 잘 알려진 통상의 3 전극시스템(3-electrode system)을 활용하였다. SWV법에 의해 전류를 측정하기 위해서는, SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP가 고정된 금기판(141)을 동작 전극(working electrode), 백금와이어(Pt-wire)를 보조 전극(counter electrode), 그리고 Ag/AgCl을 기준 전극(reference electrode)으로 활용하였다. 실험은 전위가변기(potentiostat)을 이용하였고, 주파수는 15Hz, 진폭은 25 mV, 단차(step height)는 4 mV 조건에서 측정하였다. 구체적인 실험방법은 통상의 기술자에게 자명한 사항이므로 생략하였다.

또한, SWV법 대신 순환전압전류를 이용하건 임피던스를 측정하는 임피던스 분광법(Electrochemical impedance Spectroscopy 또는 EIS)을 이용하여도 무방하다.

도 4를 참조하면, Exo1이 활성화된 경우, ssDNA의 트랜스 절단(trans-cleavage)기능을 갖는 것을 전기 화학적 신호의 변화를 통해 확인하였다. 이와 유사하게 후술할 CRISPR/Cpf1 복합체의 ssDNA 절단기능도 전기화학적 신호의 변화를 통해 확인 가능하다. 선행 논문(Lee et al., Mater. Sci. Eng. C. 99 (2019) 511-519) 에서 MB와 콘쥬게이션(conjugation)된 ssDNA의 전기화학적 신호는 Exo1을 사용하여 감소됨을 확인하였다. 도 4(a)와 도 4(b)를 참조하면, Exo1을 사용하여 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP에서 ssDNA 절단을 통해 MB의 전기화학적 신호 변화를 확인하였다. 도 4(a)를 참조하면, 전류피크(current peak)는 사각형파 전압전류법(Square Wave Voltammetry Method, 또는 SWV법)을 통해 -0.4 V에서 -0.1 V 사이에서 나타났음을 알 수 있다. 순수한 금기판(bare Au, 실선)의 경우, ssDNA가 상기 금기판에 고정화된 경우(ssDNA, 짧은 점선), 상기 금기판에 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP가 고정화된 경우(MB-AuNPs, 긴 점선), 그리고 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP에 Exo1을 첨가한 경우(Exo1 rxn, 일점쇄선)을 비교하면, MB-AuNPs의 경우가 가장 큰 전류값을 나타냄을 알 수 있다.

그리고, MB-AuNPs에 비해 Exo1 rxn의 경우, 실험한 전압범위에서 대응되는 전류값이 상대적으로 모두 줄어들었음을 알 수 있다.

그리고 도 4(b)를 참조하면, Exo1을 사용시 전류가 14.79 μA로 감소한 반면 Exo1이 없는 경우 26.90 μA로 전류가 변하지 않았음을 확인할 수 있다. 그리고, 에러바는 실험횟수 8번에 대한 상대적인 표준오차(relative standard deviation)를 뜻한다.

실시예 4. MB와 결합(conjucated)된 금나노입자에 의한 전기화학적 신호의 향상

CRISPR/Cpf1 복합체를 기반으로 하는 바이오센서의 성능을 평가하기 위해, 사각형파 전압전류법(Square Wave Voltammetry Method, 또는 SWV법)을 수행하였다. ssDNA가 절단시 메틸렌블루(MB)의 전기화학적 거동을 살펴보기 위해, SWV법을 전술한 금기판(141)위에서 Tris-HCl 버퍼(buffer)용액내에서 수행하였다.

SWV법에 의해 전류를 측정하기 위해서는, SH-ssDNA에 MB만 결합된 SH-ssDNA-MB가 고정화된 금기판 또는 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNPs가 고정화된 금기판(141)을 동작 전극(working electrode), 백금와이어(Pt-wire)를 보조 전극(counter electrode), 그리고 Ag/AgCl을 기준 전극(reference electrode)으로 활용하였다. 실험은 전위가변기(potentiostat)을 이용하였고, 주파수는 15Hz, 진폭은 25 mV, 단차(step height)는 4 mV 조건에서 측정하였다.

실험의 일례로 SH-ssDNA-MB가 고정화된 금기판 또는 위에 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNPs가 고정화된 금기판(141)위에 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane 또는 PDMS)로 만들어진 챔버를 부착시킨 후, 상기 챔버에 Tirs-HCl 버퍼용액을 넣은후 3전극시스템을 이용하여 SWV법으로 측정할 수도 있다. 이와 달리 상기 고정화된 금기판의 일정 부분을 Tirs-HCl 버퍼용액에 담근 후 이를 동작 전극으로 하여 SWV법으로 전류를 측정할 수도 있다. 이는 전기화학분야의 통상의 기술자에게는 자명하므로 생략하였다.

본 개시에서 메틸렌블루(MB)는 일종의 전기화학프로브(probe)로 사용되었다. MB의 전기화학적 특성이 2개의 전자와 1개의 양성자 전달로 인해 감소되기 때문이다. 따라서 준가역적 산화 환원 피크는 -0.4V 와 -0.1V의 전압 범위에서 나타났다. 전술하였듯이 도 2(b)에서 AuNP에서 MB의 기능화를 확인할 수 있다. MB-AuNPs에 의 전기화학적 신호가 강화되는 효과를 확인하기 위해, SH-ssDNA-MB 및 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNPs를 금기판에 고정화한후 측정한 결과는 도 5(a)와 도 5(b)에 나타내었다.

도 5(a)를 참조하면, SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNPs를 금기판에 고정화시킨 경우(약칭, MB-AuNPs로 긴 점선으로 표시)에 있어서, MB의 산화환원반응시 전류피크값이 SH-ssDNA-MB을 금기판에 고정한 경우(약칭, MB-ssDNA로 짧은 점선으로 표시)보다 상대적으로 더 높게 나타났다. 대조군으로 순수 금기판(Bare Au)에서 산화환원반응에 따른 전류를 실선으로 나타내었다. 도5(b)를 참조하면, 8번의 반복실험을 통해, SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNPs를 금기판에 고정화시킨 경우(약칭, MB-AuNPs로 긴 점선으로 표시)의 전류피크값이 SH-ssDNA-MB을 금기판에 고정한 경우(약칭, MB-ssDNA로 짧은 점선으로 표시)보다 더 높음을 알 수 있었다.

이를 통해, 금나노입자(AuNP)를 사용하면 MB의 결합 영역을 확장 할 수 있다. 왜냐하면, 도 1(a)에 도시되었듯이, MB의 단일 분자가 ssDNA에 결합하는 대신 금나노입자(AuNP)에 복수 개의 MB가 결합할 수 있기 때문이다. 따라서 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNPs로 개질된 금기판은 전기화학적 신호를 보다 향상시킬 수 있다.

즉, 금나노입자를 통해 MB의 전자전달신호를 쉽게 증폭할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 5. crRNA/Cpf1 복합체의 활성화에 대한 실험

crRNA/Cpf1 복합체가 ssDNA를 절단하는지 확인하기 위해 우선, 200 μL의 10 nm의 직경을 갖는 AuNP와 100 μL의 10μM SH-ssDNA-biotin (5 '-/ 5ThioMC6-D / ATG TTG TTC TGC CCA TCG / 3Bio / -3', 18 mer)을 1시간동안 상온에서 반응시켰다. AuNP와 결합되지 않은 ssDNA를 제거하기 위해, 반응물을 10 분 동안 10000 RPM에서 원심분리한 후 탈이온수(DIW)를 사용하여 3회 세척하였다. 1μM의 crRNA (5'-UAA UUU CUA CUC UUG UAG AUU UCC AAC AAG CAG AAC AAC AU-3 ', 41 mer)와 0.8μM의 Cpf1을 1:1의 부피비로 10 분 동안 반응시키고 1시간동안 상온에서 SH-ssDNA-biotin과 결합된 STV-AuNP에 첨가하였다.

결합되지 않은 crRNA를 없애기 위해, 위와 동일한 조건으로 원심분리한 후 DEPC처리수로 세척하였다. 마지막으로, 100 μL의 10 μM DENV-4 tcDNA (5'-ATG TTG TTC TGC TTG TTG GAA-3 ', 21 mer) 및 100 μL의 절단버퍼(cleavage buffer)를 넣고 반응시켜 2시간동안 ssDNA를 절단시켰다. 상기 절단버퍼는 20mM HEPES (pH 7.5), 150mM KCl, 10mM MgCl2, 1 % 글리세롤 및 0.5mM DTT로 구성될 수 있다.

이와 유사하게, 서열번호 12의 염기서열을 갖는 HRPzyme 3WJ-c (5'-GGA TCA ATC ATG GCA A-3 ', 16 mer) 10 μM의 대조군으로 DENV-4 tcDNA대신 첨가하였다.

이후 각 샘플을 동일한 조건에서 원심분리한 후, 상층액(supernatant)을 취하였다. 그리고 TBE 버퍼(Tris-Borate-EDTA Buffer)에서 8% 네이티브(native) 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)을 이용하여 전기영동(80V에서 50분간)시켜 crRNA/Cpf1 복합체의 특이적 결합을 시각화시켰다.

crRNA/Cpf1 복합체의 활성화를 시각화하기 위해, 실시예 2와 유사하게, TBE 버퍼(Tris-Borate-EDTA Buffer)를 이용하여 전기영동(PAGE)실험을 수행하였다. TBE-PAGE실험에서 DNA 래더는 1번 레인, SH-ssDNA-biotin (18 mer)는 2번 레인, crRNA (41 mer)는 3번 레인에 배치하였다. 그리고, DENV-4 tcDNA (21 mer)는 4번레인, crRNA/Cpf1 복합체는 SH-ssDNA-biotin과 DENV-4 tcDNA와 반응시킨 후 5번 레인에서 배치되었다. crRNA/Cpf1 복합체와 다른 비표적 DNA(HRPzyme 3WJ-c, 16 mer)가 6번레인에 추가되었고, 7번레인에는 음성대조군으로 상기 다른 비표적 DNA(HRPzyme 3WJ-c, 16 mer)만 추가되었다.

도 6을 참조하면, 5번 레인에서는 DENV-4 tcDNA에 상보적으로 결합된 crRNA로 인해 밴드 위치가 변하였음을 알 수 있다. 전술한 바와 같이 5번 레인의 상단 밴드는 crRNA/Cpf1과 DENV-4 tcDNA의 복합체를 뜻한다. crRNA/Cpf1/tcDNA 복합체는 Cpf1의 활성화로 인해 트랜스 절단(trans-cleavage)효과로 5번 레인의 하단에 위치하는 밴드가 2번 레인과 같은 SH-ssDNA-biotin의 단편화를 보인다고 가정할 수 있다.

5번 레인과 달리 6번 레인에서는 아무런 이동 변화가 없었다. 이는 설계된 crRNA/Cpf1 복합체가 비표적DNA와 반응하지 않았음을 뜻한다. 이러한 결과를 바탕으로 CRISPR/Cpf1 복합체, 구체적으로는 crRNA/Cpf1 복합체, 가 tcDNA와 결합한 후, ssDNA를 절단하였음을 알 수 있다.

실시예 6. 전기화학적 분석

우선 순수한 금기판(bare gold electrode)을 5분 동안 소니케이션(soncation)하에 아세톤(acetone)으로 세척하였다. 다음으로 10 μM의 SH-ssDNA-biotin 3μL를 상기 금기판 위에 자체조립된 단일층(self-assembled monolayer)을 형성하도록 3시간동안 놔두었다. 이후 탈이온수로 세척하고 질소 가스를 이용하여 건조시켰다. 그리고, 참고문헌(Li et al., RSC Adv. 7 (2017) 21666-21670)에 참조하여 만든 동일한 부피의 STV-MB-AuNP와 1시간 동안 반응시켰다. 이는 STV-MB-AuNP의 스트렙타비딘과 SH-ssDNA-biotin의 비오틴을 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 반응에 의해 결합시키기 위함이다.

또한, 30 nM 의 Cpf1을 37 ℃에서 10분 동안 36 nM의 crRNA와 사전 조립시켰다. 이러한 반응비는 일 실시예로 Cpf1과 crRNA를 1:1로 하여도 무방하다. 또한 Cpf1과 crRN을 극미량이용하므로, 이와 다른 비율로 반응시켜도 무방하다. 그리고, crRNA/Cpf1 복합체를 상기 금기판에 10분 동안 고정화(immobilization)시켰다.

전기화학적 방법으로 절단여부를 확인하기 위해 검출대상(target)인 DENV-4 RNA 및 절단버퍼를 개질화된(modified) 금기판에서 배양하였다. 강기 개질화된 금기판이란, SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP이 금기판에 고정화된 후, crRNA/Cpf1을 고정화한 금기판을 뜻한다.

또한, 검출대상과 경쟁적 관계에 있는 일정한 농도의 DENV-4 tcDNA를 상기 금기판 위에 동일한 비율로 동시에 첨가 하였다. 또한, 절단여부를 분석하기 위해, DENV-4 tcDNA 및 20mM HEPES (pH 7.5), 150mM KCl, 10mM MgCl2, 1 % 글리세롤 및 0.5mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol 또는 DTT)로 구성된 절단버퍼(cleavage buffer)를 개질화된 금기판에서 배양하였다.

마지막으로, MB의 산화-환원 전류는 20mM NaCl (pH 7.4)를 포함하는 20mM Tris-HCl에서 SWV법을 이용하여 측정하였다. SWV법은 Exo1을 이용한 절단 실험과 동일한 조건에서 수행하였다.

MB의 전기화학적 신호는 절단 전과 절단 후를 비교하였으며, 전류피크값의 유의한 차이는 검출대상인 DENV4-RNA 농도에 기인한 것으로 나타났다.

크리스퍼 시스템에서는 Cas라는 제한효소(restriction endonuclease)유형에 따라 단일가닥 DNA(single strand DNA, 또는 ssDNA), 이중가닥 DNA(double strand DNA, 또는 dsDNA) 및 RNA와 같은 각 유형의 표적 핵산과 반응하여 절단기능이 활성화 될 수 있다. 이중, Cpf1 단백질은 DNA 타입의 올리고뉴클레오티드와 반응하여 표적(target)인 dsDNA 또는 ssDNA를 절단하는 것으로 알려져 있다.

그러나, 뎅기바이러스의 RNA는 Cpf1 단백질과 반응하나, Cpf1의 절단 기능은 비활성화된다. 이는 Cpf1의 트랜스 절단(trans-cleavage)기능이 표적 DNA에와 결합시에만 활성화되기 때문이다. 이러한 선택적 활성화(selective-activating)특성을 이용하여, 뎅기바이러스의 RNA(DENV RNA)를 상기 DENV RNA에 경쟁적인 tcDNA와 함께 crRNA/Cpf1 복합체와의 전기화학적 반응을 측정하였다.

tcDNA는 crRNA에 DENV RNA와 경쟁적으로 반응 또는 결합하여 트랜스 절단(trans-cleavage) 기능을 활성화시켜 ssDNA를 절단할 수 있다. DENV RNA를 측정하기에 앞서, 크리스퍼(CRISPR)기반의 절단 및 검출 시스템의 검증을 위해 tcDNA와 산화-환원 피크강도 사이의 선형 관계를 SWV법으로 확인하였다.

도 7(a)를 참조하면, MB의 산화- 환원 피크는 DENV-4 tcDNA 농도가 10 nM에서 1 pM까지 증가함에 따라 감소했습니다. crRNA/Cpf1 복합체는 tcDNA와 결합시, 비특이적으로 주변의 ssDNA를 트랜스 절단(trans-cleavage)하기 때문이다. 따라서, DENV-4 tcDNA 농도가 클수록 산화-환원피크는 더 감소함을 알 수 있다.

도 7(b)를 참조하면, 95 % 신뢰수준에서 높은 결정계수(R2) 값(0.9848)을 가지므로, tcDNA 농도와 전기화학적 신호(전류) 사이에 선형 관계가 있음을 알 수 있다.

도 8은 제작된 바이오센서(100)의 검출한계(Limit of Detection, 또는 LOD) 및 DENV-4 RNA농도와 전기화학저 신호(전류) 사이의 선형관계를 도시하고 있다. 이미 도 6에서, 전기영동실험을 통해, CRISPR/Cpf1 복합체에 표적 염기서열 (DENV-4 tcDNA)이 존재하는 경우 ssDNA 절단 현상이 일어남을 확인하였다.

도 8(a)를 참조하면, SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP 및 crRNA/Cpf1 복합체가 고정화된 금기판을 이용하여, Tris-HCl 버퍼(buffer)에서 10 pM의 DENV-4 tcDNA와 함께 DENV-4 RNA를 농도별로 추가한 후, SWV법에 따른 전압 및 전류의 관계를 도시하였다. DENV-4 RNA의 농도가 100 fM(femtomole)에서 1 nM까지 증가하면서 점점 산화전류피크값이 증가함을 알 수 있다. 여기서 f는 femto의 약자로 10-15을 뜻한다.

DENV-4 RNA의 농도가 증가함에 따라 특정 DNA를 인식하는 Cpf1의 트랜스 절단(trans-cleavage) 기능이 비활성화 되었기 때문이다.

도 8(b)는 DEN4-4 RNA의 농도에 따른 전류피크값의 관계를 나타낸 것이다. 이를 토대로, 본 개시에서 설명한 바이오센서(100)의 검출 한계(LOD)는 Tris-HCl 버퍼에서 100 fM으로 계산될 수 있다. 그리고, 상기 실험의 반복횟수는 8번이다.

도 9(a)를 참조하면, 뎅기바이러스의 다른 혈청형에 따른 RNA바이러스 및 다른 DNA를 이용하여, crRNA/Cpf1 복합체가 DENV-4 tcDNA에 특이적으로 결합하여 ssDNA를 절단하는지 여부를 테스트한 결과를 도시하고 있다. 모두 10pM의 농도에서 테스트하였고, 실험횟수는 8번이다.

즉, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DENV-1 RNA(DENV 1으로 표시), 서열번호 2의 염기서열을 갖는 DENV-2 RNA(DENV 2으로 표시), 서열번호 3의 염기서열을 갖는 DENV-3 RNA(DENV 3으로 표시), DENV-4 RNA와 하나의 염기서열이 다른 서열번호 13의 염기서열을 갖는 SM (single mismatched DENV-4 RNA), 및 서열번호 15의 염기서열을 갖는 지카바이러스 RNA(zika virus RNA, 또는 ZIKV 로 표시) 염기서열의 일부를 각각 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP 및 crRNA/Cpf1 복합체가 고정화된 금기판을 이용하여, Tris-HCl 버퍼에서 SWV법으로 전압-전류를 측정한 후, 각 염기서열에서의 전류피크값을 도시하였다.

비표적인 염기서열을 갖는 경우 유사한 전류피크값을 가지나, DENV-4 tcDNA의 경우, crRNA/Cpf1 복합체와의 결합을 통해 ssDNA를 절단하므로 전류피크값이 감소했음을 알 수 있다.

도 8(c)는 뎅기바이러스에서 추출한 RNA를 목표농도(cfu/ml)에 탈이온수나 DEPC처리수에 희석하여 사용하였다. 그리고 일정농도의 DENV-4 tcDNA 하에서 SWV법에 따라 전류를 측정하였다. 일르 통해, 실제 바이러스의 농도가 증가하면 추출한 RNA의 농도가 증가하므로, 전류피크값도 증가함을 알 수 있다.

도 8(d)는 각 바이러스의 농도에 따른 전류피크값을 도시한 것이다. 도 8(d)를 참조하면, 매우 낮은 바이러스의 농도에서도 어떠한 핵산증폭과정이 없이도 DENV-4 RNA가 검출가능함을 알 수 있다. 이를 토대로, 본 개시에서 설명한 바이오센서(100)의 검출 한계(LOD)는 1 cfu/ml로 계산될 수 있다.

도 9(b)를 참조하면, 뎅기바이러스의 다른 혈청형에 따른 RNA바이러스 및 다른 DNA와 일정 농도의 DENV-4 tcDNA를 첨가하여, crRNA/Cpf1 복합체가 DENV-4 tcDNA에 특이적으로 결합하여 ssDNA를 절단하는지 여부를 테스트한 결과를 도시하고 있다. 모두 10pM의 농도에서 테스트하였고, 실험횟수는 8번이다.

즉, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DENV-1 RNA(DENV 1으로 표시), 서열번호 2의 염기서열을 갖는 DENV-2 RNA(DENV 1으로 표시), 서열번호 4의 염기서열을 갖는 DENV-4 RNA, 상기 DENV-4 RNA와 하나의 염기서열이 다른 서열번호 13의 염기서열을 갖는 SM (single mismatched DENV-4 RNA), 상기 DENV-4 RNA와 2개의 염기서열이 다른 서열번호 14의 염기서열을 DM (double mismatched DENV-4 RNA), 및 서열번호 15의 염기서열을 갖는 지카바이러스 RNA(zika virus RNA, 또는 ZIKV 로 표시)의 염기서열 일부를 각각 일정한 농도로 혼합한 후, 소정의 시간이 경과 후 Tris-HCl 버퍼에서 SWV법으로 전압-전류를 측정하였다. 이후 각 염기서열에서의 전류피크값을 도시한 것이다. 전술한 바와 같이 모두 SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP 및 crRNA/Cpf1 복합체가 고정화된 금기판을 이용하였다.

이를 통해, DENV-4 RNA가 있는 경우에는 DENV-4 tcDNA와 경쟁적으로 crRNA/Cpf1 복합체와 결합하므로, 전류피크값이 상대적으로 덜 떨어짐을 알 수 있다. 이는 DENV-4 RNA의 농도가 증가함에 따라 DENV-4 tcDNA보다 crRNA/Cpf1복합체와 더 많이 결합하여, 특정 DNA(DENV-4 tcDNA)를 인식하는 Cpf1의 트랜스 절단(trans-cleavage) 기능이 비활성화 되었기 때문이다.

따라서, SH-ssDNA-biotin/STV-MB-AuNP 및 crRNA/Cpf1 복합체가 포함된 제1제제와 DENV-4 tcDNA가 포함된 제2제제를 이용하면 DENV-4 RNA를 검출할 수 있는 조성물이 되며, 이를 토대로 상기 제1제제가 고정화된 금기판을 포함하느 전기화학기반의 바이오센서로 활용할 수 있다. 또한, 검사용액 채취를 위한 주사기 및 스왑(swab)등을 더 포함하여 조류인플루엔자의 검출용 키트의 형태로도 제공가능하다.

DENV-4 RNA만이 crRNA에 대한 경쟁적 결합을 통해 DENV-4 tcDNA 관련 ssDNA 절단 반응에 영향을 줄 수 있다. 이러한 바이오센서는 핵산 증폭 과정없이도 DENV-4 RNA의 매우 민감하고 선택적인 검출이 가능함을 보여준다.

본 개시는 다양한 형태로 변형되어 실시될 수 있을 것인바 상술한 실시예에 그 권리범위가 한정되지 않는다. 따라서 변형된 실시예가 본 개시의 특허청구범위의 구성요소를 포함하고 있다면 본 개시의 권리범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

100: 바이오센서 110: 신호부
111: 금나노입자 112: 메틸렌블루
113: 스트렙타비딘 115: 스트렙타비딘-금나노입자
117: 스트렙타비딘-메텔린블루-금나노입자
120: 고정부 125: ssDNA
127: 연결부 130: CRISPR/Cpf1 복합체
140: 기판부

<110> Kwangwoon University Industry-Academic Collaboration Foundation <120> Composition for detecting dengue virus and a biosensor including the same <130> DP-2020-0056-KR-000 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1 RNA <400> 1 cguacagcuu ccaugguuug 20 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2 RNA <400> 2 cccuucuccu uccacuccac uc 22 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3 RNA <400> 3 cucacgcguu ucagcauau 19 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4 RNA <400> 4 auguuguucu gcuuguugga a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1 tcDNA <400> 5 cgtacagctt ccatggtttg 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2 tcDNA <400> 6 cccttctcct tccactccac tc 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3 tcDNA <400> 7 ctcacgcgtt tcagcatat 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4 tcDNA <400> 8 atgttgttct gcttgttgga a 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA <400> 9 atgttgttct gcccatcg 18 <210> 10 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4 crRNA <400> 10 uaauuucuac ucuuguagau uuccaacaag cagaacaaca u 41 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPzyme 3WJ-a <400> 11 tttgggtagg gcgggttggg ttgccatgtg tatgtggg 38 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPzyme 3WJ-c <400> 12 ggatcaatca tggcaa 16 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single Mismathced DENV-4 RNA <400> 13 auguuguucu acuuguugga a 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Double mismatched DENV-4 RNA <400> 14 auguuguuca acuuguugga a 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZIKV RNA <400> 15 auguuguuca acuuguugga a 21

Claims

단일 가닥으로 형성된 제1올리고뉴클레오티드, 상기 제1올리고뉴클레오티드의 5’말단에 연결되는 고정부, 상기 제1올리고뉴클레오티드의 3’말단에 연결되는 신호부 및 뎅기바이러스(Dengue virus)의 RNA 염기서열의 일부인 제2올리고뉴클레오티드를 인식하고 결합하는 크리스퍼/Cpf1 복합체(CRISPR/Cpf1 complex)를 포함하는 제1제제; 및,
상기 크리스퍼/Cpf1 복합체에 상기 제2올리고뉴클레오티드와 경쟁적으로 결합하는 DNA 염기서열을 갖는 제3올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2제제;를 포함하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 신호부는
산화환원반응을 통해 외부로 전자를 전달하는 메틸렌블루를 포함하는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 제1올리고뉴클레오티드의 3’말단에 결합하여 상기 신호부와 상기 제1올리고뉴클레오티드를 연결하는 연결부;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 연결부는 비오틴(Biotin) 결합단백질인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 신호부는
상기 비오틴 결합단백질과 결합하는 아비딘(Avidin)계열의 단백질과 금나노입자를 결합시킨 아비딘계열 단백질-금나노입자를 상기 메틸렌블루와 컨쥬게이션(conjugation)시킨 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 아비딘계열의 단백질은 스트렙타비딘(Streptavidin)인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제2올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열 중 하나의 염기서열인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 제3올리고뉴클레오티드는 상기 서열번호 1 내지 상기 서열번호 4의 염기서열에 각각 대응되어 상기 크리스퍼/Cpf1 복합체에 경쟁적으로 결합가능한 서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열중 하나의 염기서열인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 크리스퍼/Cpf1 복합체의 크리스퍼는 상기 서열번호 1 내지 상기 서열번호 4의 염기서열에 대응되어 각각 결합가능한 염기서열중 하나의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1올리고뉴클레오티드는 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 조성물.
제1항의 조성물; 및
상기 고정부와 결합되는 기판부;를 포함하는 뎅기바이러스 검출용 바이오센서.
제11항에 있어서,
상기 신호부는
산화환원반응을 통해 외부로 전자를 전달하는 메틸렌블루를 포함하는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 바이오센서.
제12항에 있어서,
상기 제1올리고뉴클레오티드의 3’말단에 결합하여 상기 신호부와 상기 제1올리고뉴클레오티드를 연결하는 연결부;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 바이오센서.
제13항에 있어서,
상기 연결부는 비오틴(Biotin) 결합단백질인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 바이오센서.
제14항에 있어서,
상기 신호부는
상기 비오틴 결합단백질과 결합하는 아비딘(Avidin)계열의 단백질과 금나노입자를 결합시킨 아비딘계열 단백질-금나노입자를 상기 메틸렌블루와 컨쥬게이션(conjugation)시킨 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 바이오센서.
제11항에 있어서,
상기 제2올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열 중 하나의 염기서열인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 바이오센서.
제16항에 있어서,
상기 제3올리고뉴클레오티드는 상기 서열번호 1 내지 상기 서열번호 4의 염기서열에 각각 대응되어 상기 크리스퍼/Cpf1 복합체에 경쟁적으로 결합가능한 서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열중 하나의 염기서열인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 검출용 바이오센서.
제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 크리스퍼/Cpf1 복합체의 크리스퍼는 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 제4뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스의 검출용 바이오센서.
제11항의 바이오센서를 포함하는 뎅기바이러스 검출용 진단키트.