CN102864238A - 检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451，其miRNA序列为： aaaccguuaccauuacugaguu。本发明还同时公开了上述标记物miR-451的用途，制备用于筛查卵巢肿瘤或辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统；反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；引物系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成；引物探针系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物和探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物和探针组成。

Description

检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451及用途

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种卵巢癌肿瘤的生物标记物-血清microRNA-451(miR-451)，及其筛选方法和在辅助卵巢筛查与临床诊断中的应用。 

背景技术

卵巢癌(ovarian carcinoma)是女性生殖器官常见的肿瘤之一，大多数是由于卵巢上皮细胞和包涵囊肿组织上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增生失控。卵巢癌是死亡率极高的妇科恶性肿瘤，其组织学形态多种多样，是一类高度异质性的肿瘤，具有发病率高、但病程进展缓慢、早期症状不易察觉；且侵袭转移能力较强、自然生存期长等特点。在临床检查中，多采用CA-125水平检测、超声检查、以及联合CA-125动态监测和盆腔超声检查及彩色多普勒血流显像等检测方法尽可能的提高卵巢检出率。但目前80%的卵巢癌病人发现时已是中晚期(Ⅱ-Ⅳ)，采取肿瘤细胞减灭术以及化疗患者的5年存活率仅为20%左右,且治疗比较复杂，预后效果比较差。虽然早期诊断及辅助化疗和激素治疗使得卵巢癌的死亡率有所降低，但在导致女性死亡的恶性肿瘤中卵巢癌仍居世界前列。 

MiRNA(MicroRNA)是一类生物体内自然形成的小分子非编码RNA，参与调节其特异靶基因的表达，从而控制蛋白的产生，具有调节发育时序，细胞增殖，分化，代谢，凋亡与应激以及参与脊椎动物心脏、肌肉以及神经系统的形成，同时调控肿瘤发生的功能。约50%的已知人类miRA基因定位于和肿瘤相关的染色体区域，而不断累积的研究成果也已充分证实miRNA的异常表达与肿瘤的发生，发展密切相关。 

高通量测序是基于传统的Sanger测序的基础上发展而来的分子生物学的分析方法之 

一是，虽然此技术建立时间不长，但其发展速度相当快。该技术能够对数百万个分子进行同时测序。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。高通量测序的具有传统测序法达不到的优点，首先，它是利用芯片技术进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序，把利用平行处理的方略读取结果，通量较高；其次，高通量测序具有精确地样本定量功能，其原理为样本的DNA或者RA被测序的次数反应了在样品中的丰度；同时高通量测序的成本相对较为低廉。对于miRNA序列较短、同源性高，利用芯片 检测非常困难。而利用高通量技术不仅能够解决此问题，而且能够发现新的miRNA。利用此技术对卵巢肿瘤患者血清与健康血清样本分别进行测序，并对比其序列组成以及表达谱特征，对于发现生物标记物用于卵巢疾病的早期诊断有重要的意义。 

生物标记物是指能将机体的生理和病理状态区分开来的生物分子。筛选到可用于肿瘤早期发现、早期诊断的生物标记物可大大提高肿瘤患者的临床治疗效果。最新数据显示肿瘤组织普遍具有特征性的miRNA表达谱，即指肿瘤细胞某几种miRNA的表达水平常与同一组织中的正常细胞存在显著差异，而特征性的miRNA异常表达可望成为用于肿瘤的诊断、病理分级、临床分期、疗效与预后的生物标记物，显示了良好的临床应用前景。 

近年来研究人员发现在血浆和血清中也存在独立于细胞之外并且即使在严酷环境下也能明显保持稳定的miRNA分子，而作为生物检测样本，血清具有取材方便、无创伤性、并可连续的体外检测的优点，使得基于miRNA定性和定量检测技术寻找癌症特异性的血清miRNA作为分子标记的方法比传统的蛋白分子标记方法将更加有效，进而可以克服分子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。因此，开发一种可辅助卵巢癌筛查和诊断的血清miRNA作为生物标记物，具有广泛的科研价值和临床应用前景。 

目前已有实验证实，microRNA在血液中被有效地保护，使其免受在血液中大量存在的RNase的降解，表现出高度的稳定性。对于血液microRNA能否作为一种无创性检测手段，目前的研究主要集中在癌症的早期诊断方面。然而，目前还没有将血清/血浆microRNA应用于卵巢疾病的辅助判断、危险度评价等方面的报道，若能筛选与卵巢组织病理状态有关的特异或异常表达的血清/血浆microRNA作为疾病检测的生物标志物，并研制相应的检测试剂盒，将会大大提升卵巢肿瘤疾病的检测水平。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有较高靶向性、稳定性及高效率检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451及其用途。 

为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451，其miRNA序列为： 

miR-451：aaaccguuaccauuacugaguu。 

本发明还同时提供了上述血清学生物标记物的用途：制备用于筛查卵巢肿瘤或辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。 

作为本发明的血清学生物标记物的用途的改进：试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统(即，引物系统和引物探针系统任选其一)； 

反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂； 

引物系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成； 

引物探针系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物和探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物及探针组成。 

作为本发明的血清学生物标记物的用途的进一步改进：试剂盒还包括扩增系统；扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。备注说明：该扩增系统仅在引物探针系统中被用到。 

作为本发明的血清学生物标记物的用途的进一步改进：检测该标志物(标记物)的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。 

作为本发明的血清学生物标记物的用途的进一步改进：miR-451的茎环结构反转录引物，由以下核苷酸序列组成： 

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA。 

作为本发明的血清学生物标记物的用途的进一步改进：荧光定量PCR技术为DNA染料法。 

基于DNA染料法的荧光定量PCR检测方法，其中所使用的miR-451的cDNA扩增引物为： 

miR-451 PCR正向引物：CGCGGAAACCGTTACCATTA； 

miR-451 PCR反向引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT； 

基于TaqMan探针法的荧光定量PCR检测方法，其中所使用的引物为上述PCR引物(miR-451的cDNA扩增引物)，其中所使用的探针由以下核苷酸序列组成： 

miR-451荧光探针：(6-FAM)ACTGGATACGACAACTCA(MGB)。 

备注说明：以上括号内的内容代表探针合成方式。 

在荧光定量PCR检测方法中，使用保守性miRNA(miR-16)作为内参照基因，其序列、茎环结构反转录引物、扩增引物和探针为： 

序列：uauugcacuugucccggccugu； 

茎环结构反转录引物： 

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA； 

miR-16PCR正向引物：ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA； 

miR-16PCR反向引物：TGGTGTCGTGGAGTCG； 

miR-16荧光探针：(6-FAM)TTCAGTTGAGCGCCAATA(MGB)。 

本发明提供了一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物microRNA的筛选方法，对卵巢癌血清及正常血清进行solexa/illumina高通量测序，根据其表达谱特征进行筛选和鉴定；从而获得本发明所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451。 

本发明的标志物可单独用于卵巢肿瘤的筛查，也可辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断。 

本发明所述的miRNA能在血清中稳定存在，该miRNA在卵巢正常血清，卵巢良性病变患者血清和卵巢恶性肿瘤患者血清中表达具有差异性，因此，能用于卵巢肿瘤筛查及辅助卵巢肿瘤病理鉴定及临床诊断。本发明主要是以miRNA为中心，基于实时荧光定量PCR技术检测和分析血清miRNA的差异性表达，主要通过以下步骤实现： 

(a)制备卵巢肿瘤血清样本； 

(b)酸性酚/氯仿法抽提血清总RNA； 

(c)反转录反应合成cDNA； 

(d)实时荧光定量PCR检测miRNA在不同样本中的表达变化量。 

本发明是针对现有卵巢肿瘤标志物敏感性和特异性不能满足临床诊断的需要，在研究miRNA在卵巢肿瘤血清中的差异性表达及与临床病理指数的相关性的基础上所获得的。 

本发明所述的肿瘤血清标志物为miR-451；其应用主要表现在：目标miR-451在卵巢癌患者与正常人群血清中显示出差异性表达，在良性肿瘤血清样本和恶性肿瘤血清样本中表达具有显著性差异，可单独用来对卵巢癌患者进行无创性筛查，也可用于辅助卵巢肿瘤病理鉴定及临床诊断。 

本发明的技术方案是提供一种用于筛查卵巢肿瘤患者和鉴定卵巢肿瘤病理特征的试剂盒，其由反转录系统，扩增系统和引物探针系统(或引物系统)组成，其中，反转录系统由反转录酶，反转录体系缓冲液和RA酶抑制剂组成；扩增系统由含Taq酶的miRA表达定量检测混合液组成；引物探针系统由miR-451/miR-16的茎环结构反转录引物和PCR扩增引物及探针组成(引物系统由miR-451/miR-16的茎环结构反转录引物和PCR扩增引物组成)。 

本发明通过实验得出以下结论，确定了miR-451目标miRNA可单独作为卵巢肿瘤筛查的血清学生物标记物，也可辅助卵巢肿瘤临床病理鉴定及诊断。 

1.miRNA-451在血清中的特异性表达： 

目标miRNA-451通过illumina/Solexa测序筛查，在测序报告中表达差异进行分析，采 用Log2-ratio(normal/patient)方法获得fold-chang值，其中fold-chang＜-1或fold-chang＞1表示表达具有显著差异；miRNA-451 fold-chang=1.28096，充分说明了目标miRNA在卵巢癌患者血清中呈现特异性表达。 

2.miRNA-451在良性肿瘤患者血清和正常血清中表达的差异性分析： 

本发明运用SPSS 17.0软件中单样本T检验和独立样本T检验，分析了目标miRNA在收集到的23例卵巢良性肿瘤患者血清样本和8例正常血清样本中表达的差异性，结果表明目标miRNA在卵巢肿瘤血清和正常血清中的表达水平明显上调，且差异性显著 

(RQ=0.67，P=0.000)。结果表明miRNA在血清中的表达水平可反映卵巢的病理特点，进而确定了miRNA在血清学水平上可作为卵巢肿瘤的生物标记物来指示肿瘤的临床病理情况。 

3.miRNA-451在卵巢恶性肿瘤血清与正常血清中表达的差异性分析： 

如图所示，目标miRNA在31例卵巢恶性肿瘤患者的血清及其8例正常血清样本对照中表达的差异性分析，表明miR-451(RQ=1.88.，P=0.000)，在卵巢癌血清中显著表达，且已达到了极显著水平。因此根据miRNA在卵巢血清中的表达情况可明显区分癌血清和正常血清，也具有较好的参考价值。 

结果表明，miR-451在血清水平上来区分卵巢良、恶性病变肿瘤，进而无创伤性地筛查良性肿瘤患者以得到积极的早期诊断，进而积极采取适合的诊疗措施。因此在血清中检测这些miRNA的表达变化量对卵巢肿瘤快速筛查，临床诊断和治疗具有重要作用，有望作为卵巢诊断和治疗的生物标记物。 

4.在不同病理指标下，miR-451在卵巢肿瘤患者的血清和卵巢正常血清中表达的相关性分析。 

在不同年龄组、病理分期以及CA-125水平上对miR-451的表达相关性的分析(如图2、图3)可用于早期卵巢肿瘤的诊断。对低年龄组的24例样本和高年龄组的29例样本进行统计学分析，发现miR-451在低年龄组的相对表达量(RQ=1.67)中要比高年龄组的相对表达量(RQ=1.1)要高，已达到极显著水平(P=0.007)。对卵巢癌血清病理分期Ⅰ和Ⅱ(7例)，Ⅲ和Ⅳ(24例)样本进行miR-451表达量的分析，miR-451在卵巢癌晚期(Ⅲ和Ⅳ)中表达比癌症早中期(Ⅰ和Ⅱ)表达要高；在CA-125-/+水平上，miR-22在CA-125+(＞35U/ml)的相对表达量(RQ=0.89)要比CA-125-(≤35U/ml)中的相对表达量(RQ=2.2)要低。这对于癌症病人分期诊断有重要的指导意义。 

5.用Iog2 scale法反映卵巢肿瘤血清中miRNA的变化 

Log2 scale是目标miRNA相对于内参基因而言产生的变化以对数反映出来的一种分析方法，用于揭示目标miRNA是否可作为区分患者和正常人血清的生物标记物。Log2 scale法即Log2(CtmiRNA/Ctmean(miR-16)}，用于反映miRNA在卵巢肿瘤血清相对于正常血清中产生的差异变化。其中C miRNA代表荧光定量检测到的目标miRNA在卵巢血清样本中的Ct值，而Ctmean(miR-16)代表内参基因miR-16在卵巢血清样本中的平均Ct值。 

用Log2 scale法分析可得miR-451在恶性(P=0.000)和良性(P=0.000)肿瘤血清相对于正常血清的表达均有显著性差异，且在良性肿瘤与正常血清中达到了极显著水平。 

本发明人经过广泛而深入的研究，首次鉴别和分离了与卵巢肿瘤相关的血清miRNA，在此基础上完成了本发明；首次通过miRNA实时定量PCR技术在卵巢癌血清中对miR-451的表达水平进行检测，进一步验证这些血清miRNA与卵巢肿瘤各临床病理指标的关联性，所提供的试剂盒专门针对于血清miRNA的检测优化，结果准确可靠。 

本发明的优点为：(1)本发明确定的miRNA与卵巢肿瘤临床病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对卵巢肿瘤病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。(2)由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检测的优点，因此从血清中寻找生物标记物可以将卵巢肿瘤的筛查和诊断提高至一个新的水平，进而提高治愈率和降低死亡率。(3)通过实时荧光定量PCR技术对卵巢肿瘤病人的血清水平miRNA的检测，定量准确。相对于芯片技术或者分子杂交，该方法简便快速且经济实用。(4)可与其他分子指标相结合，为卵巢肿瘤筛查，诊断，治疗与预后提供新的综合性试剂盒，方便临床应用。 

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 

图1：miR-451在卵巢良性肿瘤、恶性肿瘤血清样本中与正常血清相比表达差异倍数。 

图2：miR-451在卵巢良性肿瘤、恶性肿瘤以及正常对照的血清样本中差异性表达的相关性。 

(相关性分析在P=0.01水平上，SPSS17.0软件，以及origin8.0软件)。 

图3：各病理指标上，miR-451在卵巢肿瘤患者的血清和卵巢组织中表达的相关性。 

其中age≥51/＜51：miR-451在卵巢肿瘤血清中的差异性表达与患病年龄的相关性分析，即miR-22在年龄小于51和年龄大于或等于51的卵巢肿瘤患者血清中的表达差异性分析； 

其中Grade(病理分期)Ⅰ-Ⅱ/Ⅲ-Ⅳ:miRNA在卵巢肿瘤血清中的差异性表达与卵巢肿瘤病理分级的相关性分析，即miR-451在卵巢肿瘤血清在Ⅰ和Ⅱ与Ⅲ和Ⅳ之间的表达差 异相关性； 

其中CA-125-/+：miR-451在卵巢肿瘤血清中的差异性表达与CA-125水平的相关性分析。即miR-451在卵巢肿瘤血清CA-125-(≤35U/ml)和CA-125+(＞35U/ml)上表达差异相关性。 

具体实施方式

本发明所提供的血清miRNA标记物在制备检测卵巢肿瘤的临床诊断试剂盒中应用的具体方法如下： 

一、实验样本 

本发明所使用的肿瘤组织和血清样本来自2007年11月～2008年12月间在浙江省肿瘤医院接受治疗的卵巢肿瘤患者的全血。入住患者要求有明确的细胞学诊断，手术前未经任何放疗、化疗及内分泌治疗，手术后有完整的临床及病理资料。本发明所采用的正常对照样本来自卵巢肿瘤患者的癌旁正常组织，正常血清对照样本来自健康志愿者。入组志愿者均经问卷调查和严格体检无卵巢肿瘤及其相关妇科肿瘤家族病理史且无卵巢肿瘤患病风险。 

根据国际妇产科联盟(FIGO)临床分期、分化程度、CA-125水平对卵巢恶性肿瘤与良性肿瘤患者的样本信息分类汇总如表1所示。患者年龄21-76岁，中位年龄为51岁，小于51岁的患者24例，大于和等于51岁的患者29例，年龄不清的1例。 

在31例恶性肿瘤病例中：卵巢浆液性腺癌为17例，卵巢浆液性乳头状腺癌为8例，卵巢黏液性腺癌为4例，卵巢子宫内膜样腺癌为2例；病理分级Ⅰ级者3例，病理分级Ⅱ级者4例，Ⅲ级者20例，病理Ⅳ级患者4例；低分化为9例，中低分化为10例，中分化1例，高分化为1例，分化程度不明者为10例；在CA-125水平上，低于35U/ml为2例，高于35U/ml为29例。 

在23例良性肿瘤患者中，浆液性肿瘤为5例，黏液性为4例，子宫内膜样肿瘤为10例，卵巢冠囊肿为2例，卵巢卵泡细胞瘤为1例，卵巢乳头性肿瘤为1例。在CA-125水平上，低于35U/ml为11例，高于35U/ml为12例。 

表1卵巢肿瘤病人的临床病理信息 

备注说明： 

a根据FIGO确立的卵巢癌分类标准(2009年修订) 

b根据美国癌症联合委员会建立的癌症临床分期系统(Singletary等，2003) 

二、实验试剂 

RNA提取及PCR产物检测过程中所用试剂，如酸性酚(pH4.5)，氯仿，异丙醇，乙醇，DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂等常规生化试剂，均购于上海生工公司。PCR扩增试剂(含10×buffer、dNTPs mixture)及反转录反应所用试剂，如RNase抑制剂、M-MuLV反转录酶、5×M-MuLV缓冲液以及反转录用dNTP混合物(各10mM，RNase-free)，均购自TaKaRa公司。基于DNA染料法的荧光定量PCR检测试剂盒(含real-time PCR MasterMix、50×ROX reference)为TOYOBO产品。所有引物委托(miRNA茎环结构反转录引物、PCR正向引物、PCR反向引物)上海生物工程有限公司合成。RNA提取及PCR产物检测过程中所用试剂及采购如下表所列： 

表2 total RNA提取所用试剂及其来源 

表3 miRNA反转录所用试剂及其来源 

表4 real-time PCR所用试剂及其来源 

表5琼脂糖凝胶电泳所用试剂及其来源 

三、实验过程 

1.制备卵巢癌血清样本 

全血样本来自卵巢癌，卵巢良性病变患者和健康志愿者。依次进行以下步骤： 

1)于清晨空腹取外周血3ml注入清洁干燥的离心管，立即置于37℃恒温培养箱斜置1-2h； 

2)4℃斜置3-4h，析出的血清移到新离心管中。 

3)凝血块以4℃，4000rpm，离心10min，小心吸取上清； 

4)合并步骤2)和步骤3)所得的两次血清，4℃，4000rpm离心10min，小心吸取上清转至1.5ml离心管中。 

每个样本如上制备后分别保存于-80℃冰箱，待用。 

2.血清样本中总RNA提取 

1)将卵巢血清于-80℃中取出，待4℃缓慢溶解。 

2)用移液器吸取200μl，加入到1.5ml无RNase EP管中，加入700μl Qiagen Lysissolution，置于涡旋仪剧烈涡旋混匀至充分裂解，直到看不到白色悬浮物；室温静置5min。 

3)加140ul氯仿；剧烈混合15s，静置分层3min；看到有分层现象时12000g，4℃离心15min，用移液器取上清液体(大概500ul)转移到新的1.5ml收集管中，加1.5倍上清体积的无水乙醇，上下颠倒混匀；得含乙醇的裂解液。 

4)取700μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，8000g离心18s；离心后弃含有下层溶液的收集管，将离心管重置收集管于柱上； 

5)依照裂解液的体积，重复上一步；加入700μl RWT solution(即，Wash SolutionRWT)，8000g离心18s；弃下层，将柱置于一新的收集管上。 

6)加入500μl RPE(即，Elution Buffer RPE)，8000g离心18s，弃下层，重置收集管于柱上；加入500μl RPE，8000g离心2min，弃收集管。把柱子放入新的2ml收集管中，全速离心1min。再把柱子放入1.5ml Elution管中(Qiagen试剂盒提供)； 

7)加入30μl RNase-Free Water；静置1min，使溶液充分与柱结合，然后8000g离心1min； 

8)重复上述步骤7)； 

9)NanoDrop分光光度计(ND-2000)检测总RNA的含量及纯度，A260/280的数值范围在1.8~2.0之间表示RNA的纯度较好，达到实验要求。 

3.Solexa测序 

我们提供了8例卵巢癌患者血清样本和8例正常妇女血清样本，实验由杭州联川生物公司(http://www.lc-bio.com/)完成，公司采用新一代illumina/solexa平台，通过测序我们 可以获得样品中已知和未知的miRNA，以及他们的大小和长度。其优点就是可以发现未知的miRNA和相比前一代测序平台上提高了数据的可靠性。 

4、检测用引物及探针序列 

设计与合成引物序列 

1)miRNA茎环结构反转录引物： 

miR-16(SEQ ID NO：1)： 

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA 

miR-451(SEQ ID NO：2)： 

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA 

2)miRNA的PCR反向引物为： 

miR-16(SEQ ID NO：3)：TGGTGTCGTGGAGTCG 

miR-451(SEQ ID NO：4)：CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT 

3)PCR正向引物分别为： 

miR-16(SEQ ID NO：5)：ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA 

miR-451(SEQ ID NO：6)：CGCGGAAACCGTTACCATTA； 

4)探针： 

miR-16(SEQ ID NO：7)：(6-FAM)TTCAGTTGAGCGCCAATA(MGB)； 

miR-451(SEQ ID NO：8)：(6-FAM)ACTGGATACGACAACTCA(MGB)。 

5.cDNA的合成 

1)反转录成cDNA 

按照以下体反转录系依次加入到无RNase的Ep管中，根据以上设计序列的合成miR-451/miR-16对应的茎环结构反转录茎环引物(茎环引物SLP)，包括上游引物及下游引物，对应加入，反转录反应体系如下： 

反转录反应体系如下： 

反应条件设置为： 

42°C        60min 

70°C        15min 

反应完毕后，保存于4℃冰箱。 

备注说明：本发明我们对miR-451设计了特异性的茎环结构反转录引物，单独进行如上操作，单管合成cDNA。 

2)将反转录产物进行荧光定量PCR扩增反应 

荧光定量PCR扩增反应用于分析miR-451表达差异水平，DNA染料法或TaqMan探针法均可用于检测。 

i)基于DNA染料法的荧光定量PCR检测： 

按照以下荧光定量PCR体系将试剂按以下顺序依次加入到200μl Ep管中： 

备注说明：上游引物FP和下游引物RP即为miR-16/miR-451的正向引物和反向引物。 

混匀后稍离心，在ABI 7500中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为: 

ii)基于TaqMan探针法的荧光定量PCR检测 

在新的0.2μL光学PCR反应管中依次加入： 

混匀后稍离心，反应参数设置为： 

以上两种荧光定量检测方法只需选择采用一种即可。 

四、数据处理 

Solexa测序结果分析获得miR-451在正常人样本和癌症患者样本中存在显著差异表达，检测到miR-451在两个样本中的表达水平均高于平均表达水平，差异表达水平高于两倍；具体数据见下表6。 

表6 Solexa测序结果及差异倍数分析 

荧光定量PCR定量检测miR-451的相对表达变化量时，以miR-16为内参基因，来对 目标基因进行归一化处理，已确保相等数量的样品中比较目标基因的量。表达量倍数的变化用公式RQ=2^-△△CT，其中△△CT=(C_T miRNA-C_T miR-16)_Cancer-(C_T miRNA-C_T miR-16)Mean _Normal。RQ代表相对表达量(relative quantation)，C_T miRNA和C_T miR-16分别代表荧光定量检测到的目标miRNA和内参基因miR-16的Ct值，Cancer代表卵巢肿瘤血清，Nomal代表与肿瘤组织或血清对应的正常对照组，Mean normal代表所有正常对照组中的平均值。以上数据，即Ct值均可由荧光定量检测仪配带的检测软件阅读出。定量中设立重复实验和阴性对照实验，定量实验的每个样本重复3次，阴性对照中不加模板cDNA，而以水代替，用于检验是否存在PCR污染和较高的引物二聚体污染。 

荧光定量数据的统计学分析采用SPSS 17.0统计分析软件。miRNA在两样本中的相对表达量分析采用levene’s卡方检验和independent-samples t检验，当P值≤0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，当P值<0.01时，认为结果在统计学上具有极显著性差异。miR-451在不同病理的卵巢肿瘤患者的血清中表达的差异性分析的直观表现通过绘制含误差线的柱状图实现，如图3，采用Orgin 8.0绘图软件；不同临床病理指标水平上，miR-451在卵巢肿瘤血清中表达的相关性分析直观表现通过绘制含误差线的柱状图实现。 

miR-451在卵巢恶性肿瘤、良性肿瘤血清跟各自均与正常血清中miR-451表达量相比，其表达倍数差异性分析的直观表现通过绘制柱状图实现，如图2；采用SPSS 17.0软件和Origin 8.0绘图软件。 

试剂盒检测数据经荧光定量数据分析后，RQ≥1.88时，则认为两样本存在显著差异，进而可区分两病理现象，miR-451对卵巢肿瘤与正常人群及卵巢肿瘤各临床病理的区分数据请见表7，所有数据均经荧光定量相对表达量分析和统计学分析，结论可靠，使用该试剂盒检测时可依据表中数据(当RQ≥1.88时，即可区分)。 

表7 miRNA在各病理间的相对表达变化量及实验分析所用样本的统计学P值 

a:RQ=2^-△△CT(病理1)/2^-△△CT(病理2),△△CT=(C_T miR-451-C_T miR-16)_cancer-(C_T miR-451-C_TmiR-16)Mean_Normal

b:采用SPSS 16.0(Sep 13,2007)统计分析RT-q-PCR所得的miRNA相对表达量数据，其中通过Levene′s检验两样本标准差是否相等，通过两独立样本t检验计算P值。 

c:P值以两个星号(**)标记表明其小于极显著性标准0.01。 

d:P值以一个星号(*)标记表明其小于显著性标准0.05。 

上述内容说明：miR-451在卵巢癌中表达特异性较强，可以作为物分生子标记物。 

miR-451的miRNA序列为：aaaccguuaccauuacugaguu。 

实例1、选择已确诊为恶性卵巢肿瘤的患者100例(其中浆液性腺癌41例，黏液性腺癌32例，子宫内膜样腺癌15例、透明细胞癌12例)，乳腺癌患者、肺癌患者、胃癌患者、肝癌患者、结肠癌患者、前列腺癌各30例，正常人30例，均于清晨空腹取外周血，整个检测方法同上。结果如下表8： 

表8不同癌症病例中RQ≥1.88/＜1.88的比例 

由上表中的数据可知，在卵巢癌中RQ≥1.88的所占的比例要明显高于其它的癌症的比例，即miR-451在卵巢癌中特异性表达，可作为辅助个体卵巢肿瘤筛查、早期检测卵巢肿瘤的发生以及辅助诊断的依据。 

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，所述miRNA-451还可应用于卵巢肿瘤患者的组织，唾液，尿液，血浆等体液的检测。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 

Claims (10)

1.一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451，其特征是miRNA序列为：

miR-451：aaaccguuaccauuacugaguu。

2.如权利要求1所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451的用途，其特征是：制备用于筛查卵巢肿瘤或辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451的用途，其特征是：所述试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统；

所述反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；

所述引物系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成；

所述引物探针系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物和探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物和探针组成。

4.根据权利要求3所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451的用途，其特征是：所述试剂盒还包括扩增系统；所述扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。

5.根据权利要求3或4所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451的用途，其特征是：检测该标记物的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。

6.根据权利要求5所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451的用途，其特征是：miR-451的茎环结构反转录引物由以下核苷酸序列组成：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA。

7.根据权利要求6所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451的用途，其特征是：所述荧光定量PCR为 DNA染料法或TaqMan探针法。

8.根据权利要求7所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451的用途，其特征是： miR-451的cDNA扩增引物为：

miR-451正向引物：CGCGGAAACCGTTACCATTA ；

miR-451反向引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。

9.根据权利要求8所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451的用途，其特征是：miR-451的探针由以下核苷酸序列组成：

(6-FAM) ACTGGATACGACAACTCA (MGB)。

10.根据权利要求9所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451的用途，其特征是：在荧光定量PCR检测方法中，使用保守性miRNA的miR-16作为内参照基因，miR-16的序列、茎环结构反转录引物、扩增引物和探针为：

序列：uauugcacuugucccggccugu；

茎环结构反转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA；

PCR正向引物：ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA；

PCR反向引物：TGGTGTCGTGGAGTCG；

探针：(6-FAM)TTCAGTTGAGCGCCAATA(MGB)。

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