CN104718300A - 开发用于评估法医样品中dna降解和质量的高灵敏度定量系统 - Google Patents

开发用于评估法医样品中dna降解和质量的高灵敏度定量系统 Download PDF

Info

Publication number
CN104718300A
CN104718300A CN201380052972.9A CN201380052972A CN104718300A CN 104718300 A CN104718300 A CN 104718300A CN 201380052972 A CN201380052972 A CN 201380052972A CN 104718300 A CN104718300 A CN 104718300A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
retrotransposon
sample
designated
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380052972.9A
Other languages
English (en)
Inventor
素德赫·辛哈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN104718300A publication Critical patent/CN104718300A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

描述了对人DNA样品中存在的降解程度进行定量的方法。该方法利用实时PCR系统以对样品中第一反转录转座子散布元件和相对较长的第二反转录转座子散布元件分别进行定量，其中随着所述样品降解，所述较长的元件预期以比所述较短元件更快的速度瓦解。在一实施方案中，该方法利用(在进化水平上)相对年轻的Alu Yb系亚家族序列在每个人基因组中的出现以及它们在非人样品中的基本上不存在。在优选实施方案中，该方法对“SVA”元件的较长的290bp的序列和Alu Yb8系的较短的80bp的序列进行定量。介绍了在该方法中有用的新设计的引物和TaqMan探针。相关方法还对男性特异性人DNA进行定量。

Description

开发用于评估法医样品中DNA降解和质量的高灵敏度定量系统
优先权声明
本申请引用于2012年8月13日根据35U.S.C.§111(b)作为临时申请向美国专利与商标局在先提交并且按期分配序列号61/682,507号的申请DEVELOPMENT OF A HIGHLY SENSITIVE QUANTIFICATIONSYSTEM FOR ASSESSING DNA DEGRADATION AND QUALITY INFORENSIC SAMPLES(开发用于评估法医样品中DNA降解和质量的高灵敏度定量系统)，于2013年2月21日根据35U.S.C.§111(b)作为临时申请向美国专利与商标局在先提交并且按期分配序列号61/767,668号的相同标题的另一申请，和于2013年3月15日根据35U.S.C.§111(b)作为临时申请向美国专利与商标局在先提交并且按期分配序列号61/793,595号的相同标题的第三申请，将它们并入本文，并且要求根据35U.S.C.§119(e)获得的所有权益。
发明背景
发明领域
公开了在实时聚合酶链反应系统中通过使用新鉴定的靶标元件来确定人DNA样品的环境降解的程度的方法。
相关领域描述
最近几年，实时聚合酶链反应(PCR)化学已成为对法医样品中基因组的和可扩增的DNA的量进行可靠地定量的标准。通用系统包括评定总人DNA和男性DNA。实例为来自生命科技公司的来自普洛麦格公司的和来自凯杰的目前有几种用于基于荧光定量测定的不同方法，包括绿色， 和
使用实时PCR方法以评价DNA样品的降解程度的兴趣渐增。使用两个核DNA靶标进行这一方法：短的多拷贝序列和长的多拷贝序列。因为随着样品受损，长的靶标序列比短的靶标序列降解得更迅速，短的靶标与长的靶标的量的比率将提供样品中降解程度的评价。已发表了使用Alu或微卫星靶标对法医样品中降解的DNA的评价研究。然而，以前研究的测定或缺少灵敏度或不显示高的PCR效率。法医样品在数量和质量方面变化很大，使得出于对这些样品中的DNA进行定量和确定它们的降解程度的目的开发和验证实时PCR系统的目标变成挑战。
目前在微型短串联重复(STR)分析系统方面的研究进展已使得分析高度受损的样品成为可能。发明者在开发STR扩增子方面突飞猛进，与传统的STR扩增子比较，开发的STR扩增子尺寸减小并且可以对已经显著降解的DNA样品有效(例如见，J.M.Butler等,J.Forensic Sci.48(5):1054-1064(2003)；T.J.Parsons等,Forensic Science International:Genetics 1:175-179(2007))。
Alu为短散步元件(SINE)，约300bp的插入物，其以大拷贝数分布遍及人基因组。随着时间，Alu元件在人基因组中的进化使得Alu元件非常适合区分人DNA和非人DNA的任务，并且适用于进行希望对人DNA特异的测试。最近的研究报道了使用Ya5系Alu遗传元件评价降解的DNA样品的质量评估(J.A.Nicklas等,J.Forensic Sci.57(2):466-471(2012))。用于在证据样品中对人特异性DNA进行定量的基于多拷贝内Alu的方法已成功地用于获得高灵敏度的DNA定量(J.A.Walker等,Anal.Bi℃hem.337:89-97(2005))。
Yb系亚家族元件的平均年龄估计为239万年。据估计人基因组包含超过1800个Alu Yb家族元件，并且，这些中约50％来自于Yb8亚家族。已知Alu Yb8系统以大量固定的插入物存在。已报道只有20％Yb系Alu元件为多形态的插入存在或不存在人基因组中(A.B.Carter等,Human Genomics 1(3):1-13(2004))。因为大量这些固定的元件存在于每个人基因组，当使用多拷贝靶标定量系统时使个别特异的变化可能性最小化。
1994年，Shen等在研究RP基因的结构时鉴定了新的复合反转录子(Shen等,J.Biol.Chem.269(11):8466-8476(1994))。这种新的反转录子由SINE-R元件以及一系列与Alu序列共享序列相似性的序列组成。因此，在主要组分短散布元件(SINE)，可变数目串联重复(VNTR)和Alu之后，将其命名为“SVA”。SVA元件包含反转录转座子的标志，因为它们侧翼是靶位点重复序列(TSD)，以多聚(A)尾结尾，并且在它们整合到基因组期间偶尔为截短的和反向的。
发明概述
本发明的目标之一为提供对人DNA样品中存在的降解程度进行定量的方法。
本发明的另一目标为提供对样品中人DNA及男性DNA总量进行定量的方法。
本发明的另一目标为提供阳性内对照，其通过提供样品中PCR抑制剂的存在的额外评价而向DNA降解确定的结果方面提供增强的可信性。
本发明的另一目标为提供分析师从多个DNA样品中选择最佳的一个用于进一步的分析关注的方便方法。
本发明的另一目标为提供改进的基于DNA样品的降解程度选择用于应用在特定DNA样品的最佳分析方法的方法。
本发明的另一目标为提供评价非人DNA与被测人DNA样品的混合程度的方法。
本发明的另一目标为提供评价男性DNA和女性DNA在被测样品中混合程度的方法。
在本发明的一实施方案中，可从以下方法达成这些和其他目标，对样品中人DNA进行定量以评价其中DNA降解程度的方法，所述方法包括：提供待被分析的样品，使用实时聚合酶链反应系统以对样品中第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件分别进行定量，所述第一反转录转座子散布元件为Alu元件和所述第二反转录转座子散布元件为RP基因的SVA元件，并且计算样品中第一反转录转座子散布元件的出现率与第二反转录转座子散布元件的出现率的比率。
在某些实施方案中，同时进行第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件的定量。
在某些实施方案中，样品中第一反转录转座子散布元件的出现率与第二反转录转座子散布元件的出现率的比率可用于确定样品中DNA的降解程度。
在某些实施方案中，第二反转录转座子散布元件包含的碱基对是第一反转录转座子散布元件包含的碱基对的至少三倍。
在某些实施方案中，本发明的方法还包括提供第一探针，所述第一探针包含能够在第一诊断波长处发荧光的第一部分和能够淬灭第一部分荧光的第一淬灭剂，所述第一探针靶向于第一反转录转座子散布元件，提供第二探针，所述第二探针包含能够在第二诊断波长处发荧光的第二部分和能够淬灭第二部分荧光的第二淬灭剂，所述第二探针靶向于第二反转录转座子散布元件，提供在实时聚合酶链反应系统中有用的至少一种引物，所述系统能够扩增DNA样品，提供Taq聚合酶，其能够催化形成与样品中存在的核酸序列互补的核酸序列，所述聚合酶能够切割第一探针从而使第一荧光部分与第一淬灭剂分离并且能够切割第二探针从而使第二荧光部分与第二淬灭剂分离，用第一探针和第二探针处理样品，使用所述至少一种引物和Taq聚合酶借助于实时聚合酶链反应系统扩增样品，实时聚合酶链反应系统包括多个聚合酶链反应循环，在每一实时聚合酶链反应循环期间使用能够在第一部分和第二部分诱导荧光的激发源照射样品，在每一实时聚合酶链反应循环测量从第一部分发出的荧光和从第二部分发出的荧光，确定第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件的阈值循环数，并且将所确定的阈值循环数与第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件各自的标准曲线比较，从而确定样品中第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件各自的浓度。当DNA由于暴露于环境中而降解时，用于扩增的可利用的较长的靶标序列的量比较短的靶标序列的量少，因此在给定的DNA样品中的较长片段的量与较短片段的量之间的比率为DNA降解程度的诊断。如果DNA没有降解或最低限度地降解，样品中这两个靶标的量的比率接近于1。
在某些实施方案中，用于定量人DNA的方法还包括提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:5的正向引物和标为SEQ ID NO:6的反向引物(79个碱基对Yb8 Alu片段的引物)，并且提供了选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:8的正向引物，标为SEQ ID NO:11的正向引物，标为SEQ ID NO:14的正向引物，标为SEQ ID NO:9的反向引物，标为SEQ ID NO:12的反向引物，标为SEQ ID NO:13的反向引物和标为SEQ ID NO:15的反向引物(290个碱基对SVA片段的引物)：
5’GGAAGCGGAGCTTGCAGTGA 3’(SEQ ID NO:5)
5’AGACGGAGTCTCGCTCTGTCGC 3’(SEQ ID NO:6)
5’TGGGATCCTGTTGATCTGTGACCT 3’(SEQ ID NO:8)
5’GATTTGGCAGGGTCATGGGACAAT 3’(SEQ ID NO:9)
5’ATGTGCTGTGTCCACTCAGGGTTA 3’(SEQ ID NO:11)
5’TTCTTGGGTGTTTCTCACAGAGGG 3’(SEQ ID NO:12)
5’ATTCTTGGGTGTTTCTCACAGAGG 3’(SEQ ID NO:13)
5’CCAACCCTGTGCTCTCTGAAAC 3’(SEQ ID NO:14)
5’TTTGGCAGGGTCATGGGACAA 3’(SEQ ID NO:15)。
可选地，在另一实施方案中，约80个碱基对Yb8 Alu片段与约250个碱基对Alu Ya5片段配对作为本发明方法的靶标元件。在这些实施方案中，用于定量样品中人DNA的方法还包括提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:5的正向引物和标为SEQ ID NO:6的反向引物(79个碱基对Yb8 Alu片段的引物)，并且提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:1的正向引物，标为SEQ ID NO:2的正向引物，和标为SEQ ID NO:3的反向引物(250个碱基对Alu Ya5片段的引物)：
5’GGAAGCGGAGCTTGCAGTGA 3’(SEQ ID NO:5)
5’AGACGGAGTCTCGCTCTGTCGC 3’(SEQ ID NO:6)
5’TCACGCCTGTAATCCCAGCACTT 3’(SEQ ID NO:1)
5’ACGCCTGTAATCCCAGCACTTTG 3’(SEQ ID NO:2)
5’TCTGTCGCCCAGGCTGGAGT 3’(SEQ ID NO:3)。
在某些实施方案中，第一探针可具有标为SEQ ID NO:7的序列(对79个碱基对Yb8 Alu片段而言)，并且第二探针可选自标为SEQ ID NO:4的序列(对250个碱基对Alu Ya5片段而言)和标为SEQ ID NO:10的序列(对290个碱基对SVA片段而言)：
5’ATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCAT 3’(SEQ ID NO:4)
5’AGATTGCGCCACTGCAGTCCGCAG 3’(SEQ ID NO:7)
5’AAGGGCGGTGCAAGATGTGCTTTGTT 3’(SEQ ID NO:10)。
在某些实施方案中，操作实时聚合酶链反应系统可在下列近似条件下运转：在95℃下10分钟；32-40个循环的：在95℃下15秒，在61℃下70-120秒。
在某些实施方案中，将阳性内对照添加至样品从而形成样品混合物。然后使用实时聚合酶链反应系统对样品混合物中的阳性内对照进行定量，并将样品混合物中第二反转录转座子散布元件的出现率与样品混合物中阳性内对照的出现率进行比较。然后后者比较用于确定方法受到样品中抑制剂存在影响的程度。
在某些实施方案中，同时进行第一反转录转座子散布元件，第二反转录转座子散布元件和阳性内对照的定量。
在一些实施方案中，阳性内对照包含合成的核苷酸序列。
在某些实施方案中，用于对样品中人DNA进行定量的方法包括提供阳性内对照引物，所述阳性内对照引物选自标为SEQ ID NO:16的序列，标为SEQ ID NO:17的序列，标为SEQ ID NO:18的序列和标为SEQ ID NO:19的序列：
5’AAAGATCCTGCCAACAGGACAGTG 3’(SEQ ID NO:16)
5’ACAGACGGTATAGAGACCAATCAG 3’(SEQ ID NO:17)
5’GCATAAAGATCCTGCCAACAG 3’(SEQ ID NO:18)
5’ACCAAAGTGCTGCAGAAATAC 3’(SEQ ID NO:19)。
在某些实施方案中，用于对样品中人DNA进行定量的方法包括提供第三探针，所述第三探针包含能够在第三诊断波长处发荧光的第三部分和能够淬灭第三部分荧光的第三淬灭剂，第三探针靶向于阳性内对照，Taq聚合酶还能够切割第三探针从而使第三荧光部分与第三淬灭剂分离，第三探针具有标为SEQ ID NO:20的序列：
5’AGGCAGAGATTGCACTGCCTTAAAGTGG 3’(SEQ ID NO:20)。
在某些实施方案中，第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散步元件独立地为SINE靶序列，LINE(长散布元件)靶序列和SVA靶序列的其中之一。
在某些实施方案中，第一反转录转座子散布元件由40-150个碱基对组成，并且第二反转录转座子散布元件由120-400个碱基对组成。
在某些实施方案中，DNA定量的灵敏度在约5pg-约9pg的范围内。
在某些实施方案中，实时聚合酶链反应系统关于第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件各自的效率为至少约80％。
在某些实施方案中，使用实时聚合酶链反应系统的方法步骤包括第一反转录转座子散布元件的定量和第二反转录转座子散布元件的定量标准曲线的制备。标准曲线各自为阈值循环数与DNA量的图表，并且每个具有至少0.99的R2值。
在优选实施方案中，本发明方法中用于定量样品中人DNA的实时聚合酶链反应系统基本上与样品中非灵长类动物DNA无反应。
在某些实施方案中，受试样品中的DNA已经受机械方法，化学方法和环境方法的其中之一降解。
在本发明的实施方案中，实时聚合酶链反应系统为绿，和的其中之一。
在某些其他实施方案中，根据本发明的用于对样品中总的人DNA和男性特异性DNA进行定量以便评价其中DNA降解程度的方法包括以下步骤：提供待被分析的样品，使用实时聚合酶链反应系统从而对样品中男性特异性DNA序列，第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件分别进行定量，并且计算样品中第一反转录转座子散布元件的出现率与第二反转录转座子散布元件的出现率的比率，其中男性特异性DNA序列为90bp的Y染色体特异的DNA序列，第一反转录转座子散布元件为Alu元件，第二反转录转座子散布元件为RP基因的SVA元件。
在用于对样品中总的人DNA和男性DNA进行定量的方法的某些实施方案中，第一反转录转座子散布元件为SINE靶序列，LINE靶序列和SVA靶序列的其中之一并由40-150个碱基对组成，第二反转录转座子散布元件为SINE靶序列，LINE靶序列和SVA靶序列的其中之一并由120-400个碱基对组成，并且男性靶标为人Y染色体DNA的包含90个碱基对序列的区域，其在人X染色体上X-Y染色体同源区中缺失。
在用于对样品中总的人DNA和男性特异性DNA进行定量的方法的某些实施方案中，第一反转录转座子散布元件为具有约80个碱基对的靶序列并且为亚家族Yb8的Alu元件，第二反转录转座子散布元件为具有约290个碱基对的靶序列，并且为RP基因的SVA元件，并且男性特异性DNA序列为人Y染色体DNA的包含90个碱基对序列的区域，其在人X染色体上X-Y染色体同源区中缺失。
在某些实施方案中，用于对样品中总的人DNA和男性特异性DNA进行定量的方法还包括提供选自以下的至少一种引物：标为SEQID NO:5的正向引物和标为SEQ ID NO:6的反向引物(Yb8 Alu片段的引物)，提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:8的正向引物，标为SEQ ID NO:11的正向引物，标为SEQ ID NO:14的正向引物，标为SEQ ID NO:9的反向引物，标为SEQ ID NO:12的反向引物，标为SEQ ID NO:13的反向引物和标为SEQ ID NO:15的反向引物(SVA序列的引物)：
5’GGAAGCGGAGCTTGCAGTGA 3’(SEQ ID NO:5)
5’AGACGGAGTCTCGCTCTGTCGC 3’(SEQ ID NO:6)
5’TGGGATCCTGTTGATCTGTGACCT 3’(SEQ ID NO:8)
5’GATTTGGCAGGGTCATGGGACAAT 3’(SEQ ID NO:9)
5’ATGTGCTGTGTCCACTCAGGGTTA 3’(SEQ ID NO:11)
5’TTCTTGGGTGTTTCTCACAGAGGG 3’(SEQ ID NO:12)
5’ATTCTTGGGTGTTTCTCACAGAGG 3’(SEQ ID NO:13)
5’CCAACCCTGTGCTCTCTGAAAC 3’(SEQ ID NO:14)
5’TTTGGCAGGGTCATGGGACAA 3’(SEQ ID NO:15)，
以及提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:25的正向引物和标为SEQ ID NO:26的反向引物：
5’CAATGTG[CTAGGCTCTAGGAATAC 3’(SEQ ID NO:25)
5’AAGAGTGTCATGGCTCAAAGAG 3’(SEQ ID NO:26)。
在某些实施方案中，用于对样品中总的人DNA和男性特异性DNA进行定量的方法还包括提供用于男性特异性DNA靶序列的探针，该探针具有标为SEQ ID NO:27的序列：
5’AGAGAGTATGACAAACATGGCATGGGC 3’(SEQ ID NO:27)。
在某些实施方案中，用于对样品中总的人DNA和男性特异性DNA进行定量的方法还包括将阳性内对照添加至样品从而形成样品混合物，使用实时聚合酶链反应系统对样品混合物中的阳性内对照进行定量，比较第二反转录转座子散布元件在样品混合物中的出现率与阳性内对照在样品混合物中的出现率，并且使用比较以确定方法受到样品中抑制剂存在影响的程度。
在某些实施方案中，用于对样品中总的人DNA和男性特异性DNA进行定量的方法还包括提供选自以下的至少一种引物：标为SEQID NO:21的正向引物，标为SEQ ID NO:22的反向引物和标为SEQ IDNO:23的反向引物(特异定制的阳性内对照的引物)：
5’GCATAAAGATCCTGCCAACAG 3’(SEQ ID NO:21)
5’GCCCGAACTTCCAACACTAT 3’(SEQ ID NO:22)
5’ATTGTTCCTCCTGCCTGATT 3’(SEQ ID NO:23)。
在某些实施方案中，用于对样品中总的人DNA和男性特异性DNA进行定量的方法还包括提供用于阳性内对照的探针，该探针具有标为SEQ ID NO:24的序列：
5’ACAGTGTCAGGCAGAGATTGCACT 3’(SEQ ID NO:24)。
附图简述
当连同附图考虑时，通过参考下列的详述，本发明更为完整的理解和其许多伴随优势都变得明显和更好理解，其中：
图1为阐明根据本发明确定人DNA样品的环境降解程度的方法的流程图。
图2A和2B显示Yb8和SVA靶标各自的熔点曲线分析。
图3显示了观察到的阈值循环数与gDNA灵敏度标准稀释法的预期标准浓度。
图4显示了基于每一DNA浓度处至少34个读数，每一标准稀释的复制品之间的倍数变化。
图5A和5B显示观察到的阈值循环数与血色素抑制样品的血色素浓度，分别使用92bp和172bp阳性内对照(IPC)。
图6A和6B显示观察到的阈值循环数与腐殖酸抑制样品的腐殖酸浓度，分别使用92bp和172bp IPC。
图7显示了观察到的阈值循环数与黑色素抑制样品的黑色素浓度，使用172bp IPC。
图8显示在三个不同的DNA浓度没有降解和经过两个降解时间，通过声波降解法机械降解的效果与相对荧光单位的图表。
图9显示在三个不同的DNA浓度没有降解和经过三个降解时间，通过脱氧核糖核酸酶I的作用化学降解的效果与相对荧光单位的图表。
图10显示在三个不同的DNA浓度没有降解和经过三个降解时间，通过环境的高温和湿度作用持续5年环境降解的效果与相对荧光单位的图表。
图11显示对1ng靶向声波降解的样品的STR结果。
图12显示对靶向脱氧核糖核酸酶I处理的样品的STR结果。
图13显示对200pg靶向环境降解的样品的STR结果。
图14显示物种研究结果(条纹红柱显示长的靶标SVA；实心蓝柱显示短的靶标Yb8)。
图15显示Y染色体靶序列在单重反应中的扩增曲线。
图16A显示Y染色体靶序列在4靶标多重反应中的扩增曲线。
图16B显示Y染色体靶序列在4靶标多重反应中的标准曲线。
发明详述
本发明的一实施方案为对样品中人DNA进行定量以便评价DNA在其中的降解程度的方法，该方法包括以下步骤：提供待被分析的样品，使用实时聚合酶链反应(PCR)系统对样品中第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件分别进行定量，并且计算样品中第一反转录转座子散布元件的出现率与第二反转录转座子散布元件的出现率的比率，其中第一反转录转座子散布元件为Alu元件，第二反转录转座子散布元件为RP基因的SVA元件。
在本发明的另一实施方案中，用作实时PCR系统定量靶标的第二反转录转座子散布元件包含的碱基对是第一反转录转座子散布元件包含的碱基对的至少三倍。
在本发明的另一实施方案中，第一反转录转座子散布元件为具有约80个碱基对的靶序列并且为亚家族Yb8的Alu元件，和第二反转录转座子散布元件为具有约290个碱基对的靶序列并且为RP基因的SVA元件。
在本发明的另一实施方案中，本发明的方法用于确定受试样品中男性和女性DNA降解程度。通过具有约90个碱基对的男性特异性靶序列的存在使这一实施方案成为可能，男性特异性靶序列在人X染色体上X-Y染色体同源区内缺失。如Walker等公开内容，美国专利7,405,044号(在下文中‘Walker’)中所解释的，通过引用将其全文并入，在人X染色体上X-Y同源区内90bp缺失周围设计性染色体测定(col.5,ln 42-44)。在Walker的图3中，有关引物显示为加粗字体并且染色体特异的探针显示为小写字母下划线字体。缺失起始于如通过BLAT(BLAST类型比对工具)所测定的X位置89810740(Walker,col.5,ln44-47)。
本发明的实施方案的方法还包括以下步骤：提供第一探针，其包含能够在第一诊断波长处发荧光的第一部分和能够淬灭第一部分荧光的第一淬灭剂，所述第一探针靶向于第一反转录转座子散布元件，提供第二探针，其包含能够在第二诊断波长处发荧光的第二部分和能够淬灭第二部分荧光的第二淬灭剂，所述第二探针靶向于第二反转录转座子散布元件，提供在实时聚合酶链反应系统中有用的至少一种引物，所述系统能够扩增DNA样品，提供能够催化形成与样品中存在的核酸序列互补的核酸序列的Taq聚合酶，所述聚合酶能够切割第一探针从而使第一荧光部分与第一淬灭剂分离并且能够切割第二探针从而使第二荧光部分与第二淬灭剂分离，用第一探针和第二探针处理样品，使用至少一种引物和Taq聚合酶借助于实时聚合酶链反应系统扩增样品，实时聚合酶链反应系统包括多个聚合酶链反应循环，使用能够在第一部分和第二部分诱导荧光的激发源在每一实时聚合酶链反应循环期间照射样品，在每一实时聚合酶链反应循环测量从第一部分发出的荧光和从第二部分发出的荧光，确定第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件的阈值循环数，并且将所确定的阈值循环数与第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件各自的标准曲线比较(阈值循环数与DNA量)，从而确定样品中第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件各自的浓度。
在本发明的另一实施方案中，通过使用两个独立的基因组靶标，获得具有约79个碱基对的短DNA片段和具有约290个碱基对的长DNA片段的定量，实现确定DNA样品中存在的降解程度的目标。使用这些靶片段来对证据样品中人特异的DNA进行定量开发基于多拷贝内Alu的方法并且成功地用于获得高灵敏度的DNA定量。包括Alu元件的使用的内置引物用于扩增DNA节段顾及人特异性及与单拷贝靶标相比的高灵敏度。
对人DNA样品的降解程度进行定量的方法依赖于随着DNA样品在环境中降解，较长的插入物序列的完整性比较短的插入物序列的完整性被更快地破坏的事实。随着PCR反应的聚合进行和切割两种TaqMan荧光探针，在每一PCR循环期间监测各自的荧光信号和对每一靶标确定首次检测到信号的阈值循环数。使用阈值循环数和DNA浓度之间的对数线性关系，可确定每一靶序列的浓度和DNA样品中各自的靶序列的浓度比率。这比率显示样品降解程度。
在本发明的实施方案中，使用两个独立的插入物靶标设计引物和TaqMan探针。第一个为相对短的(50-150个碱基对)反转录转座子散布元件插入物，而第二个为相对较长的(150-500个碱基对)反转录转座子散布元件插入物。在其他实施方案中，第一插入靶标具有60-125个碱基对，75-85个碱基对，或79个碱基对，并且第二插入靶标具有200-400个碱基对，220-320个碱基对，280-300个碱基对，或290个碱基对。
必须小心选择本发明的反转录转座子靶标元件。由于Yb8(80bp)和Ya5(250bp)靶标的序列相似性，由Yb8(80bp)和Ya5(250bp)靶标组成的多重实验表现出交叉反应性。当与包含单一扩增中短的(Yb8)和长的(Ya5)靶标的引物和探针的多重反应中扩增的相同样品的定量值比较时，由于这种交叉反应性，单独的靶标Yb8和Ya5扩增的样品定量值是有差异的。对这一研究而言，开发对应Ya5250个碱基对片段的两个正向引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)，反向引物(SEQ IDNO:3)和探针(SEQ ID NO:4)。
在本发明的优选实施方案中，较短的反转录转座子散布元件为来自于Alu插入物的Yb8亚家族的79个碱基对序列，较长的反转录转座子散布元件为SVA元件的290个碱基对序列。在这一实施方案中，使用大小为79bp的Yb8 Alu序列作为用5-羧基荧光素(FAM)标记的短片段，和以Cy5标记的大小为290bp的SVA序列的SINE-R区域作为长靶标来开发系统(H.Wang等,J.Mol.Biol.354:994-1007(2005))。吲哚羰花青Cy3染料标记的合成序列也用作阳性内对照(IPC)以评价样品中抑制剂的存在或不存在。这一实施方案的第二版本包括第四个，男性DNA特异性靶标。在这个系统中，以2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)标记79bp Yb8片段，以吲哚羰花青Cy5标记290bpSVA片段，Y染色体上男性DNA靶标序列为76bp片段并且以FAM标记，IPC序列以Cy3标记。在利用相似的方法的其他实施方案中，也可使用其他多拷贝反转录转座子，诸如长散布元件(LINE)。
在一些实施方案中，多拷贝靶标，两个不同大小的序列标记连同合成的靶标用作阳性内对照(IPC)可提供受试样品中PCR抑制剂的存在的额外评价。这是确定样品基质是否改变测试操作地重要方式，其通过提供在测试条件下期望可获得的荧光比率为保证。
现在参考附图(图1)更充分地描述了本发明，其中显示了本发明的示例性实施方案。
如图1中所示，DNA样品(S100)与三种TaqMan探针(S110、S120和S130)，实时PCR引物(S140)和Taq聚合酶(S150)配对，Taq聚合酶能够切割TaqMan探针，使每一荧光部分与它各自的淬灭剂分离。在TaqMan程序中，用第一TaqMan探针，第二TaqMan探针和第三TaqMan探针(S160)处理样品，TaqMan探针与互补的核酸链(S170、S180、S190)的其中之一退火，使用标准的实时PCR技术扩增样品，和切割对应靶标元件的TaqMan探针以在重复变性和退火步骤(S200)期间分离三个荧光团与它们各自的淬灭剂。在每一PCR循环期间照射样品，引起来自于两种所切割的TaqMan探针类型的荧光团发荧光。然后可确定Yb8元件，SVA元件和阳性内对照各自的阈值循环数，然后通过与标准曲线(S210)比较来确定这些中每一个的浓度。Yb8元件和SVA元件的浓度比率与初始的DNA样品(S220)中环境降解程度有关。比较获得的SVA元件的浓度与获得的阳性内对照的浓度提供了关于样品中存在PCR抑制剂程度的信息。
后者方法为通用的并且可修改以提供额外的有用信息。本领域中技术人员易于预想以上程序的修改从而包括对应以上所述的男性特异性DNA靶标的第四探针。
精确和灵敏度研究表明本发明的优选实施方案的方法具有约5pg-约9pg范围内的灵敏度阈值，与其他基于Alu定量系统报道的灵敏度相似。调节合成的IPC靶标的量以提供对于没有抑制的样品的在18-22个循环范围内的可再现阈值循环值(Ct)。
将使用新引物和TaqMan探针获得的79bp与290bp片段的估计定量与使用声波降解法，脱氧核糖核酸酶I和环境降解获得的降解的DNA样品的STR分析结果比较，关联性表明本发明的优选实施方案的方法为用于确定人DNA样品的降解程度的可靠方法。在所有情况下，STR结果反映通过这一双靶标定量测定所计算的降解比率。
本发明提供了精确地评价法医样品中存在的人DNA的质量的定量系统。结果证明本发明的优选实施方案对高等灵长目动物是特异的，对低至5-9pg的DNA灵敏，可再现，并且是用于评价生物样品中降解的有用工具。精确地预测生物样品的状态的基于DNA的定性/定量/抑制评价系统可用作用于当法医上处理受损样品DNA测试时决定利用哪种DNA测试试剂盒的宝贵工具。
实施例
通过下列特征性描述本发明的方法的实验方法，条件，准确度和精确度和如下的实施例，可以更好地理解本发明的优选实施方案。
实施例1：引物和探针
在所述实施方案中有用的引物和探针显示于表1中。内置RE引物设计用于靶向作为“短的”片段的大小为79bp的Yb8 Alu序列及作为“长的”靶标的大小为290bp的SVA的SINE-R区域中的序列。也研究评价样品中抑制剂存在或不存在的阳性内对照(IPC)。研究92bp、158bp、172bp和192bp的IPC靶标合成序列。使用法医样品中常见的抑制剂在92bp、158bp和172bp IPC靶标序列上进行抑制作用研究。
开发两种系统：一个三靶标系统，包含FAM标记的Yb8“短的”Alu片段，Cy5标记的SVA“长的”片段和Cy3染料标记的合成序列用作IPC。并入男性特异性DNA靶标序列来开发由四个靶标组成的第二系统以检测样品中男性DNA。在这种系统中，用JOE标记“短的”79bpYb8片段，用Cy5标记“长的”290bp SVA片段，Y染色体上的男性特异性DNA靶标序列为76bp片段并且用FAM标记，和用Cy3标记IPC序列。
通过将探针置于90bp X染色体缺失中来设计针对Y染色体标记的引物和探针从而提供对Y染色体靶标的特异性。运行单重反应以核实所形成的正确产物。因为这种靶标序列的拷贝数不如Yb8或SVA拷贝数高，需要更高的循环数来产生扩增产物。在单一反应中，40个循环产生126％效率的标准曲线。见图15单重Y反应的实时扩增曲线。
表1.引物序列
如实施例2-5所述进行PCR条件的优化。
实施例2:循环数
就QPCR多重预混液而言制造商推荐为：在95℃下10分钟，随后40个循环的：在95℃下15秒和在60℃下60秒。为测试对于双靶标定量测定为最佳的循环数，改变循环数。进行40个循环和32个循环的测试，检验PCR效率值。结果显示当使用32个循环时PCR效率更高。
实施例3：退火和变性时间
就PCR条件而言制造商推荐为：在95℃下10分钟，随后40个循环的：在95℃下15秒和在60℃下60秒。为测试哪个PCR条件就InnoQuant定量KitTM(InnoGenomics Technologies,LLC)而言为最佳的，改变变性和退火时间。测试四个退火时间：45、60、70和120秒；测试两个变性时间：15秒和30秒。检验PCR效率，R2值，和一式三份的定量值的标准偏差(一式三份地运行三个DNA提取物)。
结果表明，对本发明的优选实施方案而言，与更短的退火时间所获得的相比，更长的第二退火时间产生稍微改进的PCR效率和更低的一式三份的定量值的标准偏差。更长的退火时间也为酶提供了更多时间来正确地与更长的靶标发挥功能。此外，结果表明，相对于15秒变性时间所获得的，30秒变性时间显著地降低了两种靶标的标准曲线的R2值。因此，选择15秒变性时间和120秒退火时间用于优选实施方案。
实施例4：退火温度
测试三个退火温度：制造商推荐的60℃，61℃和62℃。分析一式三份的样品的效率，R2值，和样品一式三份的标准偏差。结果显示于表2中。
表2:退火温度运行
62℃的退火温度显示样品一式三份的宽的标准偏差和相对低的Yb8靶标效率。基于这些结果，因相对高的Yb8靶标效率选择61℃的退火温度。最终选择用于优选实施方案PCR条件如下：95℃下10分钟，32个循环的：95℃下15秒，61℃下70秒。
实施例5：引物和探针浓度
单独地测试两个靶标从而确定最佳的引物和探针浓度。一旦从单独运行做了确定，就复合两个靶标，并且测试组合中每一个的浓度变化。对每一参数进行至少两个单独的运行以确保结果的可再现性。改变SVA和Yb8靶标的引物和探针浓度(反应中IPC引物/探针浓度保持固定在150nM最终浓度[0.2μL放入到反应中]，和IPC模板DNA量保持固定在4.5pg)。检验样品量的标准曲线效率和R2值，以及标准偏差的平均值(一式三份地测试)，在20μl的总反应体积中选择对SVA而言0.3μM(10μM储备的0.6μl)和对Yb8而言0.25μM(10μM储备的0.5μl)的最终引物浓度。
实施例6：引物交叉反应性
为核实从每一个靶标获得的量的准确度和排除引物间任何交叉反应性，通过片段分析检验来自于包含短的靶标正向引物和长的靶标反向引物的反应的熔点曲线分析和扩增人工产物。正如预期的，熔点曲线证明每一Yb8和SVA反应单一峰的存在。在两个靶标都观察到稍微宽的底部，表明引物二聚体的存在。图2A和2B分别显示了Yb8和SVA靶标的熔点曲线分析。
片段分析确认每一靶标靶向片段的存在以及源于引物间交叉反应性的任何人工产物的不存在(见表3)。观察到一些引物二聚体并且也观察到约67bp处一种人工产物。总之，熔点曲线分析和片段分析的结果确认了靶向片段的存在和人工产物的不存在。
表3:片段分析结果
实施例7：多重灵敏度
设计灵敏度研究从而使得可以使用与输入量的对数线性关系在不同的输入范围评估给定的测量组(阈值循环数，或Ct值)，并且建立其中丢失对数线性关系的最低水平的灵敏度。对灵敏度研究而言，使用HID实时PCR分析软件v 1.1评估在应用生物系统7500实时PCR系统上运行的用InnoQuant Quantification KitTM定量的样品，标准，和阴性对照的一种模板。使用Teknova DNA稀释缓冲液(10mM Tris-0.1mM EDTA)进行标准的三次连续稀释(称为STD1、STD2和STD3)并且一式三份地运行在托盘上。当指定为“未知的”时，来自于2个定量平板的不同的DNA标准组合用于确定每一标准的平均CT和数量。在最高的标准以上两个数量和低于最低的标准两个数量，100ng/μl、50ng/μl、0.0045ng/μl和0.0023ng/μl浓度处进行DNA标准稀释STD3的延伸。使用不同的DNA标准配置，对标记为未知的每一标准计算平均的CT和数量。绘制未知的标准样品的CT与DNA数量(ng/μl，对数范围上)的图表以展示系统的线性。这一验证期间在其他样品运行上进行相同的分析，包括100ng/μl、50ng/μl、0.0045ng/μl和0.0023ng/μl标准样品的延伸。
实施例8：DNA测定的准确度，精确度，灵敏度和线性
表4显示使用平板上运行的标准曲线的不同组合，标准稀释测定的平均数量和CT值。图3为代表表4中数据的图示。结果显示InnoQuant KitTM一致地检测少至2.3pg总输入DNA的所有样品。随着DNA浓度超出标准曲线的浓度(20ng/μl-0.009ng/μl)，预期数量偏差增加，并且线性一定程度上丢失。然而，这些偏差是最小限度的，不会影响获得全部DNA谱的能力；浓度较低时可以预期偏差增加(随机扩增效应)。当所有稀释都包括在内时，数量和预期数量之间平均的倍数变化对短靶标而言为1.13和对长靶标而言为1.07。1.13倍人平均的数量值变化将导致人定量的数量中约13％偏差。在单一反应中扩增两个靶标，但是小的靶标数量在几个灵敏度稀释处显示了稍微高的偏差。当检验标准曲线浓度(20ng/μl-0.009ng/μl)中的样品时，倍数变化减少到对短靶标而言平均1.04和对长靶标而言平均1.06。这些数量中的倍数变化不会显著地影响电泳图中所见的相对荧光单位(RFU)并且起因于随机扩增效应。在标准曲线范围之外观察到更高的倍数差异并且预期扩增模板的量。
0.0045ng和0.0023ng样品的结果显示这种双靶标定量测定检测DNA样品的灵敏度低于9pg。此类值的再现性受与低模板扩增有关的随机扩增效应影响。可以在人或男性扩增中见到随机扩增效应并且未必同时见到。标准曲线末端或靠近末端处的样品更易受标准曲线斜率变化的影响。当样品定量大于20ng时，实验室可考虑稀释和再定量样品从而确保适当的定量值。
表4.标准稀释和gDNA稀释的平均的量和Ct值
实施例9：整合和再现性
使用这种双靶标测定，本发明的优选实施方案，和来自于生命科技的人试剂盒对19个样品进行定量。人DNA浓度平均为使用这种双靶标测定的短靶标(Yb8)计算的浓度的140％。如果观察到差异，在所有情况下，人值高于双靶标定量测定值。这些差异归因于DNA标准的差异和扩增子长度的差异(中62bp与双靶标定量测定系统中80bp)。
为测试系统在各种DNA浓度的再现性，检验重复间浓度倍数变化的灵敏度数据。图4显示每一标准稀释的重复间倍数变化的结果(每一浓度处至少34个读数)。结果显示标准浓度(20ng-9pg)间，倍数变化所有都小于1.20，其等价于20％变异。正如预期的，随着浓度超出或低于最佳的范围，倍数变化增加。
实施例10：抑制效应
使用腐殖酸和血色素的不同浓度用于抑制92个碱基对IPC序列和172bp IPC序列的样品。使用黑色素的不同浓度用于抑制172bp IPC序列的样品。因法医个案工作中毛发样品的普遍性，选择这种抑制剂。用InnoQuant Quantification KitTM对样品进行定量，并且评估Yb8、SVA和IPC靶标的Ct值。图5A、5B、6A、6B和7显示了受试抑制剂的结果。
对相同抑制剂浓度两种尺寸的IPC靶标间Ct值的比较显示更易于抑制172bp靶标，如预期的因其较大的尺寸。结果显示，对于92和172bp靶标，随着抑制剂浓度增加，Ct逐渐增加。观察到Yb8和IPC靶标具有与92bp IPC相似的对抑制剂的反应，并且在约相同水平的抑制剂处受到影响。SVA具有更高的抑制剂灵敏度并且为受到影响的第一个靶标。相比之下，172bp IPC靶标序列为三个中的第一个受到抑制作用影响的靶标。172bp IPC靶标追踪SVA靶标，随着抑制剂浓度增加相似地影响两者，而Yb8为随着抑制剂浓度增加最后受到影响的靶标。由于172bp IPC与短的和长的靶标的优异相关性，选择这种并入到多重反应。
正如受试的其他抑制剂，黑色素抑制剂的结果显示随着抑制剂浓度增加所有三个靶标的Ct逐渐的增加。在黑色素的情况下，SVA长靶标为三个靶标中第一个受影响的，可能由于不同的抑制作用机理。
实施例11：降解对DNA测定的影响
进行降解研究以评价这种双靶标定量测定，本发明的优选实施方案，对降解样品的效用。设计实验从而评价三种类型的降解：机械的(经由声波降解法)，化学的(经由脱氧核糖核酸酶I)和环境降解(样品置于外部元素中[高温，湿度]5年)。基于观察到的长的和短的靶标的数量的降解比率表达为百分比＝(1-[长的数量/短的数量])*100。结果显示在图8-10中。
使用加上STR试剂盒(应用生物系统/生物科技)进行降解样品的下游STR分析，针对3个不同的DNA浓度:1ng(制造商推荐靶标数量)、500pg和200pg。在所有情况下，STR结果反映通过这种双靶标定量测定，本发明的优选实施方案，所计算的降解比率。随着降解增加，在STR结果中观察到典型的“滑雪斜率”效应，直到最终在降解的最高程度处观察不到结果(或非常局部的，不确定的结果)。在低浓度的DNA(500pg和200pg)处观察到水平高得多的降解程度。正如预期的，当DNA降解并且数量低时，观察到较低的RFU，在一些情况下，观察不到结果。图11-13显示降解研究的STR结果。
实施例12：物种特异性
法医DNA样品所用的定量系统必须不与非灵长类动物DNA反应，因为通常用于犯罪实验室的STR系统只与人和灵长类动物DNA反应。使用InnoQuant Quantification KitTM分析三个灵长类动物，七个非灵长类哺乳动物，和五个原核生物物种，分析包括Yb8、SVA和172bp IPC靶标。一式三份地运行从两类狗，两个猫，鹿，大鼠，小鼠，蚊子，鸡，绿猴，黑猩猩，猩猩，大肠杆菌，罗氏真养菌，橡胶红球菌，酵母和金黄色葡萄球菌纯化的DNA。DNA样品为5ng/μl。如果使用人DNA标准曲线本发明的方法检测到>1pg/μl的DNA，样品被认为是“反应的”。
受试物种中，只有高等灵长类动物样品是反应的(图14)。以前已证明了通常所用的STR系统与非人灵长类动物物种的交叉反应性。这些结果证明本发明的方法对法医使用是充分地物种特异性的并且不会产生非灵长类动物样品的定量结果。
实施例13：四靶标系统(Yb8、SVA、Y缺失和IPC)
将男性特异性靶标添加至实时PCR定量多重反应对检测包含大量女性DNA和少量男性DNA的样品中男性DNA的量有用。通过使用对人Y染色体DNA特异的引物对(Walker等,Anal.Bi℃hem.337(1):89-97(2005))，选择在人X-染色体上X-Y染色体同源区中缺失的人Y染色体DNA包含的90个碱基对序列的区域，以便获得扩增产物。
实施例14：多重反应
当添加至多重反应时，用FAM标记男性特异性片段，用JOE标记“短的”Yb8片段，用Cy5标记“长的”SVA片段，和用Cy3标记158bp阳性内对照(IPC)从而评价中样品内抑制剂的存在或不存在。多重反应的循环数从32增加到35和38。38个循环产生足够的结果，三个靶标SVA、Yb8和Y的效率分别为88％、99％和94％。分别见图16A和16B四靶标多重反应中Y染色体靶标的扩增曲线和标准曲线。
虽然参照特异的和优选的实施方案描述本发明，能够进一步修改而不偏离本发明的精神和范围。本申请意欲涵盖本发明的所有变异，使用或改编，其次，通常来说，涵盖本发明的原理并包括在偏离产生时根据本发明所属领域中已知或惯例实践而与本公开内容产生的那些偏离，或对本领域中技术人员是明显的那些偏离。应理解的是本发明的范围不限于本发明在上文的详述，其仅仅是打算例证的，更确切地说包含下列权利要求所确定的主题。

Claims (30)

1.对样品中人DNA进行定量从而评价其中DNA降解程度的方法，所述方法包括以下步骤：
提供待分析的样品；
使用实时聚合酶链反应系统对样品中第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件分别进行定量，所述第一反转录转座子散布元件为Alu元件，所述第二反转录转座子散布元件为RP基因的SVA元件；和
计算样品中所述第一反转录转座子散布元件的出现率与所述第二反转录转座子散布元件的出现率的比率。
2.如权利要求1所述的方法，同时进行所述第一反转录转座子散布元件和所述第二反转录转座子散布元件的定量。
3.如权利要求2所述的方法，还包括使用所述比率来确定所述样品中DNA的降解程度的步骤。
4.如权利要求1所述的方法，所述第二反转录转座子散布元件包含的碱基对是所述第一反转录转座子散布元件包含的碱基对的至少三倍。
5.如权利要求2所述的方法，还包括以下步骤：
提供第一探针，其包含能够在第一诊断波长处发荧光的第一部分和能够淬灭第一部分荧光的第一淬灭剂，所述第一探针靶向于第一反转录转座子散布元件；
提供第二探针，其包含能够在第二诊断波长处发荧光的第二部分和能够淬灭第二部分荧光的第二淬灭剂，所述第二探针靶向于第二反转录转座子散布元件；
提供在实时聚合酶链反应系统中有用的至少一种引物，所述系统能够扩增DNA样品；
提供Taq聚合酶，其能够催化形成与样品中存在的核酸序列互补的核酸序列，所述聚合酶能够切割第一探针从而使第一荧光部分与第一淬灭剂分离并且能够切割第二探针从而使第二荧光部分与第二淬灭剂分离；
用所述第一探针和第二探针处理样品；
使用所述至少一种引物和Taq聚合酶借助于实时聚合酶链反应系统扩增样品，所述实时聚合酶链反应系统包括多个聚合酶链反应循环；
使用能够在所述第一部分和所述第二部分诱导荧光的激发源在每一实时聚合酶链反应循环期间照射样品；
在每一实时聚合酶链反应循环中测量从第一部分发出的荧光和从第二部分发出的荧光；
确定第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件的阈值循环数；以及
将所确定的阈值循环数与第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件各自的标准曲线比较，从而确定样品中第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件各自的浓度。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述提供至少一种引物的步骤包括：
提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:5的正向引物和标为SEQ ID NO:6的反向引物；以及
提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:8的正向引物，标为SEQ ID NO:11的正向引物，标为SEQ ID NO:14的正向引物，标为SEQ ID NO:9的反向引物，标为SEQ ID NO:12的反向引物，标为SEQ ID NO:13的反向引物和标为SEQ ID NO:15的反向引物：
5’GGAAGCGGAGCTTGCAGTGA 3’(SEQ ID NO:5)
5’AGACGGAGTCTCGCTCTGTCGC 3’(SEQ ID NO:6)
5’TGGGATCCTGTTGATCTGTGACCT 3’(SEQ ID NO:8)
5’GATTTGGCAGGGTCATGGGACAAT 3’(SEQ ID NO:9)
5’ATGTGCTGTGTCCACTCAGGGTTA 3’(SEQ ID NO:11)
5’TTCTTGGGTGTTTCTCACAGAGGG 3’(SEQ ID NO:12)
5’ATTCTTGGGTGTTTCTCACAGAGG 3’(SEQ ID NO:13)
5’CCAACCCTGTGCTCTCTGAAAC 3’(SEQ ID NO:14)
5’TTTGGCAGGGTCATGGGACAA 3’(SEQ ID NO:15)。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述第一探针具有标为SEQ IDNO:7的序列，并且所述第二探针选自标为SEQ ID NO:4的序列和标为SEQ ID NO:10的序列：
5’ATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCAT 3’(SEQ ID NO:4)
5’AGATTGCGCCACTGCAGTCCGCAG 3’(SEQ ID NO:7)
5’AAGGGCGGTGCAAGATGTGCTTTGTT 3’(SEQ ID NO:10)。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述实时聚合酶链反应系统在下列近似条件下操作：在95℃下，10分钟；32-40个循环的：在95℃下15秒，在61℃下70-120秒。
9.如权利要求5所述的方法，还包括以下步骤：
将阳性内对照添加至样品从而形成样品混合物；
使用实时聚合酶链反应系统对样品混合物中的阳性内对照进行定量；
比较样品混合物中第二反转录转座子散布元件的出现率与样品混合物中阳性内对照的出现率；以及
使用所述比较以确定所述方法受到样品中抑制剂存在影响的程度。
10.如权利要求9所述的方法，其中同时进行所述第一反转录转座子散布元件、第二反转录转座子散布元件和阳性内对照的定量。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述阳性内对照包含合成的核苷酸序列。
12.如权利要求9所述的方法，所述提供至少一种引物的步骤包括提供阳性内对照的引物，所述阳性内对照的引物选自标为SEQ ID NO:16的序列，标为SEQ ID NO:17的序列，标为SEQ ID NO:18的序列和标为SEQ ID NO:19的序列：
5’AAAGATCCTGCCAACAGGACAGTG 3’(SEQ ID NO:16)
5’ACAGACGGTATAGAGACCAATCAG 3’(SEQ ID NO:17)
5’GCATAAAGATCCTGCCAACAG 3’(SEQ ID NO:18)
5’ACCAAAGTGCTGCAGAAATAC 3’(SEQ ID NO:19)。
13.如权利要求9所述的方法，还包括提供第三探针，所述第三探针包含能够在第三诊断波长处发荧光的第三部分和能够淬灭第三部分荧光的第三淬灭剂，所述第三探针靶向于阳性内对照，所述Taq聚合酶还能够切割第三探针从而使所述第三荧光部分与所述第三淬灭剂分离，所述第三探针具有标为SEQ ID NO:20的序列：
5’AGGCAGAGATTGCACTGCCTTAAAGTGG 3’(SEQ ID NO:20)。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反转录转座子散布元件为SINE靶序列、LINE靶序列和SVA靶序列的其中之一，所述第一反转录转座子散布元件由40-150个碱基对组成，所述第二反转录转座子散布元件为SINE靶序列、LINE靶序列和SVA靶序列的其中之一并由120-400个碱基对组成。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA定量的灵敏度在约5pg-约9pg的范围内。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述实时聚合酶链反应系统关于第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件各自的效率为至少约80％。
17.如权利要求1所述的方法，使用所述实时聚合酶链反应系统的步骤包括制备第一反转录转座子散布元件的定量和第二反转录转座子散布元件的定量的标准曲线，所述标准曲线各自为阈值循环数相对于对数刻度的DNA量所作的图，并且每个具有至少0.99的R2值。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述实时聚合酶链反应系统基本上与样品中非灵长类动物DNA无反应。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA已经经过机械方法降解。
20.如权利要求1中所述的方法，其中所述DNA已经经过化学方法降解。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA已经经过环境方法降解。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述实时聚合酶链反应系统为绿，和的其中之一。
23.用于对样品中总的人DNA和男性特异性DNA进行定量以评价其中DNA降解程度的方法，所述方法包括以下步骤：
提供待被分析的样品；
使用所述实时聚合酶链反应系统对样品中男性特异性DNA序列、第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件分别进行定量，所述男性特异性DNA序列为90bp的Y染色体特异的DNA序列，所述第一反转录转座子散布元件为Alu元件，所述第二反转录转座子散布元件为RP基因的SVA元件；以及
计算样品中所述第一反转录转座子散布元件的出现率与第二反转录转座子散布元件的出现率的比率。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述第一反转录转座子散布元件为SINE靶序列，LINE靶序列和SVA靶序列的其中之一并由40-150个碱基对组成，第二反转录转座子散布元件为SINE靶序列，LINE靶序列和SVA靶序列的其中之一并由120-400个碱基对组成，并且所述男性靶标为人Y染色体DNA的包含90个碱基对序列的区域，其在人X染色体上X-Y染色体同源区中缺失。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述第一反转录转座子散布元件为具有约80个碱基对的靶序列并且为亚家族Yb8的Alu元件，所述第二反转录转座子散布元件为具有约290个碱基对的靶序列并且为RP基因的SVA元件，以及所述男性特异性DNA序列为人Y染色体DNA的包含90个碱基对序列的区域，其在人X染色体上X-Y染色体同源区域中缺失。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述使用步骤还包括：
提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:5的正向引物和标为SEQ ID NO:6的反向引物；
提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:8的正向引物，标为SEQ ID NO:11的正向引物，标为SEQ ID NO:14的正向引物，标为SEQ ID NO:9的反向引物，标为SEQ ID NO:12的反向引物，标为SEQ ID NO:13的反向引物和标为SEQ ID NO:15的反向引物：
5’GGAAGCGGAGCTTGCAGTGA 3’(SEQ ID NO:5)
5’AGACGGAGTCTCGCTCTGTCGC 3’(SEQ ID NO:6)
5’TGGGATCCTGTTGATCTGTGACCT 3’(SEQ ID NO:8)
5’GATTTGGCAGGGTCATGGGACAAT 3’(SEQ ID NO:9)
5’ATGTGCTGTGTCCACTCAGGGTTA 3’(SEQ ID NO:11)
5’TTCTTGGGTGTTTCTCACAGAGGG 3’(SEQ ID NO:12)
5’ATTCTTGGGTGTTTCTCACAGAGG 3’(SEQ ID NO:13)
5’CCAACCCTGTGCTCTCTGAAAC 3’(SEQ ID NO:14)
5’TTTGGCAGGGTCATGGGACAA 3’(SEQ ID NO:15)；以及
提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:25的正向引物和标为SEQ ID NO:26的反向引物:
5’CAATGTG[CTAGGCTCTAGGAATAC 3’(SEQ ID NO:25)
5’AAGAGTGTCATGGCTCAAAGAG 3’(SEQ ID NO:26)。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述使用步骤还包括提供用于男性特异性DNA靶序列的探针，所述探针具有标为SEQ ID NO:27的序列：
5’AGAGAGTATGACAAACATGGCATGGGC 3’(SEQ ID NO:27)。
28.如权利要求25所述的方法，还包括以下步骤：
将阳性内对照添加至样品从而形成样品混合物；
使用实时聚合酶链反应系统对样品混合物中的阳性内对照进行定量；
比较样品混合物中第二反转录转座子散布元件的出现率与样品混合物中阳性内对照的出现率；以及
使用所述比较以确定所述方法受到样品中抑制剂存在影响的程度。
29.如权利要求28所述的方法，所述使用实时聚合酶链反应系统对阳性内对照进行定量的步骤还包括：
提供选自以下的至少一种引物：标为SEQ ID NO:21的正向引物，标为SEQ ID NO:22的反向引物和标为SEQ ID NO:23的反向引物：
5’GCATAAAGATCCTGCCAACAG 3’(SEQ ID NO:21)
5’GCCCGAACTTCCAACACTAT 3’(SEQ ID NO:22)
5’ATTGTTCCTCCTGCCTGATT 3’(SEQ ID NO:23)。
30.如权利要求28所述的方法，所述使用实时聚合酶链反应系统对阳性内对照进行定量的步骤还包括提供用于阳性内对照的探针，所述探针具有标为SEQ ID NO:24的序列：
5’ACAGTGTCAGGCAGAGATTGCACT 3’(SEQ ID NO:24)。
CN201380052972.9A 2012-08-13 2013-08-13 开发用于评估法医样品中dna降解和质量的高灵敏度定量系统 Pending CN104718300A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261682507P 2012-08-13 2012-08-13
US61/682,507 2012-08-13
US201361767668P 2013-02-21 2013-02-21
US61/767,668 2013-02-21
US201361793595P 2013-03-15 2013-03-15
US61/793,595 2013-03-15
US13/964,970 US9957557B2 (en) 2012-08-13 2013-08-12 Development of a highly sensitive quantification system for assessing DNA degradation and quality in forensic samples
US13/964,970 2013-08-12
PCT/US2013/054788 WO2014028531A2 (en) 2012-08-13 2013-08-13 Development of a highly sensitive quantification system for assessing dna degradation and quality in forensic samples

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104718300A true CN104718300A (zh) 2015-06-17

Family

ID=50100292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380052972.9A Pending CN104718300A (zh) 2012-08-13 2013-08-13 开发用于评估法医样品中dna降解和质量的高灵敏度定量系统

Country Status (5)

Country Link
US (2) US9957557B2 (zh)
EP (1) EP2882871B1 (zh)
CN (1) CN104718300A (zh)
ES (1) ES2790979T3 (zh)
WO (1) WO2014028531A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564833A (zh) * 2019-08-23 2019-12-13 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种用于ffpe样本dna质控的试剂盒及检测方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10988803B2 (en) * 2014-12-29 2021-04-27 Life Genetics Lab, Llc Multiplexed assay for quantitating and assessing integrity of cell-free DNA in biological fluids for cancer diagnosis, prognosis and surveillance
EP2971087B1 (en) 2013-03-14 2017-11-01 Qiagen Sciences, LLC Assessing dna quality using real-time pcr and ct values
EP3483287A1 (en) * 2014-01-28 2019-05-15 QIAGEN GmbH Internal amplification control
CN108690831A (zh) * 2017-04-09 2018-10-23 勤浩医药（苏州）有限公司 脑胶质瘤原代细胞培养及pdx模型的建立
EP3794138A1 (en) 2018-05-14 2021-03-24 F. Hoffmann-La Roche AG Quality testing of dna samples
US20230054587A1 (en) 2019-12-19 2023-02-23 Cadex Genomics, Corp. Multiplexed Assay Using Differential Fragment Size to Identify Cancer Specific Cell-Free DNA
JP2023520871A (ja) * 2020-03-31 2023-05-22 パーソナル ゲノム ダイアグノスティクス インコーポレイテッド 核酸品質決定のための組成物および方法
CN113424799B (zh) * 2021-06-28 2022-09-02 中国人民解放军陆军特色医学中心 一种基于成骨龛微环境修饰的pdx模型的构建方法及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081186A2 (en) * 2003-03-10 2004-09-23 Applera Corporation Single nucleotide polymorphisms associated with stenosis, methods of detection and uses thereof
US20060099620A1 (en) * 2004-10-08 2006-05-11 Walker Jerilyn A Multiplex PCR for simultaneous quantitation of human nuclear, mitochondrial, and male Y-chromosome DNA
US20060199217A1 (en) * 2003-09-30 2006-09-07 Sinha Sudhir K Assay for human DNA for gender determination
WO2007100530A2 (en) * 2006-02-16 2007-09-07 New York Medical College Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium
US20080206755A1 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Sinha Sudhir K Method for genetic detection using interspersed genetic elements
WO2011042920A1 (en) * 2009-10-07 2011-04-14 Decode Genetics Ehf Genetic variants indicative of vascular conditions

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US6268130B1 (en) 1996-04-12 2001-07-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. RP compositions and diagnostic uses therefor
ATE295427T1 (de) 1996-06-04 2005-05-15 Univ Utah Res Found Überwachung der hybridisierung während pcr
US20090093620A1 (en) * 2000-09-05 2009-04-09 David Kovalic Annotated Plant Genes
DE10045521A1 (de) 2000-03-31 2001-10-04 Roche Diagnostics Gmbh Nukleinsäureamplifikationen
US6436703B1 (en) * 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
HUE039443T2 (hu) 2005-06-16 2018-12-28 Rech 2000 Inc Eljárás és összeállítás elektrolizáló egység görbeillesztéses elemzés alapján történõ diagnosztizálására és hatékonyság optimalizálására
US7991558B2 (en) 2005-09-29 2011-08-02 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for determining real-time PCR cycle thresholds using cluster analysis
WO2008021288A2 (en) 2006-08-11 2008-02-21 Johns Hopkins University Consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers
WO2012038503A1 (en) 2010-09-23 2012-03-29 Qiagen Gmbh Method for detecting and/or quantifying human dna
US20110021974A1 (en) 2010-10-05 2011-01-27 Shantha Totada R Retinitis pigmentosa treatment and prophalaxis
CN102134595B (zh) 2010-12-23 2013-03-20 苏州新海生物科技有限公司 样品中核酸质量检测方法
US10176293B2 (en) 2012-10-02 2019-01-08 Roche Molecular Systems, Inc. Universal method to determine real-time PCR cycle threshold values

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081186A2 (en) * 2003-03-10 2004-09-23 Applera Corporation Single nucleotide polymorphisms associated with stenosis, methods of detection and uses thereof
US20060199217A1 (en) * 2003-09-30 2006-09-07 Sinha Sudhir K Assay for human DNA for gender determination
US20060099620A1 (en) * 2004-10-08 2006-05-11 Walker Jerilyn A Multiplex PCR for simultaneous quantitation of human nuclear, mitochondrial, and male Y-chromosome DNA
WO2007100530A2 (en) * 2006-02-16 2007-09-07 New York Medical College Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium
US20080206755A1 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Sinha Sudhir K Method for genetic detection using interspersed genetic elements
WO2011042920A1 (en) * 2009-10-07 2011-04-14 Decode Genetics Ehf Genetic variants indicative of vascular conditions

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATIE L. SWANGO ET AL.: "A quantitative PCR assay for the assessment of DNA degradation in forensic samples", 《FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL》, no. 158, 3 June 2005 (2005-06-03), pages 14 - 26 *
WILLIAM R. HUDLOW ET AL.: "A quadruplex real-time qPCR assay for the simultaneous assessment of total human DNA, human male DNA, DNA degradation and the presence of PCR inhibitors in forensic samples: A diagnostic tool for STR typing", 《FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL: GENETICS 2》, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 108 - 125 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564833A (zh) * 2019-08-23 2019-12-13 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种用于ffpe样本dna质控的试剂盒及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20180230525A1 (en) 2018-08-16
WO2014028531A2 (en) 2014-02-20
WO2014028531A3 (en) 2014-07-03
EP2882871A2 (en) 2015-06-17
US11345953B2 (en) 2022-05-31
EP2882871B1 (en) 2019-12-18
US9957557B2 (en) 2018-05-01
EP2882871A4 (en) 2016-04-13
ES2790979T3 (es) 2020-10-30
US20140051075A1 (en) 2014-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104718300A (zh) 开发用于评估法医样品中dna降解和质量的高灵敏度定量系统
Pfaffl Quantification strategies in real-time PCR
US10538807B2 (en) Compositions and methods for detecting rare nucleic acid molecule mutations
Mayne et al. A DNA methylation age predictor for zebrafish
Ramón-Laca et al. Reliable discrimination of 10 ungulate species using high resolution melting analysis of faecal DNA
Pineda et al. Development and validation of InnoQuant™, a sensitive human DNA quantitation and degradation assessment method for forensic samples using high copy number mobile elements Alu and SVA
CA2984352A1 (en) Multiplexed optimized mismatch amplification (moma)-real time pcr for assessing cell-free dna
Stein et al. Steps to achieve quantitative measurements of microRNA using two step droplet digital PCR
CN109601008A (zh) 用于工程化信号产生的竞争性探针
Zeka et al. Circulating microRNA biomarkers for metastatic disease in neuroblastoma patients
Lee et al. Analysis of the initial lot of the CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel
KR102165933B1 (ko) 둘 이상의 데이터 세트를 이용한 비정상적인 시그널의 검출
US9411929B2 (en) Method of determining RNA integrity
Martoni et al. Disentangling bias for non-destructive insect metabarcoding
Zulch et al. Selection and exploitation of prevalent, tandemly repeated genomic targets for improved real-time PCR-based detection of Wuchereria bancrofti and Plasmodium falciparum in mosquitoes
Yan et al. Inhibition monitoring in veterinary molecular testing
KR20180035925A (ko) 타겟 분석물질의 존재 또는 부존재를 결정하기 위한 다중 데이터 세트 분석법
Goris et al. Validation of two real-time RT-PCR methods for foot-and-mouth disease diagnosis: RNA-extraction, matrix effect, uncertainty of measurement and precision
KR102098773B1 (ko) 뱀장어 Anguilla japonica(극동산 뱀장어) 종과 A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata 구별을 위한 프라이머 및 이를 이용한 Real-time PCR 검출 방법
US11702697B2 (en) Quality testing of DNA samples
Kibriya et al. Novel luminex assay for telomere repeat mass does not show well position effects like qPCR
KR102269118B1 (ko) 주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법
US20130078639A1 (en) System and method of detecting and correcting for nucleic acid damage
CN109576350B (zh) 一种dna与rna同时定量的试剂盒、方法及质控方法
JP5564795B2 (ja) Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150617

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication